JP4161236B2 - 新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼおよびその製造方法 - Google Patents
新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼおよびその製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＬ−α−グリセロホスフェートの定量に用いることのできるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有する新規な酵素、該酵素をコードする遺伝子ならびに遺伝子工学的技術による該酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、臨床的に血清またはその他の試料中のＬ−α−グリセロホスフェートの定量、グリセロキナーゼとの併用でのグリセロールの定量やリポプロテインリパーゼおよびグリセロールキナーゼとの共役により中性脂肪などの測定用酵素として、他の酵素や呈色試薬などと共に使用されている。Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、酸素の存在下にＬ−α−グリセロホスフェートに作用して、ジヒドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。
【０００３】
このようなＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、特開昭５３−２４８９２号公報、特開昭５３−２４８９３号公報、特開昭５３−７２８９２号公報、特公昭６０−２２９１５号公報などにおいて、ストレプトコッカス属（Streptococcus sp. ）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp. ）、ロイコノストック属（Leuconostoc sp. ）、ペデイオコッカス セレヴィジエ（Ｐediococcus cerevisiae）、エアロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans ）ＩＦＯ１２２１９、同ＩＦＯ１２３１７により生産されることが報告されている。このうち、ストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３が産生するＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの性質については、特開平２−４５４号公報において報告されており、また同ＧＰＯＳ−５３が産生するＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子が既に分離され、そのアミノ酸配列が記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来から報告されるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ生産菌では、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ製造時に、グリセロール、アスコルビン酸などの誘導物質の添加が必要であったり、共存する他の酵素などの除去が非常に困難であった。そのため、純度の高いＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを得る為にはコストが極めて高いものとなっていた。また、従来から公知のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、ｋｍ値が大きく反応性が悪いものとなっていた。
【０００５】
そこで、本発明の目的は、新しい細菌から、反応性の良い新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを単離し、そして、該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的に該酵素を多量に製造する方法を提供することにある。また、本発明の別な目的は、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを改変することにより、理化学的性質の改良された新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを製造する方法を導き出すことにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するために種々検討した結果、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ生産菌として、ペデイオコッカス・ホマリ(Pediococcus homari ）ＩＦＯ１２２１７を選び、該菌体から新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを単離し、さらに、該菌体より抽出した染色体ＤＮＡからＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を分離することに成功し、該遺伝子より発現される新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを単離した。さらに、該遺伝子の全塩基配列を決定し、該酵素を遺伝子工学的技術により高価な誘導物質を培地に添加する必要なく、高生産させることが可能であることを見出し、高純度な該酵素を安価に大量供給することを可能とし、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有する新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼである。
作用：酸素の存在下にＬ−α−グリセロホスフェートに作用してジヒドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素を生成する
至適温度：３５〜４０℃
至適ｐＨ：７．５〜９．０
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ７．０、１５分間処理）
ｐＨ安定性：６．０〜８．５（２５℃、２０時間処理）
分子量：６７０００±３０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
Ｌ−α−グリセロホスフェートに対するｋｍ値：３．８±０．５ｍＭ
【０００８】
また、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【０００９】
本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子である。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
また、本発明は以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡからなるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子である。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ
（ｅ）上記（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする細菌由来のＤＮＡ
【００１１】
本発明は上記Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターである。また、本発明は上記組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
【００１２】
さらに、本発明は上記形質転換体を培地で培養することにより、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成せしめ、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを採取することを特徴とするＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの製造方法である。
【００１３】
また、本発明はペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７を培養することにより、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成せしめ、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを採取することを特徴とするＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの製造方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ生産微生物、例えばペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７から入手し得る。該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、上記微生物を培養することにより得ることも可能であるが、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を分離し、これより発現されるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを単離することにより、本発明のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを簡便、かつ効率的に入手することもできる。
【００１５】
本発明の一実施態様としては、（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質がある。アミノ酸の欠失、置換、付加の程度については、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものを含む。これらの変異体を製造する方法は、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 第８２巻、第４８８頁（1985）に記載されるＫｕｎｋｅｌ法が挙げられるが、特に制限はされない。
【００１６】
本発明のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子は、例えばペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７から抽出しても良く、また化学的に合成することもできる。ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法の利用により、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００１７】
上記遺伝子としては、例えば（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがある。ＤＮＡの欠失、置換、付加の程度については、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものを含む。これらの変異体を製造する方法は、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 第８２巻、第４８８頁（1985）に記載されるＫｕｎｋｅｌ法が挙げられるが、特に制限はされない。
【００１８】
また、（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡまたは（ｅ）上記（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする細菌由来のＤＮＡがある。ここで、ストリンジェントな条件とは、×２ＳＳＣ（３００ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭ クエン酸）、６５℃、１６時間である。
【００１９】
本発明の遺伝子を得る方法としては、例えばペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７の染色体ＤＮＡを分離、精製した後、超音波破砕、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または接着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。こうして得られた組換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。次いで該微生物を培養し、該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、該組換えベクターからＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子を採取すれば良い。
【００２０】
遺伝子供与体であるペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７の染色体ＤＮＡは、具体的には、以下のように採取される。すなわち、供与微生物を例えば１〜３日間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させることによりＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えば、リゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせても良い。
【００２１】
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離・精製するには常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００２２】
微生物から分離・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素が適している。
【００２３】
ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、Lambda-gt10 、Lambda-gt11 などが使用できる。またプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９、pBluescript 、ｐＬＥＤ−Ｍ１(Journal of Fermentation and Bioenzineering 第７６巻、第２６５〜２６９頁(1993)) などが使用できる。
【００２４】
上記のようなベクターを、上述したＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であれば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。また、必要であれば、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作成することもできる。
【００２５】
宿主微生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＨＢ１０１、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９などを用いることができる。
【００２６】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。
【００２７】
上記のようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成する微生物を選択すれば良い。
【００２８】
上記の方法により得られたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２１４巻，第１２０５〜１２１０頁 (1981) に記載されるジデオキシ法により解読し、またＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼのアミノ酸配列は決定した塩基配列より推定される。このようにして一度選択されたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００２９】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常、多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。
【００３０】
炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３１】
培養温度は菌が発育し、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育しＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００３２】
培養物中のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には、常法に従ってＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼが培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などにより、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３３】
このようにして得られたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを得ることができる。
【００３４】
例えば、セファデックス(Sephadex) G-25 （ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースCL-6B(ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースCL6-B(ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一のバンドを示す程度に純化されている。
【００３５】
本発明におけるペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、以下に示す理化学的性質を有する。
作用：酸素の存在下にＬ−α−グリセロホスフェートに作用して、ジヒドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素を生成する
至適温度：３５〜４０℃
至適ｐＨ：７．５〜９．０
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ７．０、１５分間処理）
ｐＨ安定性：６．０〜８．５（２５℃、２０時間処理）
分子量：６７，０００±３０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
Ｌ−α−グリセロホスフェートに対するｋｍ値：３．８±０．５ｍＭ
【００３６】
図１〜４に、それぞれ上記ペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの至適温度、至適ｐＨ、熱安定性及びｐＨ安定性に関するデータを示す。本発明のペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼと、特開平２−４５４号公報において記載されるストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３が産生するＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼとを対比すると、ペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの至適ｐＨは、ストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３由来のものよりもアルカリ性領域に傾いていることが、図２より明らかである。また、Ｋｍ値に関しても、本発明のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの方が小さく、反応性の点においてより優れることも示される。
【００３７】
さらに、本発明の上記Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼとストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３が産生する上記Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼとのアミノ酸配列に関するホモロジーについては、図５に示す通りであり、その相同性は５２．１％である。以上のように、本発明のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、同一反応を触媒する公知の酵素とは性質の異なる新規な酵素である。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。実施例中、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性の測定は以下の試薬および測定条件で行った。
【００３９】
＜試薬＞
５０ｍＭ Tris −ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ Ｄ，Ｌ−α−グリセロリン酸ナトリウム、0.01％ ４−アミノアンチピリン、０．０２％フェノール、５．４Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．０５％ Triton X-100
【００４０】
＜測定条件＞
試薬混液１ｍｌを３７℃で約５分予備加温後、０．０２ｍｌの酵素溶液を加え、３７℃で反応を開始し、１０分間反応させた後、０．２５％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を２ｍｌ加えて反応を停止させ、５００ｎｍにおける吸光度変化を分光光度計にて測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬に加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件で１分間に１マイクロモルのＬ−α−グリセロホスフェートを分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００４１】
実施例１ 染色体ＤＮＡの分離
ペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株をブレインハートインヒュージョン培地（ディフコ社製）で３７℃一晩振盪培養した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）により集菌した。１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含んだ溶液で菌体を洗浄した後、２０％シュークロース、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃、３０分間保温し、次いで１１ｍｌの１％ラウロイルサルコシン酸、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ９．６）を含む溶液を加えた。
【００４２】
この懸濁液に臭化エチジウム溶液を０．５％塩化セシウムを約１００％加え、攪拌混合し、５５０００ｒｐｍ、２０時間の超遠心分離でＤＮＡを分取した。分取したＤＮＡは１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０溶液（以下、ＴＥと略記する）で透析し、精製ＤＮＡ標品とした。これを等量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後遠心分離により水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて上記方法でもう一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。
【００４３】
実施例２ Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製
実施例１で得たＤＮＡ５μｇを制限酵素 Eco47III （東洋紡績製）で部分分解し、２kbp 以上の断片に分解した後、制限酵素 EcoRV（東洋紡績製）で切断した pBluescript１μｇとをＴ４−ＤＮＡリガーゼ（東洋紡績製）４単位で、１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡績製）を用いて形質転換し、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性検出用寒天培地［０．５％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％グリセロリン酸ナトリウム、５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡績製）、０．０１％ο−ジアニシジン、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１．５％寒天］に塗布した。Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性の検出は、上記培地に生育し、且つ茶色に染色されるコロニーを指標に行った。
【００４４】
使用したＤＮＡ１μｇ当たり約10,000個の形質転換体のコロニーが得られ、上記スクリーニングの結果、茶色に染色されるコロニー１株を見出した。この株をＴＢ液体培地（１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．４％グリセロール、１．２５％Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．２３％ＫＨ2 ＰＯ4 、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）で培養し、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を測定したところ、該活性が検出された。この株の保有するプラスミドには約５kbp の挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをpOG3O1とした。
【００４５】
pOG3O1の制限酵素地図は図６に示す通りである。
【００４６】
実施例３ 塩基配列の決定
pOG3O1の約５kbp の挿入ＤＮＡ断片について種々の制限酵素にてサブクローンを調製した。種々のサブクローンは常法に従い、Radioactive Sequencing Kit（東洋紡績製）を用いて、塩基配列を決定した。決定したＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの塩基配列およびアミノ酸配列を配列表に示した。アミノ酸配列から求められる蛋白質の分子量はペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの分子量とほぼ一致した。
【００４７】
実施例４ 形質転換体の作成
エシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡績製）をpOG3O1で形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリーＪＭ１０９(pOG3O1)を得た。
【００４８】
実施例５ エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（pOG3O1）からのＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの製造
ＬＢ培地５００ｍｌを２Ｌフラスコに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）０．５ｍｌを添加した。この培地にＴＢ培地であらかじめ，３０℃、７時間振盪培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９(pOG3O1)の培養液５ｍｌを接種し、３７℃で１８時間通気撹拌培養した。培養終了時のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性は約２Ｕ／ｍｌであった。
【００４９】
上記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に懸濁した。上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画処理を行った後、セファデックス(Sephadex) G-25 （ファルマシアバイオテク）によるゲルろ過により脱塩し、ＤＥＡＥセファロースCL-6B （ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィー、オクチルセファロースCL6-B(ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素表品を得た。本方法により得られたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は約８０Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
【００５０】
以下に、上記方法により得られたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの性質を示す。
作用：酸素の存在下にＬ−α−グリセロホスフェートに作用してジヒドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素を生成する
至適温度：３５〜４０℃
至適ｐＨ：７．５〜９．０
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ７．０、１５分間処理）
ｐＨ安定性：６．０〜８．５（２５℃、２０時間処理）
分子量：６７，０００±３０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
Ｌ−α−グリセロホスフェートに対するｋｍ値：３．８±０．５ｍＭ
【００５１】
実施例７
ペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７をブレインハートインヒュージョン培地にて、３７℃、約１〜３日間培養し、培養液を遠心分離して集菌し、次いで、これを溶菌させることによって、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成させ、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを採取した。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、ペデイオコッカス属細菌から新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子が単離され、遺伝子工学的技術による該酵素の製造法が確立され、高純度な該酵素の大量供給との定量への利用が可能となった。また、該遺伝子を改変することにより、理化学的性質の改良された新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを製造する方法を導き出すことができる。
【００５３】
【配列表】
【００５４】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のペディオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼに関する至適温度（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液；ｐＨ８．０）のデータを示す図である。
【図２】本発明のペディオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼに関する至適ｐＨ（３７℃、１０分；５０ｍＭ緩衝液）のデータを示す図である。なお、ｐＨ６．０〜７．０ではＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０〜９．５ではトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．５〜１０．５では炭酸緩衝液を用いている。
【図３】本発明のペディオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼに関する熱安定性（０．１Ｍジメチルグルタル酸緩衝液；ｐＨ７．０，１５分）のデータを示す図である。
【図４】本発明のペディオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼに関するｐＨ安定性（２５℃、２０時間）のデータを示す図である。
【図５】本発明のペディオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼのアミノ酸配列とストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３が産生するＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼのアミノ酸配列との比較を示す図である。
【図６】ｐＯＧ３Ｏ１の制限酵素地図を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明はＬ−α−グリセロホスフェートの定量に用いることのできるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有する新規な酵素、該酵素をコードする遺伝子ならびに遺伝子工学的技術による該酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、臨床的に血清またはその他の試料中のＬ−α−グリセロホスフェートの定量、グリセロキナーゼとの併用でのグリセロールの定量やリポプロテインリパーゼおよびグリセロールキナーゼとの共役により中性脂肪などの測定用酵素として、他の酵素や呈色試薬などと共に使用されている。Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、酸素の存在下にＬ−α−グリセロホスフェートに作用して、ジヒドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。
【０００３】
このようなＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、特開昭５３−２４８９２号公報、特開昭５３−２４８９３号公報、特開昭５３−７２８９２号公報、特公昭６０−２２９１５号公報などにおいて、ストレプトコッカス属（Streptococcus sp. ）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp. ）、ロイコノストック属（Leuconostoc sp. ）、ペデイオコッカス セレヴィジエ（Ｐediococcus cerevisiae）、エアロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans ）ＩＦＯ１２２１９、同ＩＦＯ１２３１７により生産されることが報告されている。このうち、ストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３が産生するＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの性質については、特開平２−４５４号公報において報告されており、また同ＧＰＯＳ−５３が産生するＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子が既に分離され、そのアミノ酸配列が記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来から報告されるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ生産菌では、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ製造時に、グリセロール、アスコルビン酸などの誘導物質の添加が必要であったり、共存する他の酵素などの除去が非常に困難であった。そのため、純度の高いＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを得る為にはコストが極めて高いものとなっていた。また、従来から公知のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、ｋｍ値が大きく反応性が悪いものとなっていた。
【０００５】
そこで、本発明の目的は、新しい細菌から、反応性の良い新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを単離し、そして、該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的に該酵素を多量に製造する方法を提供することにある。また、本発明の別な目的は、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを改変することにより、理化学的性質の改良された新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを製造する方法を導き出すことにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するために種々検討した結果、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ生産菌として、ペデイオコッカス・ホマリ(Pediococcus homari ）ＩＦＯ１２２１７を選び、該菌体から新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを単離し、さらに、該菌体より抽出した染色体ＤＮＡからＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を分離することに成功し、該遺伝子より発現される新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを単離した。さらに、該遺伝子の全塩基配列を決定し、該酵素を遺伝子工学的技術により高価な誘導物質を培地に添加する必要なく、高生産させることが可能であることを見出し、高純度な該酵素を安価に大量供給することを可能とし、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有する新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼである。
作用：酸素の存在下にＬ−α−グリセロホスフェートに作用してジヒドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素を生成する
至適温度：３５〜４０℃
至適ｐＨ：７．５〜９．０
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ７．０、１５分間処理）
ｐＨ安定性：６．０〜８．５（２５℃、２０時間処理）
分子量：６７０００±３０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
Ｌ−α−グリセロホスフェートに対するｋｍ値：３．８±０．５ｍＭ
【０００８】
また、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【０００９】
本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子である。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
また、本発明は以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡからなるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子である。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ
（ｅ）上記（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする細菌由来のＤＮＡ
【００１１】
本発明は上記Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターである。また、本発明は上記組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
【００１２】
さらに、本発明は上記形質転換体を培地で培養することにより、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成せしめ、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを採取することを特徴とするＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの製造方法である。
【００１３】
また、本発明はペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７を培養することにより、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成せしめ、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを採取することを特徴とするＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの製造方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ生産微生物、例えばペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７から入手し得る。該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、上記微生物を培養することにより得ることも可能であるが、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を分離し、これより発現されるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを単離することにより、本発明のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを簡便、かつ効率的に入手することもできる。
【００１５】
本発明の一実施態様としては、（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質がある。アミノ酸の欠失、置換、付加の程度については、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものを含む。これらの変異体を製造する方法は、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 第８２巻、第４８８頁（1985）に記載されるＫｕｎｋｅｌ法が挙げられるが、特に制限はされない。
【００１６】
本発明のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子は、例えばペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７から抽出しても良く、また化学的に合成することもできる。ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法の利用により、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００１７】
上記遺伝子としては、例えば（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがある。ＤＮＡの欠失、置換、付加の程度については、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものを含む。これらの変異体を製造する方法は、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 第８２巻、第４８８頁（1985）に記載されるＫｕｎｋｅｌ法が挙げられるが、特に制限はされない。
【００１８】
また、（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡまたは（ｅ）上記（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする細菌由来のＤＮＡがある。ここで、ストリンジェントな条件とは、×２ＳＳＣ（３００ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭ クエン酸）、６５℃、１６時間である。
【００１９】
本発明の遺伝子を得る方法としては、例えばペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７の染色体ＤＮＡを分離、精製した後、超音波破砕、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または接着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。こうして得られた組換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。次いで該微生物を培養し、該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、該組換えベクターからＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子を採取すれば良い。
【００２０】
遺伝子供与体であるペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７の染色体ＤＮＡは、具体的には、以下のように採取される。すなわち、供与微生物を例えば１〜３日間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させることによりＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えば、リゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせても良い。
【００２１】
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離・精製するには常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００２２】
微生物から分離・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素が適している。
【００２３】
ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、Lambda-gt10 、Lambda-gt11 などが使用できる。またプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９、pBluescript 、ｐＬＥＤ−Ｍ１(Journal of Fermentation and Bioenzineering 第７６巻、第２６５〜２６９頁(1993)) などが使用できる。
【００２４】
上記のようなベクターを、上述したＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であれば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。また、必要であれば、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作成することもできる。
【００２５】
宿主微生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＨＢ１０１、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９などを用いることができる。
【００２６】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。
【００２７】
上記のようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成する微生物を選択すれば良い。
【００２８】
上記の方法により得られたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２１４巻，第１２０５〜１２１０頁 (1981) に記載されるジデオキシ法により解読し、またＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼのアミノ酸配列は決定した塩基配列より推定される。このようにして一度選択されたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００２９】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常、多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。
【００３０】
炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３１】
培養温度は菌が発育し、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育しＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００３２】
培養物中のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には、常法に従ってＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼが培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などにより、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３３】
このようにして得られたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを得ることができる。
【００３４】
例えば、セファデックス(Sephadex) G-25 （ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースCL-6B(ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースCL6-B(ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一のバンドを示す程度に純化されている。
【００３５】
本発明におけるペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、以下に示す理化学的性質を有する。
作用：酸素の存在下にＬ−α−グリセロホスフェートに作用して、ジヒドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素を生成する
至適温度：３５〜４０℃
至適ｐＨ：７．５〜９．０
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ７．０、１５分間処理）
ｐＨ安定性：６．０〜８．５（２５℃、２０時間処理）
分子量：６７，０００±３０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
Ｌ−α−グリセロホスフェートに対するｋｍ値：３．８±０．５ｍＭ
【００３６】
図１〜４に、それぞれ上記ペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの至適温度、至適ｐＨ、熱安定性及びｐＨ安定性に関するデータを示す。本発明のペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼと、特開平２−４５４号公報において記載されるストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３が産生するＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼとを対比すると、ペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの至適ｐＨは、ストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３由来のものよりもアルカリ性領域に傾いていることが、図２より明らかである。また、Ｋｍ値に関しても、本発明のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの方が小さく、反応性の点においてより優れることも示される。
【００３７】
さらに、本発明の上記Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼとストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３が産生する上記Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼとのアミノ酸配列に関するホモロジーについては、図５に示す通りであり、その相同性は５２．１％である。以上のように、本発明のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、同一反応を触媒する公知の酵素とは性質の異なる新規な酵素である。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。実施例中、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性の測定は以下の試薬および測定条件で行った。
【００３９】
＜試薬＞
５０ｍＭ Tris −ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ Ｄ，Ｌ−α−グリセロリン酸ナトリウム、0.01％ ４−アミノアンチピリン、０．０２％フェノール、５．４Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ、０．０５％ Triton X-100
【００４０】
＜測定条件＞
試薬混液１ｍｌを３７℃で約５分予備加温後、０．０２ｍｌの酵素溶液を加え、３７℃で反応を開始し、１０分間反応させた後、０．２５％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を２ｍｌ加えて反応を停止させ、５００ｎｍにおける吸光度変化を分光光度計にて測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬に加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件で１分間に１マイクロモルのＬ−α−グリセロホスフェートを分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００４１】
実施例１ 染色体ＤＮＡの分離
ペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株をブレインハートインヒュージョン培地（ディフコ社製）で３７℃一晩振盪培養した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）により集菌した。１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含んだ溶液で菌体を洗浄した後、２０％シュークロース、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃、３０分間保温し、次いで１１ｍｌの１％ラウロイルサルコシン酸、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ９．６）を含む溶液を加えた。
【００４２】
この懸濁液に臭化エチジウム溶液を０．５％塩化セシウムを約１００％加え、攪拌混合し、５５０００ｒｐｍ、２０時間の超遠心分離でＤＮＡを分取した。分取したＤＮＡは１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０溶液（以下、ＴＥと略記する）で透析し、精製ＤＮＡ標品とした。これを等量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後遠心分離により水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて上記方法でもう一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。
【００４３】
実施例２ Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製
実施例１で得たＤＮＡ５μｇを制限酵素 Eco47III （東洋紡績製）で部分分解し、２kbp 以上の断片に分解した後、制限酵素 EcoRV（東洋紡績製）で切断した pBluescript１μｇとをＴ４−ＤＮＡリガーゼ（東洋紡績製）４単位で、１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡績製）を用いて形質転換し、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性検出用寒天培地［０．５％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％グリセロリン酸ナトリウム、５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡績製）、０．０１％ο−ジアニシジン、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１．５％寒天］に塗布した。Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性の検出は、上記培地に生育し、且つ茶色に染色されるコロニーを指標に行った。
【００４４】
使用したＤＮＡ１μｇ当たり約10,000個の形質転換体のコロニーが得られ、上記スクリーニングの結果、茶色に染色されるコロニー１株を見出した。この株をＴＢ液体培地（１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．４％グリセロール、１．２５％Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．２３％ＫＨ2 ＰＯ4 、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）で培養し、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を測定したところ、該活性が検出された。この株の保有するプラスミドには約５kbp の挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをpOG3O1とした。
【００４５】
pOG3O1の制限酵素地図は図６に示す通りである。
【００４６】
実施例３ 塩基配列の決定
pOG3O1の約５kbp の挿入ＤＮＡ断片について種々の制限酵素にてサブクローンを調製した。種々のサブクローンは常法に従い、Radioactive Sequencing Kit（東洋紡績製）を用いて、塩基配列を決定した。決定したＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの塩基配列およびアミノ酸配列を配列表に示した。アミノ酸配列から求められる蛋白質の分子量はペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの分子量とほぼ一致した。
【００４７】
実施例４ 形質転換体の作成
エシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡績製）をpOG3O1で形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリーＪＭ１０９(pOG3O1)を得た。
【００４８】
実施例５ エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（pOG3O1）からのＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの製造
ＬＢ培地５００ｍｌを２Ｌフラスコに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）０．５ｍｌを添加した。この培地にＴＢ培地であらかじめ，３０℃、７時間振盪培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９(pOG3O1)の培養液５ｍｌを接種し、３７℃で１８時間通気撹拌培養した。培養終了時のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性は約２Ｕ／ｍｌであった。
【００４９】
上記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に懸濁した。上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画処理を行った後、セファデックス(Sephadex) G-25 （ファルマシアバイオテク）によるゲルろ過により脱塩し、ＤＥＡＥセファロースCL-6B （ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィー、オクチルセファロースCL6-B(ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素表品を得た。本方法により得られたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は約８０Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
【００５０】
以下に、上記方法により得られたＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの性質を示す。
作用：酸素の存在下にＬ−α−グリセロホスフェートに作用してジヒドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素を生成する
至適温度：３５〜４０℃
至適ｐＨ：７．５〜９．０
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ７．０、１５分間処理）
ｐＨ安定性：６．０〜８．５（２５℃、２０時間処理）
分子量：６７，０００±３０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
Ｌ−α−グリセロホスフェートに対するｋｍ値：３．８±０．５ｍＭ
【００５１】
実施例７
ペデイオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７をブレインハートインヒュージョン培地にて、３７℃、約１〜３日間培養し、培養液を遠心分離して集菌し、次いで、これを溶菌させることによって、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成させ、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを採取した。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、ペデイオコッカス属細菌から新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ遺伝子が単離され、遺伝子工学的技術による該酵素の製造法が確立され、高純度な該酵素の大量供給との定量への利用が可能となった。また、該遺伝子を改変することにより、理化学的性質の改良された新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを製造する方法を導き出すことができる。
【００５３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のペディオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼに関する至適温度（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液；ｐＨ８．０）のデータを示す図である。
【図２】本発明のペディオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼに関する至適ｐＨ（３７℃、１０分；５０ｍＭ緩衝液）のデータを示す図である。なお、ｐＨ６．０〜７．０ではＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０〜９．５ではトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．５〜１０．５では炭酸緩衝液を用いている。
【図３】本発明のペディオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼに関する熱安定性（０．１Ｍジメチルグルタル酸緩衝液；ｐＨ７．０，１５分）のデータを示す図である。
【図４】本発明のペディオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼに関するｐＨ安定性（２５℃、２０時間）のデータを示す図である。
【図５】本発明のペディオコッカス・ホマリＩＦＯ１２２１７由来のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼのアミノ酸配列とストレプトコッカス・エスピーＧＰＯＳ−５３が産生するＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼのアミノ酸配列との比較を示す図である。
【図６】ｐＯＧ３Ｏ１の制限酵素地図を示す図である。
Claims (11)
- 下記理化学的性質を有することを特徴とするＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ。
作用：酸素の存在下にＬ−α−グリセロホスフェートに作用してジヒドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素を生成する
至適温度：３５〜４０℃
至適ｐＨ：７．５〜９．０
熱安定性：４０℃以下（ｐＨ７．０、１５分間処理）
ｐＨ安定性：６．０〜８．５（２５℃、２０時間処理）
分子量：６７０００±３０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
Ｌ−α−グリセロホスフェートに対するｋｍ値：３．８±０．５ｍＭ - 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質 - 配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する請求項１記載のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ。
- 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質。 - 配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子。
- 以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡからなるＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ
（ｅ）上記（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする細菌由来のＤＮＡ - 配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡを含有するＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子。
- 請求項４〜７のいずれかに記載のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項８記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換した形質転換体。
- 請求項９記載の形質転換体を培養することによりＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成せしめ、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを採取することを特徴とするＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの製造方法。
- ペデイオコッカス・ホマリ(Pediococcus homari ）ＩＦＯ１２２１７を培養することによりＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを生成せしめ、該Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼを採取することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼの製造方法。
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