JPH10174585A - 安定なクレアチンアミジノヒドロラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】診断薬用酵素として、有用な液状安定性に優れ
たクレアチンアミジノヒドロラーゼを提供する。 【解決手段】アルカリゲネス・フェカリスTE3581(FERM
P-1423）由来のクレアチンアミジノヒドロラーゼのアミ
ノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸が他のアミ
ノ酸に置換した、中性緩衝液中で４５℃、１週間保存し
た後の残存活性が６０％以上である安定なクレアチンア
ミジノヒドロラーゼおよび該アミノ酸配列をコードする
変異遺伝子、該変異遺伝子を含む組換えプラスミド、該
プラスミドにより形質転換された形質転換宿主細胞、該
細胞を用いて、遺伝子工学的手法により、上記酵素を得
る方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は野生型クレアチンア
ミジノヒドロラーゼと比較して、安定なクレアチンアミ
ジノヒドロラーゼおよび該クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの製造法に関する。

【０００２】クレアチニンおよびクレアチンは血液また
は尿中に見いだされ、その量を迅速、かつ、正確に検出
測定することは疾病、例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎
炎、巨人症、強直性筋異栄養症などを診断するのに非常
に重要である。このような診断を行うために、血液また
は尿中のクレアチニンおよびクレアチンを定量すること
は一般的に行われている。

【０００３】従来のクレアチンの定量法としては、試料
中のクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼおよ
びザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化
水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料中のク
レアチンを定量する。また、クレアチニンにクレアチニ
ンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラー
ゼおよびザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する
過酸化水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料
中のクレアチニンを定量する方法などがある。

【０００４】一方、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、
クレアチンアミジノヒドロラーゼ、またはザルコシンオ
キシダーゼは微生物界に広く見いだされており、既に工
業的に種々のものが製造され、臨床検査薬として使用さ
れている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、公知の
各種菌体から製造されたクレアチンアミジノヒドロラー
ゼは熱安定性が低く、特に液状での長期の安定性も十分
とはいえなかった。例えばバチルス属由来の酵素（特公
昭61-17465号公報）は、熱安定性は４０℃以下と低い。
また、コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、アク
チノバチルス属またはバチルス属由来の酵素（特公平 3
-76915号公報）は、熱安定性は５０℃以下であるが、液
状での長期の安定性は不明であった。

【０００６】また、野生型クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼ遺伝子中に変異を導入することにより、安定性の向
上した変異型クレアチンアミジノヒドロラーゼを造成す
る試みも行われているが（特公平 3-36514号公報、特開
平7-255485号公報）、臨床検査薬用酵素として精製され
た高純度酵素としての記載はこれらの公報にはなく、ま
た、臨床検査薬用酵素として重要な指標となる液状での
長期の安定性の記載もなく、その効果が明瞭ではなかっ
た。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記問題点を解決する
ため、鋭意研究を重ねた結果、本発明者らはアルカリゲ
ネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する細菌が熱
安定性に優れ、かつ、クレアチンに対するＫｍ値の比較
的小さいクレアチンアミジノヒドロラーゼを生産するこ
とを見い出した（特願平6-63363 号公報）。しかし、該
クレアチンアミジノヒドロラーゼは、現在、臨床検査薬
の主流である液状試薬に対応した酵素としては、まだ十
分な安定性であると言い難く、更に、液状で長期間安定
なクレアチンアミジノヒドロラーゼが要望されていた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意検討した結果、アルカリゲネス属細菌
由来のクレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を用い、
蛋白工学的手法により長期の液状安定性に優れた新規ク
レアチンアミジノヒドロラーゼを創出することに成功し
た。

【０００９】すなわち、野生型クレアチンアミジノヒド
ロラーゼと比較して、中性緩衝液中で長期安定性が向上
している変異型クレアチンアミジノヒドロラーゼである
ことを特徴とする安定なクレアチンアミジノヒドロラー
ゼである。

【００１０】また、本発明はＰＩＰＥＳ緩衝液またはリ
ン酸カリウム緩衝液中で４５℃、１週間保存した後の残
存活性が６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好
ましくは８０％以上である安定なクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼである。

【００１１】また、本発明はこれらの安定なクレアチン
アミジノヒドロラーゼをコードするクレアチンアミジノ
ヒドロラーゼ遺伝子である。

【００１２】さらに、本発明はこれらのクレアチンアミ
ジノヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む組換えプラ
スミドである。

【００１３】また、本発明はこれらの組換えプラスミド
により形質転換された形質転換細胞である。

【００１４】さらに、本発明はこれらの形質転換細胞を
栄養培地にて培養し、クレアチンアミジノヒドロラーを
採取することを特徴とする安定なクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造法である。

【００１５】

【発明の実施態様】本発明の新規なクレアチンアミジノ
ヒドロラーゼとは、水の存在下にクレアチンに作用し
て、ザルコシンおよび尿素を有する作用を有する酵素で
あって、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べ
て、長期安定性、特に液状での長期安定性が改良された
安定なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。本発明
における野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼとは、
アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenesfaecaris）Ｔ
Ｅ３５８１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２３７）が産生する酵
素であり、その性質は、下記の通りである。 作用： クレアチン ＋ Ｈ₂ Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：４０℃〜４５℃ 至適ｐＨ：８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（５０ｍＭ リン酸カリウム緩
衝液、ｐＨ７．５，３０分間） ｐＨ安定性：４〜１０（２５℃，１８時間） 液状安定性：４５〜５０％（０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ、ｐ
Ｈ７．０中で４５℃、１週間） ザルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを共役酵
素として活性測定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ
値：１６〜３０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 該酵素のアミノ酸配列は配列表・配列番号１に記載され
る。

【００１６】本発明における液状での長期安定性とは、
中性緩衝液中、例えばＰＩＰＥＳ緩衝液またはリン酸カ
リウム緩衝液中で４５℃、１週間保存した後の残存活性
を意味する。本発明の一実施態様は、ＰＩＰＥＳ緩衝液
またはリン酸カリウム緩衝液中で４５℃、１週間保存し
た後の残存活性が６０％以上である安定なクレアチンア
ミジノヒドロラーゼである。また、別な実施態様はＰＩ
ＰＥＳ緩衝液またはリン酸カリウム緩衝液中で４５℃、
１週間保存した後の残存活性が７０％以上である安定な
クレアチンアミジノヒドロラーゼである。さらに、別な
実施態様はＰＩＰＥＳ緩衝液またはリン酸カリウム緩衝
液中で４５℃、１週間保存した後の残存活性が８０％以
上である安定なクレアチンアミジノヒドロラーゼであ
る。

【００１７】本発明の一実施態様は、配列表・配列番号
１記載のアミノ酸配列の内、少なくとも１つのアミノ
酸、例えば１３５番目のアルギニン、１５番目のグルタ
ミン酸および／または１０４番目のアルギニンが他のア
ミノ酸に置換された安定なクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼである。さらに、具体的な例としては、配列番号１
記載のアミノ酸配列の１３５番目のアルギニンがアラニ
ンに、１５番目のグルタミン酸がグリシンに、または１
０４番目のアルギニンがヒスチヂンに置換されている酵
素またはこれらの１５番目のグルタミン酸、１０４番目
のアルギニンおよび１３５番目のアルギニンからなる群
から選択される置換箇所を２つ以上組み合わせて置換さ
れた酵素がある。

【００１８】本発明の一例は、下記の理化学的性質を有
するクレアチンアミジノヒドロラーゼであり、野性型酵
素に比べて、液状安定性が優れる新規な酵素である。 作用： クレアチン ＋ Ｈ₂ Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：６．５〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（５０ｍＭ リン酸カリウム緩
衝液、ｐＨ７．５，３０分間） ｐＨ安定性：４〜１０（２５℃，１８時間） 液状安定性：６０〜８０％（０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ、ｐ
Ｈ７．０中で４５℃、１週間） ザルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを共役酵
素として活性測定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ
値：１６〜３０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００１９】本発明により得られる新規なクレアチンア
ミジノヒドロラーゼの一つは下記の理化学的性質を有す
る。 作用： クレアチン ＋ Ｈ₂ Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：４５℃〜５０℃ 至適ｐＨ：６．５〜７．５ 熱安定性：約５０℃以下（５０ｍＭ リン酸カリウム緩
衝液、ｐＨ７．５，３０分間） ｐＨ安定性：４〜１０（２５℃，１８時間） 液状安定性：６８％（０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ，ｐＨ７．
０、４５℃、１週間保存） ザルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを共役酵
素として活性測定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ
値：１６ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００２０】また、別な新規なクレアチンアミジノヒド
ロラーゼは下記理化学的性質を有する。 作用： クレアチン ＋ Ｈ₂ Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：４０℃ 至適ｐＨ：８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（５０ｍＭ リン酸カリウム緩
衝液、ｐＨ７．５，３０分間） ｐＨ安定性：４〜１０（２５℃，１８時間） 液状安定性：７２％（０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ，ｐＨ７．
０、４５℃、１週間保存） ザルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを共役酵
素として活性測定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ
値：３０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００２１】さらに、別な新規なクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼは下記理化学的性質を有する。 作用 クレアチン ＋ Ｈ₂ O → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：４０℃ 至適ｐＨ：８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（５０ｍＭ リン酸カリウム緩
衝液、ｐＨ７．５，３０分間） ｐＨ安定性：４〜１０（２５℃，１８時間） 液状安定性：７９％（０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ，ｐＨ７．
０、４５℃、１週間保存） ザルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを共役酵
素として活性測定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ
値：３０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

【００２２】また、本発明は配列表・配列番号１に記載
されたアミノ酸配列をコードする遺伝子に変異を導入し
て、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べて、
安定性、特に液状での長期間安定性が向上したクレアチ
ンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子である。

【００２３】また、該遺伝子としては、配列表・配列番
号１に記載されたアミノ酸配列中の１５番目、１０４番
目および１３５番目のアミノ酸の少なくとも１つが他の
アミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする遺伝子
である変異遺伝子が例示される。

【００２４】さらに、具体的な例としては配列表・配列
番号１に記載されたアミノ酸配列の１５番目のアミノ
酸、１０４番目のアミノ酸または１３５番目のアミノ酸
が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする
遺伝子などが例示される。

【００２５】本発明の実施様態としては、配列表・配列
番号１に記載されたアミノ酸配列の１５番目のグルタミ
ン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列をコードする
遺伝子、１０４番目のアルギニンがヒスチジンに置換さ
れたアミノ酸配列をコードする遺伝子、さらに、１３５
番目のアルギニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列
をコードする遺伝子がある。

【００２６】また、配列表・配列番号１に記載されるア
ミノ酸配列の１５番目、１０４番目及び１３５番目のア
ミノ酸配列の少なくとも２つが他のアミノ酸に置換され
たアミノ酸配列をコードする遺伝子、例えば１３５番目
のアルギニンがアラニンに置換され、かつ、１５番目の
グルタミン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列、ま
たは１０４番目のアルギニンがヒスチジンに置換された
アミノ酸配列をコードする遺伝子がある。

【００２７】本発明の遺伝子としては、配列表・配列番
号２記載の遺伝子のうち、少なくとも１つの遺伝子が他
の遺伝子に置換されて、野生型クレアチンアミジノヒド
ロラーゼと比較して、ＰＩＰＥＳ緩衝液またはリン酸カ
リウム緩衝液中の長期安定性が向上している変異型クレ
アチンアミジノヒドロラーゼをコードするクレアチンア
ミジノヒドロラーゼ遺伝子がある。

【００２８】さらに、本発明は該クレアチンアミジノヒ
ドロラーゼをコードする遺伝子を含んだ組換えプラスミ
ド、該組換プラスミドにより形質転換された形質転換細
胞または該細胞を栄養培地にて培養し、該クレアチンア
ミジノヒドロラーゼを採取することを特徴とする該クレ
アチンアミジノヒドロラーゼの製造法である。ベクタ
ー、宿主細胞は一般的に当該技術分野で使用されるもの
が例示される。

【００２９】本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼ
を製造する方法の一つは、野生型クレアチンアミジノヒ
ドロラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、蛋白
工学的手法により野生型クレアチンアミジノヒドロラー
ゼに比べて安定性、特に長期間の液状安定性を改良され
た新規クレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する方法
である。

【００３０】変異を導入するための野生型クレアチンア
ミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子は特に限定され
ないが、本発明の実施例ではアルカリゲネス・フェカリ
ス(Alcaligenesfaecaris）ＴＥ３５８１（ＦＥＲＭ Ｐ
−１４２３７）由来の配列表・配列番号２のクレアチン
アミジノヒドロラーゼ遺伝子を用いた。

【００３１】本発明の別な実施態様は、配列表・配列番
号１に記載されたアミノ酸配列をコードする遺伝子に変
異を導入して、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼ
に比べて安定性、特に長期間の液状安定性を改良された
新規クレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する方法で
ある。

【００３２】野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺
伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法でも用
いることができる。すなわち、該遺伝子ＤＮＡと変異源
となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法な
どから、蛋白工学的な手法、例えばＰＣＲ法や部位特異
的変異法などを用いることができる。また遺伝子修復機
構が欠損されたため高頻度に遺伝子に変異が起こる大腸
菌を用いたin vivoでの変異の導入も可能である。

【００３３】上記のようにして得られた変異クレアチン
アミジノヒドロラーゼ遺伝子を大腸菌に形質転換した
後、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒天培
地(J.Ferment. Bioeng.,Vol.76 No.2 77-81 (1993)) に
塗布し、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を発現す
ることにより茶色く着色したコロニーを選抜した。選抜
したコロニーは、栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ
培地に接種し、３７℃で一晩培養した後、菌体を破砕し
て粗酵素液を抽出する。菌体を破砕する方法は公知のい
かなる手法を用いても良く、例えば超音波処理やガラス
ビーズ破砕の様な物理的破砕法やリゾチームの様な溶菌
酵素を用いる方法が利用できる。この粗酵素液を用い
て、55℃、30分間処理後の残存活性を測定することによ
り、安定化されたクレアチンアミジノヒドロラーゼを選
抜することができる。そして、安定化されたクレアチン
アミジノヒドロラーゼを生産する菌株から組換えプラス
ミドを回収することにより変異を導入されたクレアチン
アミジノヒドロラーゼ遺伝子を回収することができる。

【００３４】変異を導入された遺伝子から変異箇所を同
定する方法は、従来公知のＤＮＡの塩基配列決定法を用
いれば良く、市販のキットを用いるのが便利である。

【００３５】上記の方法により選抜された菌株から精製
クレアチンアミジノヒドロラーゼを取得する方法は公知
のいかなる手法を用いても良く、下記の方法に限定され
るものではない。栄養培地に培養して得られた菌体を回
収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出し
て粗酵素液を得ることができる。得られた粗酵素抽出液
から硫安沈澱によりクレアチンアミジノヒドロラーゼ画
分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５
（ファルマシア・バイオテク）ゲル濾過等の方法により
脱塩を行うことができる。この操作の後、オクチルセフ
ァロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア・バイオテク）カラ
ムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標
品を得ることができる。この精製酵素標品は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ的にほぼ単一のバンドを示す程度に純化されて
いる。

【００３６】本発明において使用する新規なクレアチン
アミジノヒドロラーゼを生産する微生物としては、エシ
ェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｓ１）、
エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｓ
２）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７
３Ｓ３）が例示される。これらの微生物を培養し、該培
養物から本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼを採
取する方法は特に限定される物ではなく、通常の方法に
従う。

【００３７】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、クレアチンアミジノヒドロラーゼの活性
測定は、下記のようにして行った。また、本発明の酵素
活性の定義は下記条件下で１分間に１μモルのザルコシ
ンを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。下記反応混
液３ｍｌをキュベット（ｄ＝１ｃｍ）に取り、３７℃で
約３分間予備加温する。次に酵素液０．１ｍｌを加え、
緩やかに混和した後、水を対照に３７℃に制御された分
光光度計で５００ｎｍの吸光度変化を５分間記録し、そ
の２〜５分の直線部分から１分間あたりの吸光度変化を
求める（△ＯＤテスト）。盲検は酵素溶液の代わりに酵
素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．
５）０．１ｍｌを加え、上記と同様に操作を行って、１
分間当たりの吸光度変化を求める（△ＯＤブランク）。 測定原理

【００３８】

【化１】

【００３９】反応混液組成 ０．３Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．６ ０．００５％ ４−アミノアンチピリン ０．０１５％ フェノール １．８％ クレアチン ６Ｕ／ｍｌ ザルコシンオキシダーゼ ６Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ

【００４０】

【数１】

【００４１】１３．３：キノンイミン色素の上記測定条
件下でのミリモル吸光係数（ｃｍ²/μＭ） １／２ ：酵素反応で生成したH₂O₂の１分子から形成す
るキノンイミン色素は１／２分子であることの係数 １．０ ：光路長（ｃｍ） ０．１ ：添加酵素液量（ｍｌ）

【００４２】参考例１ 染色体ＤＮＡの分離 アルカリゲネス・フェカリスＴＥ３５８１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４２３７）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離し
た。該菌体を１５０ｍｌの普通ブイヨン培地で３０℃一
晩振とう培養した後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１
０分間）により集菌した。１０％シュークロース、５０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭＥＤＴＡを含
んだ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌの上記緩衝液に溶解し
たリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃１
５分間保温し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液を加え
た。この溶液に等量のクロロホルム・フェノール溶液
（１：１）を加え、攪拌混合し、１０，０００ｒｐｍ、
３分間の遠心分離で水層と溶媒層に分離し、水層を分取
した。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層し、
ガラス棒でゆっくり攪拌しながら、ＤＮＡをガラス棒に
巻き付かせて分離した。

【００４３】このＤＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ１
０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０溶液（以下、ＴＥと略
記）で溶解した。これを等量のクロロホルム・フェノー
ル溶液で処理後、遠心分離により水層を分取し、２倍量
のエタノールを加えて上記方法で、もう一度ＤＮＡを分
離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。

【００４４】参考例２ クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡ及び該ＤＮＡ断片を有する組換えベクタ
ーの調製 参考例１で得たＤＮＡ２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
（東洋紡製）で部分分解し、シュークロース密度勾配遠
心分離法により２〜１０ｋｂｐの断片を回収した。一
方、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡製）で切断したｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）をバクテリアルアルカリホ
スファターゼ（東洋紡製）により、脱リン酸化処理した
後、両ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１ユニ
ットで１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。
連結したＤＮＡをエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコ
ンピテントセル（東洋紡製）を用いて形質転換し、クレ
アチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒天培地［０．
５％酵母エキス、０．２％肉エキス、０．５％ポリペプ
トン、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．
０５％ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、１．１５％クレアチン、
１０Ｕ／ｍｌザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製）、
０．５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡製）、０．０
１％ο−ジアニシジン、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、
１．５％寒天］に塗布した。クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ活性の検出は上記培地に生育し、かつ、茶色に染
色されるコロニーを指標に行った。使用したＤＮＡ１μ
ｇ当たり約１×１０⁵ 個の形質転換体のコロニーが得ら
れた。

【００４５】約１２，０００個のコロニーをスクリーニ
ングした結果、６株が茶色に染色されたコロニーを見い
出した。これらの株をＬＢ液体培地（１％ポリペプト
ン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、５０μｇ
／ｍｌアンピシリン）で培養し、クレアチンアミジノヒ
ドロラーゼ活性を測定したところ、いずれの株からもク
レアチンアミジノヒドロラーゼ活性が検出された。これ
らの株の内、最もクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性
の高かった株の保有するプラスミドには約５ｋｂｐの挿
入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＣＲ
Ｈ１７とした。次いでｐＣＲＨ１７の挿入ＤＮＡを制限
酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡製）とＰｓｔＩ（東洋紡製）に
て切り出し、同じ制限酵素で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＫＳ（＋）に連結してｐＣＲＨ１７３を作製し
た。

【００４６】参考例３ 組換えプラスミドｐＣＲＨ２７
３の作製 参考例２の組換えプラスミドｐＣＲＨ１７３を用い、ベ
クター由来のβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子から挿
入ＤＮＡのクレアチンアミジノヒドロラーゼ構造遺伝子
上流部分を、配列表・配列番号３に記載した合成ＤＮＡ
と変異導入キット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ；Ｃｌ
ｏｎｅｔｅｃｈ製）により削除して組換えプラスミドｐ
ＣＲＨ１７３Ｍを作製した。なお、組換えプラスミドの
作製の詳細な方法に付いてはキット添付のプロトコール
に準拠して行った。更にｐＣＲＨ１７３Ｍを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ（東洋紡製）で切断した後、セルフライゲーシ
ョンさせてｐＣＲＨ２７３を作製した。

【００４７】実施例１ クレアチンアミジノヒドロラー
ゼ遺伝子への変異の導入 参考例１で作製したｐＣＲＨ２７３で市販の大腸菌コン
ピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬＩ−Ｒｅｄ；Ｃｌｏ
ｎｅｔｅｃｈ製）を形質転換した後、全量をアンピシリ
ンを含んだ（５０μｇ／ｍｌ；ナカライテスク製）３ｍ
ｌのＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エ
キス、１．０％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪
培養した。この培養液全量から常法によりプラスミドを
回収した。このプラスミドで再度市販の大腸菌コンピテ
ントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９；東洋紡製）を形
質転換し、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用
寒天培地に塗布して３７℃一晩培養した。こうして得ら
れた変異クレアチンアミジノヒドロラーゼライブラリー
からクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を強く発現し
ている株（着色の強い株）を選抜した。

【００４８】実施例２ 熱安定性の向上したクレアチン
アミジノヒドロラーゼのスクリーニング 実施例１で選抜した候補株をアンピシリンを含んだ（２
００μｇ／ｍｌ）３ｍｌのＴＢ培地（１．２％ポリペプ
トン、２．４％酵母エキス、０．４％グリセロール、
０．０２３１％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、 ０．１２５４％Ｋ₂ ＨＰ
Ｏ₄ ）に接種し、３７℃で一晩振培養した。その培養液
１ｍｌから遠心分離により菌体を回収し、ガラスビーズ
破砕により粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液を用
いて前述した活性測定法によりクレアチンアミジノヒド
ロラーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５５℃、
３０分間加熱処理した後クレアチンアミジノヒドロラー
ゼ活性を測定した。この２種類の活性値の比較により野
生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べ加熱処理後
のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性の残存率が野生
型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べて高い株を熱
安定性向上変異体として選抜した。上記の方法により約
１０，０００株についてスクリーニングした結果、３株
の熱安定性が向上した変異体を取得することができ、そ
れぞれの有する組換えプラスミドをｐＣＲＨ２７３Ｓ
１，ｐＣＲＨ２７３Ｓ２，ｐＣＲＨ２７３Ｓ３と命名し
た。

【００４９】ｐＣＲＨ２７３Ｓ１、ｐＣＲＨ２７３Ｓ
２、ｐＣＲＨ２７３Ｓ３の変異箇所を同定するには、Ra
dioactive Sequencing Kit（東洋紡製）を用いてクレア
チンアミジノヒドロラーゼ全遺伝子の塩基配列を確認し
て行った。その結果、ｐＣＲＨ２７３Ｓ１では１３５番
目のアルギニン（コドン；ＣＧＣ）がアラニン（コド
ン；ＧＣＣ）に（Ｒ１３５Ａ）、ｐＣＲＨ２７３Ｓ２で
は１５番目のグルタミン酸（コドン；ＧＡＧ）と１３５
番目のアルギニン（コドン；ＣＧＣ）がそれぞれグリシ
ン（コドン；ＧＧＧ）とアラニン（コドン；ＧＣＣ）に
（Ｅ１５Ｇ−Ｒ１３５Ａ）、そしてｐＣＲＨ２７３Ｓ３
では１０４番目のアルギニン（コドン；ＣＧＣ）と１３
５番目のアルギニン（コドン；ＣＧＣ）がヒスチジン
（コドン；ＣＡＣ）アラニン（コドン：ＧＣＣ）（Ｒ１
０４Ｈ−Ｒ１３５Ａ）置換されていることが確認され
た。

【００５０】実施例３ エシェリヒア・コリーＪＭ１０
９（ｐＣＲＨ２７３Ｓ１）からのクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造 ６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注
し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後
別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカラ
イテスク製）、及び２００ｍＭ ＩＰＴＧ（日本精化
製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地で
あらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・
コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｓ１）の培養液６０
ｍｌを接種し、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。培
養終了時のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性は３．
６Ｕ／ｍｌであった。上記菌体を遠心分離にて集菌し、
５０ｍＭ リン酸緩衝液，ｐＨ７．０に懸濁した。

【００５１】上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕
し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を
硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア バ
イオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロー
スＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方
法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品
の比活性は１３．３Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであっ
た。表１にこれまでの精製のまとめを示す。また表２に
上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラー
ゼの理化学的性質を示す。

【００５２】

【表１】

【００５３】

【表２】

【００５４】実施例４ エシェリヒア・コリーＪＭ１０
９（ｐＣＲＨ２７３Ｓ２）からのクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造 ６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注
し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷
後、別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナ
カライテスク製）、及び２００ｍＭ ＩＰＴＧ（日本精
化製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地
であらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア
・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｓ２）の培養液６
０ｍｌを接種し、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。
培養終了時のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性は
６．５Ｕ／ｍｌであった。上記菌体を遠心分離にて集菌
し、５０ｍＭ リン酸緩衝液，ｐＨ７．０に懸濁した。

【００５５】上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕
し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を
硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア バ
イオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロー
スＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方
法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品
の比活性は１４．８Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであっ
た。表３にこれまでの精製のまとめを示す。また表４に
上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラー
ゼの理化学的性質を示す。

【００５６】

【表３】

【００５７】

【表４】

【００５８】実施例５ エシェリヒア・コリーＪＭ１０
９（ｐＣＲＨ２７３Ｓ３）からのクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造 ６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注
し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後
別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカラ
イテスク製）、及び２００ｍＭ ＩＰＴＧ（日本精化
製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地で
あらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・
コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ３）の培養液６０
ｍｌを接種し、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。培
養終了時のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性は１
２．３Ｕ／ｍｌであった。上記菌体を遠心分離にて集菌
し、５０ｍＭ リン酸緩衝液，ｐＨ７．０に懸濁した。

【００５９】上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕
し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を
硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア バ
イオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロー
スＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方
法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、こ
の時の比活性は１６．２Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであ
った。表５にこれまでの精製のまとめを示す。また表６
に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの理化学的性質を示す。

【００６０】

【表５】

【００６１】

【表６】

【００６２】実施例６ 各種変異体と野生型クレアチン
アミジノヒドロラーゼの熱安定性の比較 実施例３、４および５で取得した変異型クレアチンアミ
ジノヒドロラーゼと野生型クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの熱安定性を比較した結果を図１に示す。図１中、
■は野性型、◆はｐＣＲＨ２７３Ｓ２、▲はｐＣＲＨ２
７３Ｓ１、●はｐＣＲＨ２７３Ｓ３から得た酵素の熱安
定性を示す。この図から判るように、全てのクレアチン
アミジノヒドロラーゼの熱変性に対する変曲点は５０℃
であるが、本発明の変異型クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼは５５℃での残存活性が有意に向上していること確
認された。

【００６３】実施例７ 各種変異体と野生型クレアチン
アミジノヒドロラーゼの液状安定性の比較 さらに、実施例３、４および５で取得した変異型クレア
チンアミジノヒドロラーゼと野生型クレアチンアミジノ
ヒドロラーゼの液状での長期間の安定性を比較した結果
を図２（ＰＩＰＥＳ緩衝液）および図３（リン酸カリウ
ム緩衝液）に示す。図２および３中、■は野性型、◆は
ｐＣＲＨ２７３Ｓ２、▲はｐＣＲＨ２７３Ｓ１、●はｐ
ＣＲＨ２７３Ｓ３から得た酵素の液状安定性を示す。そ
の結果、驚くべきことに、短時間での熱安定性の比較だ
けでは推定できなかった、長期間での液状安定性におい
て、各変異型クレアチンアミジノヒドロラーゼが大きく
野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼの安定性を上回
っていることが確認された。

【００６４】

【発明の効果】本発明により診断薬用酵素として有用な
液状安定性に優れた新規クレアチンアミジノヒドロラー
ゼを取得でき、更に工業的に大量に該クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼを生産できるようになった。

【００６５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：401 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：アルカリゲネス・フェカリス 株名：ＴＥ３５８１（微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ１４
２３７） 配列の情報：クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有
する蛋白質 配列 Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Asn Asp 20 25 30 Val Arg Gly Trp Met Ala Lys Asn Asn Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr 35 40 45 Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu Tyr Cys Tyr Phe 50 55 60 Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp His Asn Asn Ala Thr Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp 85 90 95 Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Arg Ala Val 100 105 110 Arg Gln Leu Thr Thr Gly Ala Lys Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His 115 120 125 Val Asn Leu Asp Phe Arg Arg Gln Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val 130 135 140 Glu Phe Val Asp Ile Ser Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Ile Lys 145 150 155 160 Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Val Cys Asp 165 170 175 Val Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gly Val Pro Glu 180 185 190 His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Ile Arg Glu Ile Ala 195 200 205 Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln 210 215 220 Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile 225 230 235 240 Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe 245 250 255 Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp 260 265 270 Asp Ala Ser Leu Asp Ile Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg 275 280 285 Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile 290 295 300 Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser 305 310 315 320 Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Cys His Tyr Tyr Gly Arg 325 330 335 Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Glu Leu Lys Pro 340 345 350 Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Met 355 360 365 Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu 370 375 380 Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn 385 390 395 400 Ile Ile Arg Asn 404

【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：1212 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アルカリゲネス・フェカリス 株名：ＴＥ３５８１（微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ１４
２３７） 配列 ATG ACT GAC GAC ATG TTG CAC GTG ATG AAA TGG CAC AAC GGC GAG AAA 48 Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys 1 5 10 15 GAT TAT TCG CCG TTT TCG GAT GCC GAG ATG ACC CGC CGC CAA AAC GAC 96 Asp Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Asn Asp 20 25 30 GTT CGC GGC TGG ATG GCC AAG AAC AAT GTC GAT GCG GCG CTG TTC ACC 144 Val Arg Gly Trp Met Ala Lys Asn Asn Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr 35 40 45 TCT TAT CAC TGC ATC AAC TAC TAT TCC GGC TGG CTG TAC TGC TAT TTC 192 Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu Tyr Cys Tyr Phe 50 55 60 GGA CGC AAG TAC GGC ATG GTC ATC GAC CAC AAC AAC GCC ACG ACG ATT 240 Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp His Asn Asn Ala Thr Thr Ile 65 70 75 80 TCG GCC GGC ATC GAC GGC GGC CAG CCC TGG CGC CGC AGC TTC GGC GAC 288 Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp 85 90 95 AAC ATC ACC TAC ACC GAC TGG CGC CGC GAC AAT TTC TAT CGC GCC GTG 336 Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Arg Ala Val 100 105 110 CGC CAG CTG ACC ACG GGC GCC AAG CGC ATC GGC ATC GAG TTC GAC CAC 384 Arg Gln Leu Thr Thr Gly Ala Lys Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His 115 120 125 GTC AAT CTC GAC TTC CGC CGC CAG CTC GAG GAA GCC CTA CCG GGC GTC 432 Val Asn Leu Asp Phe Arg Arg Gln Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val 130 135 140 GAC TTC GTC GAC ATC AGC CAG CCC TCG ATG TGG ATG CGC ACC ATC AAG 480 Glu Phe Val Asp Ile Ser Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Ile Lys 145 150 155 160 TCG CTC GAA GAG CAG AAG CTG ATC CGC GAA GGC GCC CGC GTG TGT GAC 528 Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Val Cys Asp 165 170 175 GTC GGC GGC GCG GCC TGC GCG GCT GCC ATC AAG GCC GGC GTG CCC GAG 576 Val Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gly Val Pro Glu 180 185 190 CAT GAA GTG GCG ATC GCC ACC ACC AAT GCG ATG ATC CGC GAG ATC GCC 624 His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Ile Arg Glu Ile Ala 195 200 205 AAA TCG TTC CCC TTC GTG GAG CTG ATG GAC ACC TGG ACC TGG TTC CAG 672 Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln 210 215 220 TCG GGC ATC AAC ACC GAC GGC GCG CAC AAT CCG GTC ACC AAC CGC ATC 720 Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile 225 230 235 240 GTG CAA TCC GGC GAC ATC CTT TCG CTC AAC ACC TTC CCG ATG ATC TTC 768 Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe 245 250 255 GGC TAC TAC ACC GCG CTG GAG CGC ACG CTG TTC TGC GAC CAT GTC GAT 816 Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp 260 265 270 GAC GCC AGC CTC GAC ATC TGG GAG AAG AAC GTG GCC GTG CAT CGC CGC 864 Asp Ala Ser Leu Asp Ile Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg 275 280 285 GGG CTC GAG CTG ATC AAG CCG GGC GCG CGC TGC AAG GAC ATC GCC ATC 912 Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile 290 295 300 GAG CTC AAC GAG ATG TAC CGC GAG TGG GAC CTG CTG AAG TAC CGC TCC 960 Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser 305 310 315 320 TTC GGC TAT GGC CAC TCC TTC GGC GTG CTG TGC CAC TAC TAC GGT CGC 1008 Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Cys His Tyr Tyr Gly Arg 325 330 335 GAG GCC GGC GTG GAG CTG CGC GAG GAC ATC GAC ACC GAG CTG AAG CCC 1056 Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Glu Leu Lys Pro 340 345 350 GGC ATG GTG GTC TCC ATG GAG CCG ATG GTG ATG CTG CCG GAG GGC ATG 1104 Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Met 355 360 365 CCC GGT GCC GGC GGC TAT CGC GAG CAC GAC ATC CTG ATC GTC GGG GAG 1152 Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu 370 375 380 GAC GGT GCC GAG AAC ATC ACC GGC TTC CCG TTC GGT CCG GAA CAC AAC 1200 Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn 385 390 395 400 ATC ATC CGC AAC 1212 Ile Ile Arg Asn 404

【００６７】配列番号：３ 配列の長さ：39 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAACA TGTCG TCAGT CATAT GTGTT TCCTG TGTGA AATT 39

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の安定なクレアチンアミジノヒドロラー
ゼの熱安定性を示す図である。

【図２】本発明の安定なクレアチンアミジノヒドロラー
ゼのＰＩＰＥＳ緩衝液中での液状安定性を示す図であ
る。

【図３】本発明の安定なクレアチンアミジノヒドロラー
ゼのリン酸カリウム緩衝液中での液状安定性を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼ
   と比較して、中性緩衝液中で長期安定性が向上している
   変異型クレアチンアミジノヒドロラーゼであることを特
   徴とする安定なクレアチンアミジノヒドロラーゼ。
2. 【請求項２】 ＰＩＰＥＳ緩衝液またはリン酸カリウム
   緩衝液中で４５℃、１週間保存した後の残存活性が６０
   ％以上である請求項１記載の安定なクレアチンアミジノ
   ヒドロラーゼ。
3. 【請求項３】 ＰＩＰＥＳ緩衝液またはリン酸カリウム
   緩衝液中で４５℃、１週間保存した後の残存活性が７０
   ％以上である請求項１記載の安定なクレアチンアミジノ
   ヒドロラーゼ。
4. 【請求項４】 ＰＩＰＥＳ緩衝液またはリン酸カリウム
   緩衝液中で４５℃、１週間保存した後の残存活性が８０
   ％以上である請求項１記載の安定なクレアチンアミジノ
   ヒドロラーゼ。
5. 【請求項５】 配列表・配列番号１記載のアミノ酸配列
   の内、少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換
   されたアミノ酸配列を有する請求項１〜４のいずれか１
   項記載の安定なクレアチンアミジノヒドロラーゼ。
6. 【請求項６】 置換部位が配列番号１記載のアミノ酸配
   列の１５番目のグルタミン酸、１０４番目のアルギニン
   および１３５番目のアルギニンからなる群から選択され
   る置換箇所を１つまたは２つ以上組み合わせてなる請求
   項５記載の安定なクレアチンアミジノヒドロラーゼ。
7. 【請求項７】 置換部位が配列番号１記載のアミノ酸配
   列の１３５番目のアルギニンである請求項５記載の安定
   なクレアチンアミジノヒドロラーゼ。
8. 【請求項８】 置換部位が配列番号１記載のアミノ酸配
   列の１５番目のグルタミン酸および１３５番目のアルギ
   ニンである請求項５記載の安定なクレアチンアミジノヒ
   ドロラーゼ。
9. 【請求項９】 置換部位が配列番号１記載のアミノ酸配
   列の１０４番目のアルギニンおよび１３５番目のアルギ
   ニンである請求項５記載の安定なクレアチンアミジノヒ
   ドロラーゼ。
10. 【請求項１０】 下記理化学的性質を有する安定なクレ
    アチンアミジノヒドロラーゼ。 作用 クレアチン ＋ Ｈ₂ O → ザルコシン ＋
    尿素 至適温度：４０℃〜４５℃ 熱安定性：約５０℃以下（５０ｍＭ リン酸カリウム緩
    衝液、ｐＨ７．５，３０分間） ｐＨ安定性：４〜１０（２５℃，１８時間） 液状安定性：６０〜８０％（０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ、ｐ
    Ｈ７．０中で４５℃、１週間） ザルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを共役酵
    素として活性測定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ
    値：１６〜３０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
11. 【請求項１１】 請求項１〜１０記載の安定なクレアチ
    ンアミジノヒドロラーゼをコードするクレアチンアミジ
    ノヒドロラーゼ遺伝子。
12. 【請求項１２】 配列表・配列番号２記載の遺伝子のう
    ち、少なくとも１つの遺伝子が他の遺伝子に置換され
    て、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼと比較し
    て、中性緩衝液中の長期安定性が向上している変異型ク
    レアチンアミジノヒドロラーゼをコードするクレアチン
    アミジノヒドロラーゼ遺伝子。
13. 【請求項１３】 請求項１１または１２のいずれか１項
    に記載されるクレアチンアミジノヒドロラーゼをコード
    する遺伝子を含む組換えプラスミド。
14. 【請求項１４】 請求項１３記載の組換えプラスミドに
    より形質転換された形質転換細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１４記載の形質転換細胞を栄養
    培地にて培養し、クレアチンアミジノヒドロラーを採取
    することを特徴とする安定なクレアチンアミジノヒドロ
    ラーゼの製造法。