CN101535476B

CN101535476B - 修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶

Info

Publication number: CN101535476B
Application number: CN2007800421102A
Authority: CN
Inventors: 川南裕; 辻裕二; 北林雅夫; 西矢芳昭
Original assignee: Toyo Textile Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd; Toyo Textile Co Ltd
Priority date: 2006-11-14
Filing date: 2007-11-12
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2027-11-12
Also published as: JP2009225800A; DE602007012130D1; ATE496124T1; CN101535476A; JP5282581B2; JP2009225801A; JP4348563B2; JP5169991B2; JP2008237210A; JP2009159964A

Abstract

本发明涉及一种提高了热稳定性的修饰型FADGDH，其是与野生型的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)相比提高了热稳定性的修饰型FADGDH，优选真核生物来源、进而优选丝状真菌来源、进而更优选曲霉菌属来源的FADGDH，例如具有在具有序列表的序列编号2或序列编号46中记载的氨基酸序列的FADGDH中至少1个氨基酸被置换、缺失、插入或添加的一级结构的修饰型FADGDH。

Description

修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶

技术领域

本发明涉及一种修饰了热稳定性的修饰型葡萄糖脱氢酶(GDH)，另外，本发明涉及以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的修饰型、FAD依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)、其制造方法以及葡萄糖传感器。

背景技术

由于糖尿病患者掌握平时自己的血糖值有助于治疗，所以自测血糖是很重要的。在自测血糖中使用的传感器利用以葡萄糖为底物的酶。作为这样的酶的例子，例如可以举出葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)(EC 1.1.3.4)。葡萄糖氧化酶具有对葡萄糖的特异性高、热稳定性出色的优点，所以很久以前就开始被用作血糖传感器用酶，其最初的公开实际上可以追溯到大约40年以前。在利用葡萄糖氧化酶的血糖传感器中，通过在氧化葡萄糖转换成D-葡萄糖酸-δ-内酯(D-glucono-δ-lactone)的过程中产生的电子经由介体(mediator)被传递到电极来进行测定，但由于在反应中生成的质子容易被传递给氧，所以存在溶解氧影响测定值的问题。

为了避免这样的问题，例如将NAD(P)依赖型葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47)或者吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone)(在本说明书中，还将吡咯喹啉醌记载为PQQ。)依赖型葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.5.2(过去为EC 1.1.99.17))用作血糖传感器用酶。它们的优势在于不受溶解氧的影响，但前者的NAD(P)依赖型葡萄糖脱氢酶(在本说明书中，还将NAD(P)依赖型葡萄糖脱氢酶记载为NADGDH)存在稳定性的缺乏或必需添加辅酶的繁杂性的问题。另一方面，后者的PPQ依赖型葡萄糖脱氢酶(在本说明书中，还将PPQ依赖型葡萄糖脱氢酶记载为PQQGDH。)由于缺乏底物特异性且还作用于麦芽糖或乳糖之类的葡萄糖以外的糖类，所以具有破坏测定值的准确性的缺点。

另外，在专利文献1中还公开了源自曲霉属(Aspergillus)的黄素结合型葡萄糖脱氢酶(在本说明书中，还将黄素结合型葡萄糖脱氢酶记载为FADGDH。)。由于该酶对木糖的作用性为对葡萄糖的作用性的10％左右，所以在测定接受木糖负荷试验的人的血糖的情况下，有时可能会破坏测定值的准确性。对于热稳定性而言，在50℃、15分钟处理下，为89％左右的活性残存率而对稳定性也出色。在专利文献2中报道了该酶的基因序列、氨基酸序列。

专利文献1：WO2004/058958

专利文献2：WO2006/101239

发明内容

本发明的目的在于提供一种与如上所述的公知的血糖传感器用酶相比在实用上更有利的可以在血糖值测定用试剂中使用的酶。

在专利文献2中记载了如下内容：通过液体培养或麸皮培养土曲霉(Aspergillus terreus)属野生型菌株，得到了黄素结合型葡萄糖脱氢酶；以及，对使编码源自土曲霉属的黄素结合型葡萄糖脱氢酶的基因分别在重组大肠杆菌、重组真菌(米曲霉(Aspergillus oryzae))、和重组酵母菌(假丝酵母(Candida)属)中表达而得到的酶进行了纯化。

另外，在专利文献2中还公开了关于这些酶特征测试以及适用于传感器时的特性比较的几个事项。

但是，本发明人等认为专利文献2的酶从产业上的要求的观点出发，其记载内容不充分，可能不满足其要求。例如可以举出，对于在被认为作为产业要求的重要的必要条件之一的最适合大量生产的大肠杆菌中表达的酶而言，没有同样作为极为重要的必要条件的温度稳定性的记载。因此，从酶的稳定供给的观点出发，以利用基因重组来生产该酶为思路，对现有技术进行了再探讨。另外，还以提供如下所述酶为目的进行了反复探讨，即：通过适当地改变源自米曲霉菌株的FADGDH的氨基酸序列，使其对木糖的反应性降低，在实用上更有利的可以在血糖值测定用试剂中使用的酶。

结果，还意外地得知：使其在作为被认为最适于大量生产的大肠杆菌中表达从而获得的FADGDH重组体(rFADGDH)的热稳定性比从野生型菌株培养·纯化得到的酶差很多。

例如，发明人等利用后述的方法从米曲霉获得的aFADGDH在50℃·15分钟处理中维持约77％的活性，而使其在大肠杆菌中表达从而获得的FADGDH重组体(raFADGDH)的热稳定性在50℃·15分钟处理中约为13％左右。另外，土曲霉FADGDH重组体(rtFADGDH)的热稳定性在50℃·15分钟处理中也约为28％左右。

对于在专利文献2中记载有其结构或制造方法的酶而言，认为同样地使其在大肠杆菌中表达而获得的酶的热稳定性比从野生型菌株培养·纯化得到的酶差的可能性很高。

认为这是因为利用基因重组生产的酶不在表面附加多糖，热稳定性降低。

在血糖传感器用芯片的制作工序中，有时实施加热干燥处理，在利用重组体的情况下，存在发生大幅度的热失活的危险性，必需提高热稳定性。

因此，我们以提供如下所述的酶为目的进一步进行了反复探讨，即：即使利用大肠杆菌的基因重组进行生产也具有充分的热稳定性，且在实用上更有利的可以在血糖值测定用试剂中使用的酶。

结果，我们通过适当地改变源自米曲霉菌株或源自土曲霉菌株的FADGDH的氨基酸序列，克服了如上所述的公知的与血糖传感器用酶的热稳定性相关的缺点，从而可以提供在实用上更有利的可以在血糖值测定用试剂中使用的酶。

即，本发明如下所述。

[项1]

一种通过修饰而提高了热稳定性的修饰型FADGDH。

[项2]

根据项1记载的修饰型FADGDH，其中，

为真核生物来源。

[项3]

根据项1记载的FADGDH，其中，

为丝状真菌来源。

[项4]

根据项1记载的FADGDH，其中，

为曲霉菌真菌来源。

[项5]

根据项1～4记载的修饰型FADGDH，其中，

与野生型的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)相比，提高了热稳定性。

[项6]

根据项1～4记载的修饰型FADGDH，其特征在于，

在液态下，50℃、15分钟的热处理后的活性残存率为20％以上。

[项7]

根据项1～4记载的修饰型FADGDH，其特征在于，

在液态下，50℃、15分钟的热处理后的活性残存率为35％以上。

[项8]

根据项1～4记载的修饰型FADGDH，其中，

在液态下，50℃、15分钟的热处理后的活性残存率为40％以上。

[项9]

根据项1～4记载的修饰型FADGDH，其中，

50℃、15分钟的热处理后的活性残存率为70％以上。

[项10]

根据项1～4记载的修饰型FADGDH，其中，

50℃、15分钟的热处理后的活性残存率为80％以上。

[项11]

一种修饰型FADGDH，其中，

具有在具有序列表的序列编号2或序列编号46中记载的氨基酸序列的FADGDH中至少1个氨基酸被置换、缺失、插入或添加的一级结构。

[项12]

一种提高了热稳定性的修饰型FADGDH，其中，

在序列表的序列编号2中，在由120位、160位、162位、163位、164位、165位、166位、167位、169位、170位、171位、172位、180 位、329位、331位、369位、471位及551位构成的组中的至少1个位置，或者，在序列表的序列编号46中，在116位、159位、161位、164位、166位、167位、175位、325位、327位、365位、547位的位置，或者，在其他种类中的与上述同等的位置，具有氨基酸取代。

[项13]

一种提高了热稳定性的修饰型FADGDH，其中，

在序列表的序列编号2中，至少氨基酸取代为K120E、G160E、G160I、G160P、G160S、G160Q、S162A、S162C、S162D、S162E、S162F、S162H、S162L、S162P、G163D、G163K、G163L、G163R、S164F、S164T、S164Y、L165A、L165I、L165N、L165P、L165V、A166C、A166I、A166K、A166L、A166M、A166P、A166S、167A、S167P、S167R、S167V、N169K、N169P、N169Y、N169W、L170C、L170F、S171I、S171K、S171M、S171Q、S171V、V172A、V172C、V172E、V172I、V172M、V172S、V172W、V172Y、A180G、V329Q、A331C、A331D、A331I、A331K、A331L、A331M、Q331V、K369R、K471R、V551A、V551C、V551T、V551Q、V551S、V551Y、(G160E+S167P)、(G160I+S167P)、(G160S+S167P)、(G160Q+S167P)、(S162A+S167P)、(S162C+S167P)、(S162D+S167P)、(S162D+S167P)、(S162E+S167P)、(S162F+S167P)、(S162H+S167P)、(S162L+S167P)、(G163D+S167P)、(S164F+S167P)、(S164T+S167P)、(S164Y+S167P)、(L165A+S167P)、(L165I+S167P)、(L165P+S171K)、(L165P+V551C)、(L165V+V551C)、(A166C+S167P)、(A166I+S167P)、(A166K+S167P)、(A166K+S167P)、(A166M+S167P)、(A166P+S167P)、(A166S+S167P)、(S167P+N169K)、(S167P+N169P)、(S167P+N169Y)、(S167P+N169W)、(S167P+L170C)、(S167P+L170F)、(S167P+S171I)、(S167P+S171K)、(S167P+S171M)、(S167P+S171Q)、(S167P+S171V)、(S167P+V172A)、(S167P+V172C)、(S167P+V172E)、(S167P+V172I)、(S167P+V172M)、(S167P+V172S)、(S167P+V172T)、(S167P+V172W)、(S167P+V172Y)、(S167P+V329Q)、(S167P+A331C)、(S167P+A331D)、(S167P+A331I)、(S167P +A331K)、(S167P+A331L)、(S167P+A331M)、(S167P+A331V)、(G163K+V551C)、(G163R+V551C)中的任意一位，或在序列表的序列编号46中，至少氨基酸取代为K116D、K116G、K116L、K116F、K116Q、Q159A、Q159K、Q159N、Q159P、Q159V、Q159L、E161C、N164Y、N164V、N164C、T166F、T166Y、T166W、T167L、T167V、T167S、G175K、S325A、S325G、S325K、S325Q、S325R、S325T、S325V、S325Y、S327E、Q365R、V547S、V547C、V547A、V547Q中的任意一位，或具有在其他种类中的与上述位置同等的位置中的氨基酸取代。

[项14]

根据项1～14记载的修饰型FADGDH，其中，

通过修饰，提高了pH稳定性。

[项15]

根据项1～15记载的修饰型FAD-GDH，其中，

在pH4.5～pH6.5下，25℃、16小时处理后的残存活性为80％以上。

[项16]

根据项1～15记载的修饰型FAD-GDH，其中，

在pH4.5～pH6.5下，25℃、16小时处理后的残存活性为90％以上。

[项17]

一种提高了pH稳定性的修饰型FADGDH，其中，

在序列编号2中，在由163位、167位、551位构成的组中的至少1个位置，或者在其他种类中的与上述位置同等的位置，具有氨基酸取代。

[项18]

一种提高了pH稳定性的修饰型FADGDH，其中，

在序列表的序列编号2中，至少氨基酸取代为S167P、V551C、(G163K+V551C)、(G163R+V551C)中的任意一位，或者具有在其他种类中的与上述同等的位置中的氨基酸取代。

[项19]

一种编码修饰型FADGDH的基因，其编码项1～18中任意一项所述的修饰型FADGDH。

[项20]

一种载体，其含有项19所述的基因。

[项21]

一种转化体，其利用项20所述的载体进行转化而成。

[项22]

一种修饰型FADGDH的制造方法，其特征在于，

培养项21所述的转化体。

[项23]

一种葡萄糖检测试剂盒，其中，

含有项1～18中任意一项所述的修饰型FADGDH。

[项24]

一种葡萄糖传感器，其中，

含有项1～18中任意一项所述的修饰型FADGDH。

[项25]

一种葡萄糖测定法，其中，

含有项1～18中任意一项所述的修饰型FADGDH。

[项26]

一种提高了热稳定性的修饰型FADGDH，其是与源自野生型的米曲霉的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)相比提高了底物特异性的修饰型FADGDH，其中，

在序列编号2的氨基酸序列中的53位或者在与所述位置同等的位置具有氨基酸取代。

[项27]

根据项26所述的修饰型FADGDH，其中，

对木糖的作用性为对葡萄糖的作用性的5.0％以下。

[项28]

根据项26所述的修饰型FADGDH，其中，

在序列编号2中的由G53H、G53N、G53K、G53M、G53T、G53V及G53C构成的组中的任意一位，或者与上述位置同等的位置，具有氨基酸取代。

[项29]

根据项26所述的修饰型FADGDH，其中，

在序列编号2中的氨基酸序列中的由163位、167位及551位构成的组中的任意一个以上的位置，或者与上述位置同等的位置，具有氨基酸取代。

[项30]

根据项29所述的修饰型FADGDH，其中，

在序列编号2的氨基酸序列中的由(G53H+S167P)、(G53N+S167P)、(G53H+S167P)及(G53N+G163R+V551C)构成的组中的任意一位，或者与上述位置同等的位置，具有氨基酸取代。

[项31]

一种修饰型FADGDH的制造方法，其特征在于，包括：

编码项26～30的任意一项所述的修饰型FADGDH的基因、含有该基因的载体、利用该载体转化而成的转化体、以及培养该转化体的步骤。

[项32]

一种葡萄糖检测试剂盒，其中，

含有项26～30中任意一项所述的修饰型FADGDH。

[项33]

一种葡萄糖测定方法，其中，

含有项26～30中任意一项所述的修饰型FADGDH。

项26记载的修饰型FADGDH，与野生型的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)相比，对戊糖类的作用性降低。作为戊糖，可以例示木糖。在项26中记载的修饰型FADGDH与野生型的FADGDH相比，对木糖的作用性为对葡萄糖的作用性的5.0％以下。其中，对木糖的作用性是指以木糖为底物的情况下与以葡萄糖为底物的情况下的反应速度的相对比％(将葡萄糖设为1)。

优选在项26中记载的修饰型FADGDH，与野生型的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)相比，提高了热稳定性。项26中记载的修饰型FADGDH在50℃、15分钟的热处理后的活性残存率为20％以上，优选为40％以上，更优选为70％以上。只要能够维持这样的稳定性，在制剂时进行加热干燥成为可能。

优选项26中记载的修饰型FADGDH，与野生型的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)相比，提高了pH稳定性。项26中记载的修饰型FADGDH在pH4.5～pH7.0下，在25℃、16小时处理后的残存活性为80％以上，或者，在pH4.5～pH6.5下，在25℃、16小时处理后的残存活性为80％以上，优选为90％以上。

[项34]

一种修饰型FADGDH，其是与野生型的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)相比，提高了热稳定性的修饰型FADGDH，优选真核生物来源，进而优选丝状真菌来源，进而优选源自曲霉菌属真菌的FADGDH。在此，FADGDH优选50℃、15分钟的热处理后的活性残存率为20％以上，进而优选为40％以上，进而优选为80％以上。

[项35]

一种提高了热稳定性的修饰型FADGDH，其是具有在具有序列编号2中记载的氨基酸序列的FADGDH中的至少1个氨基酸被置换、缺失、插入或添加的一级结构的修饰型FADGDH，其中，

例如，在序列编号2中，在由120位、160位、162位、163位、164位、165位、166位、167位、170位、171位、172位、180位、329位、331位、369位、471位及551位构成的组中的至少一个位置或者其他种类中的与上述位置同等的位置，具有氨基酸取代。

[项36]

一种提高了热稳定性的修饰型FADGDH，其是与源自野生型的米曲霉的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)相比，提高了热稳定性的修饰型FADGDH，其中，

在序列编号2的氨基酸序列中的163位及/或551位或者与上述位置同等的位置，具有氨基酸取代。

[项37]

根据前面段落中记载的修饰型FADGDH，其中，

在序列编号2的氨基酸序列中的由G163D、G163K、G163L、G163R、V551A、V551C、V551T、V551Q、V551S、V551Y、(G163D+S167P)、(L165P+V551C)、(L165V+V551C)、(G163K+V551C)、(G163R +V551C)构成的组中的任意一位或者与上述位置同等的位置，具有同等的氨基酸取代。

[项38]

一种修饰型FADGDH，其中，

除了序列编号2的氨基酸序列中的163位及/或551位以外，进而在由120位、160位、162位、164位、165位、166位、167位、170位、171位、172位、180位、329位、331位、369位及471位构成的组中的任意1个以上的位置或者与上述位置同等的位置，具有氨基酸取代。

[项39]

一种修饰型FADGDH，其是与野生型的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)相比，提高了pH稳定性的修饰型FADGDH，优选真核生物来源，进而优选丝状真菌来源，进而优选源自曲霉菌属真菌的FADGDH。

[项40]

一种提高了pH稳定性的修饰型FADGDH，其中，

除了序列编号2的氨基酸序列中的163位及/或551位以外，进而在167位或者与上述位置同等的位置，具有氨基酸取代。

[项41]

根据前面段落中记载的修饰型FADGDH，其中，

在序列编号2的氨基酸序列中的由S167P、V551C、(G163K+V551C)、(G163R+V551C)构成的组中的任意一位或者与其同等的位置，具有同等的氨基酸取代。

[项42]

根据项34～41中的任意一项记载的FADGDH，其中，

在pH4.5～pH6.5下，25℃、16小时处理后的残存活性为80％以上，优选为90％以上。

[项43]

一种提高了pH稳定性的修饰型FADGDH，其中，

在序列编号2中，在由163位、167位、551位构成的组中的至少一个位置或者其他种类中的与上述位置同等的位置，具有氨基酸取代。

[项44]

一种提高了pH稳定性的修饰型FADGDH，其中，

在序列编号2中，至少氨基酸取代为S167P、V551C、(G163K+V551C)、(G163R+V551C)中的任意一位，或者，具有在其他种类中的与上述位置同等的位置中的氨基酸取代。

[项45]

一种修饰型FADGDH的制造方法，其特征在于，包括：

编码项34～44的任意一项所述的修饰型FADGDH的基因、包含该基因的载体、利用该载体转化而成的转化体、培养该转化体的步骤。

[项46]

一种葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器，其中，

含有项34～44中任意一项所述的修饰型FADGDH。

[项47]

一种葡萄糖测定法，其中，

含有项34～44中任意一项所述的修饰型FADGDH。

在本发明的修饰型FADGDH中，尤其G163K、G163L、G163R、S167P、V551A、V551C、V551Q、V551S、V551Y、(G160I+S167P)、(S162F+S167P)、(S167P+N169Y)、(S167P+L171I)、(S167P+L171K)、(S167P+L171V)、(S167P+V172I)、(S167P+V172W)、(G163K+V551C)(G163R+V551C)的氨基酸取代有助于修饰型FADGDH的热稳定性的提高。

在此，“K120E”是指将120位的K(Lys)置换成E(GLu)。另外，“(G160E+S167P)”是指分别将160位的G置换成E、将167位的S置换成P，+是指具有此双方置换的多(在该例中，为双突变)突变体。

可以加热干燥的水平是指50℃、15分处理后的残存活性存在20％以上的状态，优选为存在40％以上的残存活性的状态，更优选为存在60％以上的残存活性的状态。

利用本发明的FADGDH的稳定性的提高可以减低葡萄糖测定试剂、葡萄糖检测试剂盒及葡萄糖传感器制作时的酶的热失活，从而使该酶的使用量减低或测定精密度的提高成为可能。

附图说明

图1表示源自米曲霉的WT(野生型)、修饰型FADGDH纯化标本的pH稳定性。分别使用pH3.5～6.3：醋酸缓冲液、pH6.3～7.3：PIPES缓冲液、pH7.3～8.8：Tris盐酸缓冲液、pH6.0～7.7：磷酸缓冲液。

具体实施方式

本发明含有与重组FADGDH相比提高了热稳定性的修饰型FADGDH。

利用以下方法获得序列编号2所示的源自野生型的米曲霉的FADGDH。

本发明人等发现可以利用国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)(以下记载为NCBI)的数据库来推断、获得源自米曲霉的葡萄糖脱氢酶基因，使用该基因并利用大肠杆菌获得源自米曲霉的葡萄糖脱氢酶。

为了获得源自米曲霉的GDH基因，尝试使用各种色谱从本公司保有的米曲霉TI菌株的培养上清中纯化GDH，但难以获得高纯度的GDH，不得不放弃作为获得基因的常用方法之一即利用部分氨基酸序列的克隆。但是，我们发现薄刺青霉(Penicillium lilacinoechinulatum)NBRC6231菌株生产GDH，并成功地用纯化酶确定了部分氨基酸序列。接着，以确定的氨基酸序列为基础，利用PCR法，部分地获得源自薄刺青霉NBRC6231的GDH基因，从而确定了碱基序列(1356bp)。最终以该碱基序列为基础，推断、获得了米曲霉GDH基因。将其简要示于以下<实验例1><实验例2>。

<实验例1>

[源自米曲霉的葡萄糖脱氢酶(以下也记载为AOGDH)基因的推断]

源自米曲霉的GDH的获得

将米曲霉TI菌株的L干燥菌株接种于土豆右旋糖琼脂培养基(Difco制)，在25℃下培养使其复性。将复性后的板上的菌丝连同琼脂一起回收，悬浮于过滤灭菌水中。在2个10L容积的发酵罐中配制6L生产培养基(1 ％麦芽提取液、1.5％大豆肽)、0.1％MGS O₄·7水合物、2％葡萄糖、pH6.5)，在120℃下高压灭菌15分钟，放冷后，接种上述的菌丝悬浮液，于30℃进行通气搅拌培养。从培养开始64小时后停止培养，通过过滤除去菌丝体，回收内含GDH活性的过滤液。利用超滤膜(截留分子量(molecular weight cutoff)10,000)从回收的上清中除去低分子物质。接着，添加、溶解硫酸铵直至成为60％饱和度，进行硫酸铵分馏，利用离心机回收内含GDH的上清馏分，然后使其吸附于辛基琼脂糖凝胶(Ocytl-Sepharose)柱上，以硫酸铵饱和度60％～0％进行梯度洗脱，回收具有GDH活性的馏分。使用G-25-Sepharoose柱对得到的GDH溶液进行脱盐，然后添加、溶解60％饱和度的硫酸铵，使其吸附于苯基琼脂糖凝胶上，以硫酸铵饱和度为60％～0％进行梯度洗脱，回收具有GDH活性的馏分。进一步以50℃对其加温45分钟，然后进行离心分离，获得上清。将经过以上工序得到的溶液作为纯化GDH标本(AOGDH)。另外，在上述纯化过程中，使用20mM磷酸钾缓冲液(Ph6.5)作为缓冲液。进而，为了确定AOGDH的部分氨基酸序列，尽管尝试了利用离子交换色谱、凝胶过滤色谱等各种方法进行纯化，但不能获得可以提供作为确定部分氨基酸序列的高纯度的纯化标本。

源自青霉属丝状真菌的GDH的获得

作为源自青霉属丝状真菌的GDH生产菌，使用薄刺青霉NBRC6231，按照与上述米曲霉TI菌株通用的顺序，进行培养及纯化，利用SDS电泳，获得大致均一的纯化标本。

[cDNA的制作]

对薄刺青霉NBRC6231，按照上述方法(其中，在发酵罐中的培养时间为24小时)实施培养，利用滤纸过滤回收菌丝体。立即将得到的菌丝放入液氮中使之冻结，使用冷轧卷曲机(cool mill)(东洋纺公司制)粉碎菌丝。立即用Sepasol RNAI(Nacalai Tesque公司制)，按照该试剂盒的操作规程从粉碎菌体中提取总RNA。用Origotex-dt30(第一化学药品公司制)，从得到的总RNA中纯化mRNA，将其作为模板，使用ReverTra-Plus-^TM(东洋纺公司制)进行RT-PCR。对得到的产物进行琼脂糖电泳，切取相当于链长0.5～4.0kb的部分。使用MagExtractor- PCR&Gel Clean Up-(东洋纺公司制)，从切取的凝胶断片提取·纯化cDNA，作为cDNA样本。

[GDH基因部分序列的确定]

将上述纯化的源自NBRC6231的GDH溶解于内含0.1％SDS、10％甘油的Tris-HCl缓冲液(pH6.8)中，向其中添加Glu特异的V8内切蛋白酶直至最终浓度成为10μg/ml，于37℃下培养(incubate)16小时，由此进行部分分解。使用丙烯酰胺浓度16％的凝胶对该样本进行电泳，分离出肽。使用印迹处理缓冲液(blot buffer)(1.4％甘油、0.3％tris、20％乙醇)，利用半干转法(semi-dry)将在该凝胶中存在的肽分子转印到PVDF膜上。用CBB染色试剂盒(PIERCE公司制GelCode Blue Stain Reagent)对转印到PVDF膜上的肽进行染色，切取已被可视化的肽片断的2处带部分，利用肽自动测序仪进行内部氨基酸序列的分析。得到的氨基酸序列为IGGVVDTSLKVYGT(序列编号37)以及WGGGTKQTVRAGKALGGTST(序列编号38)。以该序列为基础制作内含混合碱基的简并引物(Degenerateprimers)，以源自NBRC6231的cDNA为模板实施PCR，得到扩增产物，用琼脂糖凝胶电泳进行确认，结果为1.4kb左右的单带。切取该带，使用东洋纺制MagExtractor-PCR & Gel Clean Up-进行提取·纯化。利用Target Clone-Plus-(东洋纺公司制)对纯化DNA片断进行TA克隆，通过热休克，用得到的载体转化大肠杆菌JM109感受态细胞(东洋纺公司制)。对转化克隆中的用蓝白筛选确认了插入区碱基插入的克隆，使用MagExtractor-Plasmid-(东洋纺公司制)，少量提取·纯化质粒，使用质粒序列特异的引物，确定插入区碱基的碱基序列(1356bp)。

[AOGDH基因的推断]

以确定的碱基序列为基础，从“NCBJ BLAST”的主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)实施同源性检索，推断AOGDH基因。利用检索推断的AOGDH与源自薄刺青霉NBRC6231的GDH部分序列之间的氨基酸水平上的相似性为49％。

<实验例2>

[源自米曲霉的葡萄糖脱氢酶基因的获得、向大肠杆菌中的导入]

为了获得AOGDH基因，从米曲霉TI菌株的菌体配制mRNA，合成 cDNA。合成序列编号39、40所示的2种寡DNA，将配制的cDNA作为模板，使用KOD Plus DNA聚合酶(东洋纺公司制)，进行AOGDH基因扩增。用限制性内切酶NdeI和BamHI处理DNA片断，向pBluescript(对应LacZ翻译起始密码子atg，以使Ndel识别序列的atg与其对应的形式导入NdeI位点而成的质粒)NdeI-BamHI位点中插入，构建重组质粒。使用该重组质粒，转化大肠杆菌DH5α(东洋纺公司制)。利用转化体，按照常规方法提取质粒，进行AOGDH基因的碱基序列的确定(序列编号41)。结果可知，从cDNA序列推断的氨基酸残基由593个氨基酸(序列编号42)构成。数据库预测的GDH为588氨基酸的TI菌株，表明与GDH的氨基酸残基数不同。此外，还使用TI菌株基因组DNA确定了该基因的序列，还用RACE法对基因邻接区域进行了确定。另外，还使用PCR法构建了具有以数据库为基础的DNA序列的重组质粒，同样地取得了转化体。在内含100μg/ml的氨苄青霉素的液体培养基(Terrific broth)200ml中，对这些转化体进行30℃、16小时的振荡培养。对菌体破碎液确认了GDH活性，结果具有从数据库推断的GDH序列的转化体不具体GDH活性，而对于具有源自TI菌株的GDH序列的转化体而言，在菌体内，在每1ml培养液中可以得到8.0U的GDH活性。另外，在实施例1中实施的米曲霉TI菌株的培养上清的GDH活性为0.2U/ml。

<实验例3>

[源自米曲霉的葡萄糖脱氢酶(以下示为AOGDH)基因在大肠杆菌中的导入]

在将切断单肽之后的FAD-GDH作为mFAD-GDH的情况下，将在mFAD-GDH的N末端只附加M而成为mFAD-GDH的N末端伸出1个氨基酸长度的形态的多肽表达成S2。

在S2中，将序列编号43的寡核苷酸作为N末端侧引物，与序列编号44的引物组合进行PCR，利用相同顺序，构建具有编码S2的DNA序列(序列编号1)的重组质粒，同样地取得转化体。

其中，用DNA测序证实了该具有修饰FAD-GDH的DNA序列的质粒没有序列上的错误。

利用TB培养基，使用10L发酵罐，液体培养1～2天该转化体。在对各培养基期的菌体进行集菌之后，进行超声波粉碎，确认GDH活性。通过删除被认为是单肽的氨基酸序列，该GDH的生产率增大。

利用以下方法获得序列编号46所示的源自野生型的土曲霉的FADGDH。

<实验例4>

cDNA的配制

将土曲霉NBRC33026(从独立行政法人制品评价技术基盘机构购入)L干标本接种于土豆右旋糖琼脂培养基(Difco制)，通过在25℃下培养使其复性。在500ml坂口烧瓶中配制50ml pH6.5的1.5％大豆肽、2％葡萄糖、1％麦芽提取物，将复性的板上的菌丝连同琼脂一起回收、接种，进行30℃、24小时振荡培养，回收菌体。立即将得到的菌体放入液氮中，使其冻结，使用东洋纺制冷轧卷曲机，进行粉碎。立即用Nacalai Tesque公司制Sepasol RNA I，按照本试剂盒的操作规程从粉碎菌体中提取总RNA，将其作为模板，使用东洋纺公司制ReverTra-Plus-^TM，进行RT-PCR，配制cDNA。

<实验例5>

GDH基因的序列确定

我们成功地克隆了源自米曲霉、薄刺青霉及柑橘青霉(Penicilliumitalicum)的GDH基因，取得了其碱基序列信息。为了从土曲霉克隆GDH基因，对比上述3种GDH的推断氨基酸序列，以相似性高的区域的序列为基础，制作简并引物。以在<实验例4>中制作的基因组DNA为模板，实施PCR，结果可见扩增产物。亚克隆(subcloning)扩增产物，确定碱基序列。以确定的GDH部分序列为基础，用RACE法确定该序列部分的5’侧及3’侧邻接区域。以确定的基因区域的起始密码子到终止密码子的序列示为序列编号45，另外，以从本序列推断的氨基酸序列示为序列编号46。其中，与在专利文献1中所示的源自土曲霉FERM BP-08578的辅酶结合型葡萄糖脱氢酶在氨基酸水平上的相似性约为98.5％，具有非常高的相似性，被认为本质上同等。“相似性”在该技术领域中是指在使用公知的数学运算对比2个氨基酸序列时得到的最佳比对(alignment)(该运算优选为了优化比对而能够考虑向序列的一方或两方导入间隔的运算)中的相对叠加的全部氨基酸的同一氨基酸残基的比例(％)。作为这样的运算的例子，可以举出在非专利文献1～4中记载的例子，但不限定于这些。

非专利文献1：Karlin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)Vol.90p5873-5877

非专利文献2：Needleman et al.，J.Mol.Biol.(1970)Vol.48p444-453

非专利文献3：Myers and Miller，CABIOS Vol.4p11-17

非专利文献4：Pearson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)Vol.85p2444-2448

<实验例6>

GDH重组质粒及重组体的制作

对序列编号45的DNA序列编码的氨基酸序列，利用Signal P3.0Server，进行信号肽预测。基于该结果，为了进行以下序列的扩增而制作PCR引物(序列编号47、48)，其中的要扩增的序列是为了除去信号肽而删除N末端序列的25个密码子并附加起始密码子(ATG)的序列。使用这些引物，将NBRC33026 cDNA作为模板，利用KOD Plus DNApolymerase(东洋纺公司制)实施基因扩增。用限制性内切酶NdeI和BamHI处理扩增片断，向pBluescript(对应LacZ的翻译起始密码子ATG，以使Ndel识别序列的ATG以其对应的形式导入NdeI位点而成的质粒)的NdeI-BamHI位点中插入，构建重组质粒(pAtGDH-s2-7)。使用该重组质粒，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α(东洋纺公司制)，取得源自土曲霉的GDH重组体。在内含100g/ml的氨苄青霉素的液体培养基(Terrific broth)200ml中，对这些转化体进行30℃、16小时的振荡培养。对菌体破碎液确认了GDH活性，结果在菌体内，在每1ml培养液中可以得到1.0U的GDH活性。

本发明的修饰型FADGDH可以通过在序列编号2或序列编号46的氨基酸序列中在上述所示的任意位置进行氨基酸置换来获得。

例如，“与序列编号2的氨基酸序列为同等的位置”是指在对比序列编号2氨基酸序列和具有与序列编号2具有相似性(优选为60％以上、更优选为80％以上、进而优选为90％)的氨基酸序列的其他GDH的情况下，该比对中得出的同等的位置。

修饰了底物特异性及/或热稳定性的本发明可以例示在序列编号2的氨基酸序列中在53位、163位、167位及551位的至少一个位置中具有氨基酸置换的修饰型FADGDH。

例如，在序列编号2的氨基酸序列中，氨基酸置换为从G53H、G53N、G53K、G53M、G53T、G53V、G53C、G163R、S167P和V551C构成的组中选择的修饰型FADGDH。

在此，“G53H”是指将53位的G(Gly)置换成(His)。尤其G53H，G53N，G53K，G53M，G53T，G53V和G53C的氨基酸置换有助于修饰型FADGDH的底物特异性的提高，G53H+S167P、G53N+S167P、G53N+G163R+V551C的氨基酸置换有助于修饰型FADGDH的底物特异性及/或稳定性的提高。

修饰了热稳定性的本发明可以例示在序列编号2的氨基酸序列中在120位、160位、162位、163位、164位、165位、166位、167位、169位、170位、171位、172位、180位、329位、331位、369位、471位及551位的至少一个位置具有氨基酸置换的修饰型FDAGDH。在上述中，优选在162位、163位、167位及551位的至少一个位置具有氨基酸置换的修饰型FADGDH。

例如，在序列编号2的氨基酸序列中，氨基酸置换为从K120E、G160E、G160I、G160P、G160S、G160Q、S162A、S162C、S162D、S162E、S162F、S162H、S162L、S162P、G163D、G163K、G163L、G163R、S164F、S164T、S164Y、L165A、L165I、L165N、L165P、L165V、A166C、A166I、A166K、A166L、A166M、A166P、A166S、S167A、S167P、S167R、S167V、N169K、N169P、N169Y、N169W、L170C、L170F、S171I、S171K、S171M、S171Q、S171V、V172A、V172C、V172E、V172I、V172M、V172S、V172W、V172Y、A180G、V329Q、A331C、A331D、A331I、A331K、A331L、A331M、Q331V、K369R、K471R、V551A、V551C、V551T、V551Q、V551S、V551Y构成的组中选择的修饰型FADGDH。

在此，“K120E”是指将120位的K(Lys)置换成E(Glu)。尤其G163K、G163L、G163R、S167P、V551A、V551C、V551Q、V551S、V551Y、(G160I+S167P)、(S162F+S167P)、(S167P+N169Y)、(S167P+L171I)、 (S167P+L171K)、(S167P+L171V)、(S167P+V172I)、(S167P+V172W)、(G163K+V551C)和(G163R+V551C)的氨基酸置换有助于修饰型FADGDH的热稳定性的提高。

另外，还可以例示在序列编号46的氨基酸序列中116位、159位、161位、164位、166位、167位、175位、325位、327位、365位和547位的至少一个位置中具有氨基酸置换的修饰型FADGDH。

可以优选例示在序列编号46的氨基酸序列中氨基酸置换从K116D、K116G、K116L、K116F、K116Q、Q159A、Q159K、Q159N、Q159P、Q159V、Q159L、E161C、N164Y、N164V、N164C、T166F、T166Y、T166W、T167L、T167V、T167S、G175K、S325A、S325G、S325K、S325Q、S325R、S325T、S325V、S325Y、S327E、Q365R、V547S、V547C、V547A、V547Q构成的组中选择的修饰型FADGDH。

在此，“K116D”是指将116位的K(Lys)置换成D(Asp)。

对修饰了序列编号2所示的源自野生型的米曲霉的FADGDH的修饰型FADGDH的制造法或修饰了序列编号46所示的源自野生型的土曲霉的FADGDH的修饰型FADGDH的制造法没有特别限定，可以按照如下所述的顺序制造。作为修饰构成FADGDH的氨基酸序列的方法，可以使用通常进行的修饰遗传信息的方法。即，通过变换具有蛋白质的遗传信息的DNA的特定碱基或者通过使特定碱基插入或缺失，来作成具有修饰蛋白质的遗传信息的DNA。作为变换DNA中的碱基序列的具体方法，例如可以举出市售的试剂盒(转化突变试剂盒(Transformer Mutagenesis Kit)，Clontech公司；EXOIII/Mung Bean Deletion Kit，Stratagene制；Quick ChangeSite Directed Mutagenesis Kit，Stratagene制等)的使用或者聚合酶(polymerase)连锁反应法(PCR)的利用。

具有制作的修饰型FADGDH的遗传信息的DNA在与质粒连结的状态下被移入宿主微生物，成为生产修饰型FADGDH的转化体。作为此时的质粒，例如可以利用Escherichia coli JM109，Escherichia coli DH5，Escherichia coli W3110，Escherichia coli C600等。作为向宿主微生物中移入重组载体的方法，例如在宿主微生物为属于Escherichia coli的微生物的情况下，可以采用在钙离子的存在下进行重组DNA的移入的方法等，进而也可以使用电穿孔转化(electroporation)法。进而，也可以使用市售的感受态细胞(例如Competent High JM109，东洋纺制)。

作为这样地进行得到的转化体的微生物可以通过利用营养培养基培养来稳定地生产大量的修饰型FADGDH。作为转化体的宿主微生物的培养形态只要考虑宿主的营养生理上的性质来选择培养条件即可，通常大多用液体培养进行，但在工业上进行通气搅拌培养是有利的。作为培养基的营养源，广泛使用在微生物的培养中通常使用的营养源。作为碳源，只要是可以同化的碳化合物即可，例如可以使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。作为氮源，只要是可以利用的氮化合物即可，例如可以使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱性分解物等。此外，还可以根据需要使用磷酸盐，碳酸盐，硫酸盐，镁、钙、钾、铁、锰、锌等盐类，特定的氨基酸，特定的维生素等。培养基温度可以在菌体发育、生产修饰型FADGDH的范围内适当地变更，而在为Escherichiacoli的情况下，优选为20～42℃左右。培养温度根据条件不同而多少不同，但只要估计修饰型FADGDH达到最高产额的时期在适当时期结束培养即可，通常为6～48小时左右。培养基pH可以在菌体发育、生产修饰体蛋白质的范围内适当地变更，但特别优选为pH6.0～9.0左右。

也可以直接采集、利用培养物中的内含生产修饰型FADGDH的菌体的培养液，但通常在按照常规方法在培养液中存在修饰型FADGDH的情况下，在用过滤、离心分离等分离成修饰蛋白质的含有溶液和微生物菌体之后利用。在菌体内存在修饰蛋白质的情况下，用过滤或离心分离等手法，从得到的培养物中采集菌体，接着，用机械方法或溶菌酶(lysozyme)等酶方法破坏该菌体，另外，根据需要添加EDTA等螯合剂及/或表面活性剂来可溶化修饰型FADGDH，作为水溶液，进行分离采集。

只要利用例如减压浓缩，膜浓缩，进而硫酸铵、硫酸钠等盐析处理，或者用亲水性有机溶媒例如甲醇、乙醇、丙酮等的分级沉淀法使其沉淀即可。另外，加温处理或等电点处理也是有效的生成手段。可以利用使用吸附剂或凝胶过滤剂等的凝胶过滤、吸附色谱、离子交换色谱、亲合层析得到已被纯化的修饰型FADGDH。

葡萄糖检测试剂盒

另外，本发明的特征还在于，内含本发明的修饰型FADGDH的葡萄糖检测试剂盒。本发明的葡萄糖检测试剂盒含有足以进行至少1次检测的本发明的修饰型FADGDH。除了本发明的修饰型FADGDH以外，试剂盒典型地还包括试剂盒必需的缓冲液、媒介物、用于制作校正曲线的葡萄糖标准溶液以及使用的指南。可以以各种形态，例如作为冻干的试剂，或者，作为适当的保存溶液中的溶液，提供本发明的修饰型FADGDH。

葡萄糖传感器

另外，本发明的特征还在于使用本发明的修饰型FADGDH的葡萄糖传感器。作为电极，使用碳电极、金电极、铂电极等，在该电极上固定化本发明的酶。作为固定化方法，包括使用交联试剂的方法，在高分子基质中封入的方法，用透析膜覆盖的方法，使用光交联性聚合物、导电性聚合物、氧化还原聚合物等或者与以二茂铁或其衍生物为代表的电子媒介物一起在聚合物中固定或在电极上吸附固定，或者，也可以组合使用它们。典型地，使用戊二醛，在碳电极上固定本发明的修饰型FADGDH，然后用具有胺基的试剂处理，封闭(block)戊二醛。

可以如下所述地进行葡萄糖浓度的测定。在恒温槽中加入缓冲液，维持为一定温度。作为媒介物，可以使用铁氰化钾、吩嗪硫酸甲酯等。作为工作电极，使用固定化本发明的修饰型FADGDH的电极，使用对电极(例如铂电极)及参考电极(例如Ag/AgCl电极)。在向碳电极外加一定的电压、电流成为常压之后，加入内含葡萄糖的样品，测定电流的增加。可以按照利用标准浓度的葡萄糖溶液制作的校正曲线，计算样品中的葡萄糖浓度。

实施例

在本发明中，利用以下条件进行FAD依赖型GDH的活性测定。

[试验例]

<试剂>

50mM PIPES缓冲液pH6.5(含有0.1％TritonX-100)

163mM PMS溶液

6.8mM 2，6-二氯靛酚钠(DCPIP)溶液

1M D-葡萄糖溶液

混合15.6ml上述PIPES缓冲液、0.2ml DCPIP溶液和4ml D-葡萄糖溶液，作为反应试剂。

<测定条件>

在37℃下预备加温5分钟2.9ml反应试剂。添加0.1mlGDH溶液，在缓慢地混合之后，用以水为对照、控制成37℃的分光光度计，记录600nm的吸光度变化，测定从直线部分开始每1分钟的吸光度变化(ΔOD_TEST)。空白试验是代替GDH溶液而在试剂混液中加入溶解GDH的溶媒，同样地测定每1分钟的吸光度变化(ΔOD_BLANK)。按照下式，从这些值求得GDH活性。在此，GDH活性中的1个单位(U)定义为在浓度200mM的D-葡萄糖存在下还原1分钟1微摩尔的DCPIP的酶量。

活性(U/ML)＝{-(ΔOD_TEST-ΔOD_BLANK)×3.0×稀释倍率}/{16.3×0.1×1.0}

其中，式中的3.0表示反应试剂+酶溶液的液量(ml)，16.3表示本活性测定条件下的毫摩尔分子消光系数(cm²/微摩尔)，0.1表示酶溶液的液量(ml)，1.0表示槽的光程长(cm)。

实施例1：使用葡萄糖测定体系的修饰型FADGDH热稳定性的研究

按照前述的试验例的FADGDH活性的测定方法进行研究。

首先，利用酶稀释液(50mM磷酸钾缓冲液(pH5.5)、0.1％Triton X-100)溶解源自米曲霉或土曲霉的修饰型FADGDH，使其成为约2U/ml，准备50ml该溶液。准备2个1.0ml该酶溶液的样本。作为对照，准备2个添加蒸馏水0.1ml的样本来代替各修饰型FADGDH(各种化合物)。

在2个样本中，1个样本在4℃下保存，另1个样本实施50℃、15分钟处理。处理后，测定各样本的FADGDH活性。分别将在4℃下保存的样本的酶活性设为100，比较50℃、15分钟处理后的活性值，作为活性残存率(％)算出。

实施例2：在源自米曲霉的FADGDH基因中的突变导入

利用内含编码野生型FADGDH的基因(序列编号1)的重组质粒pAOGDH-S2，转化市售的大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α；TOYOBO公司制)，然后在内含氨苄青霉素(50mg/ml；Nacalai Tesque公司制)的液体培养基(1％多聚蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl；pH7.3)中接种转化体，在30℃下振荡培养一晚，利用常规方法，从得到的菌体配制质粒。将该质粒用作模板，按照其具体操作实施使用Diversify^TM PCRRandom Mutagenesis Kit(Clontech公司制)的突变处理，制作具有葡萄糖脱氢酶的生产能力的修饰型FADGDH突变质粒，利用上述方法同样地配制质粒。

实施例3：内含源自米曲霉的修饰型FADGDH的粗酶液的配制

利用在实施例2中配制的质粒转化市售的大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α；TOYOBO公司制)，然后在内含氨苄青霉素的琼脂培养基(1％多聚蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，1.5％琼脂；pH7.3)上涂布转化体，然后在30℃下振荡培养一晚，将得到的菌落进一步接种到内含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，在30℃下振荡培养一晚。对该培养液的一部分进行离心分离，回收得到的菌体，通过在50mM的磷酸缓冲液(pH7.0)中用玻璃珠破碎该菌体，由此配制粗酶液。

实施例4：提高了热稳定性的突变体的筛选

使用实施例3的粗酶液，利用上述的活性测定法，测定葡萄糖脱氢酶活性。另外，在50℃下加热处理15分钟同一粗酶液之后，测定葡萄糖脱氢酶活性，取得3种提高了热稳定性的突变体。将编码这3种突变体的质粒命名为pAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4。

为了鉴定pAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4的突变位置，用DNA测序仪(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer；Perkin-Elmer制)确定编码葡萄糖脱氢酶的基因的碱基序列，结果确认了pAOGDH-M1是将序列编号2中记载的第162位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M2是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将471位的赖氨酸置换成精氨酸，pAOGDH-M3是将第180位的丙氨酸置换成甘氨酸、将第551位的缬氨酸置换成丙氨酸，pAOGDH-M4是将第120位的赖氨酸置换成谷氨酸、将167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将369位的赖氨酸置换成精氨酸。将结果示于表1。

[表1]

氨基酸置换部位	热稳定性(％)
		S162P	38.1
S167P+K471R	41.8
		A180G+V551A	41.9
K120E+S167P+K369R	64.2
		野生型	19.5

以pAOGDH-S2的质粒为模板，以如下所述的合成寡核苷酸为基础，使用QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE制)，按照操作规程进行突变操作，制作具有葡萄糖脱氢酶的生产能力的修饰型FADGDH突变质粒，利用上述方法同样地配制质粒。其中的合成寡核苷酸是设计成将第160位的甘氨酸置换成多种氨基酸的序列编号3的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第161位的色氨酸置换成多种氨基酸的序列编号4的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第162位的丝氨酸置换成多种氨基酸的序列编号5的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第163位的甘氨酸置换成多种氨基酸的序列编号6的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第164位的丝氨酸置换成多种氨基酸的序列编号7的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第165位的亮氨酸置换成多种氨基酸的序列编号8的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第166位的丙氨酸置换成多种氨基酸的序列编号9的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第167位的丝氨酸置换成多种氨基酸的序列编号10的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第168位的甘氨酸置换成多种氨基酸的序列编号11的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第169位的天冬氨酸置换成多种氨基酸的序列编号12的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第170位的亮氨酸置换成多种氨基酸的序列编号13的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第171位的丝氨酸置换成多种氨基酸的序列编号14的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第172位的缬氨酸置换成多种氨基酸的序列编号15的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第329位的缬氨酸置换成多种氨基酸的序列编号16的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第330位的亮氨酸置换成多种氨基酸的序列编号17的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第331位的丙氨酸置换成多种氨基酸的序列编号18的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第551位的缬氨酸置换成多种氨基酸的序列编号19的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸。

利用在实施例4中配制的质粒转化市售的大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α；TOYOBO公司制)，然后与实施例3同样地配制粗酶液。

使用上述的粗酶液，利用上述的活性测定法测定葡萄糖脱氢酶活性。另外，在50℃下加热处理15分钟同一粗酶液之后，测定葡萄糖脱氢酶活性，取得16种提高了热稳定性的突变体。将编码这16种突变体的质粒命名为pAOGDH-M4、pAOGDH-M5、pAOGDH-M6、pAOGDH-M7、pAOGDH-M8、pAOGDH-M9、pAOGDH-M10、pAOGDH-M11、pAOGDH-M12、pAOGDH-M13、pAOGDH-M14、pAOGDH-M15、pAOGDH-M16、pAOGDH-M17、pAOGDH-M18、AOGDH-M19。

为了鉴定pAOGDH-M4、pAOGDH-M5、pAOGDH-M6、pAOGDH-M7、pAOGDH-M8、pAOGDH-M9、pAOGDH-M10、pAOGDH-M11、pAOGDH-M12、pAOGDH-M13、pAOGDH-M14、pAOGDH-M15、pAOGDH-M16、pAOGDH-M17、pAOGDH-M18、AOGDH-M19的突变位置，用DNA测序仪(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer；Perkin-Elmer制)确定编码葡萄糖脱氢酶的基因的碱基序列，结果确认了pAOGDH-M5是将序列编号2中记载的第160位的甘氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M6是将第163位的甘氨酸置换成赖氨酸，pAOGDH-M7是将163位的甘氨酸置换成亮氨酸，pAOGDH-M8是将第163位的甘氨酸置换成精氨酸，pAOGDH-M9是将第167位的丝氨酸置换成丙氨酸，pAOGDH-M10是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M11是将第167位的丝氨酸置换成精氨酸，pAOGDH-M12是将第167位的丝氨酸置换成缬氨酸，pAOGDH-M13是将第171位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M14是将第551位的缬氨酸置换成丙氨酸，pAOGDH-M15是将第551位的缬氨酸置换成半胱氨酸，pAOGDH-M16是将第551位的缬氨酸置换成苏氨酸，pAOGDH-M17是将第551位的缬氨酸置换成谷氨酸，pAOGDH-M18是将第551位的缬氨酸置换成丝氨酸，pAOGDH-M19是将第551位的缬氨酸置换成酪氨酸。将结果示于表2。

[表2]

氨基酸置换部位	热稳定性
		G160P	21.4
G163K	56.1
		G163L	54.5
G163R	51.2
		S167A	38.1
S167P	49.8
		S167R	21.4
S167V	23.4
		S171P	21.4
V551A	60.5
		V551C	61.3
V551T	36.8
		V551Q	40.8
V551S	41.3
		V551Y	46.5
野生型	19.5

实施例5：多重突变体的制作和热稳定性

以pAOGDH-M10的质粒为模板，以如下所述的合成寡核苷酸为基础，使用QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE制)，按照其操作规程进行突变操作，制作具有葡萄糖脱氢酶的生产能力的修饰型FADGDH突变质粒，利用上述方法同样地配制质粒。其中的合成寡核苷酸是设计成将第160位的甘氨酸置换成多种氨基酸的序列编号20的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第161位的色氨酸置换成多种氨基酸的序列编号21的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第162位的丝氨酸置换成多种氨基酸的序列编号22的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第163位的甘氨酸置换成多种氨基酸的序列编号23的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第164位的丝氨酸置换成多种氨基酸的序列编号24的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第165位的亮氨酸置换成多种氨基酸的序列编号25的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第166位的丙氨酸置换成多种氨基酸的序列编号26的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第168位的甘氨酸置换成多种氨基酸的序列编号27的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第169位的天冬氨酸置换成多种氨基酸的序列编号28的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第170位的亮氨酸置换成多种氨基酸的序列编号29的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第171位的丝氨酸置换成多种氨基酸的序列编号30的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第172位的缬氨酸置换成多种氨基酸的序列编号31的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第329位的缬氨酸置换成多种氨基酸的序列编号32的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第330位的亮氨酸置换成多种氨基酸的序列编号33的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第331位的丙氨酸置换成多种氨基酸的序列编号34的合成寡核苷酸、设计成将第551位的缬氨酸置换成多种氨基酸的序列编号35的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸。

以pAOGDH-M15的质粒为模板，以如下所述的合成寡核苷酸为基础，使用QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE制)，按照其操作规程进行突变操作，制作具有葡萄糖脱氢酶的生产能力的修饰型FADGDH突变质粒，利用上述方法同样地配制质粒。其中的合成寡核苷酸是设计成将第163位的甘氨酸置换成多种氨基酸的序列编号36的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸。

使用上述的粗酶液，利用上述的活性测定法，测定葡萄糖脱氢酶活性。另外，在50℃下加热处理15分钟同一粗酶液之后，测定葡萄糖脱氢酶活性，取得57种提高了热稳定性的突变体。将编码这57种突变体的质粒命名为pAOGDH-M20、pAOGDH-M21、pAOGDH-M22、pAOGDH-M23、pAOGDH-M24、pAOGDH-M25、pAOGDH-M26、pAOGDH-M27、pAOGDH-M28、pAOGDH-M29、pAOGDH-M30、pAOGDH-M31、pAOGDH-M32、pAOGDH-M33、pAOGDH-M34、pAOGDH-M35、pAOGDH-M36、pAOGDH-M37、pAOGDH-M38、pAOGDH-M39、pAOGDH-M40、pAOGDH-M41、pAOGDH-M42、pAOGDH-M43、pAOGDH-M44、pAOGDH-M45、pAOGDH-M46、pAOGDH-M47、pAOGDH-M48、pAOGDH-M49、pAOGDH-M50、pAOGDH-M51、pAOGDH-M52、pAOGDH-M53、pAOGDH-M54、pAOGDH-M55、pAOGDH-M56、pAOGDH-M57、pAOGDH-M58、pAOGDH-M59、pAOGDH-M60、pAOGDH-M61、pAOGDH-M62、pAOGDH-M63、pAOGDH-M64、pAOGDH-M65、pAOGDH-M66、pAOGDH-M67、pAOGDH-M68、pAOGDH-M69、pAOGDH-M70、pAOGDH-M71、pAOGDH-M72、pAOGDH-M73、pAOGDH-M74、pAOGDH-M75、pAOGDH-M76。

为了鉴定pAOGDH-M20、pAOGDH-M21、pAOGDH-M22、pAOGDH-M23、pAOGDH-M24、pAOGDH-M25、pAOGDH-M26、pAOGDH-M27、pAOGDH-M28、pAOGDH-M29、pAOGDH-M30、pAOGDH-M31、pAOGDH-M32、pAOGDH-M33、pAOGDH-M34、pAOGDH-M35、pAOGDH-M36、pAOGDH-M37、pAOGDH-M38、pAOGDH-M39、pAOGDH-M40、pAOGDH-M41、pAOGDH-M42、pAOGDH-M43、pAOGDH-M44、pAOGDH-M45、pAOGDH-M46、pAOGDH-M47、pAOGDH-M48、pAOGDH-M49、pAOGDH-M50、pAOGDH-M51、pAOGDH-M52、pAOGDH-M53、pAOGDH-M54、pAOGDH-M55、pAOGDH-M56、pAOGDH-M57、pAOGDH-M58、pAOGDH-M59、pAOGDH-M60、pAOGDH-M61、pAOGDH-M62、pAOGDH-M63、pAOGDH-M64、pAOGDH-M65、pAOGDH-M66、 pAOGDH-M67、pAOGDH-M68、pAOGDH-M69、pAOGDH-M70、pAOGDH-M71、pAOGDH-M72、pAOGDH-M73、pAOGDH-M74、pAOGDH-M75、pAOGDH-M76的突变位置，用DNA测序仪(ABIPRISMTM 3700DNA Analyzer；Perkin-Elmer制)确定编码葡萄糖脱氢酶的基因的碱基序列，结果确认了pAOGDH-M20是将序列编号2中记载的第160位的甘氨酸置换成谷氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M21是将第160位的甘氨酸置换成异亮氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M22是将第160位的甘氨酸置换成丝氨酸谷氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M23是将第160位的甘氨酸置换成谷氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M24是将第162位的丝氨酸置换成丙氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M25是将第162位的丝氨酸置换成半胱氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M26是将第162位的丝氨酸置换成天冬氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M27是将第162位的丝氨酸置换成谷氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M25是将第162位的丝氨酸置换成半胱氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M28是将第162位的丝氨酸置换成苯丙氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M29是将第162位的丝氨酸置换成组氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M30是将第162位的丝氨酸置换成亮氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M31是将第163位的甘氨酸置换成天冬氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M32是将第164位的丝氨酸置换成苯丙氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M33是将第164位的丝氨酸置换成苏氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M34是将第164位的丝氨酸置换成酪氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M35是将第165位的亮氨酸置换成丙氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M36是将第165位的亮氨酸置换成异亮氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M37是将第165位的亮氨酸置换成天冬酰胺、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M38是将第165位的亮氨酸置换成脯氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸， pAOGDH-M39是将第165位的亮氨酸置换成缬氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M40是将第166位的丙氨酸置换成半胱氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M41是将第166位的丙氨酸置换成异亮氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M42是将第166位的丙氨酸置换成赖氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M43是将第166位的丙氨酸置换成亮氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M44是将第166位的丙氨酸置换成蛋氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M45是将第166位的丙氨酸置换成脯氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M46是将第166位的丙氨酸置换成丝氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M47是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第169位的天冬酰胺置换成赖氨酸，pAOGDH-M48是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第169位的天冬酰胺置换成脯氨酸，pAOGDH-M49是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第169位的天冬酰胺置换成酪氨酸，pAOGDH-M50是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第169位的天冬酰胺置换成色氨酸，pAOGDH-M51是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第170位的亮氨酸置换成半胱氨酸，pAOGDH-M52是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第170位的亮氨酸置换成苯丙氨酸，pAOGDH-M53是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第171位的亮氨酸置换成异亮氨酸，pAOGDH-M54是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第171位的亮氨酸置换成赖氨酸，pAOGDH-M55是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第171位的亮氨酸置换成蛋氨酸，pAOGDH-M56是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第171位的亮氨酸置换成谷氨酸，pAOGDH-M57是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第171位的亮氨酸置换成缬氨酸，pAOGDH-M58是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第172位的缬氨酸置换成丙氨酸，pAOGDH-M59是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第172位的缬氨酸置换成半胱氨酸，pAOGDH-M60是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第172位的缬氨酸置换成谷氨酸，pAOGDH-M61是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第172位的缬氨酸置换成异亮氨酸，pAOGDH-M62是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第172位的缬氨酸置换成蛋氨酸，pAOGDH-M63是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第172位的缬氨酸置换成半胱氨酸，pAOGDH-M64是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第172位的缬氨酸置换成谷氨酸，pAOGDH-M65是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第172位的缬氨酸置换成色氨酸，pAOGDH-M66是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第172位的缬氨酸置换成酪氨酸，pAOGDH-M67是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第329位的缬氨酸置换成谷氨酸，pAOGDH-M68是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第331位的丙氨酸置换成半胱氨酸，pAOGDH-M69是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第331位的丙缬氨酸置换成天冬氨酸，pAOGDH-M70是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第331位的丙氨酸置换成异亮氨酸，pAOGDH-M71是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第331位的丙氨酸置换成赖氨酸，pAOGDH-M72是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第331位的丙氨酸置换成亮氨酸，pAOGDH-M73是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第331位的丙氨酸置换成蛋氨酸，pAOGDH-M74是将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸、将第331位的丙氨酸置换成缬氨酸。将结果示于表3。

[表3]

氨基酸置换部位	热稳定性(％)
		G160E+S167P	28.3
G160I+S167P	46.3
		G160S+S167P	33.9
G160Q+S167P	31.8
		S162A+S167P	38.9
S162C+S167P	21.3
		S162D+S167P	31.0
S162E+S167P	22.2
		S162F+S167P	43.2
S162H+S167P	21.3
		S162L+S167P	38.9
G163D+S167P	28.1
		S164F+S167P	27.9
S164T+S167P	32.0
		S164Y+S167P	28.3
L165A+S167P	31.8
		L165I+S167P	22.6
L165N+S167P	24.3
		L165P+S167P	25.8

[0262]

L165V+S167P	33.8
		A166C+S167P	32.3
A166I+S167P	26.0
		A166K+S167P	37.1
A166L+S167P	21.3
		A166M+S167P	31.6
A166P+S167P	38.1
		A166S+S167P	22.5
S167P+N169K	33.0
		S167P+N169P	33.8

氨基酸置换部位	热稳定性(％)
		S167P+N169Y	42.3
S167P+N169W	31.3
		S167P+L170C	20.4
S167P+L170F	36.6
		S167P+S171I	42.0
S167P+S171K	46.1
		S167P+S171M	20.9
S167P+S171Q	30.0
		S167P+S171V	47.8
S167P+V172A	35.6
		S167P+V172C	38.4
S167P+V172E	37.0
		S167P+V172I	40.8
S167P+V172M	30.0
		S167P+V172S	35.9
S167P+V172T	37.3
		S167P+V172W	42.0
S167P+V172Y	30.0
		S167P+V329Q	21.8
S167P+A331C	34.3
		S167P+A331D	36.1
S167P+A331I	26.4
		S167P+A331K	33.4
S167P+A331L	31.7
		S167P+A331M	30.9
S167P+A331V	26.9
		G163K+V551C	85.9
G163R+V551C	84.9
		野生型	17.7

实施例6：源自米曲霉的修饰型FADGDH的取得

作为修饰型FADGDH生产菌，利用pAOGDH-M10、pAOGDH-M15、pAOGDH-M75、pAOGDH-M76转化市售的大肠杆菌感受态细胞(E.coliDH5α；TOYOBO公司制)。使用10L容积发酵罐，在TB培养基中，在培养温度25℃下培养24小时得到的转化体。在用离心分离收集菌体之后，悬浮于50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中，在进行除核酸处理之后，进行离心分离，得到上清。在其中溶解饱和量硫酸铵，使目的蛋白质沉淀，使利用离心分离收集的沉淀再溶解于50mM的磷酸缓冲液(pH6.5)。接着，实施利用G-25琼脂糖凝胶柱的凝胶过滤、利用辛基琼脂糖凝胶柱及苯基琼脂糖凝胶柱的疏水层析(洗脱条件均为在25％饱和～0％的硫酸铵浓度梯度下提取峰组分(peak fraction))，进而用利用G-25琼脂糖凝胶柱的凝胶过滤除去硫酸铵，作为修饰型FADGDH样本。如表4所示，在纯化标本中也确认了热稳定性的提高。

[表4]

氨基酸置换部位	热稳定性(％)
		S167P	46.0
V551C	63.9
		G163K+V551C	84.6
G163R+V551C	85.9
		野生型	17.7

实施例7：pH稳定性

为了了解在实施例6中得到的纯化标本的pH稳定性，配制pH 3.5～8.5的范围的缓冲液(pH 3.5～6.3：0.1M醋酸缓冲液、pH 6.3～7.3：0.1MPIPES buffer、pH 7.3～8.5：0.1M tris盐酸缓冲液、pH 6.0～7.7：0.1M磷酸缓冲液)，使用这些缓冲液，将各GDH稀释成酶浓度为1U/ml。在25℃下酶切稀释液16小时，比较酶切前后的活性。将示出酶切后的活性相对酶切前的活性的残存率的曲线图示于图1。如图1所示，可以确认pH稳定域的范围变宽。

实施例8：在源自土曲霉的FADGDH基因中的突变导入

我们成功地克隆了源自土曲霉的GDH基因，取得了其碱基序列信息。另外，还实施了以热稳定性为指标的筛选，鉴定了具有热稳定性提高效果的氨基酸部位。因此，对比了源自米曲霉的GDH的推断氨基酸序列与源自土曲霉的GDH的推断氨基酸序列，鉴定了在源自土曲霉的GDH中，对应在米曲霉FADGDH中具有热稳定性提高效果的部位的氨基酸残基。

以在实施例6中制作的重组质粒pAtGDH-s2-7为模板，以如下所述的合成寡核苷酸为基础，使用QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE制)，按照其操作规程，进行突变操作，转化市售的大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α；TOYOBO公司制)，然后在内含氨苄青霉素的琼脂培养基(1％多聚蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，1.5％琼脂；pH7.3)上涂布，然后在30℃下振荡培养一晚。其中的合成寡核苷酸是设计成将第116位的赖氨酸置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第159位的谷氨酸置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第161位的谷氨酸置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第164位的天冬酰胺置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第166位的苏氨酸置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第167位的苏氨酸置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第175位的赖氨酸置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第325位的丝氨酸置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第327位的丝氨酸置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第365位的谷氨酸置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸、设计成将第547位的缬氨酸置换成多种氨基酸的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸。

实施例9：内含源自土曲霉的修饰型FADGDH的粗酶液的配制

将得到的菌落进一步接种到内含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，在30℃下振荡培养一晚。对该培养液的一部分进行离心分离，回收得到的菌体，通过在50mM的磷酸缓冲液(pH7.0)中用玻璃珠破碎该菌体，从而配制粗酶液。

实施例10：提高了热稳定性的突变体的筛选

使用实施例9的粗酶液，利用上述的活性测定法，测定葡萄糖脱氢酶活性。另外，在50℃下加热处理15分钟同一粗酶液之后，测定葡萄糖脱氢酶活性。

用DNA测序仪(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer；Perkin-Elmer制)确定这些FADGDH的基因序列。将加热处理后的活性相对加热处理前的活性的残存率(％)示于表5。从该结果可知，使用重组体取得提高了热稳定性的源自土曲霉的葡萄糖脱氢酶是可能的。

[表5]

突变氨基酸	50℃×15min残存率(％)
		K116D	38
K116G	39
		K116L	44
K116F	63
		K116Q	42
Q159A	44
		Q159K	76
Q159N	54
		Q159P	44
Q159V	44
		Q159L	35
E161C	52
		N164Y	58
N164V	83
		N164C	48
T166F	88
		T166Y	84
T166W	77
		T167L	50
T167V	61
		T167S	43
G175K	43
		S325A	44
S325G	35
		S325K	45
S325Q	40
		S325R	38
S325T	41
		S325V	36
S325Y	36
		S327E	35
Q365R	35
		V547S	71
V547C	44
		V547A	87
V547Q	73
		修饰前	28

[0280] 另外，就相对各种糖类的底物特异性而言，按照上述的活性测定方法，测定酶活性。测定将葡萄糖作为底物溶液时的脱氢酶活性值与代替其而将相同摩尔浓度的比较对象的糖类(例如麦芽糖)作为底物溶液时的脱氢酶活性值，求得在将以葡萄糖为底物时的测定值作为100时的相对值。

在上述得到的各种突变体的底物特异性为良好。

实施例11：在FADGDH基因中的突变导入

利用内含编码野生型FADGDH的基因(序列编号1)的重组质粒pAOGDH-S2，转化市售的大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α；TOYOBO公司制)，然后在内含氨苄青霉素(50μg/ml；Nacalai Tesque公司制)的液体培养基(1％多聚蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl；pH7.3)中接种转化体，在30℃下振荡培养一晚，利用常规方法，从得到的菌体配制质粒。将该质粒用作模板，按照其具体操作实施使用QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE公司制)的突变处理，制作具有葡萄糖脱氢酶的生产能力的修饰型FADGDH突变质粒，利用上述方法同样地配制质粒。

实施例12：内含修饰型FADGDH的粗酶液的配制

利用在实施例2中配制的质粒pAOGDH-S2转化市售的大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α；TOYOBO公司制)，然后在内含氨苄青霉素的琼脂培养基(1％多聚蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，1.5％琼脂；pH7.3)上涂布转化体，然后在30℃下振荡培养一晚，将得到的菌落进一步接种到内含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基上，在30℃下振荡培养一晚。对该培养液的一部分进行离心分离，回收得到的菌体，通过在50mM的磷酸缓冲液(pH7.0)中用玻璃珠破碎该菌体，从而配制粗酶液。

实施例13：提高了底物特异性的突变体的筛选

使用实施例3的粗酶液，利用上述的活性测定法，以葡萄糖以及木糖为底物，测定活性，结果取得7种提高了底物特异性的突变体。将编码这7种突变体的质粒命名为pAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4、pAOGDH-M5、pAOGDH-M6、pAOGDH-M7。

为了鉴定pAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4、pAOGDH-M5、pAOGDH-M6、pAOGDH-M7的突变位置，用DNA测序仪(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer；Perkin-Elmer制)确定编码葡萄糖脱氢酶的基因的碱基序列，结果确认了pAOGDH-M1是将序列编号2中记载的第53位的甘氨酸置换成半胱氨酸，pAOGDH-M2是将序列编号2记载的第53位的甘氨酸置换成组氨酸，pAOGDH-M3是将序列编号2记载的第53位的甘氨酸置换成赖氨酸，pAOGDH-M4是将序列编号2记载的第53位的甘氨酸置换成蛋氨酸，pAOGDH-M5是将序列编号2记载的第53位的甘氨酸置换成苏氨酸、pAOGDH-M6是将序列编号2记载的第53位的甘氨酸置换成缬氨酸。将结果示于表6。

[表6]

突变部位	底物特异性(％)
		G53C	4.3
G53H	2.5
		G53K	2.8
G53M	3.1
		G53N	2.9
G53T	4.8
		G53V	4.4
野生型	9.6

实施例14：提高了底物特异性及/或热稳定性的突变体的制作

以在实施例13中配制的质粒pAOGDH-M2为模板，以设计成将第164位的丝氨酸置换成脯氨酸的序列编号50的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸为基础；以pAOGDH-M5为模板，以设计成将第164位的丝氨酸置换成脯氨酸的序列编号50的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸为基础；以pAOGDH-M2为模板，以设计成将第163位的甘氨酸置换成精氨酸的序列编号51的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸为基础；进而，以设计成将第551位的缬氨酸置换成半胱氨酸的序列编号 52的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸为基础，利用与实施例2相同的方法进行突变操作，制作底物特异性及/或热稳定性出色的修饰型FADGDH，利用与上述相同的方法配制质粒。

为了鉴定突变位置，与实施例4同样地用DNA测序仪(ABIPRISMTM 3700DNA Analyzer；Perkin-Elmer制)确定编码葡萄糖脱氢酶的基因的碱基序列，结果确认了pAOGDH-M8是将序列编号2中记载的第53位的甘氨酸置换成组氨酸、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M9是将序列编号2中记载的第53位的甘氨酸置换成天冬酰胺、将第167位的丝氨酸置换成脯氨酸，pAOGDH-M10是将序列编号2中记载的第53位的甘氨酸置换成天冬酰胺、将第163位的甘氨酸置换成天冬酰胺、将第551位的缬氨酸置换成半胱氨酸。利用与实施例4相同的活性测定法，以葡萄糖以及木糖为底物，测定活性，结果确认pAOGDH-M8、pAOGDH-M9、pAOGDH-M10的底物特异性提高了。为了测定热稳定性，与实施例3的方法同样地配制pAOGDH-M8、pAOGDH-M9、pAOGDH-M10的粗酶液，利用上述的活性测定法，测定葡萄糖脱氢酶活性。另外，在50℃下加热处理15分钟同一粗酶液之后，测定葡萄糖脱氢酶活性，确认pAOGDH-M8、pAOGDH-M9、pAOGDH-M10的热稳定性提高了。将结果示于表7。

[表7]

突变部位	底物特异性 (％)	热稳定性 (％)
			G53H+S167P	2.9	27.1
G53N+S167P	2.8	30.3
			G53N+G163R+V551C	3.3	84.2
野生型	10.0	17.2

实施例15：修饰型FADGDH的取得

作为修饰型FADGDH生产菌，利用pAOGDH-M8、pAOGDH-M9、pAOGDH-M10转化市售的大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α；TOYOBO公司制)。使用10L容积发酵罐，在TB培养基中，在培养温度25℃下培养24小时得到的转化体。在用离心分离收集培养菌体之后，悬浮于50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中，在进行除核酸处理之后，进行离心分离，得到上清。在其中溶解饱和量硫酸铵，使目的蛋白质沉淀，使利用离心分离收集的沉淀再溶解于50mM的磷酸缓冲液(pH6.5)。接着，实施利用G-25琼脂糖凝胶柱的凝胶过滤、利用辛基琼脂糖凝胶柱及苯基琼脂糖凝胶柱的疏水层析(洗脱条件均为在25％饱和～0％的硫酸铵浓度梯度下提取峰组分)，进而用利用G-25琼脂糖凝胶柱的凝胶过滤除去硫酸铵，作为修饰型FADGDH样本。如表3所示，在纯化标本中也确认了热稳定性的提高。

[表8]

突变部位	底物特异性 (％)	热稳定性 (％)
			G53H+S167P	2.6	27.1
G53N+S167P	2.7	30.3
			G53N+G163R+V551C	3.3	80.2
野生型	9.6	17.8

产业上的可利用性

本发明发现了FAD-GDH中的与热稳定性提高相关的氨基酸残基，并证实了可以应用于所有属、种的FAD-GDH。另外，利用本发明的FADGDH的稳定性的提高减低了葡萄糖测定试剂、葡萄糖检测试剂盒及葡萄糖传感器制作时的酶的热失活，从而可以减低该酶的使用量或提高测定精密度，对医疗相关领域等产业的贡献极大。

序列表

<110>东洋纺织株式会社

<120>修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶

<130>P07-109

<150>JP 2006-308337

<151>2006-11-14

<150>JP 2006-336351

<151>2006-11-14

<150>US 60/868,249

<151>2006-12-01

<150>JP 2007-035978

<151>2007-02-16

<150>JP 2007-035979

<151>2007-02-16

<150>JP 2007-035980

<151>2007-02-16

<150>JP 2007-045372

<151>2007-02-26

<150>US 60/892,761

<151>2007-03-02

<160>52

<170>专利索引版本3.1

<210>1

<211>1719

<212>DNA

<213>曲霉

<400>1

atgaagaaca ctacgacata cgactacatc gttgtgggag gcggcacaag tggtcttgtg 60

gtcgcaaatc gcctttctga gaaccccgat gtctccgttc ttctgcttga ggccggtgct 120

tctgtgttca acaacccgga cgtaaccaac gctaacggtt atggattggc ctttggctcg 180

gccatcgact ggcagtacca gtctattaac caaagctatg caggaggtaa acagcaagtt 240

ctgcgtgctg gtaaggccct tggaggaacc agtacaatca atggaatggc ctatacccgc 300

gcagaggatg tccagattga cgtttggcag aaacttggaa acgaaggttg gacgtggaaa 360

gatctcctac catactacct gaagagtgaa aacttgacgg cccctaccag ctctcaggtt 420

gctgctggcg ctgcttataa ccctgccgtg aatggaaaag aaggtcctct caaggtcggc 480

tggtcgggaa gcctggcctc cggtaatctg tcagttgctc tgaaccgtac gttccaagcc 540

gctggtgttc catgggttga ggatgtcaat ggaggcaaga tgcgtggctt caacatctac 600

ccatccaccc tcgacgttga cctcaatgtc cgcgaagatg cagcccgggc atactacttc 660

ccttatgatg acaggaagaa ccttcacctg ctggagaaca ccactgccaa ccgccttttc 720

tggaagaacg gctctgctga ggaagctatt gcggatggtg tcgagatcac ctccgctgat 780

ggcaaggtca ctcgtgtgca tgcaaagaaa gaggtcatca tctctgctgg tgccctgcgg 840

tctcctctca ttctcgagct ttcaggagtt ggaaacccaa ccatcctcaa aaagaacaac 900

ataaccccac gtgtcgatct ccccaccgtt ggggagaacc tccaagacca gttcaacaac 960

ggcatggctg gcgaaggata cggcgtcctt gccggtgcct caaccgtgac ctacccttcc 1020

atctccgacg tcttcggtaa cgagactgac tctatcgttg catctctccg atctcaactc 1080

tccgactacg ccgccgcgac cgtcaaggtc agcaacggcc acatgaagca ggaggacctt 1140

gagcgcctct accagctcca atttgacctc atcgtcaagg acaaggtccc tatcgccgag 1200

atcctcttcc accccggtgg tggaaacgcc gtgtcctccg aattctgggg cttgcttccc 1260

ttcgcccgtg gcaacatcca cattagctcc aatgacccga ctgctcccgc cgccatcaac 1320

cctaactact ttatgttcga atgggacggc aagagccagg ccggtatcgc caagtacatc 1380

aggaagattc tccgcagcgc accattgaac aaacttattg cgaaggaaac caagcccggt 1440

ctctctgaga ttccggccac tgctgcggat gagaagtggg ttgaatggct caaggctaac 1500

tatcgttcca acttccaccc cgtcggaact gctgccatga tgcctcgttc cattggtggc 1560

gttgttgata accgtctccg ggtctatggt accagcaatg ttcgcgtcgt agatgcgtct 1620

gtcctgccct tccaggtttg cggccacttg gttagcacgc tttatgccgttgccgagcgc 1680

gcttccgact tgattaagga ggatgcgaag agtgcttag 1719

<210>2

<211>572

<212>PRT

<213>Aspergillus oryzae

<400>2

Met Lys Asn Thr Thr Thr Tyr Asp Tyr Ile Val Val Gly Gly Gly Thr

1 5 10 15

Ser Gly Leu Val Val Ala Asn Arg Leu Ser Glu Asn Pro Asp Val Ser

20 25 30

Val Leu Leu Leu Glu Ala Gly Ala Ser Val Phe Asn Asn Pro Asp Val

35 40 45

Thr Asn Ala Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Phe Gly Ser Ala Ile Asp Trp

50 55 60

Gln Tyr Gln Ser Ile Asn Gln Ser Tyr Ala Gly Gly Lys Gln Gln Val

65 70 75 80

Leu Arg Ala Gly Lys Ala Leu Gly Gly Thr Ser Thr Ile Asn Gly Met

85 90 95

Ala Tyr Thr Arg Ala Glu Asp Val Gln Ile Asp Val Trp Gln Lys Leu

100 105 110

Gly Asn Glu Gly Trp Thr Trp Lys Asp Leu Leu Pro Tyr Tyr Leu Lys

115 120 125

Ser Glu Asn Leu Thr Ala Pro Thr Ser Ser Gln Val Ala Ala Gly Ala

130 135 140

Ala Tyr Asn Pro Ala Val Asn Gly Lys Glu Gly Pro Leu Lys Val Gly

145 150 155 160

Trp Ser Gly Ser Leu Ala Ser Gly Asn Leu Ser Val Ala Leu Asn Arg

165 170 175

Thr Phe Gln Ala Ala Gly Val Pro Trp Val Glu Asp Val Asn Gly Gly

180 185 190

Lys Met Arg Gly Phe Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Leu Asp Val Asp Leu

195 200 205

Asn Val Arg Glu Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Tyr Phe Pro Tyr Asp Asp

210 215 220

Arg Lys Asn Leu His Leu Leu Glu Asn Thr Thr Ala Asn Arg Leu Phe

225 2302 35 240

Trp Lys Asn Gly Ser Ala Glu Glu Ala Ile Ala Asp Gly Val Glu Ile

245 250 255

Thr Ser Ala Asp Gly Lys Val Thr Arg Val His Ala Lys Lys Glu Val

260 265 270

Ile Ile Ser Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Leu Ile Leu Glu Leu Ser

275 280 285

Gly Val Gly Asn Pro Thr Ile Leu Lys Lys Asn Asn Ile Thr Pro Arg

290 295 300

Val Asp Leu Pro Thr Val Gly Glu Asn Leu Gln Asp Gln Phe Asn Asn

305 310 315 320

Gly Met Ala Gly Glu Gly Tyr Gly Val Leu Ala Gly Ala Ser Thr Val

325 330 335

Thr Tyr Pro Ser Ile Ser Asp Val Phe Gly Asn Glu Thr Asp Ser Ile

340 345 350

Val Ala Ser Leu Arg Ser Gln Leu Ser Asp Tyr Ala Ala Ala Thr Val

355 360 365

Lys Val Ser Asn Gly His Met Lys Gln Glu Asp Leu Glu Arg Leu Tyr

370 375 380

Gln Leu Gln Phe Asp Leu Ile Val Lys Asp Lys Val Pro Ile Ala Glu

385 390 395 400

Ile Leu Phe His Pro Gly Gly Gly Asn Ala Val Ser Ser Glu Phe Trp

405 410 415

Gly Leu Leu Pro Phe Ala Arg Gly Asn Ile His Ile Ser Ser Asn Asp

420 425 430

Pro Thr Ala Pro Ala Ala Ile Asn Pro Asn Tyr Phe Met Phe Glu Trp

435 440 445

Asp Gly Lys Ser Gln Ala Gly Ile Ala Lys Tyr Ile Arg Lys Ile Leu

450 455 460

Arg Ser Ala Pro Leu Asn Lys Leu Ile Ala Lys Glu Thr Lys Pro Gly

465 470 475 480

Leu Ser Glu Ile Pro Ala Thr Ala Ala Asp Glu Lys Trp Val Glu Trp

485 490 495

Leu Lys Ala Asn Tyr Arg Ser Asn Phe His Pro Val Gly Thr Ala Ala

500 505 510

Met Met Pro Arg Ser Ile Gly Gly Val Val Asp Asn Arg Leu Arg Val

515 520 525

Tyr Gly Thr Ser Asn Val Arg Val Val Asp Ala Ser Val Leu Pro Phe

530 535 540

Gln Val Cys Gly His Leu Val Ser Thr Leu Tyr Ala Val Ala Glu Arg

545 550 555 560

Ala Ser Asp Leu Ile Lys Glu Asp Ala Lys Ser Ala

565 570

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>3

gaaggtcctc tcaaggtcnn stggtcggga agcctggcc

39

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>4

ggtcctctca aggtcggcnn stcgggaagc ctggcctcc 39

<210>5

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>5

cctctcaagg tcggctggnn sggaagcctg gcctccggt 39

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>6

ctcaaggtcg gcttgtcgnn sagcctggcc tcccctaat 39

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>7

aaggtcggct ggtcgggann sctggcctcc ggtaatctg 39

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>8

gtcggctggt cgggaagcnn sgcctccggt aatctgtca 39

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>9

ggctggtcgg gaagcctgnn stccggtaat ctgtcagtt 39

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>10

tggtcgggaa gcctgnnstc cggtaatctg tcagttgct 39

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>11

tcgggaagcc tggcctccnn saatctgtca gttgctctg 39

<210>12

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>12

ggaagcctgg cctccggtnn stcagttgct ctgaaccgt 39

<210>13

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>13

agcctggcct ccggtaatnn stcagttgct ctgaaccgt 39

<210>14

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>14

ctggcctccg gtaatctgnn sgttgctctg aaccgtacg 39

<210>15

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>15

gcctccggta atctgtcann sgctctgaac cgtacgttct 39

<210>16

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>16

gctggcgaag gatacggcnn scttgccggt gcctcaacc 39

<210>17

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>17

ggcgaaggatacggcgtcnnsgccggtgcctcaaccgtg 39

<210>18

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>18

gaaggatacg gcgtccttnn sggtgcctca accgtgacc 39

<210>19

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 4

<400>19

caggtttgcg gccacttcnn sagcacgctt tatgccgtt 39

<210>20

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>20

gaaggtcctc tcaaggtcnn stcgggaagc ctggccccg

39

<210>21

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>21

ggtcctctca aggtcggcnn sggaagcctg gccccgggt 39

<210>22

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>39

cctctcaagg tcggctggnn sggaagcctg gccccgggt 39

<210>23

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>23

ctcaaggtcg gcttgtcgnn sagcctggcc ccgggtaat 37

<210>24

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>24

ctcaaggtcg gctggtcgnn sagcctggcc ccgggtaat 39

<210>25

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>25

gtcggctggt cgggaagcnn sgccccgggt aatctgtca 39

<210>26

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>26

ggctggtcgg gaagcctgnn sccgggtaat ctgtcagtt 39

<210>27

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>27

tcgggaagcc tggccctgnn saatctgtca gttgctctg 39

<210>28

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>28

ggaagcctgg ccccgggtnn sctgtcagttgct ctgaac 39

<210>29

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>29

agcctggcc ccggtaatnn stcagttgct ctgaaccgt 39

<210>30

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>30

ctggccccg ggtaatctgnn sgttgctctg aaccgtacg 39

<210>31

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>31

gccccgggta atctgtcann sgctctgaac cgtacgttc 39

<210>32

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>32

gctggcgaag gatacggcnn scttgccggt gcctcaacc 39

<210>33

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>33

ggcgaaggat acggcgtcnn sgccggtgcc tcaaccgtg 39

<210>34

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>34

gaaggatacg gcgtccttnn sggtgcctca accgtgacc 39

<210>35

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>35

caggtttgcg gccacttcnn sagcacgctt tatgccgtt 39

<210>36

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Example 5

<400>36

ctcaaggtcg gctggtcgnn sagcctggcc tccggtaat 39

<210>37

<211>14

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed peptide described in Experiment 1

<400>37

Ile Gly Gly Val Val Asp Thr Ser Leu Lys Val Tyr Gly Thr 14

1 5 10

<210>38

<211>20

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed peptide described in Experiment 1

<400>38

Trp Gly Gly Gly Thr Lys Gln Thr Val Arg Ala Gly Lys Ala Leu

1 5 10 15

Gly Gly Thr Ser Thr 20

20

<210>39

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polynucleotide described in Experiment 2

<400>39

ggaattccat atgctcttct cactggcatt cctg 34

<210>40

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polynucleotide described in Experiment 2

<400>40

cgggatccga attggtacgg gacactgtcc ctacg 35

<210>41

<211>1779

<212>DNA

<213>Aspergillus oryzae

<400>41

atgctcttct cactggcatt cctgagtgcc ctgtcgctgg ccacggcatc accggctgga 60

cgggccaaga acactacgac atacgactac atcgttgtgg gaggcggcac aagtggtctt 120

gtggtcgcaa atcgcctttc tgagaacccc gatgtctccg ttcttctgct tgaggccggt 180

gcttctgtgt tcaacaaccc ggacgtaacc aacgctaacg gttatggatt ggcctttggc 240

tcggccatcg actggcagta ccagtctatt aaccaaagct atgcaggagg taaacagcaa 300

gttctgcgtg ctggtaaggc ccttggagga accagtacaa tcaatggaat ggcctatacc 360

cgcgcagagg atgtccagat tgacgtttgg cagaaacttg gaaacgaagg ttggacgtgg 420

aaagatctcc taccatacta cctgaagagt gaaaacttga cggcccctac cagctctcag 480

gttgctgctg gcgctgctta taaccctgcc gtgaatggaa aagaaggtcc tctcaaggtc 540

ggctggtcgg gaagcctggc ctccggtaat ctgtcagttg ctctgaaccg tacgttccaa 600

gccgctggtg ttccatgggt tgaggatgtc aatggaggca agatgcgtgg cttcaacatc 660

tacccatcca ccctcgacgt tgacctcaat gtccgcgaag atgcagcccg ggcatactac 720

ttcccttatg atgacaggaa gaaccttcac ctgctggaga acaccactgc caaccgcctt 780

ttctggaaga acggctctgc tgaggaagct attgcggatg gtgtcgagat cacctccgct 840

gatggcaagg tcactcgtgt gcatgcaaag aaagaggtca tcatctctgc tggtgccctg 900

cggtctcctc tcattctcga gctttcagga gttggaaacc caaccatcct caaaaagaac 960

aacataaccc cacgtgtcga tctccccacc gttggggaga acctccaaga ccagttcaac 1020

aacggcatgg ctggcgaagg atacggcgtc cttgccggtg cctcaaccgt gacctaccct 1080

tccatctccg acgtcttcgg taacgagact gactctatcg ttgcatctct ccgatctcaa 1140

ctctccgact acgccgccgc gaccgtcaag gtcagcaacg gccacatgaa gcaggaggac 1200

cttgagcgcc tctaccagct ccaatttgac ctcatcgtca aggacaaggt ccctatcgcc 1260

gagatcctct tccaccccgg tggtggaaac gccgtgtcct ccgaattctg gggcttgctt 1320

cccttcgccc gtggcaacat ccacattagc tccaatgacc cgactgctcc cgccgccatc 1380

aaccctaact actttatgtt cgaatgggac ggcaagagcc aggccggtat cgccaagtac 1440

atcaggaaga ttctccgcag cgcaccattg aacaaactta ttgcgaagga aaccaagccc 1500

ggtctctctg agattccggc cactgctgcg gatgagaagt gggttgaatg gctcaaggct 1560

aactatcgtt ccaacttcca ccccgtcgga actgctgcca tgatgcctcg ttccattggt 1620

ggcgttgttg ataaccgtct ccgggtctat ggtaccagca atgttcgcgt cgtagatgcg 1680

tctgtcctgc ccttccaggt ttgcggccac ttggttagca cgctttatgc cgttgccgag 1740

cgcgcttccg acttgattaa ggaggatgcg aagagtgct 1779

<210>42

<211>593

<212>PRT

<213>Aspergillus oryzae

<400>42

Met Leu Phe Ser Leu Ala Phe Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ala Thr Ala

1 5 10 15

Ser Pro Ala Gly Arg Ala Lys Asn Thr Thr Thr Tyr Asp Tyr Ile Val

20 25 30

Val Gly Gly Gly Thr Ser Gly Leu Val Val Ala Asn Arg Leu Ser Glu

35 40 45

Asn Pro Asp Val Ser Val Leu Leu Leu Glu Ala Gly Ala Ser Val Phe

50 55 60

Asn Asn Pro Asp Val Thr Asn Ala Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Phe Gly

65 70 75 80

Ser Ala Ile Asp Trp Gln Tyr Gln Ser Ile Asn Gln Ser Tyr Ala Gly

85 90 95

Gly Lys Gln Gln Val Leu Arg Ala Gly Lys Ala Leu Gly Gly Thr Ser

100 105 110

Thr Ile Asn Gly Met Ala Tyr Thr Arg Ala Glu Asp Val Gln Ile Asp

115 120 125

Val Trp Gln Lys Leu Gly Asn Glu Gly Trp Thr Trp Lys Asp Leu Leu

130 135 140

Pro Tyr Tyr Leu Lys Ser Glu Asn Leu Thr Ala Pro Thr Ser Ser Gln

145 150 155 160

Val Ala Ala Gly Ala Ala Tyr Asn Pro Ala Val Asn Gly Lys Glu Gly

165 170 175

Pro Leu Lys Val Gly Trp Ser Gly Ser Leu Ala Ser Gly Asn Leu Ser

180 185 190

Val Ala Leu Asn Arg Thr Phe Gln Ala Ala Gly Val Pro Trp Val Glu

195 200 205

Asp Val Asn Gly Gly Lys Met Arg Gly Phe Asn Ile Tyr Pro Ser Thr

210 215 220

Leu Asp Val Asp Leu Asn Val Arg Glu Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Tyr

225 230 235 240

Phe Pro Tyr Asp Asp Arg Lys Asn Leu His Leu Leu Glu Asn Thr Thr

245 250 255

Ala Asn Arg Leu Phe Trp Lys Asn Gly Ser Ala Glu Glu Ala Ile Ala

260 265 270

Asp Gly Val Glu Ile Thr Ser Ala Asp Gly Lys Val Thr Arg Val His

275 280 285

Ala Lys Lys Glu Val Ile Ile Ser Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Leu

290 295 300

Ile Leu Glu Leu Ser Gly Val Gly Asn Pro Thr Ile Leu Lys Lys Asn

305 310 315 320

Asn Ile Thr Pro Arg Val Asp Leu Pro Thr Val Gly Glu Asn Leu Gln

325 330 335

Asp Gln Phe Asn Asn Gly Met Ala Gly Glu Gly Tyr Gly Val Leu Ala

340 345 350

Gly Ala Ser Thr Val Thr Tyr Pro Ser Ile Ser Asp Val Phe Gly Asn

355 360 365

Glu Thr Asp Ser Ile Val Ala Ser Leu Arg Ser Gln Leu Ser Asp Tyr

370 375 380

Ala Ala Ala Thr Val Lys Val Ser Asn Gly His Met Lys Gln Glu Asp

385 390 395 400

Leu Glu Arg Leu Tyr Gln Leu Gln Phe Asp Leu Ile Val Lys Asp Lys

405 410 415

Val Pro Ile Ala Glu Ile Leu Phe His Pro Gly Gly Gly Asn Ala Val

420 425 430

Ser Ser Glu Phe Trp Gly Leu Leu Pro Phe Ala Arg Gly Asn Ile His

435 440 445

Ile Ser Ser Asn Asp Pro Thr Ala Pro Ala Ala Ile Asn Pro Asn Tyr

450 455 460

Phe Met Phe Glu Trp Asp Gly Lys Ser Gln Ala Gly Ile Ala Lys Tyr

465 470 475 480

Ile Arg Lys Ile Leu Arg Ser Ala Pro Leu Asn Lys Leu Ile Ala Lys

485 490 495

Glu Thr Lys Pro Gly Leu Ser Glu Ile Pro Ala Thr Ala Ala Asp Glu

500 505 510

Lys Trp Val Glu Trp Leu Lys Ala Asn Tyr Arg Ser Asn Phe His Pro

515 520 525

Val Gly Thr Ala Ala Met Met Pro Arg Ser Ile Gly Gly Val Val Asp

530 535 540

Asn Arg Leu Arg Val Tyr Gly Thr Ser Asn Val Arg Val Val Asp Ala

545 550 555 560

Ser Val Leu Pro Phe Gln Val Cys Gly His Leu Val Ser Thr Leu Tyr

565 570 575

Ala Val Ala Glu Arg Ala Ser Asp Leu Ile Lys Glu Asp Ala Lys Ser

580 585 590

Ala

<210>43

<211>37

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Experiment 3

<400>43

ggaattccat atgaagaaca ctacgacata cgactac 37

<210>44

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polinucleotide described in Experiment 3

<400>44

cgggatccga attggtacgg gacactgtcc ctacg 35

<210>45

<211>1776

<212>DNA

<213>Aspergillus terreus

<400>45

atgttgggaa agctctcctt cctcagtgcc ctgtccctgg cagtggcagc acctttgtcc 60

aactccacgt ccgccaaata tgattatatc gttattggag gcggtaccag cggtttggcc 120

gtcgcaaacc gtctatcgga ggacccaagc gtgaacgtac tcattctgga ggccggtggc 180

tcggtctgga acaatcccaa tgtcacaaac gtgaatggct atgggcttgc atttgggtct 240

gacattgact ggcaatacca gtccgtcaac cagccatatg gaggcaacgt cagtcaagtg 300

ctgcgtgccg gcaaggccct tggtggtact agtactatta acggtatggc ctatacccgc 360

gccgaggatg tccagatcga cgcctgggaa accattggca acacaggatg gacgtggaag 420

aatctgttcc cttactatcg gaagagcgag aacttcactg tccctaccaa atcgcagact 480

tctcttggag cgtcgtatga agctggagcc cacggccacg agggtcccct tgacgttgcc 540

ttcactcaga tcgagtcgaa caacctgacc acctacctca accgtacctt ccagggcatg 600

ggactcccat ggactgagga cgtcaatggc ggaaagatgc gcggctttaa cctatacccc 660

tccaccgtga atcttgagga gtatgttcgc gaagacgccg ctcgtgcata ctactggcct 720

tacaagtccc gtcccaacct gcatgtcctg ctcaacactt ttgccaaccg gattgtgtgg 780

gacggcgaag cccgtgatgg cgacatcact gccagtggtg tcgagatcac ttccaggaac 840

ggcactgttc gtgttatcaa tgcggagaag gaagtcattg tctctgccgg cgccttgaag 900

tccccggcta tccttgaact ttccggaatt ggcaacccta gcgttcttga caagtacaac 960

atccccgtca aggtcaacct ccctactgta ggtgagaacc ttcaggacca ggtgaacagc 1020

cacatggatg cgtcgggcaa cacttccatc tctggaacca aggcagtctc ttaccccgat 1080

gtctatgacg tcttcggtga cgaagccgag tcggtcgcca aacagatccg tgccagcctg 1140

aagcaatacg ccgccgacac cgcccaggcc aacggaaaca tcatgaaggc cgccgatctg 1200

gagcgtctct tcgaggtcca gtatgacctt attttcaagg gcagagtccc aattgcagaa 1260

gtcctcaact atcctggcag cgcgacgtcc gtgtttgcag aattctgggc cctccttccc 1320

ttcgctcggg gaagtgttca catcggttct tcaaacccgg tcgagtttcc tgtcatcaac 1380

cccaactatt tcatgctcga ctgggacgcg aagagctacg tcgccgttgc aaagtatatc 1440

cgccgctcgt tcgagagcta ccctctcagc agcatcgtta aggagtctac ccctggctat 1500

gatgttatcc cccggaacgc ttctgaacag agctggaaag aatgggtctt tgataagaac 1560

tatcgttcta acttccatcc cgtcggcacg gctgccatga tgcctcgtga aattggcggt 1620

gtcgtggacg agcgtctgaa tgtctatggt actacgaacg tcagagttgt cgatgcctcg 1680

gtgcttccgt tccaggtctg cggtcatttg gtgagcaccc tatacgctgt ggccgaacgg 1740

gcagcggatc tcatcaaggc cgatgctggt cgtcgt 1776

<210>46

<211>568

<212>PRT

<213>Aspergillus terreus

<400>46

Met Lys Tyr Asp Tyr Ile Val Ile Gly Gly Gly Thr Ser Gly Leu Ala

1 5 10 15

Val Ala Asn Arg Leu Ser Glu Asp Pro Ser Val Asn Val Leu Ile Leu

20 25 30

Glu Ala Gly Gly Ser Val Trp Asn Asn Pro Asn Val Thr Asn Val Asn

35 40 45

Gly Tyr Gly Leu Ala Phe Gly Ser Asp Ile Asp Trp Gln Tyr Gln Ser

50 55 60

Val Asn Gln Pro Tyr Gly Gly Asn Val Ser Gln Val Leu Arg Ala Gly

65 70 75 80

Lys Ala Leu Gly Gly Thr Ser Thr Ile Asn Gly Met Ala Tyr Thr Arg

85 90 95

Ala Glu Asp Val Gln Ile Asp Ala Trp Glu Thr Ile Gly Asn Thr Gly

100 105 110

Trp Thr Trp Lys Asn Leu Phe Pro Tyr Tyr Arg Lys Ser Glu Asn Phe

115 120 125

Thr Val Pro Thr Lys Ser Gln Thr Ser Leu Gly Ala Ser Tyr Glu Ala

130 135 140

Gly Ala His Gly His Glu Gly Pro Leu Asp Val Ala Phe Thr Gln Ile

145 150 155 160

Glu Ser Asn Asn Leu Thr Thr Tyr Leu Asn Arg Thr Phe Gln Gly Met

165 170 175

Gly Leu Pro Trp Thr Glu Asp Val Asn Gly Gly Lys Met Arg Gly Phe

180 185 190

Asn Leu Tyr Pro Ser Thr Val Asn Leu Glu Glu Tyr Val Arg Glu Asp

195 200 205

Ala Ala Arg Ala Tyr Tyr Trp Pro Tyr Lys Ser Arg Pro Asn Leu His

210 215 220

Val Leu Leu Asn Thr Phe Ala Asn Arg Ile Val Trp Asp Gly Glu Ala

225 230 235 240

Arg Asp Gly Asp Ile Thr Ala Ser Gly Val Glu Ile Thr Ser Arg Asn

245 250 255

Gly Thr Val Arg Val Ile Asn Ala Glu Lys Glu Val Ile Val Ser Ala

260 265 270

Gly Ala Leu Lys Ser Pro Ala Ile Leu Glu Leu Ser Gly Ile Gly Asn

275 280 285

Pro Ser Val Leu Asp Lys Tyr Asn Ile Pro Val Lys Val Asn Leu Pro

290 295 300

Thr Val Gly Glu Asn Leu Gln Asp Gln Val Asn Ser His Met Asp Ala

305 310 315 320

Ser Gly Asn Thr Ser Ile Ser Gly Thr Lys Ala Val Ser Tyr Pro Asp

325 330 335

Val Tyr Asp Val Phe Gly Asp Glu Ala Glu Ser Val Ala Lys Gln Ile

340 345 350

Arg Ala Ser Leu Lys Gln Tyr Ala Ala Asp Thr Ala Gln Ala Asn Gly

355 360 365

Asn Ile Met Lys Ala Ala Asp Leu Glu Arg Leu Phe Glu Val Gln Tyr

370 375 380

Asp Leu Ile Phe Lys Gly Arg Val Pro Ile Ala Glu Val Leu Asn Tyr

385 390 395 400

Pro Gly Ser Ala Thr Ser Val Phe Ala Glu Phe Trp Ala Leu Leu Pro

405 410 415

Phe Ala Arg Gly Ser Val His Ile Gly Ser Ser Asn Pro Val Glu Phe

420 425 430

Pro Val Ile Asn Pro Asn Tyr Phe Met Leu Asp Trp Asp Ala Lys Ser

435 440 445

Tyr Val Ala Val Ala Lys Tyr Ile Arg Arg Ser Phe Glu Ser Tyr Pro

450 455 460

Leu Ser Ser Ile Val Lys Glu Ser Thr Pro Gly Tyr Asp Val Ile Pro

465 470 475 480

Arg Asn Ala Ser Glu Gln Ser Trp Lys Glu Trp Val Phe Asp Lys Asn

485 490 495

Tyr Arg Ser Asn Phe His Pro Val Gly Thr Ala Ala Met Met Pro Arg

500 505 510

Glu Ile Gly Gly Val Val Asp Glu Arg Leu Asn Val Tyr Gly Thr Thr

515 520 525

Asn Val Arg Val Val Asp Ala Ser Val Leu Pro Phe Gln Val Cys Gly

530 535 540

His Leu Val Ser Thr Leu Tyr Ala Val Ala Glu Arg Ala Ala Asp Leu

545 550 555 560

Ile Lys Ala Asp Ala Gly Arg Arg

565

<210>47

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial Seqence

<220>

<223>The sequence of designed polynucleotide described in Experiment 6

<400>47

ggaattccat atgaaatatg attatatcgt tattgg 36

<210>48

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>The sequence of designed polynucleotide described in Eeperiment 6

<400>48

cgggatccga agcgatgagt ataggtaccttc

<210>49

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polynucleotide described in Example 11

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(18)

<223>n stands for any base

<400>49

gtaaccaccg ctaacnnnta tggattggcc tt 32

<210>50

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polynucleotide described in Example 14

<400>50

tggtcgggaa gcctgggccc gggtaatctg tcagttgct 39

<210>51

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polynucleotide described in Example 14

<400>51

ctcaaggtcg gctggtcgcg cagcctggcc tccggtaat 39

<210>52

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>The sequence of designed polynucleotide described in Example 14

<400>52

caggtttgcg gccacttgtg cagcacgctt tatgccgtt 39

Claims

1.一种提高了热稳定性的修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)，

所述修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)具有与源自野生型米曲霉(Aspergillus oryzae)的FADGDH相比提高的热稳定性并由以下组成：

(i)序列编号2的氨基酸序列，只是163位的甘氨酸被精氨酸取代，且551位的缬氨酸被半胱氨酸取代；或

(ii)序列编号2的氨基酸序列，只是163位的甘氨酸被赖氨酸取代，且551位的缬氨酸被半胱氨酸取代。

2.一种提高了热稳定性的修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)，

所述修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)具有与源自野生型米曲霉的FADGDH相比提高的热稳定性并由序列编号2的氨基酸序列组成，只是162位的丝氨酸被脯氨酸取代。

3.一种提高了热稳定性的修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)，

所述修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)具有与源自野生型米曲霉的FADGDH相比提高的热稳定性并由序列编号2的氨基酸序列组成，只是163位的甘氨酸被赖氨酸、亮氨酸、或精氨酸取代。

4.一种提高了热稳定性的修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)，

所述修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)具有与源自野生型米曲霉的FADGDH相比提高的热稳定性并由序列编号2的氨基酸序列组成，只是167位的丝氨酸被丙氨酸或脯氨酸取代。

5.一种提高了热稳定性的修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)，

所述修饰型黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)具有与源自野生型米曲霉的FADGDH相比提高的热稳定性并由序列编号2的氨基酸序列组成，只是551位的缬氨酸被丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、或酪氨酸取代。

6.一种基因，

其编码权利要求1～5中任意一项所述的修饰型FADGDH。

7.一种载体，

其含有权利要求6所述的基因。

8.一种转化体，

其利用权利要求7所述的载体进行转化而成。

9.一种制造修饰型FADGDH的方法，所述方法包括培养权利要求8所述的转化体。

10.一种葡萄糖检测试剂盒，其包括权利要求1～5中任意一项所述的修饰型FADGDH。

11.一种葡萄糖传感器，其包括权利要求1～5中任意一项所述的修饰型FADGDH。

12.一种非诊断目的的葡萄糖测定法，所述方法包括权利要求1～5中任意一项所述的修饰型FADGDH。