JP5130479B2 - クレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法 - Google Patents

Description

本発明は、クレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法、比活性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体、該クレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体をコードする遺伝子、該クレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体の製造法及び該クレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体のクレアチニン測定試薬への種々の適用に関する。

従来から、クレアチニンアミドヒドロラーゼ(ＥＣ ３.５.２.１０) は、臨床的に筋疾患、腎疾患の診断の指標となっている。体液中のクレアチニンの測定用酵素として、他の酵素、例えばクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼと共に使用されている。クレアチニンアミドヒドロラーゼは、水の存在下にクレアチニンに作用してクレアチンを生成する可逆的反応を触媒する酵素である。

このようなクレアチニンアミドヒドロラーゼは、シュードモナス属（非特許文献１）あるいはアルカリゲネス属（非特許文献２）の細菌が生産することが知られている。さらに、これら以外の細菌としては、フラボバクテリウム属、コリネバクテリウム属、マイクロコッカス属（特許文献１）、ペニシリウム属 (特許文献２) 等の細菌が生産することが知られているにすぎない。このうち、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＰＳ−７が産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は既に分離され、アミノ酸配列が公開されている（特許文献３）。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,Ｖｏｌ.８６,１１０９-１１１７(１９７９) Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ,Ｖｏｌ.３４,Ｎｏ.１，２６９-２７４(１９８６) 特開昭５１−１１５９８９号公報 特開昭４７−４３２８１号公報 特許第２５２７０３５号公報

本発明の目的は、上述のような公知のクレアチニンアミドヒドロラーゼを改変し、クレアチニン測定用としてより適した酵素を提供することである。

従来、公知の各種菌体から製造されたクレアチニンアミドヒドロラーゼは臨床検査薬用酵素としてはクレアチニンに対するＫｍ値が大きく、試薬組成中に大量の酵素を添加する必要があった。例えばアルカリゲネス・フェカリスＴＥ３５８１由来の酵素（特許文献４）は、クレアチニンに対するＫｍ値は約４２ｍＭであることが報告されている。さらにアースロバクター・エスピーＴＥ１８２６由来の酵素は、クレアチニンに対するＫｍ値は約６６ｍＭと大きかった（特許文献５）。
特開平９−１５４５７４号公報 特開平１０−２１５８７４号公報

そこで、本発明者らはシュードモナス・プチダ（ＰＳ−７）株由来クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を用い、蛋白質工学的手法によりＫｍ値が低い改変体（１７９位のグリシンを種々のアミノ酸に置換した改変体）を創出した（特願２００６−３０３４５１）。
しかし、これらの改変体は比活性が低く、臨床診断薬中では高濃度のタンパク質を添加しなければならないという欠点があった。そこで、本発明者らはさらに、これらの改変体の比活性を向上させる方法を検討した。
その結果、本発明者らは、改変体を基にさらに４３位のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することにより、比活性が向上した改変体を創出することに成功した。

また、上記とは別に、本発明者らは、Ｋｍ値が低い改変体、中でも、１７９位のグリシンをセリンに置換した改変体に、さらに１７５位のアミノ酸置換を行うことでキレート剤耐性が向上することを見出し、この２重変異体にさらに４３位のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することにより、比活性を向上させることができた。

本発明者らは、さらに、Ｋｍ値が低い改変体に限定されることなく、野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼであっても４３位のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することにより、同様に比活性が向上した改変体を創出できることを見出した。

以上のことから、本発明者らは、４３位のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することが比活性を向上させるのに有用な方法であることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［項１］
配列表の配列番号１〜６からなる群より選ばれる少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列の４３位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法。
［項２］
項１に記載される方法で製造したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体。
［項３］
項２に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体をコードする遺伝子。
［項４］
項３に記載の遺伝子を含むベクター。
［項５］
項４に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
［項６］
項５に記載の形質転換体を培養し、該培養物からクレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体の製造法。
［項７］
項６に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体を含むクレアチニン測定用試薬。
［項８］
項６に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体を用いるクレアチニン測定方法。
［項９］
配列表の配列番号１〜６からなる群より選ばれる少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列の４３位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することを特徴とする、比活性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造方法。

本発明により臨床検査薬用酵素として有用な、比活性の高い新規クレアチニンアミドヒドロラーゼを創出し、工業的に大量に該クレアチニンアミドヒドロラーゼを生産できる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の一態様は、配列表の配列番号１〜６のいずれかに記載されるアミノ酸配列の４３位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することを特徴とする、クレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法である。
また、そのような方法で製造したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体、すなわち、配列表の配列番号１〜６からなる群より選ばれる少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列の４３位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸がアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換され、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体である。

本願明細書において、アミノ酸は１文字記号または３文字記号で表す。また、アミノ酸の変異の位置については次のように表記する。例えば「Ｇ１７９Ｓ」は、１７９位のＧ（Ｇｌｙ）をＳ（Ｓｅｒ）に置換することを意味する。
また、多重変異体については、同様の原則によって表記したものをプラス（＋）でつなげて表記する。例えば、「Ｇ１７９Ｓ＋Ｎ４３Ｄ」は、１７９位のＧ（Ｇｌｙ）をＳ（Ｓｅｒ）、４３位のＮ（Ａｓｎ）をＡ（Ａｓｐ）に置換すること又は置換した改変体を意味する。

クレアチニンアミドヒドロラーゼは、ＥＣ３．５．２．１０に分類される酵素である。

本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体は、改変前のクレアチニンアミドヒドロラーゼよりも比活性が向上したものである。比活性の向上とは、タンパク質あたりの活性値が上昇することを意味する。

本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼの改変の基になるクレアチニンアミドヒドロラーゼは、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、アースロバクター属、フラボバクテリウム属、ミクロコッカス属などの微生物由来の野生型のもの等が例示されるが、特に限定されるものではない。
具体的には例えば、シュードモナス・プチダ（ＰＳ−７）株に由来するものが挙げられ、そのアミノ酸配列は配列番号１、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号７でそれぞれ示される。これらはいずれも特許第２５２７０３５号公報に記載されている。
なお、配列番号１において、アミノ酸の表記は、メチオニンを１として番号付けされて
いる。

本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼの改変の基になるクレアチニンアミドヒドロラーゼは、クレアチニンに対する作用性が本質的に維持される限り、上記種々の由来のものに、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換・挿入等されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換等されていてもよい。さらに、本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼは、クレアチニンに対する作用性が本質的に維持される限り、クレアチニンアミドヒドロラーゼにヒスチジンタグなどのタグを結合または挿入させた態様、クレアチニンアミドヒドロラーゼの少なくとも一方の末端に他のペプチドや他の蛋白質（たとえばストレプトアビジンやシトクロム）を融合させた態様、糖鎖や他の化合物により化学修飾された態様、クレアチニンアミドヒドロラーゼ分子内および／または分子間でジスルフィド結合などにより架橋されたものやリンカーペプチドなどを介して連結されたもの等の態様を含みうる。あるいは、いくつかの由来の野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼの断片を組み合わせて構成したものを含みうる。
具体的には例えば、シュードモナス・プチダ（ＰＳ−７）株に由来するクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列のうち１７９位のグリシンをセリンに置換したものや、１７５位のアスパラギン酸をグルタミン、かつ１７９位のグリシンをセリンに置換したもの、１７５位のアスパラギン酸をリシン、かつ１７９位のグリシンをセリンに置換したもの、１７５位のアスパラギン酸をセリン、かつ１７９位のグリシンをセリンに置換したもの、１７５位のアスパラギン酸をヒスチジン、かつ１７９位のグリシンをセリンに置換したものが挙げられる。これらのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２〜６が示される。また、それらをコードする遺伝子の典型的な態様が、それぞれ配列番号８〜１２で示される。

なかでもシュードモナス・プチダ（ＰＳ−７）株起源のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列、Ｇ１７９Ｓ、Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５Ｑ、Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５Ｋ、Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５Ｓ、Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５Ｈからなる群より選ばれる少なくとも１つの４３位のアスパラギンをアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したものが好ましい。

なお、上記の置換位置は、シュードモナス・プチダ（ＰＳ−７）株以外の起源のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列における同等の位置であっても良い。同等の位置かどうかは、一次構造、立体構造の知見を基に判断することができる。

シュードモナス・プチダ由来のクレアチニンアミドヒドロラーゼの立体構造は既に明らかになっていたが、蛋白質工学的手法によりクレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させることを示唆する記載はなかった（非特許文献３、４）。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｖｏｌ３３７，３９９-４１６(２００４) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｖｏｌ３３２，２８７-３０１(２００４)

なお、本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼは、本願発明の効果が本質的に維持される限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換・挿入等されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換等されていてもよい。
さらに、本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼは、クレアチニンに対する作用性が本質的に維持される限り、クレアチニンアミドヒドロラーゼにヒスチジンタグなどのタグを結合または挿入させた態様、クレアチニンアミドヒドロラーゼの少なくとも一方の末端に他のペプチドや他の蛋白質（たとえばストレプトアビジンやシトクロム）を融合させた態様、糖鎖や他の化合物により化学修飾された態様、クレアチニンアミドヒドロラーゼ分子内および／または分子間でジスルフィド結合などにより架橋されたものやリンカーペプチドなどを介して連結されたもの等の態様を含みうる。あるいは、いくつかの由来の野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼの断片を組み合わせて構成したものを含みうる。

本発明はさらに、改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む。
本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、例えば、微生物など種々の起源（由来）より得られる野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を改変することにより得ることができる。具体的には、例えばアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、フラボバクテリウム・エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、コリネバクテリウム・ウレアファシエンス（Ｃｏｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・クレアチノボランス（Ｃｏｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｅａｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等の細菌を挙げることができる。
本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号７〜１２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。

本発明の遺伝子は、さらに、野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子の改変により得られた改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子について、クレアチニンアミドヒドロラーゼの発現を向上させるように、さらにコドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。

野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。

本発明はさらに、改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含むベ
クター、さらには該ベクターで形質転換された形質転換体を含む。
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。

このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。

本発明において、クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えばシュードモナス・プチダ（ＰＳ−７）株由来の染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。

次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体であるシュードモナス・プチダ（ＰＳ−７）の染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。

該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。

上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。

微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。

クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０ 、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１ などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エ
シェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９ 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ などが例示される。

クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作製する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。

クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０ 、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１ 、エシェリヒア・コリＪＭ１０９ 、エシェリヒア・コリＤＨ５αなどを用いることができる。

宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。

上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のクレアチニンアミドヒドロラーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカー発現する微生物を検索すればよい。

上記の方法により得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、クレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。

上記のようにして、一度選択されたクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を保有する組換えベクターより、クレアチニンアミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるクレアチニンアミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。

本発明はさらに、改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を培養することを含む改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼの製造法に関する。

例えば上記のようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。

培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

培養温度は菌が成育し、改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、上記のようなクレアチニンアミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。

培養物中の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してクレアチニンアミドヒドロラーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。

上記のようにして得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたクレアチニンアミドヒドロラーゼを得ることができる。

例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。

上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液に溶解しているものを用いることができる。好適なも
のはＧＯＯＤの緩衝液であり、なかでも、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液が特に好ましい。また、グルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりクレアチニンアミドヒドロラーゼをより安定化することができる。

本発明の改変タンパク質の製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作製される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ
Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。

本発明では、配列番号１〜６に示されるクレアチニンアミドヒドロラーゼの４３位に着目し、これらのアミノ酸部位へ上記変異導入キットを用いてランダムに変異を導入したライブラリーを作製し、比活性の変化を指標にスクリーニングしたところ、比活性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体を得ることができた。

本発明の別の一形態は、上記のいずれかに記載の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼを含むクレアチニン測定用試薬を含む。
それらの形態は特に制約されないが、クレアチニン測定用組成物、および／または、クレアチニン測定としての形態をとりうる。

上記各形態において、本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチニン測定用組成物、クレアチニン測定キットは、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。

さらに上記各形態において、本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチニン測定用組成物、クレアチニン測定キットは、その形態や使用方法に応じて、精製された状態であっても良いし、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤など種々の添加物が加えられていても良い。
本発明へのそれらの添加物の配合法は特に制限されるものではない。例えばクレアチニンアミドヒドロラーゼを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にクレアチニンアミドヒドロラーゼを配合する方法、あるいはクレアチニンアミドヒドロラーゼと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。

含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜１０．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。

また、さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。

一方、上記各形態において、本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチニン測定用組成物ならびにクレアチニン測定用キットは、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しない構成とすることもできる。
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分としては、例えばＢＳＡ等の生体由来物質が挙げられる。
このような構成にすることにより、クレアチニン測定系における非特異反応が低減する可能性が考えられる。

緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。
また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましい。

また、改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼと緩衝剤から基本的に成る組成物に、アミノ酸、あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。また、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。

本発明の別の一形態は、上記のいずれかに記載の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼを含むクレアチニン測定方法を含む。
後述の実施例にも記載されているように、本願発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼでは比活性が改変前のクレアチニンアミドヒドロラーゼに対して著しく向上している。このことは、例えば、臨床サンプルにおけるクレアチニン測定においてクレアチニンアミドヒドロラーゼ量を著しく低下させることができ、低コスト化が見込める。

また、本願発明のさらに別の一つの態様は、配列表の配列番号１〜６のいずれかに記載されるアミノ酸配列の４３位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することを特徴とする、比活性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造方法である。
さらには、本願発明は、クレアチニンアミドヒドロラーゼを用いる測定系において、上記のいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったクレアチニンアミドヒドロラーゼを含有することを含む、測定の反応性が向上したクレアチニン測定用試薬組成物を、製造する方法である。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１ 改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の作製
特許第２５２７０３５号、および、Ｂｉｏｓｃｉ.Ｂｉｏｔｅｃｈ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.,５
９巻７号、１３３１−１３３２ページ（１９９５）に記載の方法を参照してシュードモナス・プチダＰＳ−７株の染色体ＤＮＡを調製し、次いで、該株由来のクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を含む発現プラスミドｐＣＮＨ５−１３を調製した。
野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼの発現プラスミドｐＣＮＨ５−１３は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ(-)のマルチクローニング部位にシュードモナス・プチダＰＳ−７株由来のクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする構造遺伝子を挿入しているものである。その塩基配列は配列表の配列番号４に、また該塩基配列から推定されるクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列は配列表の配列番号１に示される。
次に、ｐＣＮＨ５−１３と変異導入部位のアミノ酸をコードするトリプレットを中央に含む４０ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、４３位においてアミノ酸置換をランダムに変異導入した変異ライブラリーを作製した。そして、比活性の変化を指標にスクリーニングして得られた候補株の塩基配列を決定して、配列番号１記載のアミノ酸配列の４３番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換された変異型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする組換えプラスミド（ｐＣＮＨ−Ｎ４３Ｄ）を取得した。
その他上記と同様に、ライブラリー作製、スクリーニングを実施し、比活性が向上した変異型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする組換えプラスミドを取得した。

実施例２ 改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼの作製
各組み換えプラスミドでエシェリヒアコリーＤＨ５αのコンピテントセルを形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
５ｍｌのＣＮＨ生産培地（１％ポリペプトン、２％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マンガン）を試験管に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンを１００μｌ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で予め３７℃、１６時間培養したエシェリヒアコリーＤＨ５α（ｐＣＮＨ−Ｎ４３Ｄ）のシングルコロニーを接種し、３７℃で２２時間通気攪拌培養した。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。また、この変異体をＮ４３Ｄと命名した。その他上記と同様に、粗酵素液を得た。

比較例１ 野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼの作製
比較例として、ｐＣＮＨ５−１３によるエシェリヒアコリーＤＨ５α形質転換体について、上記方法と同様にして、改変前の粗酵素液を取得した。

比較例２ クレアチニンアミドヒドロラーゼ（Ｇ１７９Ｓ）の作製
比較例２として、ｐＣＮＨ−Ｇ１７９ＳによるエシェリヒアコリーＤＨ５α形質転換体について、上記方法と同様にして、粗酵素液を取得した。

比較例３ クレアチニンアミドヒドロラーゼ（Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５Ｑ）の作製
比較例３として、ｐＣＮＨ−Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５ＱによるエシェリヒアコリーＤＨ５α形質転換体について、上記方法と同様にして、粗酵素液を取得した。

比較例４ クレアチニンアミドヒドロラーゼ（Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５Ｋ）の作製
比較例４として、ｐＣＮＨ−Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５ＫによるエシェリヒアコリーＤＨ５α形質転換体について、上記方法と同様にして、粗酵素液を取得した。

比較例５ クレアチニンアミドヒドロラーゼ（Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５Ｓ）の作製
比較例５として、ｐＣＮＨ−Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５ＳによるエシェリヒアコリーＤＨ５α形質転換体について、上記方法と同様にして、粗酵素液を取得した。

比較例６ クレアチニンアミドヒドロラーゼ（Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５Ｈ）の作製
比較例６として、ｐＣＮＨ−Ｇ１７９Ｓ＋Ｄ１７５ＨによるエシェリヒアコリーＤＨ５α形質転換体について、上記方法と同様にして、粗酵素液を取得した。

実施例３ 改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼの評価１
実施例２で取得した変異型クレアチニンアミドヒドロラーゼおよび比較例１で取得した各種クレアチニンアミドヒドロラーゼをそれぞれ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）中に加え、それを２分割して片方にｆｉｎａｌ ５ｍＭとなるようにＥＤＴＡ・３Ｎａを添加し、もう片方には何も添加せずに６０℃で２０分間処理を行った。後述する活性測定法によりクレアチニンアミドヒドロラーゼを測定し、（キレート剤添加ありの活性）／（キレート剤添加なしの活性）×１００をキレート剤耐性（％）とした。
また、比活性（Ｕ／ＯＤ６６０）は実施例２で取得した各種クレアチニンアミドヒドロラーゼの活性値（Ｕ／ｍＬ）／超音波破砕前の菌体濁度（ＯＤ６６０）にて算出した。
特許文献３ではシュードモナス・プチダ（ＰＳ−７）由来のクレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性は１９０５Ｕ／ｍｇと記載されているが、比較例１では同一のものであるにもかかわらず比活性は５３Ｕ／ＯＤ６６０である。これは、精製度が異なるからであり、実施例中では同一精製度のもので比較している。
その結果を表１に示す。表１から判るように本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体は改変前と比べて比活性が向上していることが確認された。また、キレート剤耐性も向上している。

実施例４ 改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼの評価２
実施例２で取得した変異型クレアチニンアミドヒドロラーゼおよび比較例２で取得した各種クレアチニンアミドヒドロラーゼをそれぞれ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）中に加え、それを２分割して片方にｆｉｎａｌ ２．５ｍＭとなるようにＥＤＴＡ・３Ｎａを添加し、もう片方には何も添加せずに５０℃で２０分間処理を行った。後述する活性測定法によりクレアチニンアミドヒドロラーゼを測定し、（キレート剤添加ありの活性）／（キレート剤添加なしの活性）×１００をキレート剤耐性（％）とした。
また、比活性（Ｕ／ＯＤ６６０）は実施例２で取得した各種クレアチニンアミドヒドロラーゼの活性値（Ｕ／ｍＬ）／超音波破砕前の菌体濁度（ＯＤ６６０）にて算出した。
その結果を表２に示す。表２からわかるように本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体は改変前と比べて比活性が向上していることが確認された。さらに比較例１の野生型と比較するとＫｍ値が低下していることがわかる。

実施例３ 改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼの評価３
実施例２で取得した変異型クレアチニンアミドヒドロラーゼおよび比較例３〜６で取得した各種クレアチニンアミドヒドロラーゼをそれぞれ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）中に加え、それを２分割して片方にｆｉｎａｌ ２．５ｍＭとなるようにＥＤＴＡ・３Ｎａを添加し、もう片方には何も添加せずに５０℃で２０分間処理を行った。後述する活性測定法によりクレアチニンアミドヒドロラーゼを測定し、（キレート剤添加ありの活性）／（キレート剤添加なしの活性）×１００をキレート剤耐性（％）とした。
また、比活性を測定するために実施例２および比較例３〜６で取得した粗精製液をさらに精製している。まず、５％ポリエチレンイミンを対液０．５％添加し、室温で３０分放置した後、遠心分離し上清を回収した。次に０．６５飽和の硫酸アンモニウムを添加し、室温で３０分放置した後、遠心分離し沈澱を回収、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８で再溶解した精製酵素標品の活性値と２８０ｎｍの吸光度を測定し、比活性（Ｕ／Ａ２８０）を求めた。
その結果を表３に示す。表中のＮｏ．１〜４は比較例３〜６である。Ｎｏ．１と５、２と６、３と７、４と８の比活性を比較するとＮ４３Ｄのアミノ酸置換により比活性が上がっていることがわかる。また、キレート剤耐性も向上している。

実施例中、クレアチニンアミドヒドロラーゼの活性測定は以下のようにして行った。なお、本発明の酵素活性の定義は、下記条件下に１分間に１マイクロモルの橙色色素を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
酵素溶液は酵素標品をあらかじめ氷冷した５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で溶解し、分析直前に１．８〜２．４Ｕ／ｍＬに希釈する。
試験管に０．１Ｍ クレアチン溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で溶解）を１．０ｍＬとり、３７℃約５分予備加温する。次に酵素溶液を０．１ｍＬ加える。３７℃で正確に反応させた後、直ちに反応液０．１ｍＬをとり、あらかじめ準備した０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液２．０ｍＬに入れる。１．０％ ピクリン酸溶液を１．０ｍＬ加え、２５℃で２０分間放置後５２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤｔｅｓｔ）を測定する。盲検は０．１Ｍ クレアチン溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で溶解）を１．０ｍＬに酵素希釈液を添加後直ちに反応液の０．１ｍＬをとり、あらかじめ準備した０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液２．０ｍＬに入れる。１．０％ ピクリン酸溶液を１．０ｍＬ加え、２５℃で２０分間放置後５２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤｂｌａｎｋ）を測定する。
Ｕ／ｍＬ＝ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×７．３３×希釈倍率

実施例中、Ｋｍ値を示す指標として２水準（ｆｉｎａｌ １１ｍＭ，５５ｍＭ）のクレアチニン濃度でそれぞれ活性値を測定し、その比（１１ｍＭ／５５ｍＭ）が高いものほどＫｍ値が低いと判断した。
＜Ｒ１＞
０．５８Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８
０．００５％ ４アミノアンチピリン
０．０１５％ フェノール
６０Ｕ／ｍｌクレアチンアミジノヒドロラーゼ
１２Ｕ／ｍｌ ザルコシンオキシダーゼ
６Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
＜Ｒ２ （ｆｉｎａｌ ５５ｍＭ）＞
０．２５Ｍ クレアチニン
０．２７Ｎ ＨＣｌ
＜Ｒ２ （ｆｉｎａｌ １１ｍＭ）＞
０．０５Ｍ クレアチニン
０．２７Ｎ ＨＣｌ
Ｒ１：２００μｌに、Ｒ２：６０μｌ及び酵素液１０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させ、５０５ｎｍの吸光度変化をＨＩＴＡＣＨＩ７０６０型自動分析装置を用いて測定した。

本発明によれば、比活性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼを得ることができる。このクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体は、クレアチニン測定試薬に利用できる。

Claims (9)

1. 配列表の配列番号１〜６からなる群より選ばれる少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列の４３位のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法。
2. 配列表の配列番号１〜６からなる群より選ばれる少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列の４３位のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体。
3. 請求項２に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体をコードする遺伝子。
4. 請求項３に記載の遺伝子を含むベクター。
5. 請求項４に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
6. 請求項５に記載の形質転換体を培養し、該培養物からクレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体の製造法。
7. 請求項６に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体を含むクレアチニン測定用試薬。
8. 請求項６に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体を用いるクレアチニン測定方法。
9. 配列表の配列番号１〜６からなる群より選ばれる少なくとも１つに記載されるアミノ酸配列の４３位のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することを特徴とする、比活性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造方法。