CN105062998A - 一种定点突变改造的基因工程l-天冬酰胺酶 - Google Patents

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张显
杨套伟
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Abstract

本发明公开了一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程领域。本发明的突变体是在SEQ？ID？N0.2所示的氨基酸的基础上，将第166位丝氨酸突变成丙氨酸。本发明得到的突变体在枯草芽孢杆菌中表达，摇瓶发酵24h后酶活为657.1U/mL，突变酶活提高了23％，底物亲和力较原始酶降低20％，催化效率提高8.4％，同时比酶活提高25％。本发明表明166位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。

Description

一种定点突变改造的基因工程L-天冬酰胺酶
技术领域
本发明涉及一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
L-天冬酰胺酶(L-asparaginaseamidohydrolase，E.C.3.5.1.1)能够将L-天冬酰胺水解脱氨基形成L-天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶具有抗肿瘤活性，目前已应用于治疗急性淋巴细胞白血病及霍金森病等，近年来研究发现L-天冬酰胺酶还可以减少油炸食品中丙烯酰胺的生成。L-天冬酰胺酶大小、结构及性质因来源不同而有所不同。L-天冬酰胺酶来源比较广泛，豚鼠血清、植物以及微生物中都发现含有L-天冬酰胺酶。
本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)的L-天冬酰胺酶分子结构、提高酶活。
异源表达L-天冬酰胺酶突出的问题是，蛋白表达量低、L-天冬酰胺酶酶活低。因此，定点突变改造L-天冬酰胺酶，提高胞外酶活，对于提高L-天冬酰胺酶工业化应用前景具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法。
本发明提供一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是SEQIDN0.1所示的序列。
所述突变体的核苷酸序列是SEQIDN0.3所示的序列。
所述突变体是在如序列SEQIDN0.2所示的氨基酸的基础上，将166位氨基酸由丝氨酸突变成丙氨酸。
前期研究工作中，本研究团队已获得一种产L-天冬酰胺酶的枯草芽孢杆菌工程菌，该枯草芽孢杆菌表达核苷酸序列如SEQIDN0.4所示的L-天冬酰胺酶。
所述编码SEQIDN0.2所示氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDN0.4所示的序列。
本发明还提供一种表达所述L-天冬酰胺酶突变体的基因工程菌。
所述基因工程菌的制备方法，是在SEQIDN0.4所示序列的基础上，将第166位的丝氨酸突变成了丙氨酸，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
所述表达载体是pMA5。
所述的制备方法，具体是:
(1)以SEQIDN0.4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQIDN0.5所示)，Rlprimer(序列如SEQIDN0.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDN0.3所示的重组基因S166A。
(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-S166A，重组质粒化转化B.subtilis168，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌株，命名为pMA5-S166A/B.subtilis168。
本发明在天然L-天冬酰胺酶的基础上，通过定点突变生物技术改造L-天冬酰胺酶分子结构，得到一株酶活提高的L-天冬酰胺酶工程菌，比酶活较原始酶提高25％。突变体酶S166Aansz的底物亲和力较原始酶降低20％，而催化效率提高8.4％。本发明表明166位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。
具体实施方式
实施例1含L-天冬酰胺酶突变体的重组载体的构建
(1)S166A突变体的获得：以SEQIDN0.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQIDN0.5所示),Rprimer(序列如SEQIDN0.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDN0.3所示的重组基因。
(2)将重组基因与pMA5分别用BamHI、MluI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pMA5-S166A。测序工作由上海生工完成。
实施例2产L-天冬酰胺酶枯草芽孢杆菌工程菌构建
将实施例1得到的重组质粒pMA5-S166A化学法转化入B.subtilis168感受态细胞，具体方法如下：
(1)转化实验所需溶液如下(g/L)：
Sp-A：(NH4)2SO44，K2HPO428，柠檬酸钠12Sp-B：MgSO4·7H2O0.4
100×CAYE：Casaminoacid20，酵母粉100SpI培养基：Sp-A49％，Sp-B49％，50％葡萄糖2％，100×CAYE2％SpII培养基：SpI培养基98％，50mmol/LCaCl21％，250mmol/LMgCl21％。115℃湿热灭菌。
(2)将B.Subtilis168的单菌落接种至2mLSpI培养基中(50mL离心管)，37℃、200r/min培养过夜；
(3)取100μL培养液至5mLSpI培养基中，37℃、200r/min培养至对数期(OD600值为1左右)，约4～5h；
(4)取200μL培养液至2mLSpII培养基中，37℃、200r/min培养90min，取出后加入20μL10mmol/LEGTA，于37℃、200r/min继续培养10min，然后分装成500μL每管，加入5μL重组质粒pMA5-S166A，混匀，37℃、200r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌pMA5-S166A/B.subtilis168。
实施例3：重组菌pMA5-S166A/B.subtilis168L-天冬酞胺酶高效表达及酶活测定。
(1)将实施例2构建的重组菌pMA5-S166A/B.subtilis168与原始菌株pMA5-ansz/B.subtilis168分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于枯草芽抱杆菌发酵培养基中，37℃培养24h，取发酵液于4℃,10000r/min离心l0min,上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。
(2)枯草芽抱杆菌发酵培养基:大豆蛋白胨10g/L,K2HPO42.3g/L,KH2PO41.7g/L,玉米浆15g/L，尿素3g/L，葡萄糖40g/L，MgSO40.75g/L,NaCl5g/L。调节pH6.8-7.0。
(3)酶活定义:在40℃，pH7.5反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酞胺转化为1μmolNH3所需要的酶量为一个酶活单位。
(4)L-天冬酰胺酶酶活测定方法：以L-天冬酰胺为底物，通过测定在催化反应中释放的NH3的量来测定酶活。反应混合物(1mL)组成为：400μL25mML-天冬酰胺(溶解于50mMpH7.5Tris-HCl)；400μL50mMpH7.5Tris-HCl；100μL适当浓度的酶溶液。反应混合物在40℃，pH7.5条件下，反应15min后，加入100μL15％(W/V％)三氯乙酸溶液终止反应。以酶反应前加入三氯乙酸终止反应的反应液作为空白对照。反应混合物在20000g条件下离心10min,取200uL上清液加入到4.8mL的去离子水中。向上述体系中加入200μL的奈斯勒试剂，测定在450nm波长下测吸光度，通过显色反应测酶反应所释放的NH3的量。
(5)结果表明重组菌pMA5-S166A/B.subtilis168表达的L-天冬酰胺酶酶活为657.1U/mL，比原始菌株pMA5-ansz/.subtilis168(534.2U/mL)L-天冬酰胺酶酶活提高23％。
(6)分析纯化后的重组L-天冬酰胺酶S166Aansz酶学性质，如表1,底物亲和力较原始酶降低20％，催化效率提高8.4％，同时比酶活提高25％。由于催化效率的提高，增加了S166Aansz的比酶活。
表1S166Aansz反应动力学参数
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列SEQIDN0.1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是在如序列SEQIDN0.2所示的氨基酸的基础上，将第166位丝氨酸突变成丙氨酸。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的核苷酸序列是SEQIDN0.3所示的序列。
4.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述编码SEQIDN0.2所示氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDN0.4所示的序列。
5.一种含有权利要求1所述突变体的重组表达载体。
6.一种表达权利要求1所述L-天冬酰胺酶突变体的基因工程菌。
7.一种权利要求6所述基因工程菌的制备方法，是在SEQIDN0.4所示序列的基础上，将第166位丝氨酸突变成丙氨酸，得到重组基因，将重组基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体是:(1)以SEQIDN0.4所示核酸序列为模板，序列如SEQIDN0.5所示的Fprimer、序列如SEQIDN0.6所示的Rprimer为引物，进行PCR，即得到编码的166位氨基酸由丝氨酸突变成丙氨酸S166A突变体基因序列；(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-S166A，重组质粒化转化B.Subtilis，获得重组枯草芽孢杆菌基因工程菌。
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