CN104862264A - 一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，属于生物技术领域。本发明成功实现了大肠杆菌内aspC、tyrB和ilvE基因的敲除，从而阻断了细胞对产物PPA的降解，进一步提高了胞外转化L-苯丙氨酸的产量，PPA的产量可达3.9g/L。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成PPA的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产PPA的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产PPA，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。

Description

一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌

技术领域

本发明涉及一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，属于生物技术领域。

背景技术

α-苯丙酮酸(PPA)有很多应用，可用来合成抗肿瘤药物的杂环化合物，可作为抗氧化剂及促进伤口愈合。是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性药物中间体。PPA还可用于制备苯乳酸，苯乳酸可作为抗菌物质。目前PPA生产主要是化学合成法，主要包括：乙酰氨基肉桂酸水解法、乙内酰脲与苯甲醛合成法和海因法。这些方法均需经过多步反应，对反应条件有较高要求，例如高压、高温等，产品得率低，对后期分离纯化加大了难度，易产生有毒有害产物。酶和全细胞生物催化剂越来越多的用于工业化生产。

L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应α-酮酸和氨，多为黄素蛋白，二聚体结构。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存在。Proteus mirabilis KCTC2566有两种L-氨基酸脱氨酶，一种具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性；另一种具有底物限制性，只对碱性氨基酸具有催化活性，尤其是L-组氨酸。大部分细菌L-氨基酸脱氨酶是胞外分泌型，但是P.mirabilis中两种L-氨基酸脱氨酶都是膜蛋白。

全细胞转化相比分离酶具有如下优势：易制备，成本低；更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；无污染，副产物少。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化PPA生产。之前的研究中我们已经成功构建了大肠杆菌全细胞催化剂，表达来源于P.mirabilis KCTC2566的脱氨酶基因，PPA的产量为3.3g/L。本发明旨在进一步提高PPA产量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，解除了菌株本身对PPA的降解，从而提高胞外转化L-苯丙氨酸的效率。

所述重组菌是将重组表达了L-氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的aspC(编码天冬氨酸转氨酶，GeneID 8182318)、tyrB(编码芳香族氨基酸转氨酶，GeneID 8179723)和ilvE(编码异亮氨酸转氨酶，GeneID 8182196)基因敲除，从而阻断胞内PPA的分解途径。

所述重组表达了L-氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的构建方法参见发明名称为“一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法”，申请号为201310392427.6的专利申请。

所述aspC、tyrB和ilvE基因敲除方法：PCR扩增aspC、tyrB和ilvE基因上下游约1000bp及抗性标记片段约1000bp，通过融合PCR制备打靶片段。将打靶片段转化大肠杆菌感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株，再用温敏型质粒消去抗性。

本发明还提供一种应用所述重组菌全细胞转化生产α-苯丙酮酸的方法，将L-苯丙氨酸4-6g/L、全细胞催化剂1.2-1.5g/L，在20mM Tris-HCl(pH 8.0)中，于36-37℃、200-220rpm转化6-10h。

所述全细胞催化剂的获得，是将含有L-氨基酸脱氨酶突变体的重组大肠杆菌按1-2％接种量到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当OD₆₀₀达到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达。诱导5h后，8,000rpm低温离心10-15min，收集菌体，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗两遍菌体即得。

发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60-80℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH₂PO₄和72mmol/L K₂HPO₄的溶液(2.31g的KH₂PO₄和12.54g的K₂HPO₄溶于水中，终体积为100mL，高压灭菌)。

在本发明的一种实施方式中，全细胞转化体系为：L-苯丙氨酸4-5g/L，全细胞催化剂1.2-1.5g/L，反应在20mM Tris-HCl(pH 8.0)中进行，37℃，200rpm转化6-10h。

本发明的有益效果：本发明成功实现了大肠杆菌内aspC、tyrB和ilvE基因的敲除，从而阻断了细胞对产物的降解，进一步提高了胞外转化L-苯丙氨酸的产量，PPA的产量可达3.9g/L。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成PPA的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产PPA的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产PPA，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。

具体实施方式

材料与方法

种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，自来水定容至100mL。

发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH₂PO₄和72mmol/LK₂HPO₄的溶液。

PPA含量测定：将转化体系进行离心，弃上清，离心向细胞中加入100μL L-苯丙氨酸(100mM)，30min后，离心，取上清100μL，加入3mL三氯化铁，分光光度计测定640nm的吸光度。

表1 PCR所用引物

注：下划线标示的核苷酸代表融合PCR的同源序列。

实施例1 aspC、tyrB和ilvE基因的敲除

此前，我们通过大肠杆菌表达L-氨基酸脱氨酶基因，得到一株重组表达L-氨基酸脱氨酶的重组大肠杆菌，此重组大肠杆菌可用于全细胞转化L-苯丙氨酸生产PPA，参见发明名称为“一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法”，申请号为201310392427.6的专利申请，以此重组大肠杆菌基因组DNA为模板，以aspC-Left-S和aspC-Left-A、tyrB-Left-S和tyrB-Left-A、ilvE-Left-S和ilvE-Left-A为引物，PCR扩增aspC、tyrB和ilvE基因上游约1000bp，以aspC-Right-S和aspC-Right-A、tyrB-Right-S和tyrB-Right-A、ilvE-Right-S和ilvE-Right-A为引物，PCR扩增aspC、tyrB和ilvE基因下游约1000bp。

以pKD13为模板，以aspC-Middle-S和aspC-Middle-A、tyrB-Middle-S和tyrB-Middle-A、ilvE-Middle-S和ilvE-Middle-A为引物，扩增抗性标记片段约1000bp。将各待敲除基因上下游片段及抗性标记片段分别进行融合PCR。融合PCR片段转化大肠杆菌，同源重组，卡纳抗性筛选转化子。温敏型质粒pCP20转化阳性转化子，消除卡纳抗性。通过42℃培养12h，丢失温敏型质粒pCP20。逐个敲除各个基因，从而得到了敲除aspC、tyrB和ilvE基因的菌株。

实施例2 全细胞催化剂的制备及全细胞转化过程

实施例1中的敲除aspC、tyrB和ilvE后的重组大肠杆菌接种种子培养基(含氨苄青霉素10mg/L)，37℃，200rpm过夜培养。发酵在3LNBS发酵罐中进行，1％接种量到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当OD₆₀₀达到0.6，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达。诱导5h后，8,000rpm低温离心10min，收集菌体，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗两遍菌体。全细胞转化体系为：L-苯丙氨酸4g/L，全细胞催化剂1.2g/L，反应在20mM Tris-HCl(pH 8.0)中进行，37℃，200rpm转化24h。

野生型、基因单敲除、基因两两敲除、三个基因同时敲除的菌株，全细胞转化PPA产量见表1。其中敲除aspC、tyrB和ilvE三个基因后的重组大肠杆菌，其PPA的产量可达3.9g/L；未敲除aspC、tyrB和ilvE的重组大肠杆菌，其PPA的产量为3.3g/L。

表1

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，其特征在于，是将重组表达了L-氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的编码天冬氨酸转氨酶的基因aspC、编码芳香族氨基酸转氨酶的基因tyrB和编码异亮氨酸转氨酶的基因ilvE进行敲除，解除了菌株本身对PPA的降解。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所示aspC的序列如GeneID 8182318所示，tyrB的序列如GeneID 8179723所示，ilvE的序列如GeneID 8182196所示。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组表达了L-氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的构建方法参见发明名称为一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法，申请号为201310392427.6的专利申请。

4.一种构建权利要求1-3任一所述重组菌的方法，其特征在于，PCR扩增aspC、tyrB和ilvE基因上、下游各约1000bp的核苷酸及抗性标记片段，通过融合PCR制备打靶片段，将打靶片段转化大肠杆菌感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株，再消去抗性。

5.一种应用1-3任一所述重组菌全细胞转化生产α-苯丙酮酸的方法，其特征在于，将L-苯丙氨酸4-6g/L、全细胞催化剂1.2-1.5g/L，在pH 8.0的20mM Tris-HCl中，于36-37℃、200-220rpm转化6-10h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化剂的获得，是将重组大肠杆菌按1-2％接种量到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当OD₆₀₀达到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达，诱导5h后，8,000rpm低温离心10-15min，收集菌体，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗两遍菌体即得。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，各组分溶解后高压灭菌，冷却到60-80℃，再加100mL灭菌的17mmol/LKH₂PO₄和72mmol/L K₂HPO₄的溶液。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，全细胞转化体系为：L-苯丙氨酸4-5g/L，全细胞催化剂1.2-1.5g/L，反应在pH 8.0的20mM Tris-HCl中进行，37℃，200rpm转化6-10h。