CN105734027B

CN105734027B - 一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN105734027B
Application number: CN201410764840.5A
Authority: CN
Inventors: 邢新会; 王成华; 张翀
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2019-03-05
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: CN105734027A

Abstract

本发明公开了一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用。本发明公开一种蛋白，该蛋白是由如下(1)所示的蛋白质和/或(2)所示的蛋白质组成：(1)SEQ ID No.4所示的蛋白质或将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；(2)SEQ ID No.5所示的蛋白质或将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的黄嘌呤脱氢酶有利于与其他酶类联用进一步开发新的应用领域，尤其适合于样品检测和工业化应用等商业化应用的需求。

Description

一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

背景技术

黄嘌呤氧化还原酶(Xanthine oxidoreductase，简称XOR)是一种包含[2Fe-2S]簇、钼蝶呤和黄素辅基的结构复杂的氧化还原酶类，它是黄嘌呤氧化酶(Xanthineoxidase,简称XOD，EC 1.17.3.2)和黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase，简称XDH，EC1.17.1.4)两种不同存在形式的通称。XOR能够利用多种类型的电子受体，如分子氧、NAD、亚甲基蓝、苯醌、高铁氰化物和硝酸盐，催化包括嘌呤、蝶啶、杂环分子和醛类在内的多种底物的氧化反应(李丽书，陈献华，邵叶波，刘璇，徐平，《黄嘌呤氧化还原酶的结构、功能和作用》，细胞生物学杂志，2004，26:381-384)。因此，XOR作为一种具有广泛用途的重要商业用酶，用于生产黄嘌呤氧化酶抗体和临床诊断试剂盒，以及酶法生物合成病毒唑等核苷类药物和降解有机污染物等(Agarwal,A.,A.Banerjee,and U.C.Banerjee,Xanthineoxidoreductase:a journey from purine metabolism to cardiovascular excitation-contraction coupling.Crit Rev Biotechnol,2011.31(3):264-80。孟疆辉,陈蔚梅,利用黄嘌呤氧化酶提高病毒唑转化率.武汉大学学报(自然科学版).1999.45(6):838-840)。

目前，市场上广泛采用的XOR是XOD，主要提取自牛奶奶油等动物源材料和野生藤黄节杆菌等野生微生物，如Sigma公司提供的牛奶XOD，日本TOYOBO公司提供的细菌XOD。XOD是由前体蛋白XDH经过巯基氧化可逆转变或者通过酶解断裂不可逆转变而来，可以利用分子O₂作为电子受体，但失去了XDH所具有的利用NAD作为电子受体的能力。由于溶液中溶解氧含量受到温度、压力、盐分和有机物含量等因素影响，商品化XOD在运用于样品检测时，样品中溶解氧量对样品测定结果造成影响，同时也对限制工业化应用中的酶法转化合成及底物降解过程。除此之外，XDH到XOD的复杂转变过程，影响到XOD的活性和得率，增加了酶的使用成本。因此，有必要获取对分子氧依赖性低而高活性的XOR酶类。

黄嘌呤脱氢酶，作为黄嘌呤氧化酶的前体蛋白，在生物体内是转化生成的直接产物，避免复杂转化工艺带来的酶活降低，同时不受溶解氧影响。研究表明，微生物来源的XDH具有比动植物来源XDH更高的温度耐受性和催化活性，更加适合于商业化应用。然而，迄今为止除了只有极少数牛和鸡来源XDH可以商业途径获取，比如美国MyBioSource公司提供的牛XDH，尚未见到商品化微生物来源XDH的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用。

本发明提供一种蛋白，该蛋白是由如下(1)所示的蛋白质和/或(2)所示的蛋白质组成：

(1)SEQ ID No.4所示的蛋白质或将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

(2)SEQ ID No.5所示的蛋白质或将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：

1)SEQ ID No.3中自5’末端起第30位至第3748位核苷酸所示的DNA分子；

2)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

3)SEQ ID No.3中自5’末端起第30位至第1418位核苷酸所示的DNA分子；

4)SEQ ID No.3中自5’末端起第1415位至第3748位核苷酸所示的DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

6)与1)或2)或3)或4)或5)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

一种制备上述蛋白的方法也属于本发明的保护范围，包括将SEQ ID No.3所示的DNA分子导入大肠杆菌中进行诱导表达，得到所述蛋白。

上述方法中，所述SEQ ID No.3所示的DNA分子是通过重组表达载体导入所述大肠杆菌中的；

所述重组表达载体是将SEQ ID No.3所示的DNA分子插入pTrc99A的NcoI和HindIII位点间得到的；

所述诱导具体为IPTG诱导。

上述任一所述的方法中，所述诱导表达之后还包括离心收集大肠杆菌、破碎大肠杆菌得到破胞液、将破胞液离心收集上清的步骤。

上述任一所述的方法中，所述将破胞液离心收集上清之后还包括将所述上清进行镍柱亲和层析的步骤；

所述镍柱亲和层析的步骤如下：

1)在所述上清中加入终浓度为300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑，并用滤膜过滤，得到滤液；

2)将滤液上样镍柱亲和树脂，依次用含10mmol/L、30mmol/L和50mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液洗涤杂蛋白，每次洗脱的体积至少为20个柱体积，然后用含120mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液即得，洗脱的流速均为2.5ml/min。

上述蛋白或上述任一所述的编码基因在制备具有黄嘌呤脱氢酶活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述蛋白或上述任一所述的编码基因在降解黄嘌呤或次黄嘌呤中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供的黄嘌呤脱氢酶由大小约为49.1kDa、序列如SEQ ID No.4所示的小亚基和大小约为83.2kDa、序列如SEQ ID No.5所示的大亚基两种亚基组成,该黄嘌呤脱氢酶最适pH为8.0-8.5，pH4.5-10.5范围内稳定，最适温度为35-40℃，25-50℃范围内稳定，对黄嘌呤的K_m值为57.81±5.96μM，比活力可达20.89±1.46U/mg蛋白。

本发明提供的黄嘌呤脱氢酶明显不同于已有的商品化黄嘌呤氧化酶及已报道的黄嘌呤脱氢酶，该黄嘌呤脱氢酶高的催化效率和不依赖于分子氧(黄嘌呤脱氢酶利用NAD作为电子受体，不管是否存在氧气均可以发生反应)的特性有利于减少酶的用量、降低成本和消除使用时对溶解氧的需求，宽泛的pH耐受性和温度耐受性有利于与其他酶类联用进一步开发新的应用领域，尤其适合于样品检测和工业化应用等商业化应用的需求，并可以将本发明提供的黄嘌呤脱氢酶的应用领域拓展至其它催化底物，例如其它嘌呤、蝶啶、杂环分子和醛类在内的多种底物的氧化反应，和亚甲基蓝、苯醌、高铁氰化物和硝酸盐等多种类型的电子受体，进一步将该黄嘌呤脱氢酶应用于生物传感器领域。

附图说明

图1为含荚膜红细菌黄嘌呤脱氢酶基因的重组质粒pTrc99A-RcXDHNHis的构建示意图。

图2为纯化的重组黄嘌呤脱氢酶的SDS-PAGE电泳图。

图3为纯化的重组黄嘌呤脱氢酶的酶活和稳定性随温度变化图。

图4为纯化的重组黄嘌呤脱氢酶的酶活和稳定性随pH变化图。

图5为纯化的重组黄嘌呤脱氢酶催化黄嘌呤反应进程及其双倒数曲线图。

图6为黄嘌呤脱氢酶催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸反应过程示意图。

图7为纯化的重组黄嘌呤脱氢酶液降解黄嘌呤和次黄嘌呤生成尿酸随时间变化图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pTrc99A为中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心Biovector Science Lab,Inc.产品，产品目录号为Biovector108321。

镍离子金属鳌合亲和层析介质－镍柱亲和树脂为Qiagen公司产品，产品目录号为30210。

黄嘌呤和次黄嘌呤为Sigma公司产品，产品目录号分别为Sigma X7375-10g和Sigma H9377。

下述实施例中的重组黄嘌呤脱氢酶均是指实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶。

实施例1、含荚膜红细菌黄嘌呤脱氢酶基因的重组质粒pTrc99A-RcXDHNHis的构建

一、提取保藏编号为CGMCC 1.3366的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)的基因组DNA。

二、设计并合成如下引物

上游引物：5’-GGCTCATGATGCATCATCACCATCACCATATGGAAATTGCGTTTCTTCTCAATG-3’(SEQ ID No.1)

(下划线所示序列为PagI酶切识别位点，斜体部分为方便纯化而引入的6xHis tag纯化标签的编码序列)

下游引物：5’-GCCAAGCTTATCACCCGGTCTGTCCTTCC-3’(SEQ ID No.2)

(下划线所示序列为Hind III酶切识别位点)

三、以步骤一提取的荚膜红细菌的基因组DNA为模板，以上游引物和下游引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为4693bp的PCR扩增产物，即为黄嘌呤脱氢酶基因簇，该基因簇序列如SEQ ID No.3所示。

SEQ ID No.3中自5’末端起第30位至第3748位为黄嘌呤脱氢酶的编码基因序列，其中第30位至第1418位为黄嘌呤脱氢酶的小亚基的编码基因序列，该黄嘌呤脱氢酶的小亚基的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，大小为约49.1kDa；其中第1415位至第3748位为黄嘌呤脱氢酶的大亚基的编码基因序列，该黄嘌呤脱氢酶的大亚基的氨基酸序列如SEQ IDNo.5所示，大小为83.2kDa；SEQ ID No.3中自5’末端起第3748位至第4683位为黄嘌呤脱氢酶伴侣蛋白的编码基因序列，该黄嘌呤脱氢酶伴侣蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，大小为33.4kDa。

四、Pag I和Hind III双酶切SEQ ID No.3所示的DNA分子，得到基因片段；NcoI和Hind III双酶切pTrc99A，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pTrc99A-RcXDHNHis，将pTrc99A-RcXDHNHis送测序，结果正确。

pTrc99A-RcXDHNHis的构建过程如图1所示。

实施例2、重组黄嘌呤脱氢酶的纯化

一、将pTrc99A-RcXDHNHis转化大肠杆菌DH5α，得到重组菌，挑取重组菌单菌落，接种于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220r/min条件下培养过夜。将过夜培养的菌液，按照1％的接种量转接于500ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220r/min条件下培养，待菌液培养至OD₆₀₀为0.6左右，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导剂，同样条件下继续诱导培养16h。

二、将步骤一得到的菌液9000r/min、4℃离心，收集沉淀，得到诱导表达的工程菌，沉淀用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)洗涤一次后，重悬于100ml同样的缓冲液中，得到菌悬液，将菌悬液通过高压细胞破碎机JN-10HC(广州聚能生物科技有限责任公司)破胞，流速10L/H，4℃，压力为150MPa，破胞液于12000r/min 4℃下离心30min，上清液为粗酶液。

三、金属螯合层析法纯化重组黄嘌呤脱氢酶

(一)在粗酶液中加入终浓度为300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑，并用0.22μm滤膜过滤，得到滤液；

(二)将总体积为40ml的滤液上样镍柱亲和树脂，依次用含10mmol/L、30mmol/L和50mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液洗涤杂蛋白，每次洗脱的体积至少为20个柱体积，然后用含120mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱液为目的重组酶，以上洗脱的流速均为2.5ml/min。

(三)将洗脱的目的重组酶通过分子截留量为10KDa的Millipore超滤管，用50mmol/L pH 7.5Tris盐酸缓冲溶液反复换洗三次以除去盐分及咪唑成份后，得到浓缩酶液，再将其重悬于50mmol/L pH 7.5Tris盐酸缓冲液中，得到重组酶。

将重组酶进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE检测，结果如图2所示。

图2中，XdhB代表大小约为83.2kDa的大亚基(氨基酸序列如SEQ ID No.5所示)，XdhA代表大小约为49.1kDa的小亚基(氨基酸序列如SEQ ID No.4所示)。

结果表明该重组酶(以下简称为重组黄嘌呤脱氢酶)由XdhB和XdhA组成，黄嘌呤脱氢酶伴侣蛋白只是辅助形成活性黄嘌呤脱氢酶，成熟的黄嘌呤脱氢酶并不含有该伴侣蛋白。

实施例3、重组黄嘌呤脱氢酶的表征

一、黄嘌呤脱氢酶酶活性的测定方法

2mL反应体系如表1所示。

表1黄嘌呤脱氢酶酶活测定的2mL反应体系组成

将表1中的2mL反应体系中除实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶水溶液外的其余试剂混匀后置于35℃水浴温浴5min，然后加入100μL实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶水溶液启动反应。在35℃条件下边反应边记录反应3-5min内OD₂₉₅吸光值变化，计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间变化速率(ΔOD₂₉₅/min)，吸光度随时间变化速率(ΔOD₂₉₅/min)反映的是实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶催化黄嘌呤生成尿酸的速率。

按照下述公式计算所检测的实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶的酶活和比酶活。

酶活(U/ml)＝ΔOD₂₉₅/min×1.6×df (公式1)

比酶活(U/mg)＝(U/ml)×1/C (公式2)

公式1中1.6为采用消光系数法将上述2ml反应体系中尿酸从吸光度变化转化为摩尔浓度的计算系数，该系数计算方法为：

(公式3)

其中：Vt为反应总体积(2.0ml)，Vs为反应体系中酶液体积(0.1ml)，12.5为

测定条件下尿酸的摩尔消光系数(cm²/μmol)，1.0cm为测定比色杯光程。

公式1中df为酶液稀释倍数。

公式2中C为酶液的浓度，单位为mg/ml。

酶活力单位(U)定义：在测定温度和pH值条件下每分钟转化生成1μmol尿酸所需要的酶量。

二、最适温度和温度耐受性的测定

最适温度的测定通过将表1的200μl反应体系分别置于25-80℃区间范围内测定酶活，方法同步骤一，仅将水浴温度替换为25-80℃区间，相对酶活用残余酶活相对于最大酶活的百分比来表示，最适温度用相对酶活的最大值对应的温度表示。

实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶催化活性随反应温度变化曲线如图3A所示。图3A表明，重组黄嘌呤脱氢酶的最适反应温度为35-40℃。

温度耐受性的测定是通过将实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶在25-80℃区间不同温度下分别处理30min，然后采用步骤一中的方法测定残余酶活，相对酶活用残余酶活性相对于未经过处理的重组黄嘌呤脱氢酶的酶活性的百分比来表示。

实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶温度耐受性的测定结果如图3B所示。图3B表明，在25-50℃以下，重组黄嘌呤脱氢酶保持稳定。

三、最适pH和pH耐受性的测定

最适pH值通过测定pH 4.0-11.0范围内的相对酶活，用最大酶活对应的pH值表示。具体是将表1中反应体系中最终浓度为0.05M的pH 8.5Tris盐酸缓冲溶液分别替换为pH4.0-5.8的0.05M乙酸缓冲体系、pH 5.8-8.0的0.05M磷酸缓冲体系、pH 7.5-9.0的0.05M的Tris盐酸缓冲体系和pH 9.0-11.0的0.05M的碳酸钠缓冲体系进行测定。

结果如图4A所示。图4A表明，重组黄嘌呤脱氢酶的最适pH值在8.0-8.5之间。

pH耐受性的测定是通过将重组黄嘌呤脱氢酶液置于pH 4.0-11.0区间不同pH值0.05M缓冲溶液(pH 4.0-5.8为0.05M乙酸缓冲体系；pH 5.8-8.0为0.05M磷酸缓冲体系；pH7.5-9.0为Tris盐酸缓冲体系；pH 9.0-11.0为碳酸钠缓冲体系)中，于室温放置16h。然后采用步骤一中的方法测定残余酶活，相对酶活用残余酶活性相对于未经过处理的重组黄嘌呤脱氢酶的酶活性的百分比来表示。

结果如图4B所示。图4B表明，在pH4.5-10.5范围内，重组黄嘌呤脱氢酶保持稳定。

四、酶促动力学参数

按照步骤一的方法测定实施例2的重组黄嘌呤脱氢酶的酶活力，结果表明在最适pH8.5和最适温度35℃条件下，测定0.001-5mM区间不同浓度黄嘌呤条件下，重组黄嘌呤脱氢酶催化反应的最初反应速度，采用双倒数法，测定酶促动力学参数。

测定结果如图5所示

图5中，A为重组黄嘌呤脱氢酶催化黄嘌呤反应进程，B为双倒数曲线图。

图5表明，重组黄嘌呤脱氢酶对黄嘌呤的K_m为57.81±5.96μM，k_cat值为46.36±3.23s^-1，比酶活可达20.89±1.46U/mg蛋白。

实施例4、黄嘌呤脱氢酶测定黄嘌呤和次黄嘌呤

黄嘌呤脱氢酶利用NAD⁺为电子受体，将来自水分子的氧原子特异性加成到底物分子含氮杂环中sp2杂化的碳原子上形成氧化产物，催化过程如图6所示。黄嘌呤脱氢酶催化次黄嘌呤生成黄嘌呤和NADH，并进而催化黄嘌呤生成尿酸和NADH的反应式如下：

基于这一特异性反应，通过检测尿酸产物的变化，黄嘌呤脱氢酶可被用作测定样品中黄嘌呤和次黄嘌呤的试剂。进而，以黄嘌呤脱氢酶为基础试剂，添加人工电子受体，选择性添加电子介电体，及其它辅助试剂包括显色试剂、缓冲溶液、特异性抑制尿酸酶活性的抑制剂等，组成检测用试剂盒，可用于检测样品中黄嘌呤和次黄嘌呤。

参照表1构建如下反应体系：

(1)0.1M Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)1ml，10mM EDTA水溶液(pH 7.5)200μL，10mM氧嗪酸钾水溶液20μL，100mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)水溶液2μL，ddH₂O 758μL，实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶3.2μg(12nmol)。

将所述各试剂混匀后置于35℃水浴温浴5min，然后分别加入100μL浓度分别为0.02mM、0.2mM、0.4mM、0.8mM、1mM和2mM的黄嘌呤水溶液(pH 7.5)启动反应，在35℃条件下边反应边记录反应3-5min内OD₂₉₅吸光值变化，计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间变化速率(ΔOD₂₉₅/min),采用实施例3中酶学性质测定方法，按照公式1，求解酶催化反应速度，记为V。

(2)采用实施例3中酶促反应动力学参数求解方法，解得在上述检测条件下，即pH7.5和35℃，酶促动力学方程，V＝[S]/(K_m+[S])*V_max＝21.42*[S]/(22.24+[S]),其中：表观米氏常数K_m为22.24μM，最大反应速度V_max为21.42μM.min^-1，[S]为底物浓度，单位为μM，V为反应速度，单位为μM.min^-1。由此，可以由米氏方程的变换形式：[S]＝VK_m/(V_max-V)＝22.24*V/(21.42-V)求解不同反应速度对应的底物浓度。

(3)将(1)中不同底物浓度黄嘌呤溶液对应的反应速度V代入(2)中公式：[S]＝22.24*V/(21.42-V)，即可计算出底物浓度，然后再乘以稀释系数20，计算出样品中黄嘌呤的浓度含量。

计算结果如表2所示。

表2重组黄嘌呤脱氢酶检测0.02-2mM黄嘌呤水溶液结果

各样品中底物浓度实际值	0.02mM	0.2mM	0.4mM	1mM	2mM
						ΔOD<sub>295</sub>/min	0.0072	0.041	0.063	0.095	0.108
反应速度(μM.min<sup>-1</sup>)	1.15	6.56	10.11	15.2	17.15
						反应体系中底物浓度(μM)	1.25	9.8	19.9	54.5	94.5
样品中底物浓度计算值(mM)	0.025	0.196	0.398	1.09	1.89

以表2中各样品的底物浓度实际值为横坐标(x)，以底物浓度计算值为纵坐标(y)作图，可得到曲线方程为y＝0.9549x+0.0284，相关系数(R²)为0.99。

以上结果表明，当样品中的黄嘌呤浓度在0.02mM－2mM范围内，基于酶促反应方程，利用重组黄嘌呤脱氢酶作为检测试剂测定的底物浓度值与真实值之间满足线性关系。

实施例5、黄嘌呤脱氢酶在降解黄嘌呤和次黄嘌呤以及处理含该类底物的材料中的应用

参照表1中黄嘌呤脱氢酶反应体系的构建方法，构建如下a)至d)四组反应体系：

a)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，0.1mM的黄嘌呤和1.59mg/L实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶；

b)50mMTris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，5mM的次黄嘌呤，和1.59mg/L实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶；

c)50mMTris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，0.1mM的黄嘌呤，和1.59mg/L实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶；

d)50mMTris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，0.1mM的次黄嘌呤，和1.59mg/L实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶；

分别将a)和b)反应体系中除重组黄嘌呤脱氢酶外的所有试剂加入并混匀，置于35℃水浴中温浴5min，然后加入黄嘌呤脱氢酶启动反应，利用带有加热模块的分光光度计将反应温度控制在35℃条件下，边反应边记录反应3-5min内295nm下吸光值变化，绘制吸光度(ΔOD₂₉₅)的增加随时间变化的关系曲线、并计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间的变化速率(ΔOD₂₉₅/min)，从而检测底物黄嘌呤和次黄嘌呤的降解情况。

采用同样的操作方法，将c)和d)置于40℃温浴，然后加入重组黄嘌呤脱氢酶启动反应，记录40℃反应条件下ΔOD₂₉₅变化，检测底物黄嘌呤和次黄嘌呤的降解情况。

a)至d)反应体系中吸光度(ΔOD₂₉₅)的增加值随时间的曲线如图7所示。

图7表明，重组黄嘌呤脱氢酶可以在35℃和40℃下有效降解黄嘌呤和次黄嘌呤。a)至d)反应体系下的最大吸光度变化速度(ΔOD₂₉₅/min)分别为0.24、0.094、0.40和0.19，对应的降解速率分别为0.38μmol.L^-1.min^-1，0.15μmol.L^-1.min^-1，0.60μmol.L^-1.min^-1和0.30μmol.L^-1.min^-1，对应的比活力分别为2.42U/mg，0.96U/mg，1.92U/mg和3.79U/mg。

实施例6、黄嘌呤脱氢酶的活性比较

采用实施例3中步骤四的酶促动力学参数测定方法，分别测定黄嘌呤脱氢酶在(1)pH 7.5和25℃和(2)pH 8.5和25℃条件下的表观米氏常数K_m、催化常数k_cat和比活力。其中测定用的缓冲溶液为0.05M的Tris盐酸缓冲体系。测定结果如表3所示。

表3黄嘌呤脱氢酶在不同测定条件下酶学参数与现有技术对比

注：*文献1为Silke Leimükhler，Rachael Hodson,Graham N.George andK.V.Rajagopalan.Recombinant Rhodobacter capsulatus Xanthine Dehydrogenase,aUseful Model system for the Characterization of Protein Variants Leading toXanthinuria I in Humans.The Journal of Biological Chemistry,2003,278(23):20802-20811.

**文献2为Silvia Schumann,Miguel Saggu,Nadine Stefan D.Anker,Friedhelm Lendzian,Peter Hildebrandt and Silke Leimkühler.The Mechanism ofAssembly and Cofactor Insertion intoRhodobacter capsulatus XanthineDehydrogenase.JBC,2008,283(24):16602-16611.

***文献3为James Hall,Stefan Reschke,Hongnan Cao,Silke Leimkuhler andRuss Hille.The reductive half-reaction of xanthine dehydrogenase fromRhodobacter capsulatus.The role of Glu 232in catalysis.The Journal ofBiological Chemistry,doi:10.1074/jbc.M114.603456.

文献1、2和3中所报道黄嘌呤脱氢酶为来源相同的酶，但是文献3中酶活性按照钼元素含量进行过矫正，而文献1和2与本发明一样均未进行矫正。因此，为便于将本发明与已有技术进行比较，pH 7.5和25℃条件下酶学参数的比较，已有技术以文献2报道的数值为准。而pH 8.5和25℃条件下酶学参数，均以pH 7.5和25℃条件下测定值为相对标准归一化后进行比较。文献3中pH 8.5和25℃下黄嘌呤脱氢酶K_m、k_cat和最大比活分别为pH 7.5和25℃条件下的1.63、1.64和1.64倍，而本发明实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶的对应值分别为2.25、2.28和2.28倍。

因此，从表3可以看出，本发明实施例2制备的重组黄嘌呤脱氢酶，与文献中报道的黄嘌呤脱氢酶相比，具有更高的底物亲和力(K_m值较小)、催化常数和更高的催化效率，因此将具有更优的实施效果。

Claims

1.一种蛋白，该蛋白是由如下（1）所示的蛋白质和/或（2）所示的蛋白质组成：

（1）SEQ ID No.4所示的蛋白质；

（2）SEQ ID No.5所示的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种：

1）SEQ ID No.3中自5’末端起第30位至第3748位核苷酸所示的DNA分子；

2）SEQ ID No.3所示的DNA分子；

3）SEQ ID No.3中自5’末端起第30位至第1418位核苷酸所示的DNA分子；

4）SEQ ID No.3中自5’末端起第1415位至第3748位核苷酸所示的DNA分子；

5）在严格条件下与1）或2）或3）或4）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

6）与1）或2）或3）或4）或5）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.一种制备权利要求1所述蛋白的方法，包括将SEQ ID No.3所示的DNA分子导入大肠杆菌中进行诱导表达，得到权利要求1所述蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述SEQ ID No.3所示的DNA分子是通过重组表达载体导入所述大肠杆菌中的；

所述重组表达载体是将SEQ ID No.3所示的DNA分子插入pTrc99A的NcoI和Hind III位点间得到的。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述诱导表达之后还包括离心收集大肠杆菌、破碎大肠杆菌得到破胞液、将破胞液离心收集上清的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述将破胞液离心收集上清之后还包括将所述上清进行镍柱亲和层析的步骤。

9.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的编码基因在制备具有黄嘌呤脱氢酶活性的产品中的应用。

10.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的编码基因在降解黄嘌呤或次黄嘌呤中的应用；所述应用为非疾病诊断和治疗的应用。