CN106916840A - 一种腈水解酶基因工程菌及其构建方法、发酵培养方法和应用 - Google Patents

一种腈水解酶基因工程菌及其构建方法、发酵培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及工业微生物和基因工程领域，公开了一种腈水解酶基因工程菌及其构建方法、发酵培养方法以及基因工程菌株的应用。将来自于Arthrobacter nitroguajacolicus菌的腈水解酶基因插入用NdeⅠ和SalⅠ双酶切的pET32表达质粒，构建高表达和高催化活性的腈水解酶基因工程菌。这种腈水解酶基因工程菌可用于水解羟基乙腈生产乙醇酸，反应可以在纯水相中进行，反应的水解副产物少，条件温和，产率高，具有很高的工业化生产潜力。本发明还提供了优化的基因工程菌发酵培养条件，进一步提高催化活性。

Description

一种腈水解酶基因工程菌及其构建方法、发酵培养方法和应用
技术领域
本发明属于工业微生物和基因工程技术领域，具体地说，涉及一种利用大肠杆菌pET表达系统构建高效表达腈水解酶基因工程菌的方法、构建的基因工程菌及其发酵培养方法，以及所得的基因工程菌株的应用。
背景技术
乙醇酸是一种重要的有机合成中间体和化工产品，可用于生产各类清洁剂、助剂，也可用于生产医用可降解聚合物和化妆品添加剂。工业生产乙醇酸目前多采用化学合成方法，传统方法主要有氯乙酸水解法、甲醛氰化法和甲醛羰基化法等。化学方法通常需要在高压、酸性条件下进行催化反应，产品杂质多，催化剂分离回收困难，且能耗高，设备腐蚀严重。国内企业多采用氯乙酸小规模生产乙醇酸，所得产品为70％乙醇酸溶液，多供给低端市场(生产清洁剂、助剂等)，无法满足高端市场(医用、化妆品)需求，高质量晶体乙醇酸依赖进口。
腈水解酶是一种具有广泛底物适应性的生物催化剂，可以催化腈水解生成相应的羟基酸。由于天然腈化物的广泛存在，使很多微生物都或多或少具有降解腈化物的能力。上海市农药研究所保藏的一株产腈水解酶菌株Arthrobacter nitroguajacolicus(保藏号CGMCC No.2405)，并克隆到了该菌株所产的腈水解酶基因(中国专利授权公告号CN102031247)，该腈水解酶除了能够如上述专利所述能够水解3-羟基丁腈产3-羟基丁酸外，还能水解羟基乙腈产乙醇酸。
与化学合成法相比，利用产腈水解酶的微生物转化羟基乙腈生产乙醇酸，具有反应条件温和、副产物少、工艺相对简单、对环境污染小等优点，具有竞争优势。上海市农药研究所曾与企业合作开展了微生物催化法生产乙醇酸的项目(上海市科委应用技术开发项目和浙江省科技型中小企业技术创新基金项目)，所得乙醇酸产品质量高，符合高端市场客户要求。该项目采用了上述菌株Arthrobacter nitroguajacolicus进行催化反应，发酵酶活单位一般在5万单位，反应70h后，反应产物乙醇酸的浓度在10-15％。结果显示，采用该野生型菌株，酶活单位低，反应时间长，限制了催化反应的效率，成为大规模生产的瓶 颈问题。
因此，要解决该问题的关键是获得高产腈水解酶工程菌株，并采用适当的培养基和条件进行发酵，以获得腈水解酶工程菌用于水解羟基乙腈生产乙醇酸。
发明内容
本发明旨在是提供一种高效表达腈水解酶基因工程菌及其构建方法。
本发明的第二个目的是提供了优化的基因工程菌发酵培养方法。
本发明的第三个目的在于提供高产腈水解酶的基因工程菌水解羟基乙腈生产乙醇酸的方法。
本发明技术方案为，一种高效表达腈水解酶基因工程菌的构建方法，采用大肠杆菌pET表达系统，选用表达载体pET32a，对该质粒进行了改造，去除了一段表达为165个氨基酸的Tag蛋白质的DNA片段，插入来自于Arthrobacter nitroguajacolicus菌的腈水解酶基因，并转入大肠杆菌，获得的工程菌能够高效表达腈水解酶基因。
一种腈水解酶基因工程菌的构建方法，按照以下步骤进行：
(1)采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的正向和反向引物，以Arthrobacter nitroguajacolicus菌的总DNA为模板进行PCR扩增；
正向引物(SEQ ID NO.1)：5’-TAC ACA CAT ATG ATG ACC CAC CCC CAG TTC-3’(下划线序列为NdeⅠ酶切位点)，反向引物(SEQ ID NO.2)：5’-GATT GTC GAC CTA GAG TTC CGC CAT GTC-3’(下划线序列为SalⅠ酶切位点)；扩增产物为两端分别带有NdeⅠ和SalⅠ酶切位点的腈水解酶基因NYNit，腈水解酶基因NYNit的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
(2)将步骤(1)的扩增产物及pET32a质粒分别用NdeⅠ和SalⅠ双酶切；回收酶切片段并连接，获得重组质粒；
优选的酶切反应条件为，37℃反应过夜(8～16hr)；优选的连接条件为，纯化回收酶切后的扩增产物和pET32a片段，以摩尔比3:1配制连接体系，加入T4连接酶，在16℃反应过夜(8～16hr)。
本步骤将表达载体中pET32a质粒表达一段165个氨基酸的Tag蛋白质(分别为Trx·Tag、His·Tag和S·Tag)的DNA切除。
(3)经过鉴定，用连接正确的重组质粒pETNYNitd转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得腈水解酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd。
优选的，步骤(3)鉴定重组质粒方法为：将步骤(2)连接反应液转化克隆宿主E.coli DH5α，涂布在LB平板(含100ppm氨苄青霉素)上，挑选阳性克隆，并在LB培养基(含100ppm氨苄青霉素)中37℃培养过夜，提取小量质粒，进行分别用BamHⅠ单酶切和NdeⅠ+SalⅠ双酶切及PCR测序验证，验证正确的质粒命名为pETNYNitd。重组质粒中所插入的腈水解酶基因NYNit核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述菌株Arthrobacter nitroguajacolicus保藏号为CGMCC No.2405，保藏日期2008年3月17日，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
通过上述方法所得到的腈水解酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd，含有pET32a重组质粒。pET32a经过NdeⅠ和SalⅠ双酶切，在重组质粒上插入了Arthrobacter nitroguajacolicus腈水解酶基因NYNit，NYNit的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。这种基因工程菌能够高效表达腈水解酶，可用于水解多种有机腈化合物(如3-羟基丁腈，丙烯腈，羟基乙腈)，尤其是用于水解羟基乙腈生产乙醇酸。
上述腈水解酶的基因工程菌的发酵培养方法，步骤包括：
(1)种子培养
种子培养基的pH值为7.0～7.4，其活性成分及含量包括：葡萄糖0.2％～1.0％、蛋白胨0.5％～1.5％、NaCl 0.5～1.5％、酵母膏0.5～1.0％，均为重量百分比；当种子培养基为斜面培养基时，还含有1％～5％琼脂；优选的，种子培养基还含有50～200ppm(50～200μg/ml)氨苄青霉素；
培养条件为：34～37℃、150～500rmp搅拌条件下，培养至1.3≥OD600≥0.8。
优选的，种子培养基的pH值为7.1～7.3，其活性成分为：葡萄糖0.4％～0.9％、蛋白胨0.8％～1.2％、NaCl 0.8～1.2％、酵母膏0.5％～1.0％(均为重量百分比)，还含有50～200ppm(50～200μg/ml)氨苄青霉素，余量为水。种子培养基如为斜面培养基，还含1wt％～5wt％琼脂。优选的，种子培养基pH为7.2，组分为：葡萄糖0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl 1.0％、酵母膏0.5％，氨苄青霉素100ppm(100μg/ml)，余量为水；如为斜面培养基，还含1wt％～2.5wt％琼脂。
(2)发酵诱导
将步骤(1)获得的种子液以1～10％接种量转接入发酵培养基；34～37℃、150～500rmp搅拌条件下，培养至12≥OD600≥6，加入诱导剂，降低温度至27～29℃，继续诱导培养14～18h；
所述诱导剂为乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；优选的，诱导剂的用量为：乳糖 0.5wt％～1.5wt％，或者异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.1～1mM；
发酵培养基的活性成分及含量包括：葡萄糖0.05％～1.0％、甘油0.5％～1.5％、蛋白胨0.5～1.5％％、酵母膏0.5～1.5％、(NH4)2SO4 0.01％～1.0％、Na2HPO4 0.5～1.5％、KH2PO4 0.01％～1.0％、MgSO4 0.01％～0.1％、NH4Cl 0～0.15％(均为重量百分比)，还含有50～200ppm(50～200μg/ml)氨苄青霉素；pH值为7.0～8.5。余量为水。
优选的，发酵培养基的pH值为7.0～7.4，其活性成分为：葡萄糖0.1％～0.5％、甘油0.8％～1.2％、蛋白胨0.8％～1.5％、酵母膏0.5％～1.2％、(NH4)2SO4 0.1％～0.6％、Na2HPO4 0.8％～1.3％、KH2PO4 0.1％～1.0％、MgSO4 0.01％～0.1％(均为重量百分比)；还含有80～200ppm氨苄青霉素，余量为水。最优选的方案，发酵培养基pH为7.2，组分为：葡萄糖0.2％、甘油0.8％、蛋白胨1.2％、酵母膏0.8％、(NH4)2SO4 0.3％、Na2HPO4 1.04％、KH2PO4 0.39％、MgSO4 0.03％，氨苄青霉素100ppm(100μg/ml)，余量为水；培养条件为37℃、240rpm，培养至OD600≈6，加入诱导剂1wt％乳糖，降低温度至28℃，诱导培养16h。
优选的，发酵培养基或种子培养基中，所述蛋白胨选自胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、肉蛋白胨，酵母膏选自酵母抽提物或酵母浸膏。
本发明的腈水解酶基因工程菌水解羟基乙腈生产乙醇酸的方法，按以下步骤进行：
(1)取腈水解酶基因工程菌发酵液分离收集细胞，并用去离子水洗涤后，用去离子水重悬获得细胞悬浮液，去离子水与原始发酵液体积比为1：0.6～1.2，优选为1(等体积重悬)，用于催化反应；也可以用腈水解酶基因工程菌发酵液直接进行催化反应；
(2)向其中分批加入羟基乙腈，每次加入量为初始细胞悬浮液或发酵液体积的5％～15％，优选为10％，搅拌反应，反应温度28～30℃，当加入的底物接近反应完全后再继续添加新的底物，即累加催化反应。
通过上述反应，所获得的反应体系中，乙醇酸浓度可以≥30％，比原始菌株Arthrobacter nitroguajacolicus高4倍以上。
本发明用来自于Arthrobacter nitroguajacolicus菌的腈水解酶基因插入用NdeⅠ和SalⅠ双酶切的pET32表达质粒，构建了一种高表达和高催化活性的腈水解酶基因工程菌；通过去除了表达载体上的一段表达Tag蛋白质的DNA片段，能够实现腈水解酶基因高效表达，可高效催化有机腈水解生成相应的酸。尤其是可用于水解羟基乙腈生产乙醇酸。该催化反应可以在纯水相中进行，使反应的水解副产物少，条件温和，产率高，因此本发明具有很高的工业化生产潜力。
同时，本发明还通过优化发酵培养条件，使经过发酵培养的表达腈水解酶基因的工程 菌催化活性进一步提高。
附图说明
图 1为实施例1pETNYNitd酶切电泳图谱，其中泳道1为BamHⅠ单酶切产物，泳道2为NdeⅠ+SalⅠ双酶切产物，M为λ-HindⅢ digest Marker。
图 2为实施例2不同浓度乳糖诱导发酵培养E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd基因工程菌的酶活性及OD600值。
图 3为实施例3中E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd基因工程菌累加催化反应走势图。
图 4为实施例3中原始菌与E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd基因工程菌累加催化反应走势比较图。
图 5为实施例4中，E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd及E.coli BL21(DE3)-pETNYNit基因工程菌的种龄及经发酵诱导培养后酶活性变化趋势比较。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
如专利文件CN102031247中阐述，菌株Arthrobacter nitroguajacolicus保藏号为CGMCC No.2405，保藏日期：2008年3月17日，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
实施例1 E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd基因工程菌的构建
(1)根据菌株Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405的腈水解酶基因NYNit两端DNA序列设计引物，正向引物5’-TAC ACA CAT ATG ATG ACC CAC CCC CAG TTC-3’(下划线序列为NdeⅠ酶切位点)，反向引物5’-GATT GTC GAC CTA GAG TTC CGC CAT GTC-3’(下划线序列为SalⅠ酶切位点)，即SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列。以菌株基因组为模板，通过PCR扩增得到两端带酶切位点的NYNit片段(即5’端加上NdeⅠ酶切位点和3’端加上SalⅠ酶切位点的NYNit片段)。
扩增体系(20μl)：正向引物，1μl；反向引物，1μl；模板，1μl；dNTP，2μl；10×PCR Buffer，2μl；Taq，1μl；DMSO，1μl；ddH2O，11μl。
扩增程序：95℃4min→(95℃40s→55℃40s→72℃1min)30个循环→72℃10min。
(2)将pET32a质粒和步骤(1)所得到的两端带酶切位点的NYNit片段分别用NdeⅠ和SalⅠ双酶切，37℃反应过夜。此步骤同步切除了表达载体中表达一段165个氨基酸的Tag蛋白质(分别为Trx·Tag、His·Tag和S·Tag)的DNA。
再使用Glassmilk(PBS缓冲液浸泡处理购自Sigama公司的硅胶S5631)分别回收酶切片段，将回收的NYNit片段和pET32a片段以摩尔比3∶1配制连接体系，加入T4连接酶，在16℃反应过夜。连接反应液转化克隆宿主E.coli DH5α，得到的转化子培养，提取质粒，进行酶切验证(分别为NdeⅠ+SalⅠ双酶切和BamHⅠ单酶切)和PCR验证，挑出正确的重组质粒，命名为pETNYNitd。插入重组质粒的NYNit基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。然后将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)得到基因工程菌，命名为E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd。
图 1为pETNYNitd酶切电泳图谱。其中1为BamHⅠ单酶切产物，2为NdeⅠ+SalⅠ双酶切产物，M为λ-HindⅢ digest Marker。
实施例2 E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd基因工程菌的发酵培养
采用最优培养基进行发酵培养，培养过程为：
接20μl甘油保藏菌液于2ml种子培养基，37℃、240rpm培养过夜(约16h)，转接200μl培养液于20ml种子培养基中，37℃、240rpm培养约2.5h至OD600值为0.8-1.0；
种子培养基的组分为：葡萄糖0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl 1.0％、酵母膏0.5％，氨苄青霉素100ppm，余量为水，pH7.2。
转接0.6ml种子液于20ml发酵培养基中，37℃、240rpm培养约4.5h至OD600值约为6，加入乳糖(终浓度分别为0.5wt％、0.75wt％和1wt％)，降温至28℃诱导培养16h，发酵液OD600值约为20～23。
发酵培养基的组分为：葡萄糖0.2％、甘油0.8％、蛋白胨1.2％、酵母膏0.8％、(NH4)2SO4 0.3％、Na2HPO4 1.04％、KH2PO4 0.39％、MgSO4 0.03％，氨苄青霉素100ppm，余量为水，pH 7.2。
如图 2所示，乳糖诱导浓度为0.5wt％时，发酵液OD600值约为20，酶活209899单位；乳糖诱导浓度为0.75wt％时，发酵液OD600值约为22，酶活单位233826单位；乳糖诱导浓度为1.0wt％时，发酵液OD600值约为23，酶活305194单位。乳糖浓度从0.5％升高至 1.0％，放瓶菌密度(放瓶OD600)从19上升至23。乳糖浓度为1.0％时的放瓶菌液酶活最高，达30万单位，比乳糖浓度为0.5％的放瓶菌液酶活高58％，比乳糖浓度为0.75％的放瓶菌液酶活高30％，其酶活的提高主要是由于发酵菌密度的提高。
由此可见，采用上述方法培养的基因工程菌，发酵液酶活单位≥20万单位，比原始菌Arthrobacter nitroguajacolicus提高3-4倍，发酵段培养周期24-30h，比原始菌Arthrobacter nitroguajacolicus缩短近30h。
注：原始菌Arthrobacter nitroguajacolicus的培养基如CN102031247所描述，种子培养：28℃、220rpm、24-48h，以10％接种量转接入发酵培养基；发酵培养：28℃、220rpm、48-72h，转接入种子液后，加入诱导剂。经检测，Arthrobacter nitroguajacolicus的酶活为5万～6万单位。
诱导剂可采用终浓度0.5～1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)代替乳糖。
采用以下方法检测酶活：
1体积的发酵液或细胞液中加1/20体积的底物(99.0％丙烯腈)，40℃水浴振荡反应5min后加1/12.5体积37wt％浓盐酸使反应液终pH达1～2，以终止反应。然后15000rpm下离心5min，取上清用气相色谱法测定丙烯酸含量，计算酶活。酶活计算公式：C样品＝C 标样×A样品/A标样×60/t。[C：浓度(ppm)；A：峰面积；t：反应时间(min)]。
酶活单位定义：1mL发酵液或细胞液反应1h产生1μg丙烯酸酸为1个单位。
实施例3水解羟基乙腈生产乙醇酸
取450ml实施例2中获得的E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd基因工程菌发酵液(乳糖的用量1wt％)，离心收集细胞，用去离子水洗涤2次，再用去离子水悬浮细胞至原体积，得细胞悬浮液。
细胞悬浮液装在1L三口圆底烧瓶中，圆底烧瓶两个口分别插入搅拌棒和温度计，另一个口为取样口。反应体系于28～30℃水浴加热，250rpm下搅拌反应。向反应体系中分批加入羟基乙腈(即累加催化反应)，每次加入量为细胞悬浮液体积的10％，当加入的底物接近反应完全后再继续添加新的底物。反应期间每隔0.5h～1h取样检测羟基乙腈和乙醇酸含量。
测定乙醇酸含量的方法采用高效液相色谱法，具体如下：
检测条件：流动相：磷酸二氢钠缓冲液:乙腈＝95:5(V/V)。磷酸二氢钠缓冲液(g/L)：磷酸二氢钠0.83，辛烷磺酸钠0.19，磷酸0.34mL/L。检测温度：室温；检测波长：210nm； 流速0.4mL/min；进样体积：20μL。
检测方法：称取含0.05g乙醇酸的试样置50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下进样分析，计算公式如下：
[X1：乙醇酸的质量分数(％)；A1：标样溶液中乙醇酸峰面积的平均值；A2：试样溶液中乙醇酸峰面积的平均值；m1：乙醇酸标样的质量(g)；m2：试样的质量(g)；P：标样中乙醇酸的质量分数(％)]。
原始菌Arthrobacter nitroguajacolicus采用同样的方法进行累加催化反应，比较原始菌Arthrobacter nitroguajacolicus和基因工程菌的反应差异，结果如图 3和4所示。
从图 3可看出，使用基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd催化反应，产物乙醇酸浓度提升到25％时，增长速度开始放缓，14h后乙醇酸浓度达到30％，之后仍可继续反应，但反应速度明显降低。反应20h，乙醇酸浓度可达36％。从图 4可以看出，使用野生菌催化反应48h后，乙醇酸含量累积到10％，之后反应速度开始明显放缓，60h后乙醇酸含量达到10.7％。后期反应极慢，催化反应72h后乙醇酸浓度仅达到11.6％。
上述结果显示，基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd累加催化反应的反应速度和最终获得的产物浓度均明显高于原始菌，大大提高了催化反应的效率；通过累加催化反应得到较高浓度的产物，减少了后续浓缩工艺的能耗。
实施例4对照例
参考pET系统操作手册(英文版第10版，pET System Manual 10th Ed.)，用带有EcoR I酶切位点的上游引物及带有Sal I酶切位点的下游引物，以Arthrobacter nitroguajacolicus总DNA为模板扩增。PCR扩增产物及pET-32a分别用EcoR I和Sal I双酶切并连接，将NYNit基因插入pET-32a获得重组质粒。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组的E.coli BL21(DE3)-pETNYNit。参见“Arthrobacter nitroguajacolicus腈水解酶基因的克隆和表达”，《工业微生物》2014年，44(6)，p.13-20。
用LB培养基发酵，并用IPTG诱导。将发酵液浓缩15倍检测酶活性，结果如表 1，最高的酶活性为5万。
表 1 E.coli BL21(DE3)-pETNYNit诱导培养结果
注：0为不加诱导剂对照。
以相同的方法分别培养基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNit和E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd，取诱导培养的发酵菌液测酶活，比较两者的酶活水平。
培养方法如下：
(1)种子培养：种子培养基的组成为，葡萄糖0.5％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、NaCl 1.0％，pH7.2，斜面培养基含2％琼脂粉；余量为水。在37℃、240rpm下培养至OD6000.4～1.0，分别取培养至不同OD600值的种子液转发酵。
(2)发酵培养：发酵培养基的组成为，葡萄糖0.2％、甘油0.8％、蛋白胨1.2％、酵母膏0.8％、NaCl 0.3％、(NH4)2SO40.3％、NH4Cl 0.13％、Na2HPO4·12H2O 1.04％、KH2PO4 0.39％、MgSO4·7H2O 0.03％，含100μg/ml Amp(100ppm氨苄青霉素)；pH 7.2。以3％的接种量将培养至不同OD600值的种子液转接入发酵培养基，装瓶量为20ml/250ml摇瓶，；在37℃、240rpm下发酵培养4h至OD600≈6；降温至28℃加入IPTG至终浓度0.5mM，240rpm下诱导培养16h。
种子液在OD6000.4～1.0的范围中取7个水平点转发酵培养。放瓶菌液测酶活及OD600，所有实验组菌液的OD600值(稀释20倍测定)都在0.8～0.9范围中，没有明显差异值出现，说明菌浓度无显著差异，酶活测定和放瓶菌液OD600比较结果如图 5。重组菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNit(简称重组菌1)种子液OD600为0.4的放瓶酶活约为4.5万单位，0.5-0.6时为7万单位，而种子液OD6000.7～1.0的放瓶酶活稳定在8万单位左右。总得来说此株菌在种子液OD600为0.5-1.0的放瓶酶活稳定在一个水平，约7万～8万单位；重组菌E.coli BL21(DE3)-pETNYNitd(简称重组菌2)种子液OD600为0.4的放瓶酶活约为9万单位，0.5～0.7时为12万～14万单位，而种子液OD6000.8～1.0的放瓶酶活明显提高，稳定在20万单位左右。
综上所述，相同种龄水平下，重组菌2的发酵酶活明显优于重组菌1，前者是后者的2至3倍；不同种龄下，重组菌1的发酵酶活变化幅度不如重组菌2显著，种子液OD600值从0.4上升至1.0时，重组菌1的酶活从4.5万单位提高至8万单位，提高了78％，重组菌2的酶活则从9万单位提高至20万单位，提高了122％。
综上所述，本发明提供了一株产腈水解酶基因工程菌的构建方法及其高效表达产酶的发酵培养方法，该基因工程菌可用于水解羟基乙腈生产乙醇酸，具有很高的工业化生产潜力。

Claims (9)

1.一种腈水解酶基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的正向和反向引物，以Arthrobacter nitroguajacolicus菌的基因组为模板扩增；
(2)将步骤(1)的扩增产物及pET32a质粒分别用NdeⅠ和SalⅠ双酶切，回收酶切片段并连接，获得重组质粒；
(3)经过鉴定，用连接正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得腈水解酶基因工程菌。
2.权利要求1所述腈水解酶基因工程菌的构建方法，其特征在于，重组质粒中插入的腈水解酶基因NYNit核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，Arthrobacter nitroguajacolicus菌的保藏号为CGMCC No.2405。
3.一种腈水解酶基因工程菌，其特征在于，通过权利要求1或2所述的方法构建。
4.权利要求3所述腈水解酶基因工程菌在水解羟基乙腈生产乙醇酸方面的应用。
5.权利要求3所述腈水解酶基因工程菌的发酵培养方法，其特征在于，步骤包括：
(1)种子培养
种子培养基的pH值为7.0～7.4，其活性成分及含量包括：葡萄糖0.2％～1.0％、蛋白胨0.5％～1.5％、NaCl 0.5～1.5％、酵母膏0.5～1.0％；当种子培养基为斜面培养基时，还含有1％～5％琼脂；
培养条件为：34～37℃、150～500rmp搅拌条件下，培养至1.3≥OD600≥0.8；
(2)发酵诱导
将步骤(1)获得的种子液以1％～10％接种量转接入发酵培养基；34～37℃、150～500rmp搅拌条件下，培养至12≥OD600≥6，加入诱导剂，降低温度至27～29℃，继续诱导培养14～18h；
所述诱导剂为乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；
发酵培养基的pH值为7.0～8.5，其活性成分及含量包括：葡萄糖0.05％～1.0％、甘油0.5％～1.5％、蛋白胨0.5～1.5％、酵母膏0.5％～1.5％、(NH4)2SO4 0.01％～1.0％、Na2HPO40.5％～1.5％、KH2PO4 0.01％～1.0％、MgSO4 0.01％～0.1％、NH4Cl 0～0.15％。
6.权利要求5所述腈水解酶基因工程菌的发酵培养方法，其特征在于，种子培养基的pH值为7.1～7.3，其活性成分为：葡萄糖0.4％～0.9％、蛋白胨0.8％～1.2％、NaCl 0.8～1.2％、酵母膏0.5％～1.0％，还含有80～200ppm氨苄青霉素；
发酵培养基的pH值为7.0～7.4，其活性成分及含量为：葡萄糖0.1％～0.5％、甘油0.8％～1.2％、蛋白胨0.8％～1.5％、酵母膏0.5％～1.2％、(NH4)2SO4 0.1％～0.6％、Na2HPO40.8％～1.3％、KH2PO4 0.1％～1.0％、MgSO4 0.01％～0.1％；还含有50～200ppm氨苄青霉素。
7.权利要求5所述腈水解酶基因工程菌的发酵培养方法，其特征在于，所述蛋白胨选自胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、肉蛋白胨，酵母膏选自酵母抽提物或酵母浸膏。
8.权利要求5所述腈水解酶基因工程菌的发酵培养方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导剂的用量为：乳糖0.5wt％～1.5wt％，或者异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.1～1mM。
9.生产乙醇酸的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)取腈水解酶基因工程菌发酵液，或者分离收集发酵诱导培养的腈水解酶基因工程菌，加入去离子水悬浮得到细胞悬浮液，去离子水与原始发酵液体积比为1：0.6～1.2；
(2)向其中分批加入羟基乙腈，每次加入量为初始细胞悬浮液或发酵液体积的5％～15％，28～30℃下搅拌反应，当加入的底物接近反应完全后再继续添加新的底物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107267433A (zh) * 2017-07-17 2017-10-20 江南大学 一种腈水解酶重组表达菌株的构建及其高密度发酵方法
CN114874036A (zh) * 2022-04-27 2022-08-09 眉县食品药品安全检验检测中心 实验室农产品检后残渣中乙腈的酶化处理方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102031247A (zh) * 2009-09-29 2011-04-27 上海市农药研究所 一种腈水解酶及其制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102031247A (zh) * 2009-09-29 2011-04-27 上海市农药研究所 一种腈水解酶及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
司文等: "一株产腈水解酶基因工程菌转化羟基乙腈生产乙醇酸的工艺初探", 《工业微生物》 *
唐璐敏: "Arthrobacter nitroguajacolicus腈水解酶基因的克隆和表达", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107267433A (zh) * 2017-07-17 2017-10-20 江南大学 一种腈水解酶重组表达菌株的构建及其高密度发酵方法
CN114874036A (zh) * 2022-04-27 2022-08-09 眉县食品药品安全检验检测中心 实验室农产品检后残渣中乙腈的酶化处理方法

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