JP4487174B2 - 液状にて安定なコレステロールオキシダーゼおよびその製造法 - Google Patents
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Description
項1.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、60分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。
項2.
加熱処理後の残存活性率が、改変前に比べて50%以上増大している、項1記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項3.
液状において60℃、60分間の加熱処理を施した後のコレステロールオキシダーゼ残存活性率が35%以上であるコレステロールオキシダーゼ。
項4.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、60分間の加熱処理を施した後の残存活性率が35%以上である改変型コレステロールオキシダーゼ。
項5.
項1〜4のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子
項6.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されてなる、項1〜4記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項7.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、40分間の加熱処理を施した後に残存するコレステロールオキシダーゼ活性が、改変前の該タンパク質と比べて向上していることを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼ。
項8.
加熱処理後の残存活性率が、改変前に比べて30%以上増大している、項7記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項9.
液状において60℃、40分間の加熱処理を施した後のコレステロール残存活性率が45%以上であるコレステロールオキシダーゼ。
項10.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入若しくは付加された一次構造を有し、液状において60℃、40分間の加熱処理を施した後の残存活性率が45%以上である改変型コレステロールオキシダーゼ。
項11.
項7〜10のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子
項12.
コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質の一次構造において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されてなる、項7〜10記載の改変型コレステロールオキシダーゼ。
項13.
配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されてなる、項6あるいは12記載のコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項14.
配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体たんぱく質の一次構造アミノ酸配列の109位のスレオニン残基、252位のスレオニン残基、404位のアラニン残基からなる群より選択される少なくとも1箇所もしくは2箇所以上が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項15.
配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において252位スレオニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項16.
配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、404位アラニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項17.
配列表の配列番号1に記載されたアミノ酸配列を有するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質の一次構造において、109位スレオニン残基が置換箇所であるアミノ酸配列をコードするコレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素遺伝子。
項18.
項5、6および、項11,12に記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
項19.
項14〜17記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
項20.
項18および19に記載の組換えベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主細胞
項21.
項20に記載の形質転換宿主細胞を培養することにより改変型コレステロールオキシダーゼを生成させ、該改変型コレステロールオキシダーゼを採取することを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼの製造方法。
項22.
項1〜4、項6〜10および項12のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼを含有するコレステロール測定用試薬組成物。
項23.
項1〜4、項6〜10および項12のいずれかに記載のコレステロールオキシダーゼを用いるコレステロール測定方法。
コレステロールオキシダーゼの酵素活性は、コレステロールを基質とし、その消失量を500nmの吸光度の変化で測定することにより測定した。具体的方法を以下に示す。
5mg/ml コレステロール溶液(5%(V/V)Triton X−100、4%(W/V) コール酸ナトリウム塩を含む)、0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、1.76% 4−アミノアンチピリン(4−AA)水溶液、6.0%フェノール水溶液、ぺルオキシダーゼ(POD)15,000U/ml−0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を調製し、下記反応混液を調製した。
51.0ml 0.1M 0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
4.0ml コレステロール溶液
1.0ml 4AA水溶液
2.0ml フェノール水溶液
2.0ml POD溶液。
上記反応混合液を3.0ml取り、37℃で約5分間予備加温した後、測定試料(酵素液)を0.05mlを添加し、混和後、37℃に制御された分光光度計で500nmの吸光度を3〜4分間記録し、その初期直線部分から1分間当たりの吸光度変化を求めた(ΔODtest)。盲検は酵素液の代わりに20mM、リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を0.05ml加え上記同様に操作を行って1分間当りの吸光度変化量を求めた(ΔODblank)。
得られた吸光度変化量より下記計算式に基づきコレステロールオキシダーゼの酵素活性を算出した。なお上記条件下で1分間に1マイクロモルのH2O2を酸化する酵素量を1単位(1U)とする。
計算式
活性値(U/ml)={ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×3.05(ml)×希釈倍率}/{13.78×1/2×1.0×0.05(ml)}
13.78 : Quinoneimine色素の上記測定条件下でのミリモル分子吸光係数
1/2 : 酵素反応で生成したH2O2の2分子から形成するQuinoneimine色素は1分子であることによる係数
1.0 : セルの光路長(cm)
遺伝子工学的手法を用いた改変により熱安定性が向上したコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドpCO110−S103T+V145E(特開平8−242860)で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli JM109;TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン(50μg/ml;ナカライテスク社製)を含んだ液体培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl;pH7.3)を摂取し、30℃で一晩神振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調製した。該プラスミドを鋳型として用いDiversifyTM PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech 社製)を用いた変異処理をそのプロトコールに従って施し、コレステロールオキシダーゼの生産能力を有する、改変型コレステロールオキシダーゼ変異プラスドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
実施例1で調製したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli JM109;TOYOBO社製)を形質転換し、該形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl、1.5%寒天;pH7.3)に塗布した後、30℃で一晩培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン(100μg/ml)を含んだLB液体培地に摂取し、30℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって菌体を回収し、20mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli JM109;TOYOBO社製)を計17種類の改変型コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクターでそれぞれ形質転換することにより改変コレステロールオキシダーゼ生産菌株12種類を造成した。これらの菌株ををアンピシリン(50μg/ml;ナカライテスク社製)を含んだ液体培地(1%ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% NaCl;pH7.3)でそれぞれ30℃、24時間培養し、約100−500mU/mlのコレステロールオキシダーゼ活性を得た。pCO110−S103T+V145E−M1、pCO−110−S103T+V145E−M2、pCO110−S103T+V145E−M3、pCO110−S103T+V145E−M4、pCO110−S103T+V145E−M5、pCO110−S103T+V145E−M6、pCO110−S103T+V145E−M7、pCO−110−S103T+V145EM8、pCO110−S103T+V145E−M9、pCO110−S103T+V145E−M10、pCO110−S103T+V145E−M11、pCO110−S103T+V145E−M12、pCO110−S103T+V145E−M13、pCO110−S103T+V145E−M14の各プラスミドに由来するコレステロールオキシダーゼをV121A, T252A, T103I, T109I,T109P, T252Y, T252W, T252F, T252G, A404V、M402L、M402V+N371H+N390S、M402V+M369I+E536V、M402V+N443S、また、pCO110−S103T+V145E+T252A+V121A、pCO110−S103T+V145E+T252A+T109I、pCO110−S103T+V145E+T252A+T103Iの各プラスミドに由来するオキシダーゼをV121A+T252A, T109I+T252A, T103I+T252Aと命名した。
なお、確認のために述べるが、本実施例においては、改変の基になるコレステロールオキシダーゼ活性を有する既知のタンパク質として、ストレプトマイセスsp.SA−COOが産生するコレステロールオキシダーゼの前駆体タンパク質を遺伝子工学的手法を用いて改変させて得られた酵素の1つであるS103T+V145Eを用いているため、本実施例におけるコレステロールオキシダーゼは、すべてS103TとV145Eの2箇所の変異を持っている。
したがって、上記において例えばV121Aとは、S103TおよびV145Eの2箇所が変異した変異体にさらにV121Aの変異が加わったものを示す。また、上記において例えばV121A+T252Aとは、S103TとV145Eの2箇所が変異した変異体にさらにV121AとT252Aの2箇所の変異が加わったものを示す。
V121A,T252A,T103I,T109I,T109P粗酵素液サンプルを60℃、40分加熱処理した時の残存活性を比較した時の残存活性を比較した結果を図1に示す。図1から分かるようにコレステロールオキシダーゼに対して遺伝子レベルでの改変を行うことにより熱安定性が有意に向上するものが取得できることが確認された。
各種改変型組み合わせコレステロールオキシダーゼ粗酵素液サンプルを60℃、60分加熱処理した時の残存活性を比較した時の残存活性を比較した結果を図2に示す。図2から分かるように熱安定性の向上コレステロールオキシダーゼに対して遺伝子レベルでの変異部位を組み合わせた改変体を作製することによりT109I+T252Aにおいて大きな相乗効果が認められることが確認され、60℃、60分加熱処理後も90%以上の活性を保持していた。
各種改変体コレステロールオキシダーゼと親酵素を20mM リン酸緩衝液(pH7.0)中で60℃、60分加熱処理を施した時の残存活性を比較した結果を図3に示す、図3から分かるようにこれら改変型コレステロールオキシダーゼの熱安定性は親酵素の熱安定性よりも有意に向上していることが確認された。
Claims (8)
- 配列表の配列番号1に記載される一次構造において、以下の(1)から(13)のいずれかの変異を有する改変型コレステロールオキシダーゼ
(1)252位のスレオニンがアラニンに置換
(2)103位のスレオニンがイソロイシンに置換
(3)109位のスレオニンがイソロイシンに置換
(4)109位のスレオニンがプロリンに置換
(5)121位のバリンがアラニンに、252位のスレオニンがアラニンにそれぞれ置換
(6)109位のスレオニンがイソロイシンに、252位のスレオニンがアラニンにそれぞれ置換
(7)103位のスレオニンがイソロイシンに置換、252位のスレオニンがアラニンにそれぞれ置換
(8)252位のスレオニンがチロシンに置換
(9)252位のスレオニンがトリプトファンに置換
(10)252位のスレオニンがフェニルアラニンに置換
(11)404位のアラニンがバリンに置換
(12)402位のメチオニンがバリンに、369位のメチオニンがイソロイシンに、536位のグルタミン酸がバリンにそれぞれ置換
(13)402位のメチオニンがバリンに、443位のアスパラギンがセリンにそれぞれ置換 - 請求項1に記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子
- 請求項2に記載のコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターで形質転換されたことを特徴とする宿主細胞
- エシェリヒア・コリーであることを特徴とする請求項4に記載の宿主細胞
- 請求項4または5に記載の形質転換宿主細胞を培養することにより改変型コレステロールオキシダーゼを生成させ、該改変型コレステロールオキシダーゼを採取することを特徴とする改変型コレステロールオキシダーゼの製造方法。
- 請求項1に記載のコレステロールオキシダーゼを含有するコレステロール測定用試薬組成物。
- 請求項1に記載のコレステロールオキシダーゼを用いるコレステロール測定方法。
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