CN105647846B - 一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转化生产α‑苯丙酮酸效率提高的重组菌，属于生物技术领域。本发明成功实现了大肠杆菌内L‑氨基酸脱氨酶和卤化酶的共表达，提高了辅酶再生，PPA的产量可达18.3g/L。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成PPA的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产PPA的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产PPA，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。

Description

一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌
技术领域
本发明涉及一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，属于生物技术领域。
背景技术
α-苯丙酮酸(PPA)有很多应用，可用来合成抗肿瘤药物的杂环化合物，可作为抗氧化剂及促进伤口愈合。目前PPA生产主要是化学合成法，这些方法均需经过多步反应，对反应条件有较高要求，易产生有毒有害产物。酶和全细胞生物催化剂越来越多的用于工业化生产。
L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应α-酮酸和氨。Proteus mirabilis KCTC2566中L-氨基酸脱氨酶具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性。
全细胞转化相比分离酶具有很多优势，如易制备，更稳定，无污染，副产物少。通过构建表达来源于P.mirabilis KCTC2566的脱氨酶基因的大肠杆菌，并以之为全细胞催化剂转化L-苯丙氨酸生产PPA，PPA的产量可以达到10.0g/L。但是，这个全细胞催化的氧化脱氨基反应需要辅酶FAD作为电子载体，FAD的胞内再生系统需要多酶催化，效率低；而FAD价格昂贵，不宜外源添加，因此需要构建一种一步再生系统，以促进转化效率。
现有的FAD再生系统包括电化学再生、化学再生、酶法再生，这些方法的缺陷是生成H2O2、酶失活、选择性低、共底物有毒性等。因此需要一种温和、简单、低成本、高效率的FAD再生方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，通过加强重组大肠杆菌的辅酶FAD再生系统，从而提高全细胞转化L-苯丙氨酸生产苯丙酮酸的产量和效率。
所述重组菌是共表达L-氨基酸脱氨酶和卤化酶的大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，编码所述L-氨基酸脱氨酶的基因aad的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述卤化酶的基因rebH的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，以表达载体pRSFDuet-1共表达L-氨基酸脱氨酶和卤化酶。
在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建是通过PCR扩增rebH和aad，克隆到质粒pRSFDuet-1，构建重组质粒pRSFDuet-AAD-RebH，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组大肠杆菌全细胞催化剂。
本发明还提供一种应用所述重组菌转化生产α-苯丙酮酸的方法，是将重组菌作为全细胞催化剂。
在本发明的一种实施方式中，是将L-苯丙氨酸20-30g/L、全细胞催化剂4-6g/L、L-色氨酸1-2g/L，在pH 8.0的0.9％的NaCl溶液中，于36-37℃、200-220rpm转化6-10h。
在本发明的一种实施方式中，所述是全细胞催化剂的获得，是将重组菌培养后诱导其表达L-氨基酸脱氨酶和卤化酶，进一步收集重组菌菌体得到。
在本发明的一种实施方式中，所述是全细胞催化剂的获得，是将共表达L-氨基酸脱氨酶和卤化酶的重组大肠杆菌按1-2％接种量到50mL发酵培养基中，37℃培养，当OD600达到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶和卤化酶表达，28℃诱导24h后，8,000rpm低温离心10-15min，收集菌体，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗两遍菌体即得。
在本发明的一种实施方式中，诱导重组菌发酵产酶的发酵培养基组成为：蛋白胨12g/100mL，酵母提取物24g/100mL，甘油4mL/100mL。各组分溶解后高压灭菌，冷却到60-80℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g的K2HPO4溶于水中，终体积为100mL，高压灭菌)。
本发明的有益效果：本发明成功实现了大肠杆菌内L-氨基酸脱氨酶和卤化酶的共表达，卤化酶以L-色氨酸为底物催化其加氯的过程消耗FADH2生成FAD，提高了FAD再生效率，从而提高了全细胞转化效率，PPA产量可达18.3g/L。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成PPA的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产PPA的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产PPA，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。
具体实施方式
材料与方法
种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，自来水定容至100mL。
发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解于1L去离子水中后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
PPA含量测定：将转化体系进行离心，弃上清，离心向细胞中加入100μL L-苯丙氨酸(100mM)，30min后，离心，取上清100μL，加入3mL三氯化铁，分光光度计测定640nm的吸光度。
表1PCR所用引物
实施例1rebH和aad基因的克隆及重组全细胞催化剂构建
合成得到aad基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，进一步经BamHI和Hind III双酶切后，克隆到质粒pRSFDuet-1的多克隆1位点，构建重组质粒pRSFDuet-AAD。以Lechevalieria aerocolonigenes基因组为模板，以rebH-MCS2-S和rebH-MCS2-A为引物，PCR扩增rebH基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。PCR产物经NdeI和XhoI双酶切后，克隆到质粒pRSFDuet-AAD的多克隆2位点，构建质粒pRSFDuet-AAD-RebH。重组质粒pRSFDuet-AAD和pRSFDuet-AAD-RebH转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建BL21(pRSFDuet-AAD)和BL21(pRSFDuet-AAD-RebH)。
实施例2全细胞催化剂的制备及全细胞转化过程
实施例1中的共表达L-氨基酸脱氨酶和卤化酶后的重组大肠杆菌接种种子培养基(含卡纳青霉素10mg/L)，37℃，200rpm过夜培养。发酵在500mL三角瓶中进行，1％接种量到50mL发酵培养基中，37v培养，当OD600达到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶和卤化酶表达，28℃诱导24h后，8,000rpm低温离心10-15min，收集菌体，用20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液洗两遍菌体即得。
全细胞转化体系为：将L-苯丙氨酸20-30g/L、全细胞催化剂4-6g/L、L-色氨酸1-2g/L，在pH 8.0的0.9％NaCl中，于36-37℃、200-220rpm转化6-10h。BL21(pRSFDuet-AAD)和BL21(pRSFDuet-AAD-RebH)菌株全细胞转化PPA产量分别为10.0g/L和18.3g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，其特征在于，是以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主，以表达载体pRSFDuet-1共表达L-氨基酸脱氨酶和卤化酶，加强辅酶FAD再生；编码所述L-氨基酸脱氨酶的基因aad的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述卤化酶的基因rebH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种构建权利要求1所述重组菌的方法，其特征在于，PCR扩增编码L-氨基酸脱氨酶和卤化酶的基因，克隆到质粒pRSFDuet-1，构建重组质粒pRSFDuet-AAD-RebH，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
3.一种应用权利要求1所述重组菌转化生产α-苯丙酮酸的方法，其特征在于，将重组菌作为全细胞催化剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，是将L-苯丙氨酸20-30g/L、全细胞催化剂4-6g/L、L-色氨酸1-2g/L，在pH 8.0的0.9％的NaCl溶液中，于36-37℃、200-220rpm转化6-10h。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化剂是通过培养重组菌使其表达L-氨基酸脱氨酶和卤化酶，进一步收集重组菌菌体得到的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将重组大肠杆菌按1-2％接种量到50mL发酵培养基中，37℃培养，当OD600达到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶和卤化酶表达，28℃诱导24h后，8000rpm低温离心10-15min，收集菌体，用pH为8的20mM Tris-HCl缓冲液洗两遍菌体即得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，诱导重组菌发酵产酶的发酵培养基组成为：蛋白胨12g/100mL，酵母提取物24g/100mL，甘油4mL/100mL；各组分溶解后高压灭菌，冷却到60-80℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
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