CN106868030A - 重组载体、含有其的工程菌及在产α-酮戊二酸的应用 - Google Patents

重组载体、含有其的工程菌及在产α-酮戊二酸的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种重组载体，含有L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。本发明还提供了一种产α-酮戊二酸的基因工程菌，包含宿主菌及导入所述宿主菌的含有目的基因的重组载体，所述目的基因为L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。另提供了所述基因工程菌的制备方法及应用。含有本发明重组载体的工程菌可以高效地转化合成α-酮戊二酸。本发明的生产方法所用原料相对低廉，工艺简单，生产效率高，易于工业化大规模生产。

Description

重组载体、含有其的工程菌及在产α-酮戊二酸的应用
技术领域
本发明总地涉及基因工程领域，更具体地涉及重组载体、含有其的工程菌及在产α-酮戊二酸的应用。
背景技术
α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)作为一种重要的短链羧酸分子，是三羧酸循环中重要的代谢中间产物。它具有广泛的应用前景，可以被广泛应用于医学领域，减轻肾病患者的肾脏负担、减少并发症和促进患者手术后快速恢复；也可以应用于食品保健，α-酮戊二酸与精氨酸等氨基酸复配，能快速帮助运动员补充能量。除此以外，由于α-酮戊二酸特殊的化学性质，被广泛用于化学合成行业。
α-酮戊二酸目前的合成方法主要有：化学合成法，微生物发酵法，酶法。
化学合成法生产α-酮戊二酸，虽然具有收率高、原料易得的特点，但反应过程中大量有机溶剂的使用，以及多步复杂的合成反应过程中会产生大量副产物从而增加分离成本，使得化学合成法总成本偏高、对环境不友好。因此近年来采用生物法来生产α-酮戊二酸的报道越来越多。
微生物发酵法生产α-酮戊二酸，相对于化学法，具有环境友好等特点，是研究报道的热点。1968年，Finogenova等利用液体石蜡生产微生物蛋白时发现解脂亚洛酵母Yarrowia lipolytica能够积累α-KG。1969年，Tanaka等发现石蜡节杆菌Arthrobacter paraffineus能利用石蜡积累高达70g/L的α-KG。江南大学的陈坚等人利用重组菌发酵生产α-酮戊二酸，发酵时长48-72h，α-酮戊二酸产量达到18.6g/L(发明专利公开号CN101245323A)；另一篇专利中经过工艺和菌种的改进，α-酮戊二酸产量达到31.7g/L(发明专利公开号CN101717735A)；经过进一步改进的方案，α-酮戊二酸产量达到47.2g/L，发酵时长144h(发明专利公开号CN102586128A)。天津科技大学的陈宁等人利用谷氨酸棒杆菌发酵生产α-酮戊二酸，发酵32h，α-酮戊二酸产量最高可达47.2g/L(发明专利公开号CN102391977A)。可以看出，生物发酵也有其缺点：生产周期长，产量低，产品与发酵液中多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂，总成本偏高。
酶合成法，目前合成α-酮戊二酸的酶主要有L-谷氨酸脱氢酶(GDH)、L-氨基酸氧化酶(LAAO)和L-谷氨酸氧化酶(LGOX)。以上3种酶都是利用L-谷氨酸盐为底物，生成α-酮戊二酸，其中，L-氨基酸氧化酶对底物的专一性不强，产物α-酮戊二酸会抑制L-氨基酸氧化酶的活性；L-谷氨酸脱氢酶需要外源性添加NAD+或NADP+，而且L-谷氨酸脱氢酶更倾向于分解α-酮戊二酸；相比之下，L-谷氨酸氧化酶对底物专一性强，无需添加辅因子，仅产生NH3与H2O2，而且L-谷氨酸氧化酶在确定温度和pH下能长时间保持活性，是目前为止最高效的合成方法。目前酶法转化生成α-酮戊二酸最高产量为：2014年Panqing Niu等利用重组L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶24h催化110g/L谷氨酸盐生成104g/Lα-酮戊二酸。但是转化时间较长，工艺相对复杂，需要纯化酶，或者固定化酶等，会增加α-酮戊二酸的生产成本。因此迫切需要构建高效率、安全、工艺简单、低成本的α-酮戊二酸基因工程菌株，以满足工业化生产α-酮戊二酸的需求。
近年来采用全细胞催化剂来生产精细化工产品是非常高效的方法，相比较发酵法，具有生产周期短，效率高，产物相对单一的优点。相比较于酶法来说，工艺简单，无需纯化酶和固定化酶。2014年江南大学的陈坚等人(中国发明专利申请号201410132063.2)，采用全细胞转化生产α-酮戊二酸的方法，但是由于其采用的L-谷氨酸氧化酶的催化性质不够好,且转化率低，在24h内，转化率只有59.6％,产量为7.7g/L。
综上所述，本领域迫切需要构建一种高效生产α-酮戊二酸的方法。
发明内容
本发明提供了一种重组载体、含有其的工程菌及在产α-酮戊二酸的应用，含有本发明重组载体的工程菌可以高效地转化合成α-酮戊二酸。
本发明的一个方面，提供了一种重组载体，其中，含有L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。
以上所述的重组载体，其中，所述重组载体为将所述L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因插入合适的表达载体上得到的重组载体。所述合适的表达载体可以为本领域的各种常规载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
以上所述的重组载体，其中，所述合适的表达载体为质粒；优选地，所述质粒为pBAD-hisB。
本发明的另一个方面，提供一种产α-酮戊二酸的基因工程菌，包含L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。
以上所述的基因工程菌，其中，所述基因工程菌为将含有L-谷氨酸氧化酶编码基因和过氧化氢酶编码基因的重组载体导入宿主菌得到的。
以上所述的基因工程菌，其中，所述宿主菌为能使所述重组表达载体稳定地自行复制且其携带的L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因可被有效表达的常规宿主细胞；优选地，所述宿主菌为大肠杆菌或大肠杆菌的基因敲除突变体。
以上所述的基因工程菌，其中，所述大肠杆菌的基因敲除突变体为将大肠杆菌中α-酮戊二酸脱氢酶E1基因敲除后获得的大肠杆菌。
以上所述的基因工程菌，其中，所述L-谷氨酸氧化酶的编码基因来源于茂源链霉菌Streptomyces mobaraesis，所述过氧化氢酶的编码基因来源于Proteus mirabilis。
以上所述的基因工程菌，其中，所述L-谷氨酸氧化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的基因或与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的基因，所述过氧化氢酶的编码基因的核苷酸为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的基因或与与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的基因。
以上所述的基因工程菌，其中，所述L-谷氨酸氧化酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质，或与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质；
所述过氧化氢酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质，或SEQID NO：3经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质。
本发明的再一个方面，提供一种产α-酮戊二酸的基因工程菌的制备方法，其中，包括如下步骤：将以上任一所述的重组载体导入到宿主菌中。
以上所述的制备方法，其中，所述宿主菌为大肠杆菌或大肠杆菌的基因敲除突变体。
以上所述的制备方法，其中，所述大肠杆菌的基因敲除突变体为将大肠杆菌中α-酮戊二酸脱氢酶E1基因敲除后获得的大肠杆菌。
以上所述的制备方法，其中，所述重组载体中的L-谷氨酸氧化酶的编码基因来源于茂源链霉菌Streptomyces mobaraesis，所述重组载体中的所述过氧化氢酶的编码基因来源于Proteus mirabilis。
以上所述的制备方法，其中，所述L-谷氨酸氧化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的基因或与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的基因，所述过氧化氢酶的编码基因的核苷酸为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的基因或与与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的基因。
以上所述的制备方法，其中，所述L-谷氨酸氧化酶为氨基酸序列为SEQID NO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质；
所述过氧化氢酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质，或SEQID NO：3经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质。
本发明的又一个方面，提供一种产α-酮戊二酸的方法，其中，利用以上任一所述的基因工程菌催化L-谷氨酸或其盐来生成α-酮戊二酸。
本发明所提供的产α-酮戊二酸的基因工程菌，主要通过优选了L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶在菌体内共表达，在细胞内L-谷氨酸氧化酶对L-谷氨酸或其盐进行催化氧化反应，生成α-酮戊二酸的同时会生产过氧化氢，过氧化氢的积累会对L-谷氨酸氧化酶造成损伤，本发明在菌体内表达过氧化氢酶可用于消除过氧化氢，从而消除对L-谷氨酸氧化酶造成的损伤，提高α-酮戊二酸的产量。同时也消除了产物抑制，可以高效的转化合成α-酮戊二酸。同时敲除了sucA的基因，减少了α-酮戊二酸消耗的途径。利用本发明的工程菌生产α-酮戊二酸，所用原料相对低廉，工艺简单，生产效率高，易于工业化大规模生产。
附图说明
图1为α-酮戊二酸的合成示意图；
图2为重组载体pBAD-CSM的示意图；
图3为本发明实施例3中α-酮戊二酸标准品和谷氨酸钠标准品的HPLC检测图谱；
图4为本发明实施例中转化产物的HPLC检测图谱；
图5为本发明实施例2中生产α-酮戊二酸的基因工程菌种L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的蛋白电泳检测结果；
图6为本发明实施例中不同全细胞催化剂生产α-酮戊二酸转化率示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中的L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的来源菌株的详细信息如下：
SM LGOX来源于茂源链霉菌Streptomyces mobaraesis的L-谷氨酸氧化酶编码基因，下文简写为SM，氨基酸序列为SEQ ID NO：1，核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
SS LGOX来源于链霉菌Streptomyces sp.的L-谷氨酸氧化酶编码基因，下文简写为SS，氨基酸序列为SEQ ID NO：5，核苷酸序列为SEQ ID NO：6。
KS LGOX来源于Kitasatospora setae的L-谷氨酸氧化酶基因，下文简写为KS，氨基酸序列为SEQ ID NO：7，核苷酸序列为SEQ ID NO：8。
Catalase来源于Proteus mirabilis的过氧化氢酶基因，下文简写为C，氨基酸序列为SEQ ID NO：3，核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
实施例1产α-酮戊二酸的基因工程菌表达载体pBAD-CSS；pBAD-CSM，pBAD-CKS以及相应菌株的构建
一、构建重组质粒
构建表达来源于茂源链霉菌Streptomyces mobaraesis的L-谷氨酸氧化酶基因和来源于Proteus mirabilis的过氧化氢酶的重组质粒pBAD-CSM。
委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成来源于茂源链霉菌Streptomycesmobaraesis的L-谷氨酸氧化酶基因和来源于Proteus mirabilis的过氧化氢酶基因。合成后的基因两端分别带有XhoI和SpeI酶切位点。设计两对引物，第一对上游引物为：5’-cgatgacgataaggatccgagctcgaggaaaaaaagaaactgaccaccgcagc-3’和下游引物5’-gcggtagatttctcgagactagtttatttcgcatctttgccttcgaggac-3’。第二对上游引物为：5’-gcaaagatgcgaaataaactagtctcgagaaatctaccgctgactgggacacc-3’和下游引物5’-cccatatggtaccagctgcagatactagtttacgctaaatgagcttccagcg-3’。
以合成后的Streptomyces mobaraesis的L-谷氨酸氧化酶基因DNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到大小为1866bp的PCR扩增产物1。以合成后的Proteus mirabilis的过氧化氢酶基因DNA为模板，用第二对引物进行PCR扩增，得到大小为1454bp的PCR扩增产物2。
用XhoI和speI酶可商业化购买的pBAD-hisB(购买自Invitrogen公司)载体。利用Gibson Assembly法(GIBSON D G.Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides[J].Nucleic Acids Res,2009,37(20):6984-6990.)连接扩增产物1、2和酶切后的pBAD载体，得到重组载体1。测序重组载体1，其为将序列表中SEQ IDNO：2所示的L-谷氨酸氧化酶基因和序列表SEQ ID NO：4所示过氧化氢酶基因替换pBAD-hisB载体XhoI和speI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体。将该重组载体1命名为pBAD-CSM(如图2所示)，编码L-谷氨酸氧化酶与过氧化氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3。
二、构建对照质粒
1、构建表达来源于链霉菌Streptomyces sp.的L谷氨酸氧化酶基因和来源于Proteus mirabilis的过氧化氢酶基因对照质粒pBAD-CSS
委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成来源于Streptomyces sp.的L-谷氨酸氧化酶基因和来源于Proteus mirabilis的过氧化氢酶基因。合成后的基因两端分别带有XhoI和SpeI酶切位点。设计两对引物，第一对上游引物为：5’-cgatgacgataaggatccgagctcgaggaaaaaaagaaactgaccaccgc-3’和下游引物5’-cgttcatggtatatctccttctcgagactagtttatttcgcatctttgccttcgaggac-3’。第二对上游引物为：5’-gcaaagatgcgaaataaactagtctcgagaaggagatataccatgaacg-3’和下游引物5’-cccatatggtaccagctgcagatactagtttaagaggtcagagcttcttcacgc-3’。
以合成后的Streptomyces sp.的L-谷氨酸氧化酶基因DNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到大小为2073bp的PCR扩增产物3。以合成后的Proteus mirabilis的过氧化氢酶基因DNA为模板，用第二对引物进行PCR扩增，得到大小为1454bp的PCR扩增产物4。
用XhoI和speI酶切pBAD-hisB(购自Invitrogen公司)载体。利用GibsonAssembly法连接扩增产物3、4和酶切后的pBAD载体，得到重组载体2。测序重组载体2，其为将序列表中SEQ ID NO：6所示的L-谷氨酸氧化酶基因和序列表SEQ ID NO：4所示过氧化氢酶基因替换pBAD载体XhoI和speI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体。将该重组载体2命名为pBAD-CSS，编码L-谷氨酸氧化酶与过氧化氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：3。
2、构建表达来源于Kitasatospora setae的L-谷氨酸氧化酶基因和来源于Proteus mirabilis的过氧化氢酶基因对照质粒pBAD-CKS
委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成来源于Kitasatospora setae的L-谷氨酸氧化酶基因和来源于Proteus mirabilis的过氧化氢酶基因。合成后的基因两端分别带有XhoI和Spe1酶切位点。设计两对引物，第一对上游引物为：5’-gacgataaggatccgagctcgaggaaaaaaagaaactgaccaccg-3’和下游引物5’-gccagagcagctgcggtcatctcgagactagtttatttcgcatctttgcc-3’。第二对上游引物为：5’-gcaaagatgcgaaataaactagtctcgagatgaccgcagctgctctggc-3’和下游引物5’-ggtaccagctgcagatactagtttagccaccagtcagttgcacg-3’。
以合成后的Kitasatospora setae的L-谷氨酸氧化酶基因DNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到大小为1845bp的PCR扩增产物5。以合成后的Proteus mirabilis的过氧化氢酶基因DNA为模板，用第二对引物进行PCR扩增，得到大小为1454bp的PCR扩增产物6。
用XhoI和speI酶切pBAD载体。利用Gibson Assembly法连接扩增产物3、4和酶切后的pBAD载体，得到重组载体3。测序重组载体3，其为将序列表中SEQ ID NO：8所示的L-谷氨酸氧化酶基因和序列表SEQ IDNO：4所示过氧化氢酶基因替换pBAD载体XhoI和speI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体。将该重组载体3命名为pBAD-CKS，编码L-谷氨酸氧化酶与过氧化氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：3。
三、构建产α-酮戊二酸的基因工程菌
1、构建基因工程菌TY001
将上述制备的重组载体pBAD-CSM用氯化钙法转化大肠杆菌sucA缺失突变体BW25113-sucA(购买自武汉淼灵生物科技有限公司)，得到产α-酮戊二酸的基因工程菌pBAD-CSM/sucA，命名为TY001。
2、构建基因工程菌TY002
将上述制备的重组载体pBAD-CSM用氯化钙法转化大肠杆菌BW25113(购买自武汉淼灵生物科技有限公司)，得到产α-酮戊二酸的基因工程菌pBAD-CSM/BW，命名为TY002。
3、构建基因工程菌TY003
将上述制备的重组载体pBAD-CSS用氯化钙法转化大肠杆菌BW25113，得到产α-酮戊二酸的基因工程菌pBAD-CSS/BW，命名为TY003。
4、构建基因工程菌TY004
将上述制备的重组载体pBAD-CKS用氯化钙法转化大肠杆菌BW25113，得到产α-酮戊二酸的基因工程菌pBAD-CKS/BW，命名为TY004。
实施例2、α-酮戊二酸的制备和检测
采用实施例1获得的基因工程菌为催化剂去生产α-酮戊二酸，生产方法：
一、制备α-酮戊二酸
1、将基因工程菌TY001接种到含有50μg/mL链霉素的液体2YT培养基中，37℃培养至OD为0.8加0.2mM阿拉伯糖诱导，30℃诱导16小时后，收集诱导产物，于4℃，8000转/min，离心15min,收集菌体。
2、YT配方如下：0.5％NaCl、1％酵母抽提物、1.6％胰蛋白胨和水混匀，得到2YT。
将上述菌体(即细胞)、L-谷氨酸钠、TritonX-100加入去离子水中混匀，得到混合液；其中，细胞浓度为30OD/ml、L-谷氨酸钠浓度为100g/L、TritonX-100的浓度为0.1％(体积百分含量)；将混合液在30℃，1000rpm/min、催化反应5时，得到转化液。
3、将收集的菌体破碎离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图5所示，(M：Maker；1：TY001全菌；2：TY001上清；3：TY001沉淀)可以看出，TY001可以表达L-谷氨酸氧化酶与过氧化氢酶，说明菌株构建正确。
重组蛋白L-谷氨酸氧化酶蛋白大小为76kDa，重组蛋白过氧化氢酶蛋白大小为54kDa。
4、将上述步骤1得到的转化液于4℃，12000转/分钟，离心5min，取上清。用0.22μM的滤膜过滤上清，收集滤液进行HPLC检测α-酮戊二酸的产量。HPLC采用Agilent ODS C18柱；流动相：pH2.4，0.5％(NH4)2HPO4-H3PO4缓冲液，流速为0.6mL·min-1，柱温40℃，进样量2μl，检测波长233nm。α-酮戊二酸的标准品购自百灵威公司。实验设三次重复，结果取平均值。
TY001结果如图3示，α-酮戊二酸的标准品的保留时间为2.000min。谷氨酸钠标准品的保留时间为1.453min。转化液上清中也有保留时间为2.009min的峰值(见图4)，表明采用谷氨酸钠为底物生成了α-酮戊二酸。
二、全细胞催化剂制备α-酮戊二酸
采用上述1中的方法用TY001、TY001、TY003、TY004菌催化100g/LL-谷氨酸钠，制备α-酮戊二酸，检测α-酮戊二酸。实验设三次重复，取平均值。计算转化率＝(α-酮戊二酸摩尔浓度/L-谷氨酸钠摩尔浓度)*100％。
基因工程菌TY001菌催化100g/L L-谷氨酸钠的生成α-酮戊二酸64.97g/L，转化率为83.3％，TY002菌催化100g/L L-谷氨酸钠的生成α-酮戊二酸59.75g/L，转化率为76.6％，TY003菌催化100g/L L-谷氨酸钠的生成α-酮戊二酸41.34g/L，转化率为53％，TY004菌催化100g/L L-谷氨酸钠的生成α-酮戊二酸33.77g/L，转化率为43.3％，可以看出，TY001转化能力最强，转化率最高。
三、发酵罐或者其它供氧条件好的容器来制备α-酮戊二酸
用发酵罐或者其他供氧条件好的容器进行反应，反应体系含50-150g/L谷氨酸钠,采用30OD/ml TY001的全细胞催化剂，采用5M的氢氧化钠或者盐酸将反应液pH控制在7.0-8.0之间，温度20-45℃，通气量0.5-2vvm，罐压0.01-0.1mpa，通过搅拌速度、罐压和通气量的调节将溶氧量控制在20％以上。转化至溶氧量上升时结束反应，或者是补加20-100g/L的L-谷氨酸钠，使溶氧下降，继续反应直至溶氧量再次上升时再结束反应。
最终通过HPLC测定，计算产量和转化率。
TY001的转化，第一次加100克的L-谷氨酸碱金属盐、L-谷氨酸碱性氨基酸盐、L-谷氨酸铵盐、或其组合，然后等溶氧上升时，再次加入谷氨酸金属盐。最终测定测定产率，α-酮戊二酸生成110g/L，转化率为80％。这表明采用本发明的工程菌和生产方法可以大规模的生产α-酮戊二酸。
本发明的主要优点包括：
(1)原料易得且成本低廉：谷氨酸或谷氨酸的钠盐(即味精)可以从味精工业大量获取，且价格低廉。
(2)工艺简单：不需要纯化酶，直接用一种细胞，共表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶，在一个反应器内一步反应即可制备α-酮戊二酸，不涉及中间步骤和反应，极大地简化了工艺流程，且设备利用率高。
(3)本发明所提供的α-酮戊二酸的合成方法，转化率≥80％，简化了提取工艺，产品浓度可以达到或超过100g/L，生产强度为14g/L/h。这是生物发酵法无法企及的，有利于大规模工业化生产。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (17)

1.一种重组载体，其特征在于，含有L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。
2.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为将所述L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因插入合适的表达载体上得到的重组载体。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述合适的表达载体为质粒；优选地，所述质粒为pBAD-hisB。
4.一种产α-酮戊二酸的基因工程菌，包含L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。
5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为将含有L-谷氨酸氧化酶编码基因和过氧化氢酶编码基因的重组载体导入宿主菌得到的。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为能使所述重组表达载体稳定地自行复制且其携带的L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因可被有效表达的常规宿主细胞；优选地，所述宿主菌为大肠杆菌或大肠杆菌的基因敲除突变体。
7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌的基因敲除突变体为将大肠杆菌中α-酮戊二酸脱氢酶E1基因敲除后获得的大肠杆菌。
8.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述L-谷氨酸氧化酶的编码基因来源于茂源链霉菌Streptomyces mobaraesis，所述过氧化氢酶的编码基因来源于Proteus mirabilis。
9.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述L-谷氨酸氧化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的基因或与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的基因，所述过氧化氢酶的编码基因的核苷酸为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的基因或与与SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的基因。
10.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，
所述L-谷氨酸氧化酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质；
所述过氧化氢酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质，或SEQID NO：3经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质。
11.一种产α-酮戊二酸的基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1至3中任一所述的重组载体导入到宿主菌中。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌或大肠杆菌的基因敲除突变体。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌的基因敲除突变体为将大肠杆菌中α-酮戊二酸脱氢酶E1基因敲除后获得的大肠杆菌。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体中的L-谷氨酸氧化酶的编码基因来源于茂源链霉菌Streptomyces mobaraesis，所述重组载体中的所述过氧化氢酶的编码基因来源于Proteus mirabilis。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述L-谷氨酸氧化酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的基因或与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的基因，所述过氧化氢酶的编码基因的核苷酸为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的基因或与与SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的基因。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述L-谷氨酸氧化酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质；
所述过氧化氢酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质，或SEQID NO：3经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性且具有L-谷氨酸氧化酶活性的蛋白质。
17.一种产α-酮戊二酸的方法，其特征在于，利用权利要求4至10中任一所述的基因工程菌催化L-谷氨酸或其盐来生成α-酮戊二酸。
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