JP5660271B2 - グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
中でも、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)由来GDHは基礎的にも応用的にも詳細に検討されており、酵素特性、遺伝子クローニング、結晶構造解析、変異体による酵素機能の改良など数多くの研究報告がある(特許文献1〜7,非特許文献1〜7)。
項2.以下の(A)〜(E)のいずれかのポリペプチド:
(A)配列番号1のアミノ酸配列において、259位および/または261位のアミノ酸がアラニンまたはバリンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(B)配列番号1のアミノ酸配列において、
a.259位および/または261位のアミノ酸がアラニンまたはバリンに置換されており、さらに
b.1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつ
配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドよりもグルコースデヒドロゲナーゼ活性の基質特異性が向上しているポリペプチド;
(C)配列番号1のアミノ酸配列において、
a.259位および/または261位のアミノ酸がアラニンまたはバリンに置換されており、さらに
b.1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつ
配列番号1のアミノ酸配列において当該b.の欠失、置換若しくは付加がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチド
よりもグルコースデヒドロゲナーゼ活性の基質特異性が向上しているポリペプチド;
(D)配列番号1のアミノ酸配列において、
a.259位および/または261位のアミノ酸がアラニンまたはバリンに置換されており、さらに
b.1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、
配列番号1のアミノ酸配列において当該a.の置換がなされたアミノ酸配列に対して90%以上の同一性の範囲内で修飾されてなるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドよりもグルコースデヒドロゲナーゼ活性の基質特異性が向上しているポリペプチド;
(E)配列番号1のアミノ酸配列において、
a.259位および/または261位のアミノ酸がアラニンまたはバリンに置換されており、さらに
b.1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、
配列番号1のアミノ酸配列において当該a.の置換がなされたアミノ酸配列に対して90%以上の同一性の範囲内で修飾されてなるアミノ酸配列からなり、かつ
配列番号1のアミノ酸配列において当該b.の欠失、置換若しくは付加がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチド
よりもグルコースデヒドロゲナーゼ活性の基質特異性が向上しているポリペプチド。
項3.項1又は2に記載される変異型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
項4.項3に記載の遺伝子を含むベクター。
項5.項4に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項6.項5に記載の形質転換体を培養し、該培養物から変異型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、変異型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
項7.項1または2に記載される変異型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬。
項8.項1または2に記載される変異型グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定方法。
項9.以下の(I)〜(III)のいずれかの工程を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を向上させる方法:
(I)配列番号1のグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、259位および/または261位のアミノ酸をアラニンまたはバリンに置換する工程;
(II)配列番号1のアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列(ただし、配列番号1のアミノ酸配列の259位のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列、ならびに259位のアミノ酸がアラニンに置換されているものを除く。)からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、
配列番号1のアミノ酸配列の259位に相当する位置のアミノ酸をアラニンに置換する工程;及び
(III)配列番号1のアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列(ただし、配列番号1のアミノ酸配列の261位のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列、ならびに261位のアミノ酸がバリンに置換されているものを除く。)からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、
配列番号1のアミノ酸配列の261位に相当する位置のアミノ酸をバリンに置換する工程。
項10.以下の(i)〜(iii)のいずれかの工程を含む、基質特異性が向上したグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法:
(i)配列番号1のグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、259位および/または261位のアミノ酸をアラニンまたはバリンに置換する工程;
(ii)配列番号1のアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列(ただし、配列番号1のアミノ酸配列の259位のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列、ならびに259位のアミノ酸がアラニンに置換されているものを除く。)からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、
配列番号1のアミノ酸配列の259位に相当する位置のアミノ酸をアラニンに置換する工程;及び
(iii)配列番号1のアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列(ただし、配列番号1のアミノ酸配列の261位のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列、ならびに261位のアミノ酸がバリンに置換されているものを除く。)からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、
配列番号1のアミノ酸配列の261位に相当する位置のアミノ酸をバリンに置換する工程。
また、本発明によれば、グルコース定量用酵素として有用な、基質特異性の高い新規グルコースデヒドロゲナーゼを生産することもできる。
さらに、本発明によれば、精度の高いグルコース測定を行うことできる。
1.本発明のポリペプチド
本発明において、GDH活性は、次の方法によって測定する。
0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)2.6ml、1.5M D-グルコース水溶液0.3ml、80mg/mlNAD水溶液0.1mlをキュベットに調製し、37℃で約5分間予備加温する。次いで、酵素溶液(酵素活性の目安:〜1.2U/ml)0.05mlを添加し、ゆるやかに混和後、蒸留水を対照に37℃に制御された分光光度計で、NADH濃度を反映する340nmの吸光度の変化を5〜6分間記録し、その初期直線部分から1分間あたりの吸光度変化を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、同様にして吸光度変化を測定する。このようにして求めた吸光度変化速度から酵素活性を算出する。上記条件下で1分間に1マイクロモルの還元型補酵素(NADH)を生成する酵素量を1単位とする。測定値が0.05単位以上であればGDH活性を有していると評価する。
活性測定法の試薬中、基質のD-グルコースのみを対象とする糖に置き換え、活性測定を行う。同一の酵素溶液にて測定した、対象とする糖での酵素活性値に対するD-グルコースでの酵素活性値の割合を、基質特異性とする。
また、多重変異体については、同様の原則によって表記したものをプラス(+)でつなげて表記することがある。例えば、「G259A+G261A」は、259位のG(グリシン)をA(アラニン)、261位のG(グリシン)をA(アラニン)に置換すること又は置換した改変体を意味する。
本発明のポリペプチドをコードしているDNAは、本発明のポリペプチドをコードしていればよく、特に限定されない。
微生物から分離、精製されたDNAを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素が適している。
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリW3110 、エシェリヒア・コリC600、エシェリヒア・コリHB101 、エシェリヒア・コリJM109 、エシェリヒア・コリDH5αなどを用いることができる。
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の天然型GDHを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするDNAを保持するベクターの薬剤耐性マーカー発現する微生物を検索すればよい。
上記のようにして、一度選択された天然型GDH遺伝子を保有する組換えベクターより、天然型GDH生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、天然型GDH遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やPCR法により天然型GDH遺伝子であるDNAを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。
天然型GDHをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつGDH活性を有するタンパク質をコードするDNAである。
本発明の遺伝子は、さらに、野生型GDHをコードする遺伝子の改変により得られた変異型GDHをコードする遺伝子について、GDHの発現を向上させるように、コドンユーセージ(Codon usage)を変更したものを含みうる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAを適当なベクターに連結することによって、該DNAを含有する組換えベクターを得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主において当該ポリペプチドを発現させ得るものであれば、特に制限されない。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等のベクターを用いることができる。具体的には、大腸菌ベクターのpBR322、pUC19、pKK233-2、pET11a等、バチルス属細菌ベクターのpUB110、pC194、pE194、pTHT15、pBD16等、酵母用ベクターYip5、Yrp17、Yep24等、動物細胞用ベクターのpcDNA、pBAC等を例示できる。例えば、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)を宿主微生物とする場合にはpBluescript,pUC18などが使用できる。
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するDNAは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー W3110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5αなどが利用できる。
例えば上記のようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
のはGOODの緩衝液であり、なかでも、PIPES、MESもしくはMOPS緩衝液が特に好ましい。また、グルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することにより本発明のポリペプチドをより安定化することができる。
本発明のポリペプチドを用いるグルコース測定方法は、上記の本発明のポリペプチドを用いてグルコースを測定する方法である。
測定系には、本発明のポリペプチドの特性に応じてさらに適当な補酵素を添加する。補酵素としては、NAD、NADP、チオNADなどの修飾NADあるいは修飾NADP等が挙げられる。
また、さらに血清アルブミンを含有させてもよい。血清アルブミンの含有量は0.05〜0.5重量%であることが好ましい。使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン(OVA)などが挙げられる。特にBSAが好ましい。
上記各形態において、本発明のポリペプチド、グルコース測定用組成物、グルコース測定キットは、液状(水溶液、懸濁液等)、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン(OVA)などが挙げられる。特にBSAが好ましい。
このような構成にすることにより、グルコース測定系における非特異反応が低減する可能性が考えられる。
本発明のポリペプチドでは基質特異性が向上している。このことは、例えば、臨床診断薬でのグルコース定量の精度を高めることができる。
また、本願発明のさらに別の一つの態様は、配列表の配列番号1の配列に記載されるアミノ酸配列の259位および/または261位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をアラニンまたはバリンに置換することを特徴とする、基質特異性が向上したGDHの製造方法である。
バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030株の染色体DNAを次の方法で分離した。
同菌株を、バクトトリプトン(ディフコ社製)10g/l、酵母エキス(ディフコ社製)5g/l、NaCl5g/lを加え、NaOHでpHを7.2に調節した培地で30℃、一晩振とう培養した後、遠心分離(8,000rpm、15分間)により集菌した。
遠心チューブ内に残存する培養液をキムワイプで拭き取った後、細胞1gあたり20%シュークロース、100mMトリス−塩酸(pH8.0)、50mM EDTA、0.1% SDSを含んだ溶液15mlに懸濁し、150μlのプロテアーゼK溶液(10mg/ml)と150μlのRNAseA(10mg/ml)とを加え、37℃、12時間保温した。これを等量のクロロホルム/フェノール溶液で処理後遠心分離により水層を分取する操作を3回繰り返した。
得られた水層に600μlの5M NaClを加え混合した後、0.8倍量のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和後に出現するDNAを硝子棒に巻き付け精製DNA標品とした。この精製DNAを5mlの1mM EDTAを含んだ10mMトリス塩酸(pH8.0)溶液(以下、TEと略記する)に再溶解し、200μlの5MNaClを加え混合した後0.8倍量のイソプロピルアルコールを加え再抽出したDNAを70%エタノール溶液で洗浄後、風乾の後1mlのTE(トリス塩酸−EDTA)緩衝液で溶解した。
バシラス・メガテリウムIAM1030のgdhIII及びgdhIV遺伝子の塩基配列(D10625、D10626;GenBank、EMBL、DDBJ)は非常に相同性が高い。そこで、各遺伝子の上流と下流の配列情報に基づき、gdhIIIは配列番号3に示すセンスプライマーと配列番号4に示すアンチセンスプライマーを、gdhIVは配列番号5に示すセンスプライマーと配列番号6に示すアンチセンスプライマーをそれぞれ合成した。このプライマーセットと、Pfu turbo DNAポリメラーゼとを用い、実施例1で得られたDNAを鋳型として、以下のサイクルでPCRを行った。
ステップ1:94℃、1分間
ステップ2:50℃、1分間
ステップ3:72℃、2.0分間(30サイクル)
得られたPCR産物を1%アガロースゲルにて泳動すると、約1.00kbの大きさの特異的バンドが認められた。それぞれのDNA断片を鋳型として、gdhIIIは配列番号7に示すセンスプライマーと配列番号8に示すアンチセンスプライマーを、gdhIVは配列番号7に示すセンスプライマーと配列番号9にアンチセンスプライマーをそれぞれ合成した。このプライマーセットと、Pfu turbo DNAポリメラーゼとを用い、以下のサイクルでPCRを行った。
ステップ1:94℃、1分間
ステップ2:50℃、1分間
ステップ3:72℃、2.0分間(30サイクル)
得られたPCR産物を1%アガロースゲルにて泳動すると、0.8kbの大きさの特異的バンドが認められた。このDNA断片を、制限酵素NdeI及びXhoIで消化し、このDNA断片を同じくNdeI及びXhoIで消化することにより得られたベクターpET28の開環物とライゲーションした。このようにして、pET28/gdhIII及びgdhIVを得た。各組み換えベクターは、タンパク質のN末端側にヒスチジンタグが付加されるように構築した。この組み換えベクターによりエシェリヒア・コリXL1/Blue株(Stratagene社)を形質転換した。
pET28/gdhIII、gdhIV及び変異型gdh遺伝子の約0.8kbpの挿入DNAについて、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(アプライドバイオシステムズ社)及びABI3100(アプライドバイオシステムズ社)を用いて塩基配列を決定した。決定した塩基配列(gdhIII、gdhIV)のオープンリーディングフレーム及びこれに対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号2及び配列番号1に示した。アミノ酸配列から求められるタンパク質の分子量は約28.200であった。
エシェリヒア・コリBL21(DE3)RIL株(Stratagene社)のコンピテントセルをpET28/gdhで形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリBL21(DE3)RIL(pET28/gdh)を得た。
LB培地100mLを500mLフラスコに分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過した20mg/mlカナマイシン、34mg/mlクロラムフェニコール(Sigma社)0.1mlを添加した。この培地にLB培地で予め37℃、17時間振とう培養したエシェリヒア・コリBL21(DE3)RIL(pET28/gdh)の培養液20mlを接種し、37℃で6時間通気攪拌培養した。
LB培地900mLを3000mLフラスコに分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌濾過した20mg/mlカナマイシン、34mg/mlクロラムフェニコール(Sigma社)0.9mlを添加した。この培地に先程の6時間培養したエシェリヒア・コリBL21(DE3)RIL(pET28/gdh)の培養液100mlを接種し、1MのIPTG(Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)を400μL加え、30℃で16時間通気攪拌培養した。培養液中の菌体を遠心分離により集菌し、BufferA(50mMリン酸ナトリウム緩衝液、300mM塩化ナトリウム、pH8.0)に懸濁した。菌体懸濁液を超音波で破砕し、遠心分離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液を、BufferAで平衡化したHis-Select HF Nickel Affinity Gel(Sigma社)に供した。素通り画分のタンパク質が完全に流出した後に、BufferB(50mMリン酸ナトリウム緩衝液、300mM塩化ナトリウム、10%グリセロール、pH6.0)により洗浄後、0-400mMイミダゾールによる濃度勾配によって精製を行い、精製酵素標品を得た。本方法により得られたGDH標品は、電気泳動(SDS−PAGE)によりほぼ単一なバンドを示した。
インバースPCRを使用した変異導入方法(M.J.McPherson,Philip Quirke and Graham R.Taylor(1986)PCR1:A Practical Approach.Oxford University Press)に準じて、アミノ酸配列の259位および/または261位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をアラニンまたはバリンに置換した変異体を得た。センスプライマー及びアンチセンスプライマーをT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Stratagene社)で37℃、30分間反応させ、プライマーのリン酸化を行なった。pET28/gdhIVを鋳型として、A258Fは配列番号17に示すセンスプライマーと配列番号18に示すアンチセンスプライマーを用い、インバースPCRを行った。A258Tは配列番号19に示すセンスプライマーと配列番号18に示すアンチセンスプライマーを用い、インバースPCRを行った。G259Aは配列番号10に示すセンスプライマーと配列番号11に示すアンチセンスプライマーを用い、インバースPCRを行った。G259Vは配列番号12に示すセンスプライマーと配列番号11に示すアンチセンスプライマーを用い、インバースPCRを行った。G261Aは配列番号13に示すセンスプライマーと配列番号14に示すアンチセンスプライマーを用い、インバースPCRを行った。G261Vは配列番号15に示すセンスプライマーと配列番号14に示すアンチセンスプライマーを用い、インバースPCRを行った。G259A+G261AはpET28/gdhIV(G261A)をテンプレートに配列番号16に示すセンスプライマーと配列番号11に示すアンチセンスプライマーを用い、インバースPCRを行った。得られたインバースPCR産物を1%アガロースゲルにて泳動すると、約6.0kbの大きさの特異的バンドが認められた。このDNA断片を、DNA ligation kit Ver.I(Takara社)を用いてセルフライゲージョンを行ない、この組み換えベクターによりエシェリヒア・コリXL1/Blue株(Stratagene社)を形質転換した。
変異型gdh遺伝子の塩基配列決定、形質転換体の作製、形質転換体からの変異型GDHの製造については、実施例3、実施例4、実施例5と同様に実施した。
実施例5、実施例7において製造した各GDHの精製酵素標品を用い、基質特異性を比較した。結果を表1に示す。
さらに、野生型GDHおよび各変異体の至適pH、熱安定性を確認した。結果を図2、図3に示す。G259または/およびG261変異体は、野生型GDHと比較して酸性側での相対活性の向上が見られた。熱安定性については、G261A、G261Vが野生型GDHと比較して安定性の向上が見られた。
以上の通り、本発明者は、同一タンパク質のサブユニット構造を有するGDHの基質との結合に、隣接するサブユニットのカルボキシル末端の重要性を見出した。さらに、カルボキシル末端から1番目または3番目のアミノ酸残基の置換により、野生型GDHよりも他の糖に対する相対活性の低下した変異型GDHを創出できることを見出した。カルボキシル末端から1番目または3番目のアミノ酸残基は、配列表の配列番号1においては261位または259位に相当する。
Claims (9)
- 以下の(A)〜(C)のいずれかのポリペプチド:
(A)配列番号1のアミノ酸配列において、259位および/または261位のアミノ酸がアラニンまたはバリンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(B)配列番号1のアミノ酸配列において、
a.259位および/または261位のアミノ酸がアラニンまたはバリンに置換されており、さらに
b.1個〜25個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつ
配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドよりもグルコースデヒドロゲナーゼ活性の基質特異性が向上しているポリペプチド;
(C)配列番号1のアミノ酸配列において、
a.259位および/または261位のアミノ酸がアラニンまたはバリンに置換されており、さらに
b.1個〜25個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつ
配列番号1のアミノ酸配列において当該b.の欠失、置換若しくは付加がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチド
よりもグルコースデヒドロゲナーゼ活性の基質特異性が向上しているポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードする遺伝子。
- 請求項2に記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項3に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養し、該培養物から請求項1に記載のポリペプチドを採取することを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチドの製造方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含むグルコース測定用試薬。
- 請求項1に記載のポリペプチドを用いるグルコース測定方法。
- 以下の(I)〜(III)のいずれかの工程を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を向上させる方法:
(I)配列番号1のグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、259位および/または261位のアミノ酸をアラニンまたはバリンに置換する工程;
(II)配列番号1のアミノ酸配列において、1個〜25個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列(ただし、配列番号1のアミノ酸配列の259位のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列、ならびに259位のアミノ酸がアラニンに置換されているものを除く。)からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、
配列番号1のアミノ酸配列の259位に相当する位置のアミノ酸をアラニンに置換する工程;及び
(III)配列番号1のアミノ酸配列において、1個〜25個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列(ただし、配列番号1のアミノ酸配列の261位のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列、ならびに261位のアミノ酸がバリンに置換されているものを除く。)からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、
配列番号1のアミノ酸配列の261位に相当する位置のアミノ酸をバリンに置換する工程。 - 以下の(i)〜(iii)のいずれかの工程を含む、基質特異性が向上したグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法:
(i)配列番号1のグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、259位および/または261位のアミノ酸をアラニンまたはバリンに置換する工程;
(ii)配列番号1のアミノ酸配列において、1個〜25個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列(ただし、配列番号1のアミノ酸配列の259位のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列、ならびに259位のアミノ酸がアラニンに置換されているものを除く。)からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、
配列番号1のアミノ酸配列の259位に相当する位置のアミノ酸をアラニンに置換する工程;及び
(iii)配列番号1のアミノ酸配列において、1個〜25個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列(ただし、配列番号1のアミノ酸配列の261位のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列、ならびに261位のアミノ酸がバリンに置換されているものを除く。)からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列において、
配列番号1のアミノ酸配列の261位に相当する位置のアミノ酸をバリンに置換する工程。
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