CN110283837A - 一种高酶活性l-谷氨酸氧化酶突变体及其制备方法 - Google Patents

一种高酶活性l-谷氨酸氧化酶突变体及其制备方法 Download PDF

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刘君
李家龙
徐宁
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    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
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    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y104/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
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Abstract

本发明公开了一种高酶活性L‑谷氨酸氧化酶突变体及其制备方法。L‑谷氨酸氧化酶(LGOX)是一种黄素蛋白酶，能够专一地氧化L‑谷氨酸生成α‑酮戊二酸、过氧化氢、氨，但目前来源于链霉菌属的L‑谷氨酸氧化酶活性普遍较低并且稳定性较差，限制了其实际应用。本发明利用易错PCR技术建立突变文库，通过建立文库筛选和定向改造方法，最终获得了酶活性显著提升的含有单个或多个氨基酸突变位点的L‑谷氨酸氧化酶突变体，相关突变体将为开发α‑KG高效生物转化法奠定重要酶资源条件。

Description

一种高酶活性L-谷氨酸氧化酶突变体及其制备方法
技术领域
本发明属于分子酶学领域，涉及一种来源于链霉菌属(Streptomyces X)的L-谷氨酸氧化酶突变体的制备方法。
背景技术
谷氨酸氧化酶(LGOX)是黄素蛋白酶类的一种，能够催化L-谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸、氨、过氧化氢。具有较高酶活性的谷氨酸氧化酶在工业生物应用领域将会有很大的应用空间，例如用于工厂生产、生物传感器、临床生化检测等。1983年，Kamei等首次从浅紫链霉菌H82-N-SY7中得到了一株谷氨酸氧化酶，其相对分子质量为60KDa，且在490nm处有最大吸收波长，每摩尔的酶包含1摩尔的FAD，因此反应过程中不需要添加额外的FAD，该酶对谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸都有相对的作用，因此底物专一性较弱。在pH6.8时，对L-谷氨酰胺和L-组氨酸的相对活性分别为L-谷氨酸的32.1％和13.1％，Km值分别3.3和5.0mM。在pH5.0时，对L-谷氨酸和L-谷氨酰胺的Km值分别为1.1mM和10mM。该酶的稳定性较好，在pH 3.0-7.0范围内，37℃可稳定1小时。Kusakabe等从链霉菌X-119-6分离出了LGOX，其相对分子质量为140KDa，在490nm处有最大吸收波长，每摩尔的酶包含2摩尔的FAD，该酶底物特异性较好，除了谷氨酸外，仅对天冬氨酸有微弱作用，但粗酶液酶活力仅为0.056U/mg。在pH为7-8时有较高的酶活，且在pH＝5.0时，在65℃时处理15min时，剩余活性为原来的100％，而75℃处理时剩余酶活为87％，85℃处理时剩余酶活为47％。Arima等将来源于链霉菌X-119-6的LGOX在大肠杆菌JM109中异源表达并分析了结构，结果得到了酶活提高LGOX，粗酶液的酶活为2.42U/mg，酶比活力比原始菌中提高了43.2倍，但热稳定性迅速降低，该酶在pH为7.4、30℃处理30分钟时，剩余酶活仅为50％。随后，卢婵等又将该来源的LGOX连接到表达载体pET28a上，在大肠杆菌BL21中高效表达，得到了1.1U/mg的粗酶液，后对其酶学性质进行研究，结果表明该酶在37℃时有最高的酶活，将酶在37℃下处理2h，能维持其70％以上的酶活；而在50℃下处理10min，酶活为原来的15％左右，处理30min后，酶活基本丧失，该酶稳定性较差。该酶的最适pH为5.0，Km值为2.12mmol/L，Vmax为1.06μmol/min·mg，对谷氨酸有专一性。
等从内涂链霉菌中分离出一株LGOX，并对其生物学性质做了研究，结果发现该酶的相对分子质量为90KDa，包含两个亚基，每个亚基非共价键结合一个FAD，在457nm处有最大吸收波长，等电点为6.2，在pH＝7.0时，以L-谷氨酸为底物，其Km值为1.1mM，且只对L-谷氨酸有作用，具有很强的底物特异性，在pH为6.5-8.0时，酶活性最高，温度在37℃时，也有最高的酶活性，且在60℃以内时，处理一小时，活性仍保持100％，在70℃处理一小时后，剩余酶活几乎丧失。日本的Ishikawa等利用基因重组技术成功地构建出表达LGOX的基因，酶学性质研究结果发现，该酶每个酶分子可以结合1-2个FAD，pH为6.0-8.5时都有很好的活性，且具有良好的底物特异性。陈稳等将从白丝北里孢菌KM-6054得到的LGOX连接到pET28a上，在大肠杆菌中异源表达，得到了酶活49.10U/mL的粗酶液，而纯化之后测得其比酶活为45.98U/mg，其相对分子质量为70KDa。
发明内容
本发明的目的在于得到一种高酶活性的来源于链霉菌属(Streptomyces X)的L-谷氨酸氧化酶突变体，通过易错PCR技术，建立突变文库及筛选方法，对其筛选得到了单位点突变体，后通过随机饱和突变以及定点突变，得到多位点突变体，得到的突变体酶活性明显提高。一种高酶活性L-谷氨酸氧化酶的突变体基因序列，其序列如SEQ ID NO 1所示，编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。突变体所含有氨基酸突变位点分别为：F94L，即94位的苯丙氨酸突变为亮氨酸；S280L，即280位的丝氨酸突变为亮氨酸；I282L，即282位的异亮氨酸突变为亮氨酸；H533Q，即533位的组氨酸突变为谷氨酰胺。本发明所述的高酶活性L-谷氨酸氧化酶突变体为含有上述单一氨基酸突变位点、含有上述两个氨基酸组合突变位点、含有上述三个氨基酸组合突变位点或含有上述四个氨基酸组合突变位点。
本发明所述的高酶活性L-谷氨酸氧化酶突变体的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)L-谷氨酸氧化酶基因片段的扩增
以实验室保存的含有来源于茂原链霉菌的L-谷氨酸氧化酶的基因为模板，设计引物扩增L-谷氨酸氧化酶基因片段，回收1869bp的基因片段。
(2)L-谷氨酸氧化酶突变文库的构建
以上述回收后的谷氨酸氧化酶基因片段为模板，调整PCR体系，加入锰离子和镁离子，用上述引物扩增获得具有点突变的L-谷氨酸氧化酶基因片段，回收基因片段。使用限制性内切酶NdeI/XhoI进行酶切，回收片段后亚克隆于载体质粒pET21b，转化大肠杆菌DH5α感受态，提取质粒获得L-谷氨酸氧化酶基因突变文库。将质粒突变文库转化大肠杆菌BL21，用于后续L-谷氨酸氧化酶筛选实验。
(3)L-谷氨酸氧化酶突变文库的筛选
将上述转化子挑于96孔板中，待OD为0.6-0.8时，加入IPTG诱导表达，后取部分菌液加入底物谷氨酸钠进行显色反应，挑取颜色比对照更深的加样孔，经过酶活性测定以及测序后得到了4个单位点突变体：F94L、S280L、I282M、H533V。
(4)随机饱和突变及定点突变
将上述单位点突变体分别进行随机饱和突变，经筛选得到了两个酶活性更高的突变体，测序后发现其突变位点为I282L、H533Q。设计引物，将上述4个单位点突变体进行定点突变，分别得到多个位点组合突变体：F94L-S280L、F94L-I282L、F94L-H533Q、S280L-H533Q、I282L-H533Q、F94L-S280L-I282L、F94L-S280L-H533Q、F94L-I282L-H533Q、S280L-I282L-H533Q、F94L-S280L-I282L-H533Q。
本发明制备的高酶活性的L-谷氨酸氧化酶突变体能够在大肠杆菌中表达，可用于生产α-酮戊二酸，也可用于检测谷氨酸含量等。本发明所得到的L-谷氨酸氧化酶突变体酶活性可提高90％左右。
附图说明
图1为筛选出来的突变体所测得的的酶活性。
图2为随机饱和突变所筛选出来所测得的突变体酶活性。
图3为定点突变得到的部分组合突变体所测得的酶活性。
具体实施方法
下面结合具体实例及附图对本发明作进一步阐述，但所阐述的实例不限制本发明的保护范围。
实施例1谷氨酸氧化酶突变文库的构建。
文库构建采用PCR完成，所使用引物：LGOX-F,CATGCATATGGCGGTTCCTGCGAAAAGCAC；LGOX-R,CTAGCTCGAGCGCTAAATGCGCTTCTAACG。PCR体系及程序：5μL 10×Taq buffer(Mg2+-free)；14μL Mg2+(25mM)；5μL Mn2+(10mM)；2μL上游引物(10pmol)；2μL下游引物(10pmol)；4μL dNTP(10mM)；1μL质粒模板(10pmol)；rTaq DNA酶5U；最后加入高温灭菌的水补齐至50μL。PCR程序为：95℃变性3分钟后进入扩增循环，即95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸2min；循环35次，最后72℃再延伸5min。PCR产物大小为1869bp。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后用PCR胶回收试剂盒进行回收。
PCR产物及载体质粒酶切、酶连和转化
回收后的PCR产物和pET21b质粒分别用XhoI、NdeI限制性内切酶进行酶切。酶切后的产物用PCR回收纯化试剂盒进行回收。酶切后的质粒以及PCR产物用凝胶电泳验证。酶连体系为：10×T4buffer 1μL；酶切后的PCR产物6μL；酶切后的质粒2.5μL；T4DNA连接酶0.5μL。酶连温度为22℃，连接2h。将酶连产物利用热激法转化入大肠杆菌DH5α感受态中。挑选菌落进行PCR验证，对验证正确的菌落测序，确保其在正确的突变频率范围之内。将平板上所有的菌落用涂布棒刮下，离心后用质粒提取试剂盒提取质粒，将质粒化转入大肠杆菌BL21感受态中，建立突变文库。
实施例2高酶活性突变文库的筛选。
具体筛选方法如下：挑取单菌落于每孔含有600μL含氨苄抗性LB培养基的96孔板中，96孔板第一列为野生型对照，待其OD 0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，将96孔板于30℃、800rpm过夜培养，取OD为1.0的菌液加入到新的含有终浓度为60mM谷氨酸钠的96孔板中，37℃、800rpm震荡培养1h，反应后取5μL反应液加入新的透明96孔板中，每孔加入56μL2，4-二硝基苯肼，于37℃反应20min后，加入140μL 1M的氢氧化钠，室温放置5min后用酶标仪测OD390，挑取颜色深且OD390高的加样孔作为目的突变体进行酶活性测定。随机饱和突变和定点突变得到相应突变体。
F94L随机饱和突变引物：
F94L-F CACCAGGTCTCAAACCNNKCGCAAAGGCGGCCATGAACATG
F94L-R CACCAGGTCTCAGGTTTTAATGCGGCCGCCAACACGATTGC
S280L随机饱和突变引物：
S280L-F CACCAGGTCTCACCAGNNKCTGATTTCACCGGATACCGCG
S280L-R CACCAGGTCTCACTGGCTAATAAAGCTATGCACAAAGCTTAACGGC
I282M随机饱和突变引物：
I282M-F CACCAGGTCTCACCTGNNKTCACCGGATACCGCGTTTTGG
I282M-R CACCAGGTCTCACAGGCTCTGGCTAATAAAGCTATGCACAAAGC
H533V随机饱和突变引物：
H533V-F CACCAGGTCTCATCCGNNKGCACTGTGTGGTCTGCAACAG
H533V-R CACCAGGTCTCACGGATAGCGCGCTTCATCATCCAGGC
S280L定点突变引物：
S280L-F CACCAGGTCTCACCAGCTTCTGATTTCACCGGATACCGCG
S280L-R CACCAGGTCTCACTGGCTAATAAAGCTATGCACAAAGCTTAACGGC
I282L定点突变引物
I282L-F CACCAGGTCTCACCTGTTGTCACCGGATACCGCGTTTTGG
282L-R CACCAGGTCTCACAGGCTCTGGCTAATAAAGCTATGCACAAAGC
H533Q定点突变引物：
H533Q-F CACCAGGTCTCATCCGCAAGCACTGTGTGGTCTGCAACAG
H533Q-R CACCAGGTCTCACGGATAGCGCGCTTCATCATCCAGGC
S280L-I282L定点突变引物：
S280L-I282L-F CACCAGGTCTCACCAGCTTCTGTTGTCACCGGATACCGCG
S280L-I282L-R CACCAGGTCTCACTGGCTAATAAAGCTATGCACAAAGCTTAACGGC
所用的PCR体系成分及程序为：PCR反应体系为：10μL 5×HF buffer；1μL pET21b-LGOX质粒模板；4μL 2.5mM dNTPs；2.5μL DMSO；2.5μL 10pmol Primer1；2.5μL 10pmolPrimer2；0.5μL Phusion高保真DNA聚合酶；最后加入无菌水补齐至50μL。PCR反应程序为：98℃预变性30s，在98℃使其变性10s；63℃退火20s；72℃延伸4min；循环35次。扩增结束后在72℃再延伸8分钟。随后加入1μL DpnI限制性内切酶，于37℃反应2h以消化掉质粒模板。用胶回收试剂盒割胶回收纯化PCR产物，用核酸凝胶电泳对回收之后的片段进行验证。采用GoldenGate方法进行连接。15μL反应体系为：10μL回收后的PCR产物；1.5μL T4连接酶buffer；1μL T4连接酶；1.5μL BSA；1μL BsaI限制性内切酶。程序为：37℃ 30min；22℃4min；循环35次，22℃ 30min；50℃ 5min；80℃ 5min；25℃ 30min。GoldenGate结束后，将连接产物化学转化于E.coli BL21感受态中，后对其进行筛选及测序验证。
实施例3突变体酶活性的测定。
具体方法为：将得到的所有突变体的单菌落接入含有LB+Amp的液体培养基的试管中，于37℃、200rpm过夜震荡培养。后转接于含有50ml LB+Amp的液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养，待其OD600为0.6--0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，16℃、200rpm过夜培养20-24h，后离心收集菌体、用水洗涤后，加入pH 7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液重悬细胞进行细胞破碎，破碎在低温进行，破碎条件为：功率285W，工作1s，停3s，破碎10min，4℃8000rpm离心10min，收集上清液，即为谷氨酸氧化酶粗酶液，以此粗酶液来测定其粗酶活性。反应体系为：100μL粗酶液、300μL水、600μL终浓度为60mM的谷氨酸钠溶液，混匀后于37℃反应30min，后沸水浴煮沸10min以终止反应，反应结束后取20μL反应液，加入400μL 2，4-二硝基苯肼，于37℃反应20min，后加入1mL 1M的氢氧化钠溶液，室温放置5min后，用酶标仪测定OD390下数值。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种高酶活性L-谷氨酸氧化酶突变体及其制备方法
<130> 210
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1872
<212> DNA
<213> Streptomyces X
<400> 1
catatggcgg ttcctgcgaa aagcaccgcg gattgggata cctgtctgga agtggcgcgc 60
gcgttattag tggtggatga acatgatcgt ccgctggtgc cggaatataa gaagattctg 120
gatgatggcc tgcctcgcac cggtaaaaaa gcgggccgca aagtgttagt tgttggtgcg 180
ggtcctgcag gtttagttgc ggcgtggctg ttaaaacgtg cgggtcatca tgtgactctg 240
ctggaagcga acggcaatcg tgttggcggc cgcattaaaa cccttcgcaa aggcggccat 300
gaacatgcgg ttcagccgtt tgcagatccg cgtcagtatg cagaagcagg cgcgatgcgt 360
attcctggca gccatccgtt agtgatgagc ctgattgatg gcctgggtgt taaacgccgc 420
ccgttttatc tggtggatgt ggatggccaa ggcaaaccgg ttaaccatgc gtggctgcat 480
gtgaatggtg ttcgcgttcg ccgtgcggat tatgtgaaag atccgcgcaa agtgaaccgc 540
agctttggtg tgccgcgtga attatgggat accccgagca gcgttattct gcgccgcgtt 600
ttagatcctg tgcgcgatga attttcaacc gcgggcgcgg atggtaaacg cgtggataaa 660
ccgatgccgg aacgcgttaa aggttgggcg cgcgtgattc agaaatatgg cgactggagc 720
atgtatcgct ttctgaccga agaagcgggc tttgatgaac gcaccctgga tttagttggc 780
accctggaaa acttaaccag ccgcctgccg ttaagctttg tgcatagctt tattagccag 840
cttctgttgt caccggatac cgcgttttgg gaactggttg gtggcaccgc gagcttacct 900
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gaatattgga gcccggatcg tactggtgcg gatcgtgcga cccatgttcg tgaaggtggt 1020
ccgcatgtgt ggattgatac cgtgagcgaa ggccgcgatg gcaaagttgt gcgcgaacag 1080
tttactggcg atctggcgat tgtgaccgtg ccgtttaccg gtctgcgcca tgttcaagtg 1140
agcccgctga tgagctatgg taaacgtcgc gcggtgaccg aactgcatta tgatagcgcg 1200
accaaagtgc tgctggaatt tagccgccgc tggtgggaat ttaccgaaga agattggaaa 1260
cgcgaactgg aagatgttcg cccgggctta tatgcagcgt atcgcgatgg taaagcgcct 1320
gcggatggta gcttattagg cacccatccg tcagttccgc atggccatat tagccaagcg 1380
cagcgtgcac attatgcggc gaactattgg gaaggccgcg atcaacctga agcggcgcat 1440
attgttggtg gtggcagcgt tagcgataac ccgaaccgct ttatgtttaa cccgagccat 1500
ccggttcctg gtagcgaagg tggtgttgtg ctggcggttt attgctgggc ggatgatgca 1560
agccgttggg atagcctgga tgatgaagcg cgctatccgc aggcactgtg tggtctgcaa 1620
caggtttatg gccagcgcgt ggaagtgttt tataccggcg cgggtcgtac tcaatcatgg 1680
ctgcgtgatc cgtatgcgta tggcgaagcg agcgttttat tacctggcca gcataccgaa 1740
ttactgggcg cgattcgcga acctgaaggc cctttacatt ttgcgggcga tcatacctca 1800
gtgaaaccga gctggattga aggtgcggtg gaaagcggtg ttcgtgcggc gttagaagcg 1860
catttagcgt aa 1872
<210> 2
<211> 622
<212> PRT
<213> Streptomyces X
<400> 2
Met Ala Val Pro Ala Lys Ser Thr Ala Asp Trp Asp Thr Cys Leu Glu
1 5 10 15
Val Ala Arg Ala Leu Leu Val Val Asp Glu His Asp Arg Pro Leu Val
20 25 30
Pro Glu Tyr Lys Lys Ile Leu Asp Asp Gly Leu Pro Arg Thr Gly Lys
35 40 45
Lys Ala Gly Arg Lys Val Leu Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu
50 55 60
Val Ala Ala Trp Leu Leu Lys Arg Ala Gly His His Val Thr Leu Leu
65 70 75 80
Glu Ala Asn Gly Asn Arg Val Gly Gly Arg Ile Lys Thr Leu Arg Lys
85 90 95
Gly Gly His Glu His Ala Val Gln Pro Phe Ala Asp Pro Arg Gln Tyr
100 105 110
Ala Glu Ala Gly Ala Met Arg Ile Pro Gly Ser His Pro Leu Val Met
115 120 125
Ser Leu Ile Asp Gly Leu Gly Val Lys Arg Arg Pro Phe Tyr Leu Val
130 135 140
Asp Val Asp Gly Gln Gly Lys Pro Val Asn His Ala Trp Leu His Val
145 150 155 160
Asn Gly Val Arg Val Arg Arg Ala Asp Tyr Val Lys Asp Pro Arg Lys
165 170 175
Val Asn Arg Ser Phe Gly Val Pro Arg Glu Leu Trp Asp Thr Pro Ser
180 185 190
Ser Val Ile Leu Arg Arg Val Leu Asp Pro Val Arg Asp Glu Phe Ser
195 200 205
Thr Ala Gly Ala Asp Gly Lys Arg Val Asp Lys Pro Met Pro Glu Arg
210 215 220
Val Lys Gly Trp Ala Arg Val Ile Gln Lys Tyr Gly Asp Trp Ser Met
225 230 235 240
Tyr Arg Phe Leu Thr Glu Glu Ala Gly Phe Asp Glu Arg Thr Leu Asp
245 250 255
Leu Val Gly Thr Leu Glu Asn Leu Thr Ser Arg Leu Pro Leu Ser Phe
260 265 270
Val His Ser Phe Ile Ser Gln Leu Leu Leu Ser Pro Asp Thr Ala Phe
275 280 285
Trp Glu Leu Val Gly Gly Thr Ala Ser Leu Pro Asp Ala Leu Leu Lys
290 295 300
Lys Val Asp Asp Val Leu Arg Leu Asp Arg Arg Ala Thr Arg Ile Glu
305 310 315 320
Tyr Trp Ser Pro Asp Arg Thr Gly Ala Asp Arg Ala Thr His Val Arg
325 330 335
Glu Gly Gly Pro His Val Trp Ile Asp Thr Val Ser Glu Gly Arg Asp
340 345 350
Gly Lys Val Val Arg Glu Gln Phe Thr Gly Asp Leu Ala Ile Val Thr
355 360 365
Val Pro Phe Thr Gly Leu Arg His Val Gln Val Ser Pro Leu Met Ser
370 375 380
Tyr Gly Lys Arg Arg Ala Val Thr Glu Leu His Tyr Asp Ser Ala Thr
385 390 395 400
Lys Val Leu Leu Glu Phe Ser Arg Arg Trp Trp Glu Phe Thr Glu Glu
405 410 415
Asp Trp Lys Arg Glu Leu Glu Asp Val Arg Pro Gly Leu Tyr Ala Ala
420 425 430
Tyr Arg Asp Gly Lys Ala Pro Ala Asp Gly Ser Leu Leu Gly Thr His
435 440 445
Pro Ser Val Pro His Gly His Ile Ser Gln Ala Gln Arg Ala His Tyr
450 455 460
Ala Ala Asn Tyr Trp Glu Gly Arg Asp Gln Pro Glu Ala Ala His Ile
465 470 475 480
Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Asp Asn Pro Asn Arg Phe Met Phe Asn
485 490 495
Pro Ser His Pro Val Pro Gly Ser Glu Gly Gly Val Val Leu Ala Val
500 505 510
Tyr Cys Trp Ala Asp Asp Ala Ser Arg Trp Asp Ser Leu Asp Asp Glu
515 520 525
Ala Arg Tyr Pro Gln Ala Leu Cys Gly Leu Gln Gln Val Tyr Gly Gln
530 535 540
Arg Val Glu Val Phe Tyr Thr Gly Ala Gly Arg Thr Gln Ser Trp Leu
545 550 555 560
Arg Asp Pro Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Ser Val Leu Leu Pro Gly Gln
565 570 575
His Thr Glu Leu Leu Gly Ala Ile Arg Glu Pro Glu Gly Pro Leu His
580 585 590
Phe Ala Gly Asp His Thr Ser Val Lys Pro Ser Trp Ile Glu Gly Ala
595 600 605
Val Glu Ser Gly Val Arg Ala Ala Leu Glu Ala His Leu Ala
610 615 620

Claims (3)

1.一种高酶活性L-谷氨酸氧化酶的突变体基因序列，其序列如SEQ ID NO1所示。
2.根据权利要求书1所述的高酶活性的L-谷氨酸氧化酶突变体，其特征在于：所述的突变体编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.根据权利要求书1所述的L-谷氨酸氧化酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)L-谷氨酸氧化酶基因片段的扩增
以实验室保存的含有来源于链霉菌属(Streptomyces X)的L-谷氨酸氧化酶的基因为模板，设计引物扩增L-谷氨酸氧化酶基因片段，回收基因片段。
(2)L-谷氨酸氧化酶突变文库的构建
以上述回收后的谷氨酸氧化酶基因片段为模板，调整PCR体系，加入锰离子和镁离子，用上述引物扩增有突变的L-谷氨酸氧化酶基因片段，利用常规酶切连接操作，将含有点突变的基因片段亚克隆至pET21b表达载体中，建立基因突变文库。
(3)L-谷氨酸氧化酶突变文库的筛选
将上述突变文库转化大肠杆菌BL21菌株，挑取转化子接种于96孔板中，待OD为0.6-0.8时，加入IPTG诱导表达。取部分菌液加入底物谷氨酸钠进行显色反应，挑取颜色比对照更深的加样孔，经过酶活性测定及测序获得4个单位点突变体：F94、LS280T、I282M、H533R。(4)随机饱和突变及定点突变
将上述位点进行随机饱和突变，经筛选得到了两个酶活性更高的突变体，即I282L、H533L。对上述位点进行组合突变，获得多个酶活性获得提高的组合突变体：F94L-S280T、F94L-I282L、F94L-H533L、S280T-I282L、S280T-H533L、I282L-H533L、F94L-S280T-I282L、F94L-S280T-H533L、F94L-I282L-H533L、S280T-I282L-H533L、F94L-S280T-I282L-H533L。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021193598A1 (ja) * 2020-03-24 2021-09-30 味の素株式会社 Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ変異体

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060228790A1 (en) * 2000-04-19 2006-10-12 Yamasa Corporation L-glutamate oxidase
CN106282205A (zh) * 2015-06-12 2017-01-04 上海市农业科学院 一种高比活l-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用
CN106868030A (zh) * 2015-12-14 2017-06-20 中国科学院微生物研究所 重组载体、含有其的工程菌及在产α-酮戊二酸的应用
CN111635898A (zh) * 2020-06-17 2020-09-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060228790A1 (en) * 2000-04-19 2006-10-12 Yamasa Corporation L-glutamate oxidase
CN106282205A (zh) * 2015-06-12 2017-01-04 上海市农业科学院 一种高比活l-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用
CN106868030A (zh) * 2015-12-14 2017-06-20 中国科学院微生物研究所 重组载体、含有其的工程菌及在产α-酮戊二酸的应用
CN111635898A (zh) * 2020-06-17 2020-09-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "AQX34445.1", 《NCBI》 *
李家龙: "利用定向进化技术提高L-谷氨酸氧化酶活性及热稳定性的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (基础科学辑) 》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021193598A1 (ja) * 2020-03-24 2021-09-30 味の素株式会社 Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ変異体
EP4130023A4 (en) * 2020-03-24 2024-04-24 Ajinomoto Kk L-GLUTAMIC ACID OXIDAZE MUTANT

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