CN108624568B

CN108624568B - 变异黄嘌呤脱氢酶及其应用

Info

Publication number: CN108624568B
Application number: CN201710152663.9A
Authority: CN
Inventors: 邢新会; 王成华; 张翀
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2037-03-15
Also published as: CN108624568A

Abstract

本发明公开了一种变异黄嘌呤脱氢酶及其应用。本发明的变异黄嘌呤脱氢酶是将野生变异黄嘌呤脱氢酶进行如下任一突变后获得的：1)在野生变异黄嘌呤脱氢酶的α亚基的D358与E359位之间插入一段长度由QDISAVCYKLSKRFE组成的15各氨基酸多肽片段；2)将野生变异黄嘌呤脱氢酶的α亚基进行F270L突变；3)将野生变异黄嘌呤脱氢酶的α亚基进行S362A突变。本发明的变异黄嘌呤脱氢酶的黄嘌呤氧化酶活性显著增强，与野生型黄嘌呤脱氢酶相比，利用空气中氧气作为电子受体，催化氧化黄嘌呤底物的活性分别增加2125倍，63倍和122倍，可降低生产成本，更加适用于工业化生产应用。

Description

变异黄嘌呤脱氢酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种变异黄嘌呤脱氢酶及其应用，尤其涉及一种通过点突变制造黄嘌呤氧化酶活增强的变异黄嘌呤脱氢酶及其在降解含次黄嘌呤和黄嘌呤样品中的应用。

背景技术

黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，简称XOD，EC 1.17.3.2)是一种包含铁硫簇、钼蝶呤辅基的黄素蛋白类氧化还原酶，它利用空气中氧气作为电子受体，催化氧化包括嘌呤、蝶啶和醛类等多种杂环分子的sp2杂化的碳原子，伴随产生过氧化氢和超氧化物自由基等活性氧类(李丽书，陈献华，邵叶波，刘璇，徐平，《黄嘌呤氧化还原酶的结构、功能和作用》)。XOD具有重要的商业应用价值，被用于生产XOD抗体和检测黄嘌呤/次黄嘌呤和酶联法检测无机磷等的临床诊断试剂盒，以及酶法生物合成病毒唑等核苷类药物和降解有机污染物等(Agarwal,A.,A.Banerjee,and U.C.Banerjee,Xanthine oxidoreductase:a journeyfrom purine metabolism to cardiovascular excitation-contraction coupling.CritRev Biotechnol,2011.31(3):264-80。孟疆辉,陈蔚梅,利用黄嘌呤氧化酶提高病毒唑转化率.武汉大学学报(自然科学版).1999.45(6):838-840)。

XOD由前体蛋白黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase，EC1.17.1.4，简称XDH)转变而来，两者是同一基因转录表达的产物，其中XDH是基因转录后直接产物，是活机体内的主要存在形式(Woolfolk,C.A.and J.S.Downard,Distribution of xanthine oxidaseand xanthine dehydrogenase specificity types among bacteria.J Bacteriol,1977.130(3):1175-91)。XOD与XDH均含有2个[2Fe-2S]簇中心(N端)，1个黄素腺嘌呤二核苷酸FAD中心(中间域)和一个1钼蝶呤中心(C端)，四个氧化还原中心在三维结构中几乎呈线性排列，结构区别仅在于FAD结合部位。XOD中FAD区域附近柔环阻塞了NAD⁺的进入，但不影响分子O₂的进入，同时形成有利O₂反应的氧化还原环境，造成XOD以O₂为电子受体，而XDH优选NAD⁺(Enroth,C.，Eger,B.T.，Okamoto,K.，Nishino,T.，Nishino,T.，Pai,E.F，Crystalstructures of bovine milk xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase:structure-based mechanism of conversion.Proc Natl Acad Sci U S A,2000.97(20):10723-8)。相对于XDH利用昂贵的NAD⁺作为电子受体而言，可以直接利用空气中O₂作为电子受体的XOD成为商业用酶的首选。

目前，商品化XOD仅限于提取法生产，主要包括从牛奶奶油等动物源材料提取(Zikakis,J.P.and D.Townsend,Preparation of high purity xanthine oxidase frombovine milk.1977,University of Delaware:USA PatentUS 4172763)，野生阴沟肠杆菌(Nakanishi,T.and Y.Machida,Method and test composition for the determinationof the substrate for xanthine oxidase.1982,Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd:Japan,USA patent US 4341868)和藤黄节杆菌(Tanigaki,N.，Furukawa,K.，Sogabe,Y.，Emi,S.，Thermostable xanthine oxidase from Arthrobacter luteus.1993,Toyo BosekiKabushiki Kaisha:Japan，USApatent US 5185257)等野生微生物细胞提取。牛奶黄嘌呤氧化酶是最早获得专利并投向市场的酶，是目前市场上最主要的XOD。然而，目前生产工艺均依赖于活性前体XDH的生成和翻译后修饰转化成活性XOD的复杂过程，存在活性XOD与前体蛋白混杂与活性XOD含量低的问题，造成XOD价格高昂，限制了其应用发展(Enroth,C.,etal.,Crystal structures of bovine milk xanthine dehydrogenase and xanthineoxidase:structure-based mechanism of conversion.Proc Natl Acad Sci U S A,2000.97(20):10723-8)。

本发明人前期研究获取了一种新的荚膜红细菌来源XDH(申请号201410764840.5；发明人：邢新会、王成华、张翀；发明名称：一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用)，并通过基因工程手段获取了更高催化活性的截断体形式变体XDH(申请号201510048275.7；发明人：邢新会、王成华、张翀；发明名称：一种黄嘌呤脱氢酶截断体及其应用)。相比于牛奶XDH经过胰蛋白酶等蛋白酶的部分酶解或者氧化形成二硫键自发转变成为XOD，但是两种处理方法均不能将荚膜红细菌XDH转变成XOD，即荚膜红细菌XDH是一种纯粹的XDH。荚膜红细菌XDH催化活性比牛奶XOD/XDH至少高5倍，而且具有更高的温度耐受性(Leimkü hlerSilke,HodsonRachael,George Graham N,Rajagopalan K.V.Recombinant Rhodobactercapsulatus xanthine dehydrogenase,a useful model system for thecharacterization of protein variants leading to xanthinuria I inhumans.Journal of Biological Chemistry,2003,278(23):20802-20811)。如果能将荚膜红细菌XDH蛋白改造成可以直接转录翻译的XOD将具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种变异黄嘌呤脱氢酶及其应用。

本发明所提供的变异黄嘌呤脱氢酶具备增强的黄嘌呤氧化酶的活性，该变异黄嘌呤脱氢酶是在由序列1所示氨基酸序列的α亚基与序列2所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型黄嘌呤脱氢酶序列中，进行人为突变后获得。所述人为突变为仅对α亚基进行突变(β亚基不进行突变)。

本发明所提供的变异黄嘌呤脱氢酶具有由如下α亚基和β亚基构成。

所述α亚基为如下(a1)-(a4)中任一：

(a1)氨基酸序列为序列表中序列3所示的亚基；

(a2)将序列表中序列1的第270位的丙苯氨酸(F)替换为亮氨酸(L)后得到的氨基酸序列所示的亚基；

(a3)将序列表中序列1的第362位的丝氨酸(S)替换为丙氨酸(A)后得到的氨基酸序列所示的亚基；

(a4)将(a1)-(a3)中任一氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加后得到的具有相同功能的亚基。

所述β亚基为如下(b1)或(b2)：

(b1)氨基酸序列为序列表中序列2所示的亚基；

(b2)将(b1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加后得到的具有相同功能的亚基。

对于以上(a1)来说，所述人为突变具体为在野生型黄嘌呤脱氢酶的α亚基第D358氨基酸和Q359氨基酸间插入一段长度为15个氨基酸，具体序列为QDISAVCYKLSKRFE的氨基酸多肽序列。该突变记为D358Insert。

对于以上(a2)来说，所述人为突变具体为将野生型黄嘌呤脱氢酶的α亚基(序列1)的第270位的苯丙氨酸(Phenylalanine,F)替换为亮氨酸(Leucine,L)。该突变记为F270L。

对于以上(a3)来说，所述人为突变具体为将野生型黄嘌呤脱氢酶的α亚基(序列1)的第362位的丝氨酸(serine,S)替换为丙氨酸(alanine,A)。该突变记为S362A。

编码所述变异黄嘌呤脱氢酶的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的实施例中，所述核酸分子具体为编码所述变异黄嘌呤脱氢酶的基因，所述基因具体为如下1)-8)中任一所示DNA分子：

1)序列表中序列5所示DNA分子；

2)序列表中序列5的第1-3764位所示DNA分子；

3)将序列表中序列4的第808-810位的ttc替换为ctg后所得序列所示DNA分子；

4)将序列表中序列4的第808-810位的ttc替换为ctg后所得序列的第1-3719位所示DNA分子；

5)将序列表中序列4的第1084-1086位的tct替换为gca后所得序列所示DNA分子；

6)将序列表中序列4的第1084-1086位的tct替换为gca后所得序列的第1-3719位所示DNA分子；

7)在严格条件下与1)-6)中任一所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

8)与1)-7)中任一所限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述1)和2)所示基因为编码变异黄嘌呤脱氢酶D358Insert的基因；上述3)和4)为编码变异黄嘌呤脱氢酶F270L的基因；上述5)和6)为编码变异黄嘌呤脱氢酶S362A的基因。

用于制造变异黄嘌呤脱氢酶的亲本基因为来源于荚膜红细菌的黄嘌呤脱氢酶基因，其核苷酸序列如序列4表示，序列4自5’末端起第1位至第1389位核苷酸所示的DNA分子编码α亚基，第1386位至第3719位核苷酸所示的DNA分子编码β亚基。所述基因中，除了α亚基及β亚基外，还包括对形成活性黄嘌呤脱氢酶必须的伴侣蛋白进行编码的碱基序列，其对应的碱基序列为第3716位至第4654位。由于本发明的变异黄嘌呤脱氢酶F270L和S362A只在野生型酶α亚基中发生突变，因此具有与野生酶相同的氨基酸序列的β亚基及伴侣蛋白。

用于制造变异黄嘌呤脱氢酶D358Insert的序列5，自5’末端起第1位至第1434位核苷酸所示的DNA分子编码α亚基，第1431位至第3764位核苷酸所示的DNA分子编码β亚基，第3761位至第4699位编码活性黄嘌呤脱氢酶必须的伴侣蛋白序列。由于变异黄嘌呤脱氢酶D358Insert只在野生型酶α亚基中发生突变，因此具有与野生酶相同的氨基酸序列的β亚基及伴侣蛋白。

含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、宿主细胞或微生物也属于本发明的保护范围。

所述重组载体是指用于克隆编码变异黄嘌呤脱氢酶基因的质粒载体、病毒或其他媒介体。本发明中被克隆的多核苷酸序列可操作地连接在适当的表达调节序列上。所述可操作地连接的基因序列，可存在于同时还包括选择标记及复制起点的一个表达载体内。所述“可操作地连接”是指所述多核苷酸序列以可让基因表达的方式连接在表达序列上。所述“表达调节序列”是指在特定宿主细胞上，对可操作地连接的多核苷酸序列的表达进行调节的DNA序列。这种调节序列包括由用于实施转录的启动子、用于调节转录的任意操作基因序列、对转录及终止进行调节的序列等构成的群中所选的某一种以上。所述“表达载体”没有特别的限制。本领域中，在作为宿主细胞使用的微生物中，为了表达所使用的所有质粒载体、病毒或其他媒介体等均可使用。比如作为所述质粒载体有来自大肠杆菌的质粒(pBR322，pUC18，pET28a，pSE380，pACYCDuet-1)、来自枯草芽孢杆菌的质粒(pWB980，pUB110及pTP5)及来自酵母的质粒(pPIC9K，pPink-LC及YEp13)等，作为所述病毒有拟转录病毒、腺病毒或牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒，但不受限于此。

所述宿主细胞的含义包括通常使用的所有种类单细胞有机体、比如肠杆菌、梭菌、芽孢杆菌属等的原核细胞微生物及酵母等真核细胞微生物。

在本发明的一个实例中，所述重组载体具体为将序列表中序列5所示的DNA分子替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRXO358。在本发明的另一个实例中，所述重组载体具体为将“将序列表中序列4的第808-810位的ttc替换为ctg后所得序列所示的DNA分子”替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRXO270。在本发明的再一个实例中，所述重组载体具体为将“将序列表中序列4的第1084-1086位的tct替换为gca后所得序列所示的DNA分子”替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRXO362。以上三个重组载体即为产荚膜红细菌变异黄嘌呤脱氢酶的重组质粒，分别表达三种变异黄嘌呤脱氢酶。

在本发明中，所述微生物具体为将所述重组载体(上述三个重组载体之一)转化大肠杆菌后得到的重组大肠杆菌。

其中，所述转化可以是把所述重组载体引入到宿主细胞时所使用的一切方法。比如，把所述表达载体引入到宿主细胞的方法包括但不局限于氯化钙及热冲击转化法、离子枪冲击法、电穿孔法、超声波处理、通过PEG的沉淀法。

所述变异黄嘌呤脱氢酶在作为黄嘌呤氧化酶中的应用也属于本发明的保护范围。

所述变异黄嘌呤脱氢酶作为黄嘌呤氧化酶在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)降解次黄嘌呤和/或黄嘌呤；

(b)降解含有次黄嘌呤和/或黄嘌呤的材料。

所述变异黄嘌呤脱氢酶或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、宿主细胞或微生物在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(A)制备具有黄嘌呤氧化酶活性的产品；

(B)制备既具有黄嘌呤脱氢酶活性，也具有黄嘌呤氧化酶活性的产品。

下述任一生物材料也属于本发明的保护范围：

I)蛋白质，其氨基酸序列为如下(1)-(3)中任一：

(1)序列表中序列3；

(2)将序列表中序列1的第270位的丙苯氨酸替换为亮氨酸后得到的序列；

(3)将序列表中序列1的第362位的丝氨酸替换为丙氨酸后得到的序列；

II)基因，其核苷酸序列为如下1)-3)中任一：

1)序列表中序列5的第1-1434位；

2)将序列表中序列4的第808-810位的ttc替换为ctg后所得序列的第1-1389位；

3)将序列表中序列4的第1084-1086位的tct替换为gca后所得序列的第1-1389位；

III)含有II)中所述基因的重组载体、表达盒、宿主细胞或微生物。

所述生物材料在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(A)制备具有黄嘌呤氧化酶活性的产品；

另外，本发明还保护制备所述变异黄嘌呤脱氢酶的方法，具体是将编码所述变异黄嘌呤脱氢酶的核酸分子导入大肠杆菌进行诱导表达，得到所述蛋白质。

所述核酸分子是通过含有所述核酸分子的重组表达载体(如上述三个重组载体)导入所述大肠杆菌中的。

本发明的变异黄嘌呤脱氢酶D358Insert的最适pH为9.5，最适温度为35℃，利用空气中氧气作为电子受体时，对黄嘌呤的K_m值为13.3±0.88μM，转化数为1.53±0.22s^-1，比活力为0.69±0.099U/mg蛋白。对以NAD作为电子受体时转化数为0.04s^-1，对应的比活力为0.018U/mg蛋白。两种受体时比活力的比值为38.25，比野生型提高2125倍(野生型两者的比值为0.018)。

本发明的变异黄嘌呤脱氢酶F270L的最适pH为8.5，最适温度为40℃。利用空气中氧气作为电子受体时，对黄嘌呤底物的K_m值为1.3μM，转化数为0.75±0.27s^-1，比活力为0.34±0.12U/mg蛋白。对以NAD作为电子受体时转化数为0.66±0.23s^-1，对应的比活力为0.30±0.1U/mg蛋白。两种受体时比活力的比值为1.1，比野生型提高63倍(野生型两者的比值为0.018)。

本发明的变异黄嘌呤脱氢酶S362A的最适pH为8.5，最适温度为40℃。利用空气中氧气作为电子受体时，对黄嘌呤底物的K_m值为1.37μM，转化数为0.66±0.2s^-1，比活力为0.30±0.09U/mg蛋白。对以NAD作为电子受体时转化数为0.3±0.066s^-1，对应的比活力为0.13±0.03U/mg蛋白。两种受体时比活力的比值为2.2，比野生型提高122倍(野生型两者的比值为0.018)。

本发明提供的变异黄嘌呤脱氢酶，具有比野生型纯粹黄嘌呤脱氢酶增强的黄嘌呤氧化酶活性，可以利用分子氧作为电子受体反应、增强的碱性pH作用范围和耐受性，有利于与其他酶类联用进一步开发新的应用领域，适合于样品检测，包括黄嘌呤和次黄嘌呤的检测，PNP酶的检测和5’-核苷酸酶的检测，以及与PNP酶联用检测无机磷酸、腺苷脱氨酶，同时适合于工业化应用，包括降解病毒唑等核苷类药物生产过程中产生的次黄嘌呤等副产物、以及降解嘌呤、蝶啶和醛类等多种含sp2杂化的碳原子的杂环分子类有机污染物等商业化应用。本发明提供的黄嘌呤脱氢酶的应用领域可以拓展至其它催化底物，例如其它嘌呤、蝶啶、杂环分子和醛类在内的多种底物的氧化反应，和亚甲基蓝、苯醌、高铁氰化物和硝酸盐等多种类型的电子受体，进一步将该变异黄嘌呤氧化酶应用于生物传感器领域。

由于上述技术方案应用，本发明与现有技术相比具有下列优点：1)底物亲和力高，有利于结合低浓度底物；2)最适pH为碱性，可以耐受碱性pH值，有利于扩大应用领域；3)利用空气中氧气作为电子受体，消除对NAD的依赖，有利于降低应用的成本；4)直接转录翻译生成变异黄嘌呤脱氢酶，有助于简化生产过程，降低成本。

附图说明

图1为纯化的重组变异黄嘌呤脱氢酶SDS-PAGE电泳图。泳道M:标准蛋白Marker，条带大小分别为140kDa，115kDa，80kDa，65kDa，50kDa，40kDa和30kDa；泳道1:突变体F270L；泳道2:突变体S362A；泳道3:突变体D358Insert；泳道4:野生型RcXDH。

图2为纯化的变异黄嘌呤脱氢酶与野生黄嘌呤脱氢酶降解黄嘌呤和次黄嘌呤底物酶活检测体系的吸光度随时间变化图。(A)为基于产物H₂O₂检测法；(B)为尿酸检测法。RcXDH为野生型荚膜红细菌黄嘌呤脱氢酶，D358Insert、F270L及S362A为变异黄嘌呤脱氢酶。以图例中D358Insert-xanthine为例说明反应条件，为变异黄嘌呤脱氢酶D358Insert以黄嘌呤(xanthine)为底物的降解反应。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

基因来源菌株为荚膜红细菌(Acinetobacter baumannii)：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号为CGMCC 1.3366。

pTrc99A为中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心Biovector Science Lab,Inc.产品，产品目录号为Biovector108321(GenBank登录号为M22744.1，Amann,E.,Ochs,B.andAbel,K.J.Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression ofunfused and fused proteins in Escherichia coli.Gene,1988,69(2):301-315.)。

重组质粒pTRAN为表达野生型荚膜红细菌黄嘌呤脱氢酶的重组质粒，其是通过将如序列表中序列4所示的野生型荚膜红细菌黄嘌呤脱氢酶基因、在5`端引入6×组氨酸纯化标签编码编码序列后，插入pTrc99A载体NcoI和Hind III双酶切位点得到的载体。来自申请人前期申请的专利申请(申请号为201410764840.5，发明人为邢新会、王成华、张翀，发明名称为一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用)，即为该专利申请中实施例1制备的重组质粒pTrc99A-RcXDHNHis。

镍离子金属鳌合亲和层析介质－

镍柱亲和树脂为Qiagen公司产品，产品目录号为30210。

黄嘌呤、次黄嘌呤和NAD为Sigma公司产品，产品目录号分别为Sigma X7375-10g、Sigma H9377和Sigma N1636。

下述实施例中的变异黄嘌呤脱氢酶均是指实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶，其组成小亚基和大亚基分别简记为α亚基(XDHA)，β亚基(XDHB)。

实施例1、变异黄嘌呤脱氢酶的制备

一、变异黄嘌呤脱氢酶重组质粒的构建

1、突变位点的选择及突变引物的设计

黄嘌呤脱氢酶与黄嘌呤氧化酶根本区别在于电子受体区域结构差异，造成氧化还原环境的不同从而对NAD及氧气造成不同的选择性。本发明选择对电子受体区域氧化还原电势贡献较大的D358、F270、S362位点进行定点突变，构建利用氧气作为电子受体活性增强的变异黄嘌呤脱氢酶。

采用PCR引物介导的突变方法，以重组质粒pTRAN为模板构建突变体，所设计引物序列如下：

在F270位点构建突变体的引物对：

F270L-S：5’-TTGCGCCGCCTGGCTTCGGAACAGGTGCGGCAGGTG-3’(序列6)

F270L-A：5’-TTCCGAAGCCAGGCGGCGCAACAGATCCGCCAG-3’(序列7)。

在D358位点构建突变体的引物对：

D358Insert-S：

5’-GTCGAAAAGGTTCGAACAGGACATTTCTGCGGTCTGCGGATGCTTCAATCTGACCCTG-3’(序列8)

D358Insert-A：

5’-CTGTTCGAACCTTTTCGACAATTTGTAGCAGACCGCAGAAATGTCCTG-3’(序列9)

在S362位点构建突变体的引物对：

S362A-S：5’-CAGGACATTGCAGCGGTCTGCGGATGCTTCAATCTG-3’(序列10)

S362A-A：5’-GCAGACCGCTGCAATGTCCTGATCGAACCTTTTCGAC-3’(序列11)

2、PCR产物的扩增

以pTRAN重组质粒DNA为模板，以上述1合成的上游引物D358Insert-S和下游引物D358Insert-A为引物，进行PCR扩增，得到长度为8.8kb的全质粒PCR产物，即为表达在D358位点和E359位点间插入QDISAVCYKLSKRFE多肽氨基酸片段的变异黄嘌呤脱氢酶的重组质粒全长片段。

25μl PCR反应体系：0.1ng质粒总DNA，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，5μl 5×PrimeSTAR Reaction buffer，2μl dNTPs(各2.5mM)，0.25U PrimeSTAR DNA polymerase，ddH₂O补齐至25μl。

PCR反应程序为：98℃预变性1min；98℃10s，62℃5s，72℃9min，循环30次；最后72℃退火10min。

3、PCR产物的转化

将上述获得的PCR产物加入10U DpnI酶，于37℃水浴温浴1h以消解掉甲基化的模板质粒，然后于80℃水浴温浴20min以失活DpnI酶。采用Gibsen连接法(NEB#E5510)，将PCR产物于50℃温浴20min。采用常规分子生物学操作，取10μl连接产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB固体培养基，倒置于37℃恒温培养箱培养16h。

4、变异黄嘌呤脱氢酶重组质粒的筛选

将上述转化产物挑取重组菌单菌落，接种于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220r/min条件下培养至OD₆₀₀为0.6左右，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导剂，同样条件下继续诱导培养16h。取2ml诱导培养的菌液，9000r/min、4℃离心，收集沉淀，得到诱导表达的工程菌，沉淀用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)洗涤一次后，重悬于1ml同样的缓冲液中，得到菌悬液，将菌悬液通过超声细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)破胞，30％功率，1s/2s，4℃超声破碎2min，破胞液于12 000r/min 4℃下离心30min，上清液为粗酶液。采用下述方法进行粗酶液黄嘌呤氧化酶活性的测定：

1)构建3ml如下反应体系：50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)，2.55ml；20mM黄嘌呤，0.20ml；0.2％4-AAP，0.05ml；6％苯酚，0.1ml；80U/ml辣根过氧化物酶，0.1ml；

2)反应体系置于37℃平衡10min；

3)加入100μl粗酶液，于37℃反应，510nm条件下测定吸光度变化。

对具有酶活的阳性克隆抽提质粒进行测序验证，结果质粒为将序列表中序列5所示的DNA分子替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRXO358，即为产变异黄嘌呤脱氢酶的重组质粒，表达变异黄嘌呤脱氢酶，记为D358Insert。D358Insert在D358位点和E359位点间插入了一个长度为15AA的氨基酸肽段：QDISAVCYKLSKRFE。

序列表中序列号5所示的DNA分子，自5’末端起第1位至第1434位核苷酸所示的DNA分子编码α亚基，其氨基酸序列如序列3所示，大小为51kDa，第1431位至第3764位核苷酸所示的DNA分子编码β亚基，其氨基酸序列如序列2所示，大小为83kDa，第3761位至第4699位编码活性黄嘌呤脱氢酶必须的伴侣蛋白序列，该伴侣蛋的氨基酸序列如序列12所示，大小为33kDa。

采用相同的方法，分别用F270L-S和F270L-A PCR扩增构建F270位点的变异突变体及其重组质粒pTRXO270；用S362A-S和S362A-A构建S362A位点的突变体及其重组质粒pTRXO362。pTRXO270的结构描述为：将“将序列表中序列4的第808-810位的ttc替换为ctg后所得序列所示的DNA分子”替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒。pTRXO362的结构描述为：将“将序列表中序列4的第1084-1086位的tct替换为gca后所得序列所示的DNA分子”替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒。

二、变异黄嘌呤脱氢酶的纯化

1、将上述步骤一得到的pTRXO358转化大肠杆菌DH5α，得到重组菌，挑取重组菌单菌落，接种于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220r/min条件下培养过夜。将过夜培养的菌液，按照1％的接种量转接于500ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220r/min条件下培养，待菌液培养至OD₆₀₀为0.6左右，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导剂，同样条件下继续诱导培养16h。

2、将步骤1得到的菌液9000r/min、4℃离心，收集沉淀，得到诱导表达的工程菌，沉淀用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)洗涤一次后，重悬于100ml同样的缓冲液中，得到菌悬液，将菌悬液通过高压细胞破碎机JN-10HC(广州聚能生物科技有限责任公司)破胞，流速10L/H，4℃，压力为150MPa，破胞液于12 000r/min 4℃下离心30min，上清液为粗酶液。

3、金属螯合层析法纯化黄嘌呤脱氢酶

(1)在上述步骤2获得的粗酶液中加入终浓度为300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑，并用0.22μm滤膜过滤，得到滤液；

(2)将总体积为40ml的滤液上样至

镍柱亲和树脂，依次用含10mmol/L、30mmol/L和50mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液洗涤杂蛋白，每次洗脱的体积至少为20个柱体积，然后用含120mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱液为目的重组酶，以上洗脱的流速均为2.5ml/min。

(3)将洗脱的目的重组酶通过分子截留量为10KDa的Millipore超滤管，用50mmol/L pH 7.5Tris盐酸缓冲溶液反复换洗三次以除去盐分及咪唑成份后，得到浓缩酶液，再将其重悬于50mmol/L pH 7.5Tris盐酸缓冲液中，得到纯化变异黄嘌呤脱氢酶。

将变异黄嘌呤脱氢酶D358Insert进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，结果如图1所示，结果表明，D358Insert由大小约为51kDa的小亚基和大小约为83kDa的大亚基这两种亚基组成。纯化酶中不含有大小约为33kDa的伴侣蛋白。

采用同样的方法对变异黄嘌呤脱氢酶F270L和S362A进行表达和纯化，SDS-PAGE检测结果同样列于图1，结果表明，与野生型一样，F270L和S362A均由大小约51kDa的小亚基和大小约为83kDa的大亚基这两种亚基组成。

实施例2、变异黄嘌呤脱氢酶作为黄嘌呤氧化酶以及黄嘌呤脱氢酶的表征

一、黄嘌呤氧化酶酶活的测定方法

可以通过两种方法对变异黄嘌呤脱氢酶的黄嘌呤氧化酶活性进行精确表征。

第一种方法基于黄嘌呤氧化酶催化如下反应(反应式1和2)，尿酸在295nm处有特异性吸收，因此可以通过分光光度法测定产物尿酸的生成对酶活进行表征。

本发明中，黄嘌呤氧化酶酶活性测定的反应体系如表1所示。

表1黄嘌呤氧化酶酶活测定的2mL反应体系组成

编号	样品名称	母液浓度(mM)	加入量(μL)	终浓度(mM)
					1	pH 8.5的Tris-HCl水溶液	100	1000	50
2	pH 8.5的EDTA水溶液	10	200	1
					3	氧嗪酸钾水溶液	10	20	0.1
4	黄嘌呤溶液	20	10	0.1
					5	变异黄嘌呤脱氢酶水溶液	C mg/ml	100	C/20mg/ml
6	ddH<sub>2</sub>O	－	670	－

表1中除酶液最后加入外，其余样品不限加入顺序。将反应体系中除黄嘌呤脱氢酶水溶液外的其余试剂混匀后，置于40℃水浴温浴5min，然后加入100μL变异黄嘌呤脱氢酶水溶液启动反应。在40℃条件下边反应边记录3-5min内反应体系OD₂₉₅吸光值变化，计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间变化速率(ΔOD₂₉₅/min)。

按照下述公式计算所检测的黄嘌呤氧化酶的酶活和比酶活。

酶活(U/ml)＝ΔOD₂₉₅/min×1.6×df (公式1)

比酶活(U/mg)＝(U/ml)×1/C (公式2)

公式1中1.6为采用消光系数法将上述2ml反应体系中尿酸从吸光度变化转化为摩尔浓度的计算系数，该系数计算方法为：

其中：Vt为反应总体积(2.0ml)，Vs为反应体系中酶液体积(0.1ml)，12.5为测定条件下尿酸的摩尔消光系数(cm²/μmol)，1.0cm为测定比色杯光程。

公式1中df为酶液稀释倍数。

公式2中C为酶液的浓度，单位为mg/ml。

酶活力单位(U)定义：在测定温度和pH值条件下每分钟转化生成1μmol尿酸所需要的酶量。

第二种方法基于黄嘌呤氧化酶催化如下反应(反应式1、2和3)，通过偶联辣根过氧化物酶(HRP)，H₂O₂与4-氨基安替比林(4-AAP)以及苯酚生成在510nm处有特异性吸收的红色亚醌，因此可以通过亚醌的生成速度对酶活进行精确表征。

2mL黄嘌呤氧化酶酶活性的测定反应体系如表2所示。

表2黄嘌呤氧化酶酶活测定的2mL反应体系组成

编号	样品名称	母液浓度(mM)	加入量(μL)	终浓度(mM)
					1	pH 8.5的Tris-HCl水溶液	100	1000	50
2	pH 8.5的EDTA水溶液	10	200	1
					3	氧嗪酸钾水溶液	10	20	0.1
4	黄嘌呤溶液	20	10	0.1
					5	4-AAP	0.2％	33	0.0033％
6	苯酚	6％	67	0.2％
					7	HRP	80U/ml	67	2.68U/ml
8	变异黄嘌呤脱氢酶水溶液	C mg/ml	100	C/20mg/ml
					9	ddH<sub>2</sub>O	－	503	－

表2中除酶液最后加入外，其余试剂不限加入顺序。将表2中的除黄嘌呤脱氢酶水溶液外的其余试剂混匀后置于40℃水浴温浴5min，然后加入100μL变异黄嘌呤脱氢酶水溶液启动反应。在40℃条件下边反应边记录反应3-5min内OD₅₁₀吸光值变化，计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间变化速率(ΔOD₅₁₀/min)。

按照下述公式计算所检测的黄嘌呤氧化酶的酶活和比酶活。

酶活(U/ml)＝ΔOD₅₁₀/min×20/ε×df (公式4)

比酶活(U/mg)＝(U/ml)×1/C (公式5)

公式4中20/ε为采用消光系数法将上述2ml反应体系中从吸光度变化转化为摩尔浓度的计算系数，该系数计算方法为：

其中：Vt为反应总体积(2.0ml)，Vs为反应体系中酶液体积(0.1ml)，ε为测定条件下亚醌的摩尔消光系数(cm²/μmol)，1.0cm为测定比色杯光程。

公式4中df为酶液稀释倍数。

公式5中C为酶液的浓度，单位为mg/ml。

酶活力单位(U)定义：在测定温度和pH值条件下每分钟转化生成1μmol H₂O₂所需要的酶量。

当以黄嘌呤作为底物测定黄嘌呤氧化酶的酶活性时，产物尿酸与H₂O₂以等物质的量生成，因此所述两种酶活测定方法所得结果一致。

二、黄嘌呤脱氢酶活的测定方法

基于黄嘌呤脱氢酶催化如下反应(反应式4和反应式5)，可以通过产物尿酸的生成速度对酶活进行精确表征。因为尿酸在295nm处有特异性吸收，本发明通过分光光度法对酶活性进行测定。

2mL黄嘌呤脱氢酶酶活性的测定反应体系如表3所示。

表3黄嘌呤脱氢酶酶活测定的2mL反应体系组成

表3中除酶液最后加入外，其余试剂加入顺序不限。将表3中除变异黄嘌呤脱氢酶水溶液外的其余试剂混匀后置于40℃水浴温浴5min，然后加入100μL变异黄嘌呤脱氢酶水溶液启动反应。在40℃条件下边反应边记录3-5min内反应体系OD₂₉₅吸光值变化，计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间变化速率(ΔOD₂₉₅/min)。

变异黄嘌呤脱氢酶的黄嘌呤脱氢酶活性和比酶活计算方法与上述基于尿酸生成计算黄嘌呤氧化酶得计算方法相同，具体如下：

按照下述公式1和2计算所检测的黄嘌呤脱氢酶酶的酶活和比酶活。

酶活(U/ml)＝ΔOD₂₉₅/min×1.6×df (公式1)

比酶活(U/mg)＝(U/ml)×1/C (公式2)

公式1中1.6为采用消光系数法将上述2ml反应体系中NADH从吸光度变化转化为摩尔浓度的计算系数，该系数计算方法为：

公式1中df为酶液稀释倍数。

公式2中C为酶液的浓度，单位为mg/ml。

三、最适温度和最适pH的测定

以黄嘌呤为底物时，特别检测实施例1中制备的变异黄嘌呤脱氢酶分别作为黄嘌呤脱氢酶及黄嘌呤氧化酶时的最适pH和最适温度。

最适温度的测定通过按照表1(黄嘌呤氧化酶活性)和表3(黄嘌呤脱氢酶活性)构建200μl反应体系，分别置于25-80℃区间范围内测定酶活，最适温度用相对酶活的最大值对应的温度表示。

最适pH值通过测定pH 4.0-11.0范围内缓冲体系下相对酶活，用最大酶活对应的pH值表示。具体是分别将表1(黄嘌呤氧化酶活性)和表3(黄嘌呤脱氢酶活性)中反应体系中最终浓度为0.05M的pH 8.5Tris盐酸缓冲溶液分别替换为pH 4.0-5.8的0.05M乙酸缓冲体系、pH 5.8-8.0的0.05M磷酸缓冲体系、pH 7.5-9.0的0.05M的Tris盐酸缓冲体系和pH 9.0-11.0的0.05M的碳酸钠缓冲体系进行测定。

结果如表4所示，在pH 6.0-11.0范围内，变异黄嘌呤脱氢酶保持稳定；各变异黄嘌呤脱氢酶作为黄嘌呤脱氢酶与黄嘌呤氧化酶时的最适pH和最适温度一致；变异酶D358Insert的最适pH为9.5比野生型提高一个pH单位，最适温度为35℃，比野生型降低5℃；变异酶F270L和S362A的最适温度和pH与野生型一致，分别为40℃和pH8.5.

表4变异黄嘌呤脱氢酶与野生型的部分酶学参数

四、酶促动力学参数

按照上述步骤一和二中所述方法测定实施例1的变异酶的黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤脱氢酶活性。在最适温度和最适pH条件下，0.001-1mM浓度范围，各变异酶降解黄嘌呤的最初反应速度符合米氏动力学方程。按照米氏方程进行非线性拟合，结果如表4所示，相对于野生型酶作为纯粹的黄嘌呤脱氢酶，利用氧气作为电子受体的氧化酶活性是利用NAD作为电子受体的脱氢酶活性的1.8％，而催化效率之比为1.1％；本发明提供的变异酶F270L、D358Insert和S362A均具有更强的利用空气中氧气作为电子受体催化底物黄嘌呤氧化的功能，三者氧化酶与脱氢酶(XOD/XDH)活性之比分别为114％，3825％和220％，相对于野生型分别提高了63倍，2125倍和122倍，而对应的催化效率分别提高了4927倍，3400倍和336倍。

实施例3、变异黄嘌呤脱氢酶作为黄嘌呤氧化酶在降解黄嘌呤和次黄嘌呤以及处理含该类底物的材料中的应用

一、方法1

参照表2中黄嘌呤氧化酶反应体系的构建方法，构建如下a)至j)8组反应体系：

a)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤，0.0033％的4-AAP，0.2％的苯酚，2.68U/ml辣根过氧化物酶(HRP)和1.56mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶F270L；

b)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 9.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤，0.0033％的4-AAP，0.2％的苯酚，2.68U/ml辣根过氧化物酶(HRP)和1.23mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶D358Insert；

c)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤，0.0033％的4-AAP，0.2％的苯酚，2.68U/ml辣根过氧化物酶(HRP)和0.66mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶S362A；

d)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤，0.0033％的4-AAP，0.2％的苯酚，2.68U/ml辣根过氧化物酶(HRP)和0.1mg/L实施例1制备的野生型黄嘌呤脱氢酶；

e)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的次黄嘌呤，0.0033％的4-AAP，0.2％的苯酚，2.68U/ml辣根过氧化物酶(HRP)和1.56mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶F270L；

f)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 9.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的次黄嘌呤，0.0033％的4-AAP，0.2％的苯酚，2.68U/ml辣根过氧化物酶(HRP)和1.23mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶D358Insert；

g)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的次黄嘌呤，0.0033％的4-AAP，0.2％的苯酚，2.68U/ml辣根过氧化物酶(HRP)和0.66mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶S362A；

h)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的次黄嘌呤，0.0033％的4-AAP，0.2％的苯酚，2.68U/ml辣根过氧化物酶(HRP)和0.1mg/L实施例1制备的野生型黄嘌呤脱氢酶；

分别将上述a)至h)8组反应体系中除酶外的所有试剂加入并混匀，置于40℃水浴中温浴5min，然后加入相应的纯化酶液启动反应，利用带有加热模块的分光光度计将反应温度控制在40℃条件下，边反应边记录反应3-5min内510nm下吸光值变化，绘制吸光度(ΔOD₅₁₀)的增加随时间变化的关系曲线、并计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间的变化速率(ΔOD₅₁₀/min)，通过亚醌变化检测底物黄嘌呤和次黄嘌呤的降解情况。

将a)至h)8组实验结果列于图2中(A)。图2中(A)表明：

以0.1mM黄嘌呤为底物时，a)至c)反应体系下的最大吸光度变化速度(ΔOD₅₁₀/min)分别为0.0199、0.022和0.098，而d)吸光度值没有变化；

以0.1mM次黄嘌呤为底物时，e)至g)反应体系下的最大吸光度变化速度(ΔOD₅₁₀/min)分别为0.0288、0.0504和0.135，而h)吸光度值没有变化。

这表明变异黄嘌呤脱氢酶F270L，S362A和D358Insert均可以利用空气中氧气作为电子受体生成H₂O₂，而野生型基本没有可检测到H₂O₂。

二、方法2

参照表3中黄嘌呤脱氢酶反应体系的构建方法，构建如下j)至q)8组反应体系：

j)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤和1.56mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶F270L；

k)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 9.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾0.1mM的黄嘌呤和1.23mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶D358Insert；

l)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤和0.66mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶S362A；

m)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤，0.1mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)和0.1mg/L实施例1制备的野生型黄嘌呤脱氢酶；

n)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的次黄嘌呤和1.56mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶F270L；

o)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 9.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾0.1mM的次黄嘌呤和1.23mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶D358Insert；

p)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的次黄嘌呤和0.66mg/L实施例1制备的变异黄嘌呤脱氢酶S362A；

q)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的次黄嘌呤，0.1mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)和0.1mg/L实施例1制备的野生型黄嘌呤脱氢酶；

分别将上述j)至q)8组反应体系中除酶外的所有试剂加入并混匀，置于40℃水浴中温浴5min，然后加入相应的纯化酶液启动反应，利用带有加热模块的分光光度计将反应温度控制在40℃条件下，边反应边记录反应3-5min内295nm下吸光值变化，绘制吸光度(ΔOD₂₉₅)的增加随时间变化的关系曲线、并计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间的变化速率(ΔOD₂₉₅/min)，通过尿酸变化检测底物黄嘌呤和次黄嘌呤的降解情况。

将a)至h)8组实验结果列于图2中(B)。图2中(B)表明：

以0.1mM黄嘌呤或次黄嘌呤为底物时，j)至q)8组反应体系下的最大吸光度变化速度(ΔOD₂₉₅/min)分别为0.071、0.0501、0.0336、0.0034、0.062、0.0286、0.0042和0.0025，对应的降解速率分别为0.1136μmol·L^-1·min^-1、0.0801μmol·L^-1·min^-1、0.0538μmol·L^-1·min^-1、0.0054μmol·L^-1·min^-1、0.0992μmol·L^-1·min^-1、0.0457μmol·L^-1·min^-1、0.0067μmol·L^-1·min^-1和0.0041μmol·L^-1·min^-1，对应的比活力为0.3U/mg、0.48U/mg、0.21U/mg、3.21U/mg、0.48U/mg、0.27U/mg、0.051U/mg和2.36U/mg。

因此，相对于野生型基本不能利用空气中氧气作为电子受体，而依赖于利用NAD作为电子受体，本发明提供的变异黄嘌呤脱氢酶F270L，S362A和D358Insert均可以利用空气中氧气作为电子受体生成H₂O₂，氧化降解黄嘌呤和次黄嘌呤生成尿酸。

以上公开了较佳实施例，但其并非用以限定本发明，应当理解的是，采用本领域熟知的技术，在不脱离本发明的精神和范围内，所作出的任何改动与修饰，都属于本发明权利要求书中界定保护的范围。

<110> 清华大学

<120> 变异黄嘌呤脱氢酶及其应用

<130> CGGNQALN166153

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Met Glu Ile Ala Phe Leu Leu Asn Gly Glu Thr Arg Arg Leu Arg Ile

1 5 10 15

Gly Asp Pro Thr Gln Ser Leu Leu Asp Trp Leu Arg Ala Glu Gly Leu

20 25 30

Thr Gly Thr Lys Glu Gly Cys Asn Glu Gly Asp Cys Gly Ala Cys Thr

35 40 45

Val Met Val Thr Asp Ala Ala Gly Pro Arg Ala Val Asn Ala Cys Leu

50 55 60

Met Met Leu Pro Gln Ile Ala Gly Lys Ala Leu Arg Thr Val Glu Gly

65 70 75 80

Ile Ala Ala Pro Asp Gly Arg Leu His Pro Val Gln Gln Ala Met Ile

85 90 95

Asp His His Gly Ser Gln Cys Gly Phe Cys Thr Pro Gly Phe Val Val

100 105 110

Ser Met Ala Ala Ala His Gly Gln Gly Arg Arg Asp Tyr Asp Asp Phe

115 120 125

Leu Ala Gly Asn Leu Cys Arg Cys Thr Gly Tyr Ala Pro Ile Leu Arg

130 135 140

Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Glu Pro Pro Ala Glu Trp Leu Gln Ala

145 150 155 160

Asp Ala Leu Phe Thr Leu Ala Glu Ile Ser Ser Gly Val Arg Gly Gln

165 170 175

Thr Ala Pro Ala Val Leu Pro Glu Thr Gly Asp Ala Leu Ala Ala Trp

180 185 190

Tyr Leu Ala His Pro Glu Ala Thr Leu Ile Ala Gly Gly Thr Asp Val

195 200 205

Ser Leu Trp Val Thr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Pro Glu Val Ala Phe

210 215 220

Leu Ser His Cys Lys Asp Leu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Ala Asp Gly

225 230 235 240

Val Val Ile Gly Ala Gly Val Thr Ile Ala Ala Leu Arg Ala Trp Ala

245 250 255

Glu Gly Pro His Pro Ala Leu Ala Asp Leu Leu Arg Arg Phe Ala Ser

260 265 270

Glu Gln Val Arg Gln Val Ala Thr Ile Gly Gly Asn Ile Ala Asn Gly

275 280 285

Ser Pro Ile Gly Asp Gly Pro Pro Ala Leu Ile Ala Leu Gly Ala Ser

290 295 300

Leu Thr Leu Arg Arg Gly Ala Glu Arg Arg Thr Met Pro Leu Glu Ala

305 310 315 320

Phe Phe Leu Asp Tyr Arg Lys Gln Asp Arg Arg Pro Gly Glu Phe Val

325 330 335

Glu Ser Val Thr Leu Pro Lys Ser Ala Pro Gly Leu Arg Cys Tyr Lys

340 345 350

Leu Ser Lys Arg Phe Asp Gln Asp Ile Ser Ala Val Cys Gly Cys Phe

355 360 365

Asn Leu Thr Leu Lys Gly Ser Ile Ile Glu Thr Ala Arg Val Ala Phe

370 375 380

Gly Gly Met Ala Gly Ile Pro Lys Arg Ala Ala Ala Phe Glu Ala Ala

385 390 395 400

Leu Ile Gly Gln Asp Phe Asn Glu Asp Thr Ile Ala Ala Ala Leu Pro

405 410 415

Leu Leu Glu Arg Asp Phe Thr Pro Leu Ser Asp Met Arg Ala Ser Ala

420 425 430

Ala Tyr Arg Met Asn Ala Ala Gln Ala Met Ala Leu Arg Tyr Val Arg

435 440 445

Asp Arg Ala Gly Leu Pro Val Ser Val Leu Glu Val Thr Pro

450 455 460

<210> 2

<211> 777

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Ser Val Gly Lys Pro Leu Pro His Asp Ser Ala Arg Ala His Val

1 5 10 15

Thr Gly Gln Ala Arg Tyr Leu Asp Asp Leu Pro Cys Pro Ala Thr Thr

20 25 30

Leu His Leu Ala Phe Gly Leu Ser Thr Glu Ala Phe Ala Ala Ile Thr

35 40 45

Ala Leu Asp Leu Asp Pro Val Arg Gln Ser Pro Gly Val Val Ala Val

50 55 60

Phe Thr Ala Ala Asp Leu Pro His Asp Asn Asn Ala Ser Pro Ala Pro

65 70 75 80

Ser Pro Glu Pro Val Leu Ala Thr Gly Glu Val His Phe Ile Gly Gln

85 90 95

Pro Ile Phe Leu Val Ala Ala Thr Ser His Arg Ala Ala Arg Ile Ala

100 105 110

Ala Arg Lys Ala Arg Val Ile Tyr Ala Pro Arg Pro Ala Val Leu Thr

115 120 125

Leu Asp Gln Ala Leu Ala Ala Asn Ser Arg Phe Glu Ala Gly Pro Val

130 135 140

Ile Trp Ala Arg Gly Asp Val Glu Thr Ala Leu Ala Gly Ala Ala His

145 150 155 160

Leu Val Glu Gly Met Val Glu Ile Gly Gly Gln Glu His Phe Tyr Leu

165 170 175

Glu Gly Gln Ala Ala Leu Ala Leu Pro Ser Glu Ser Gly Val Val Ile

180 185 190

Gln Cys Ser Ser Gln His Pro Ser Glu Ile Gln His Lys Val Ala His

195 200 205

Ala Leu Gly Leu Ala Phe His Asp Val Arg Val Glu Met Arg Arg Met

210 215 220

Gly Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Ser Gln Gly Asn His Leu Ala Ile

225 230 235 240

Ala Cys Ala Val Ala Ala Gln Glu Thr Gly Arg Pro Cys Lys Met Arg

245 250 255

Tyr Asp Arg Asp Asp Asp Met Val Ile Thr Gly Lys Arg His Asp Phe

260 265 270

Arg Ile Arg Tyr Arg Ile Gly Ala Asp Ala Ser Gly Lys Leu Val Gly

275 280 285

Ala Asp Phe Leu His Leu Ala Arg Cys Gly Trp Ser Ala Asp Leu Ser

290 295 300

Leu Pro Val Cys Asp Arg Ala Met Leu His Ala Asp Gly Ser Tyr Phe

305 310 315 320

Val Pro Ala Leu Arg Ile Glu Ser His Arg Leu Arg Thr Asn Thr Gln

325 330 335

Ser Asn Thr Ala Phe Arg Gly Phe Gly Gly Pro Gln Gly Ala Leu Gly

340 345 350

Met Glu Arg Ala Ile Glu His Leu Ala Arg Arg Met Gly Arg Asp Pro

355 360 365

Ala Glu Leu Arg Ala Leu Asn Phe Tyr Asp Ala Pro Glu Ala Gly Gly

370 375 380

Leu Ser Ala Pro Pro Ser Pro Pro Glu Arg Ser Glu Thr Lys Lys Lys

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Gln Thr Thr His Tyr Gly Gln Glu Val Ala Asp Cys Val Leu Thr Glu

405 410 415

Leu Val Ala Arg Leu Gln Lys Ser Ala Asp Phe Val Ala Arg Lys Ala

420 425 430

Glu Ile Ala Glu Trp Asn Ser Arg Asn Arg Thr Leu Ala Arg Gly Ile

435 440 445

Ala Leu Ser Pro Val Lys Phe Gly Ile Ser Phe Thr Leu Thr His Leu

450 455 460

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Leu Asn His Gly Gly Thr Glu Met Gly Gln Gly Leu His Ala Lys Met

485 490 495

Val Gln Val Ala Ala Ala Val Leu Gly Ile Asp Ala Ala Gln Val Arg

500 505 510

Val Thr Ala Thr Asp Thr Ser Lys Val Pro Asn Thr Ser Ala Thr Ala

515 520 525

Ala Ser Ser Gly Ala Asp Met Asn Gly Met Ala Val Lys Asp Ala Cys

530 535 540

Glu Ile Leu Arg Gly Arg Leu Ala Gly Phe Val Ala Ala Arg Glu Gly

545 550 555 560

Cys Ala Glu Pro Glu Val Val Phe Asp Ala Gly Gln Val Arg Ala Gln

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Gly Lys Arg Trp Ser Phe Ala Glu Thr Val Ala Ala Ala Tyr Met Ala

580 585 590

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725 730 735

Ile Ser Ala Phe Leu Ala Leu Asn Asp Ala Cys Ala Ala Cys Gly Pro

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770 775

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

Met Glu Ile Ala Phe Leu Leu Asn Gly Glu Thr Arg Arg Leu Arg Ile

1 5 10 15

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Leu Ala Gly Asn Leu Cys Arg Cys Thr Gly Tyr Ala Pro Ile Leu Arg

130 135 140

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145 150 155 160

Asp Ala Leu Phe Thr Leu Ala Glu Ile Ser Ser Gly Val Arg Gly Gln

165 170 175

Thr Ala Pro Ala Val Leu Pro Glu Thr Gly Asp Ala Leu Ala Ala Trp

180 185 190

Tyr Leu Ala His Pro Glu Ala Thr Leu Ile Ala Gly Gly Thr Asp Val

195 200 205

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210 215 220

Leu Ser His Cys Lys Asp Leu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Ala Asp Gly

225 230 235 240

Val Val Ile Gly Ala Gly Val Thr Ile Ala Ala Leu Arg Ala Trp Ala

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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Leu Thr Leu Arg Arg Gly Ala Glu Arg Arg Thr Met Pro Leu Glu Ala

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Phe Phe Leu Asp Tyr Arg Lys Gln Asp Arg Arg Pro Gly Glu Phe Val

325 330 335

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340 345 350

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Ser Lys Arg Phe Glu Gln Asp Ile Ser Ala Val Cys Gly Cys Phe Asn

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Leu Thr Leu Lys Gly Ser Ile Ile Glu Thr Ala Arg Val Ala Phe Gly

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405 410 415

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450 455 460

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465 470 475

<210> 4

<211> 4654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atggaaattg cgtttcttct caatggagaa acccggcggt tgcggatcgg ggatccgacg 60

caaagcctgc tggactggct gcgcgccgag ggtctgaccg gcaccaagga gggctgcaac 120

gagggcgatt gcggcgcctg cacggtgatg gtgaccgacg cggcaggccc ccgcgccgtc 180

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atcgccgcgc cggacggccg cctgcacccg gtgcaacagg cgatgatcga ccatcacggc 300

agccaatgcg gcttttgcac ccccggtttc gttgtctcga tggccgcggc gcatggccaa 360

ggccgccggg attacgacga ctttctggcg ggcaacctct gccgctgcac cggctacgcg 420

ccgatcctgc gcgccgccga agccgccgaa gcggaaccgc ccgccgagtg gctgcaagcc 480

gatgcccttt tcactttggc ggaaatatcc tcgggcgtgc gggggcagac agcccccgcg 540

gtcctgcccg aaaccgggga tgcgctggcc gcatggtatc tcgcccatcc cgaggcaacg 600

ctgatcgcgg gcggaaccga tgtcagcctc tgggtgacga aagcgctgcg cgacctgccc 660

gaggtggcgt ttctcagcca ttgcaaggac ttggcgcaga tccgagagac cgctgatggg 720

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atcggcggca acatcgccaa cggctcgccg atcggcgacg gcccgccggc gctgatcgcg 900

ctgggggcaa gcctgacact ccggcgcggc gccgaacgcc gcacgatgcc ccttgaggct 960

ttcttcctcg attaccgcaa gcaggaccgg cgtccgggcg agttcgtcga aagcgtcacc 1020

ctaccgaaat ccgcgccggg tctgcgctgc tacaaattgt cgaaaaggtt cgatcaggac 1080

atttctgcgg tctgcggatg cttcaatctg accctgaaag gttcgataat tgaaactgcg 1140

cgcgtggcat tcggcggcat ggcggggatc ccgaaacggg ccgcagcctt cgaagcggcg 1200

ctgatcgggc aggatttcaa cgaagacacg atcgccgcgg cgctgccgct gctggagcgc 1260

gatttcacgc cgctttccga catgcgcgcc tcggccgcct atcggatgaa tgcggcgcag 1320

gcgatggcct tgcgctatgt ccgcgaccgc gcgggcctgc ccgtctcggt gctggaggtg 1380

acgccatgag cgttggcaag ccgctgccgc acgactcggc gcgggcgcat gtgaccgggc 1440

aggcgcgtta ccttgacgac ctgccctgcc ccgcgaccac gctgcatctg gcctttggcc 1500

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ccggtgtggt ggccgtcttc acggcagccg atctgccgca tgacaacaat gcctcgcccg 1620

cgcccagccc ggaacccgtt ctggcgacgg gcgaggtgca tttcatcggc cagccgatct 1680

ttctggtcgc cgccaccagc caccgcgcgg cgcggatcgc tgcccgcaag gcgcgcgtca 1740

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aggcggcgct ggccctgcct tcggaaagcg gggtggtgat ccagtgttcg agccagcatc 1980

cgtcggagat ccagcacaag gtggcgcatg ctttggggct ggcgttccac gatgtgcggg 2040

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ggtcggcgga tctgagcctg ccggtctgcg accgcgcgat gctgcatgcc gatggcagct 2340

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cgaaagtgcc caatacctcg gccaccgcgg cctcttcggg cgccgacatg aacggcatgg 3000

cggtgaagga cgcctgcgag atcctgcgcg ggcggctggc cggttttgtc gctgcgcgcg 3060

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tggatatcgg gcagatcgag ggcgcctatg tgcagggcgc gggctggctg acgaccgagg 3420

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cctttctggc gctgaatgac gcctgcgccg cctgcgggcc gcattggcct gacctgcagg 3660

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cggtggcgcg gtgacgctgg ccttcgaacc gctggacgcc gcaactctga cgcggatcga 4020

ggggccgttt catgcccgcc ccctgacccg ccccgcgatg ccgctttcgg tgcagcgcgc 4080

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cgccgatctg gtgccgcttg ccgcaaggtc agcacaccat ctgatcctga ccttctcgca 4380

tgcgctcgac ctcgagttgt gccaccgggt tctgcgccac ggctttgctg cctgcgggtt 4440

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<211> 4699

<212> DNA

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<220>

<223>

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atggaaattg cgtttcttct caatggagaa acccggcggt tgcggatcgg ggatccgacg 60

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ggccgccggg attacgacga ctttctggcg ggcaacctct gccgctgcac cggctacgcg 420

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cgcggcgatt cccgacgcag tcaccccggt cattgccgaa aatcccgccg atctggtgcc 4380

gcttgccgca aggtcagcac accatctgat cctgaccttc tcgcatgcgc tcgacctcga 4440

gttgtgccac cgggttctgc gccacggctt tgctgcctgc gggttgatcg gttcgcagac 4500

caaatggtca agattccagc gccgcctgcg cgatctgggg cacgcccacg cgcaaatttc 4560

gcgcattgcc tgcccgatag gcgatcctgc attgggaaag gagccgcagg ccattgcgat 4620

ttccgtcgcc gccgcgctac tgagagagcg ggtcggccat gccgggctga ccgtcaacac 4680

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

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<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

ttccgaagcc aggcggcgca acagatccgc cag 33

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

gtcgaaaagg ttcgaacagg acatttctgc ggtctgcgga tgcttcaatc tgaccctg 58

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

ctgttcgaac cttttcgaca atttgtagca gaccgcagaa atgtcctg 48

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

caggacattg cagcggtctg cggatgcttc aatctg 36

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

gcagaccgct gcaatgtcct gatcgaacct tttcgac 37

<210> 12

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

Met Ser Leu Asp Leu Gln Gly Leu Ala Gln Ala Ala Ala Lys Gly Pro

1 5 10 15

Phe Val Arg Val Leu Val Val Glu Thr Lys Gly Ser Thr Pro Arg Glu

20 25 30

Val Gly Ala Glu Met Arg Val Trp Pro Asp His Met Gln Gly Thr Ile

35 40 45

Gly Gly Gly Thr Leu Glu Ala Glu Ala Ile Thr Ile Ala Arg Ser Leu

50 55 60

Arg Ala Pro Ala Leu Arg Arg Phe Pro Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gln

65 70 75 80

Cys Cys Gly Gly Ala Val Thr Leu Ala Phe Glu Pro Leu Asp Ala Ala

85 90 95

Thr Leu Thr Arg Ile Glu Gly Pro Phe His Ala Arg Pro Leu Thr Arg

100 105 110

Pro Ala Met Pro Leu Ser Val Gln Arg Ala Leu Ser Arg Ala Arg Asn

115 120 125

Ser Gly Glu Ala Pro Pro Leu Leu Leu Asp Gly Trp Leu Ile Glu Pro

130 135 140

Leu Thr Pro Pro Ala Gln Glu Leu Trp Ile Trp Gly Ala Gly His Val

145 150 155 160

Gly Arg Ala Leu Val Ser Thr Leu Ala Pro Leu Pro His Trp Ser Ile

165 170 175

Arg Trp Ala Asp Ile Asp Glu Ser Arg Phe Pro Ala Ala Ile Pro Asp

180 185 190

Ala Val Thr Pro Val Ile Ala Glu Asn Pro Ala Asp Leu Val Pro Leu

195 200 205

Ala Ala Arg Ser Ala His His Leu Ile Leu Thr Phe Ser His Ala Leu

210 215 220

Asp Leu Glu Leu Cys His Arg Val Leu Arg His Gly Phe Ala Ala Cys

225 230 235 240

Gly Leu Ile Gly Ser Gln Thr Lys Trp Ser Arg Phe Gln Arg Arg Leu

245 250 255

Arg Asp Leu Gly His Ala His Ala Gln Ile Ser Arg Ile Ala Cys Pro

260 265 270

Ile Gly Asp Pro Ala Leu Gly Lys Glu Pro Gln Ala Ile Ala Ile Ser

275 280 285

Val Ala Ala Ala Leu Leu Arg Glu Arg Val Gly His Ala Gly Leu Thr

290 295 300

Val Asn Thr Glu Gly Gln Thr Gly

305 310

Claims

1.一种蛋白质，由α亚基和β亚基构成，其特征在于：所述α亚基为如下(a1)-(a3)中任一；所述β亚基为如下(b1)；

(a1)氨基酸序列为序列表中序列3所示的亚基；

(a2)将序列表中序列1的第270位的丙苯氨酸替换为亮氨酸后得到的氨基酸序列所示的亚基；

(a3)将序列表中序列1的第362位的丝氨酸替换为丙氨酸后得到的氨基酸序列所示的亚基；

(b1)氨基酸序列为序列表中序列2所示的亚基。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)-6)中任一所示DNA分子：

1)序列表中序列5所示DNA分子；

2)序列表中序列5的第1-3764位所示DNA分子；

6)将序列表中序列4的第1084-1086位的tct替换为gca后所得序列的第1-3719位所示DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、宿主细胞或微生物。

5.权利要求1所述的蛋白质在作为黄嘌呤氧化酶中的应用；

所述应用为非疾病诊断治疗性应用。

6.权利要求1所述的蛋白质作为黄嘌呤氧化酶在如下任一中的应用：

(a)降解次黄嘌呤和/或黄嘌呤；

(b)降解含有次黄嘌呤和/或黄嘌呤的材料；

所述应用为非疾病诊断治疗性应用。

7.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、宿主细胞或微生物在如下任一中的应用：

(A)制备具有黄嘌呤氧化酶活性的产品；

8.下述任一生物材料：

I)蛋白质，其氨基酸序列为如下(1)-(3)中任一：

(1)序列表中序列3；

II)基因，其核苷酸序列为如下1)-3)中任一：

1)序列表中序列5的第1-1434位；

9.权利要求8所述生物材料在如下任一中的应用：

(A)制备具有黄嘌呤氧化酶活性的产品；

10.一种制备权利要求1所述蛋白质的方法，是将权利要求2或3所述的核酸分子导入大肠杆菌进行诱导表达，得到所述蛋白质。