JP3075390B2 - 新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ、その製法およびその用途 - Google Patents
新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ、その製法およびその用途Info
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- amidinohydrolase
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- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は新規なクレアチンア
ミジノヒドロラーゼ、その製法及び該酵素を使用するク
レアチンまたはクレアチニン定量用試薬に関する。
ミジノヒドロラーゼ、その製法及び該酵素を使用するク
レアチンまたはクレアチニン定量用試薬に関する。
【０００２】クレアチニンおよびクレアチンは血液また
は尿中に見い出され、その量を迅速かつ正確に検出測定
することは、疾病、例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎
炎、巨人症、強直性筋異栄養症などを診断するのに非常
に重要である。このような診断を行うために、血液また
は尿中のクレアチン及びクレアチニンを定量することは
頻繁に行われている。
は尿中に見い出され、その量を迅速かつ正確に検出測定
することは、疾病、例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎
炎、巨人症、強直性筋異栄養症などを診断するのに非常
に重要である。このような診断を行うために、血液また
は尿中のクレアチン及びクレアチニンを定量することは
頻繁に行われている。
【０００３】従来のクレアチンの定量法としては、試料
中のクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼおよ
びザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化
水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料中のク
レアチンを定量する。また、クレアチニンにクレアチニ
ンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラー
ゼおよびザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する
過酸化水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料
中のクレアチニンを定量する方法などがある。
中のクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼおよ
びザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化
水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料中のク
レアチンを定量する。また、クレアチニンにクレアチニ
ンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラー
ゼおよびザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する
過酸化水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料
中のクレアチニンを定量する方法などがある。
【０００４】一方、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、
クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダ
ーゼは微生物界に広く見い出されており、既に工業的に
製造され、臨床検査薬として使用されている。
クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダ
ーゼは微生物界に広く見い出されており、既に工業的に
製造され、臨床検査薬として使用されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、公知の
各種菌体から製造されたクレアチンアミジノヒドロラー
ゼは熱安定性が低く、またクレアチンに対するＫｍ値も
大きかった。例えばバチルス属由来の酵素（特公昭６１
−１７４６５号公報）は、熱安定性は４０℃以下と低
い。さらにシュードモナス・プチダ由来の酵素は、クレ
アチンに対する見かけのＫｍ値は１．３３ｍＭと小さい
が(Archives Biochemistry and Biophysics177, 508-51
5 (1976))、活性測定法が異なっており、臨床検査薬で
汎用されているザルコシンオキシダーゼとペルオキシダ
ーゼを共役酵素として用いた活性測定法でのクレアチン
に対するＫｍ値は不明であった。コリネバクテリウム
属、ミクロコッカス属、アクチノバチルス属、バチルス
属由来の酵素（特公平３−７６９１５号公報）は、熱安
定性は５０℃以下であるが、クレアチンに対するＫｍ値
は約２０ｍＭと大きかった。
各種菌体から製造されたクレアチンアミジノヒドロラー
ゼは熱安定性が低く、またクレアチンに対するＫｍ値も
大きかった。例えばバチルス属由来の酵素（特公昭６１
−１７４６５号公報）は、熱安定性は４０℃以下と低
い。さらにシュードモナス・プチダ由来の酵素は、クレ
アチンに対する見かけのＫｍ値は１．３３ｍＭと小さい
が(Archives Biochemistry and Biophysics177, 508-51
5 (1976))、活性測定法が異なっており、臨床検査薬で
汎用されているザルコシンオキシダーゼとペルオキシダ
ーゼを共役酵素として用いた活性測定法でのクレアチン
に対するＫｍ値は不明であった。コリネバクテリウム
属、ミクロコッカス属、アクチノバチルス属、バチルス
属由来の酵素（特公平３−７６９１５号公報）は、熱安
定性は５０℃以下であるが、クレアチンに対するＫｍ値
は約２０ｍＭと大きかった。
【０００６】上記の問題点を解決するため、本発明者ら
は既にアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に
属する細菌が熱安定性に優れ、かつ、クレアチンに対す
るＫｍ値が比較的小さい（Ｋｍ値：約１５．２）クレア
チンアミジノヒドロラーゼを生産することを見い出した
（特願平６−６３３６３号）。さらに、該菌株よりクレ
アチンに対するＫｍ値の比較的小さいクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼ遺伝子を単離し、グラム陰性細菌を宿主
として、大量に該酵素を生産する技術を確立した（特願
平７−１１７２８３号）。また、同じアルカリゲネス属
細菌から、高ｐＨ領域において安定であり、また、Ｋｍ
値の小さいクレアチンアミジノヒドロラーゼが報告され
ている（特開平７−１７０９７９号公報）。
は既にアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に
属する細菌が熱安定性に優れ、かつ、クレアチンに対す
るＫｍ値が比較的小さい（Ｋｍ値：約１５．２）クレア
チンアミジノヒドロラーゼを生産することを見い出した
（特願平６−６３３６３号）。さらに、該菌株よりクレ
アチンに対するＫｍ値の比較的小さいクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼ遺伝子を単離し、グラム陰性細菌を宿主
として、大量に該酵素を生産する技術を確立した（特願
平７−１１７２８３号）。また、同じアルカリゲネス属
細菌から、高ｐＨ領域において安定であり、また、Ｋｍ
値の小さいクレアチンアミジノヒドロラーゼが報告され
ている（特開平７−１７０９７９号公報）。
【０００７】しかし、これらのクレアチンアミジノヒド
ロラーゼは、一般的な臨床検査薬である酵素としては、
まだＫｍ値が大きく、更にＫｍ値の小さい、望ましくは
約１５．０以下のクレアチンアミジノヒドロラーゼが要
望されていた。
ロラーゼは、一般的な臨床検査薬である酵素としては、
まだＫｍ値が大きく、更にＫｍ値の小さい、望ましくは
約１５．０以下のクレアチンアミジノヒドロラーゼが要
望されていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するために、鋭意検討した結果、アルカリゲネス属
由来の上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を用
い、蛋白工学的手法により、クレアチンに対するＫｍ値
のより小さい新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを
創出することに成功した。
達成するために、鋭意検討した結果、アルカリゲネス属
由来の上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を用
い、蛋白工学的手法により、クレアチンに対するＫｍ値
のより小さい新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを
創出することに成功した。
【０００９】すなわち、本発明は下記理化学的性質を有
する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
【００１０】また、本発明は下記理化学的性質を有する
新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを生産する微生
物を栄養培地にて培養し、新規なクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼを採取することを特徴とする新規なクレアチ
ンアミジノヒドロラーゼの製造法である。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを生産する微生
物を栄養培地にて培養し、新規なクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼを採取することを特徴とする新規なクレアチ
ンアミジノヒドロラーゼの製造法である。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
【００１１】本発明は、上記クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出
用組成物を含有することを特徴とする試料中のクレアチ
ン定量用試薬である。
ラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出
用組成物を含有することを特徴とする試料中のクレアチ
ン定量用試薬である。
【００１２】また、本発明はクレアチニンアミドヒドロ
ラーゼ、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコ
シンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有
することを特徴とする試料中のクレアチニン定量用試薬
である。
ラーゼ、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコ
シンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有
することを特徴とする試料中のクレアチニン定量用試薬
である。
【００１３】
【発明の実施態様】本発明の一実施態様は、下記理化学
的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ
である。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約４．５±１．０ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ
である。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約４．５±１．０ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
【００１４】また、別な実施態様は、下記理化学的性質
を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼであ
る。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約６．５±１．０ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼであ
る。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約６．５±１．０ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
【００１５】さらに、別な実施態様は、下記理化学的性
質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼであ
る。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約９．０±１．０ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼであ
る。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約９．０±１．０ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
【００１６】本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼ
を製造する方法の１つは、野性型クレアチンアミジノヒ
ドロラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、蛋白
工学的手法により、野生型クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼに比べてクレアチンに対するＫｍ値の小さくなった
新規クレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する方法で
ある。
を製造する方法の１つは、野性型クレアチンアミジノヒ
ドロラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、蛋白
工学的手法により、野生型クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼに比べてクレアチンに対するＫｍ値の小さくなった
新規クレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する方法で
ある。
【００１７】変異を導入するための野生型クレアチンア
ミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子は特に限定され
ないが、本発明の一実施態様では、アルカリゲネス・フ
ェカリス(Alcaligenes faecalis)ＴＥ３５８１（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４２３７）由来の配列表・配列番号２のクレ
アチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を用いた。
ミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子は特に限定され
ないが、本発明の一実施態様では、アルカリゲネス・フ
ェカリス(Alcaligenes faecalis)ＴＥ３５８１（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４２３７）由来の配列表・配列番号２のクレ
アチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を用いた。
【００１８】本発明の別な実施態様は、配列表・配列番
号１に記載されたアミノ酸配列をコードする遺伝子に変
異を導入して、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼ
に比べてクレアチンに対するＫｍ値の小さくなった新規
クレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する。
号１に記載されたアミノ酸配列をコードする遺伝子に変
異を導入して、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼ
に比べてクレアチンに対するＫｍ値の小さくなった新規
クレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する。
【００１９】野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺
伝子に変異を導入する方法は、既知のいかなる方法でも
用いることができる。例えば、野生型クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼ遺伝子ＤＮＡと変異源となる薬剤を接触
させる方法や紫外線照射による方法などから、蛋白工学
的な手法、例えばＰＣＲ法や部位特異的変異などの方法
を用いることができる。また、遺伝子修復機構が欠損さ
れたため、高頻度に遺伝子に変異が起こる大腸菌を用い
たin vivoでの変異の導入も可能である。
伝子に変異を導入する方法は、既知のいかなる方法でも
用いることができる。例えば、野生型クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼ遺伝子ＤＮＡと変異源となる薬剤を接触
させる方法や紫外線照射による方法などから、蛋白工学
的な手法、例えばＰＣＲ法や部位特異的変異などの方法
を用いることができる。また、遺伝子修復機構が欠損さ
れたため、高頻度に遺伝子に変異が起こる大腸菌を用い
たin vivoでの変異の導入も可能である。
【００２０】上記のようにして得られた変異クレアチン
アミジノヒドロラーゼ遺伝子を例えば大腸菌に形質転換
した後、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒
天培地(J. Ferment. Bioeng.,Vol.76 No.2 77-81(199
3)) に塗布し、発色の強いコロニーを選抜する。選抜し
たコロニーは、栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培
地に接種し、３７℃で一晩培養した後、菌体を破砕して
粗酵素液を抽出する。菌体を破砕する方法は、公知のい
かなる手法を用いても良く、例えば超音波処理やガラス
ビーズ破砕の様な物理的破砕法やリゾチームの様な溶菌
酵素を用いる方法が利用できる。この粗酵素液を用い
て、２種類の基質濃度の異なる活性測定反応液によりク
レアチンアミジノヒドロラーゼ活性を測定し、両者の活
性比率を野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼと比較
することにより、クレアチンに対するＫｍ値の小さくな
ったクレアチンアミジノヒドロラーゼをスクリーニング
することができる。
アミジノヒドロラーゼ遺伝子を例えば大腸菌に形質転換
した後、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒
天培地(J. Ferment. Bioeng.,Vol.76 No.2 77-81(199
3)) に塗布し、発色の強いコロニーを選抜する。選抜し
たコロニーは、栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培
地に接種し、３７℃で一晩培養した後、菌体を破砕して
粗酵素液を抽出する。菌体を破砕する方法は、公知のい
かなる手法を用いても良く、例えば超音波処理やガラス
ビーズ破砕の様な物理的破砕法やリゾチームの様な溶菌
酵素を用いる方法が利用できる。この粗酵素液を用い
て、２種類の基質濃度の異なる活性測定反応液によりク
レアチンアミジノヒドロラーゼ活性を測定し、両者の活
性比率を野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼと比較
することにより、クレアチンに対するＫｍ値の小さくな
ったクレアチンアミジノヒドロラーゼをスクリーニング
することができる。
【００２１】上記方法により選抜された菌株から精製ク
レアチンアミジノヒドロラーゼを取得する方法は、公知
のいかなる手法を用いても良く、例えば下記方法があ
る。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵
素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を
得る。得られた粗酵素抽出液から硫安沈澱によりクレア
チンアミジノヒドロラーゼ画分を回収する。この粗酵素
液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア・バイオテ
ク）ゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。
この操作の後、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ファ
ルマシア・バイオテク）カラムクロマトグラフィーによ
り分離・精製し、精製酵素標品を得ることができる。こ
の精製酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一のバ
ンドを示す程度に純化される。
レアチンアミジノヒドロラーゼを取得する方法は、公知
のいかなる手法を用いても良く、例えば下記方法があ
る。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵
素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を
得る。得られた粗酵素抽出液から硫安沈澱によりクレア
チンアミジノヒドロラーゼ画分を回収する。この粗酵素
液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア・バイオテ
ク）ゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。
この操作の後、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ファ
ルマシア・バイオテク）カラムクロマトグラフィーによ
り分離・精製し、精製酵素標品を得ることができる。こ
の精製酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一のバ
ンドを示す程度に純化される。
【００２２】本発明において使用する新規なクレアチン
アミジノヒドロラーゼを生産する微生物としては、エシ
ェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ１）
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３７４）、エシェリヒア・コリー
ＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５３７５）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲ
Ｈ２７３Ｍ３）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３７６）が例示さ
れる。これらの微生物を培養し、該培養物から本発明の
クレアチンアミジノヒドロラーゼを採取する方法は特に
限定されるものではなく、通常の方法に従う。
アミジノヒドロラーゼを生産する微生物としては、エシ
ェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ１）
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３７４）、エシェリヒア・コリー
ＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５３７５）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲ
Ｈ２７３Ｍ３）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３７６）が例示さ
れる。これらの微生物を培養し、該培養物から本発明の
クレアチンアミジノヒドロラーゼを採取する方法は特に
限定されるものではなく、通常の方法に従う。
【００２３】本発明の上記製法により得られた新規クレ
アチンアミジノヒドロラーゼは、下記理化学的性質を有
する。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
アチンアミジノヒドロラーゼは、下記理化学的性質を有
する。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５
【００２４】本発明におけるＫｍ値は、ザルコシンオキ
シダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活
性測定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値である。
従来のシュードモナス・プチダ由来の酵素は、クレアチ
ンに対する見かけのＫｍ値は１．３３ｍＭと小さいが(A
rchives Biochemistry and Biophysics 177, 508-515(1
976))、活性測定法は、反応液中の残存したクレアチン
をα−ナフトールとジアセチルにより定量する方法であ
り、臨床検査薬で汎用されているザルコシンオキシダー
ゼとペルオキシダーゼを共役酵素として用いた活性測定
法でのクレアチンに対するＫｍ値は不明であった。
シダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活
性測定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値である。
従来のシュードモナス・プチダ由来の酵素は、クレアチ
ンに対する見かけのＫｍ値は１．３３ｍＭと小さいが(A
rchives Biochemistry and Biophysics 177, 508-515(1
976))、活性測定法は、反応液中の残存したクレアチン
をα−ナフトールとジアセチルにより定量する方法であ
り、臨床検査薬で汎用されているザルコシンオキシダー
ゼとペルオキシダーゼを共役酵素として用いた活性測定
法でのクレアチンに対するＫｍ値は不明であった。
【００２５】本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼ
は、ザルコシンオキシダーゼ及び過酸化水素検出用組成
物を組み合わせて、クレアチンの測定に使用することが
できる。またクレアチニンアミドヒドロラーゼを共存さ
せて、クレアチニンを定量することができる。
は、ザルコシンオキシダーゼ及び過酸化水素検出用組成
物を組み合わせて、クレアチンの測定に使用することが
できる。またクレアチニンアミドヒドロラーゼを共存さ
せて、クレアチニンを定量することができる。
【００２６】本発明の試料中のクレアチン定量用試薬
は、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシン
オキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有す
る。
は、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシン
オキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有す
る。
【００２７】本発明の試料中のクレアチニン定量用試薬
は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、上記クレアチン
アミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび
過酸化水素検出用組成物を含有する。
は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、上記クレアチン
アミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび
過酸化水素検出用組成物を含有する。
【００２８】本発明のクレアチンまたはクレアチニンの
定量に使用するザルコシンオキシダーゼは、アースロバ
クター属、コリネバクテリウム属、アルカリゲネス属、
シュードモナス属、マイクロコッカス属、バチルス属等
の起源の微生物より得ることができ、これらのいくつか
は既に市販されている。クレアチニンアミドヒドロラー
ゼとしては、シュードモナス属、フラボバクテリウム
属、アルカリゲネス属、ペニシリウム属等の起源の微生
物より得ることができ、これらのいくつかは既に市販さ
れている。
定量に使用するザルコシンオキシダーゼは、アースロバ
クター属、コリネバクテリウム属、アルカリゲネス属、
シュードモナス属、マイクロコッカス属、バチルス属等
の起源の微生物より得ることができ、これらのいくつか
は既に市販されている。クレアチニンアミドヒドロラー
ゼとしては、シュードモナス属、フラボバクテリウム
属、アルカリゲネス属、ペニシリウム属等の起源の微生
物より得ることができ、これらのいくつかは既に市販さ
れている。
【００２９】過酸化水素検出用組成物はペルオキシダー
ゼ活性を有する酵素及び色原体、緩衝液を含む。ペルオ
キシダーゼ活性を有する酵素としては、ペルオキシダー
ゼ、ハロペルオキシダーゼ、ブロムペルオキシダーゼ、
ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ等が
挙げられる。色原体は更に水素受容体およびカプラーよ
りなる。水素受容体は過酸化水素、ペルオキシダーゼ、
カプラーとの反応に際し、水素を受容する化合物であれ
ば良く、例えば４−アミノアンチピリン、３−メチル−
２−ベンソチアゾリン−ヒドラジン誘導体等が挙げられ
る。またカプラーとしては、アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トル
イジン（ＴＯＯＳ）などのアニリン誘導体、フェノー
ル、ｐ−クロロフェノールなどのフェノール誘導体が挙
げられる。
ゼ活性を有する酵素及び色原体、緩衝液を含む。ペルオ
キシダーゼ活性を有する酵素としては、ペルオキシダー
ゼ、ハロペルオキシダーゼ、ブロムペルオキシダーゼ、
ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ等が
挙げられる。色原体は更に水素受容体およびカプラーよ
りなる。水素受容体は過酸化水素、ペルオキシダーゼ、
カプラーとの反応に際し、水素を受容する化合物であれ
ば良く、例えば４−アミノアンチピリン、３−メチル−
２−ベンソチアゾリン−ヒドラジン誘導体等が挙げられ
る。またカプラーとしては、アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トル
イジン（ＴＯＯＳ）などのアニリン誘導体、フェノー
ル、ｐ−クロロフェノールなどのフェノール誘導体が挙
げられる。
【００３０】本発明のクレアチン定量用試薬中、各成分
の好ましい量はクレアチンアミジノヒドロラーゼ約５〜
３００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ約１〜１００
Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ約０．０１〜５０Ｕ／ｍ
ｌ、水素受容体約０．１〜１０ｍＭ、カプラー約０．１
〜５０ｍＭである。本発明のクレアチニン定量用試薬
中、各成分の好ましい量はクレアチニンアミドヒドロラ
ーゼ約１０〜３００Ｕ／ｍｌ、クレアチンアミジノヒド
ロラーゼ約１０〜３００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダ
ーゼ約１〜１００Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ約０．０
１〜５０Ｕ／ｍｌ、水素受容体約０．１〜１０ｍＭ、カ
プラー約０．１〜５０ｍＭである。
の好ましい量はクレアチンアミジノヒドロラーゼ約５〜
３００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ約１〜１００
Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ約０．０１〜５０Ｕ／ｍ
ｌ、水素受容体約０．１〜１０ｍＭ、カプラー約０．１
〜５０ｍＭである。本発明のクレアチニン定量用試薬
中、各成分の好ましい量はクレアチニンアミドヒドロラ
ーゼ約１０〜３００Ｕ／ｍｌ、クレアチンアミジノヒド
ロラーゼ約１０〜３００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダ
ーゼ約１〜１００Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ約０．０
１〜５０Ｕ／ｍｌ、水素受容体約０．１〜１０ｍＭ、カ
プラー約０．１〜５０ｍＭである。
【００３１】本発明のクレアチンまたはクレアチニン定
量用試薬は、通常、ｐＨ約６〜８の緩衝液とともに使用
する。例えばリン酸緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝
液等が挙げられる。本発明の試薬には必要によりアスコ
ルビン酸オキシダーゼまたはカタラーゼを添加してもよ
い。更に本発明の試薬には酵素反応または呈色反応を円
滑に行わせるために他の化合物を添加しても良い。この
ような化合物としては、例えば安定化剤、界面活性剤、
賦形剤等が挙げられる。
量用試薬は、通常、ｐＨ約６〜８の緩衝液とともに使用
する。例えばリン酸緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝
液等が挙げられる。本発明の試薬には必要によりアスコ
ルビン酸オキシダーゼまたはカタラーゼを添加してもよ
い。更に本発明の試薬には酵素反応または呈色反応を円
滑に行わせるために他の化合物を添加しても良い。この
ような化合物としては、例えば安定化剤、界面活性剤、
賦形剤等が挙げられる。
【００３２】本発明は以下の測定反応を利用する。
【００３３】
【化１】
【００３４】
【化２】
【００３５】
【化３】
【００３６】生成したキノンイミン色素は通常、５００
〜６５０ｎｍの波長で吸光度測定を行う。クレアチンの
定量法としては、エンド法およびレート法で行われる
が、エンド法を用いるのが一般的である。
〜６５０ｎｍの波長で吸光度測定を行う。クレアチンの
定量法としては、エンド法およびレート法で行われる
が、エンド法を用いるのが一般的である。
【００３７】本発明のＫｍ値が小さいクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼは、従来の酵素に比べて、クレアチンま
たはクレアチニンの定量において、検査試薬中の使用酵
素量を約１／３〜１／４に減少させることが可能であ
り、かつ、反応後半の反応性が良好となる。
ノヒドロラーゼは、従来の酵素に比べて、クレアチンま
たはクレアチニンの定量において、検査試薬中の使用酵
素量を約１／３〜１／４に減少させることが可能であ
り、かつ、反応後半の反応性が良好となる。
【００３８】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、クレアチンアミジノヒドロラーゼの活性
測定は以下のようにして行った。なお、本発明の酵素活
性の定義は、下記条件下に１分間に１μモルのザルコシ
ンを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。 反応混液組成 ０．３Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６ ０．００５％ ４アミノアンチピリン ０．０１５％ フェノール １．８ ％ クレアチン ６Ｕ／ｍｌ ザルコシンオキシダーゼ ６Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ 上記反応混液３ｍｌをキュベット（ｄ＝１ｃｍ）に取
り、３７℃で約３分間予備加温する。次に酵素液０．１
ｍｌを加え、緩やかに混和後、水を対照に３７℃に制御
された分光光度計で５００ｎｍの吸光度変化を５分間記
録し、その２〜５分の直線部分から１分間あたりの吸光
度変化を求める（△ＯＤテスト）。盲検は酵素溶液の代
わりに酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液，
ｐＨ７．５）０．１ｍｌを加え上記と同様に操作を行っ
て、１分間当たりの吸光度変化を求める（△ＯＤブラン
ク）。
る。実施例中、クレアチンアミジノヒドロラーゼの活性
測定は以下のようにして行った。なお、本発明の酵素活
性の定義は、下記条件下に１分間に１μモルのザルコシ
ンを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。 反応混液組成 ０．３Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６ ０．００５％ ４アミノアンチピリン ０．０１５％ フェノール １．８ ％ クレアチン ６Ｕ／ｍｌ ザルコシンオキシダーゼ ６Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ 上記反応混液３ｍｌをキュベット（ｄ＝１ｃｍ）に取
り、３７℃で約３分間予備加温する。次に酵素液０．１
ｍｌを加え、緩やかに混和後、水を対照に３７℃に制御
された分光光度計で５００ｎｍの吸光度変化を５分間記
録し、その２〜５分の直線部分から１分間あたりの吸光
度変化を求める（△ＯＤテスト）。盲検は酵素溶液の代
わりに酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液，
ｐＨ７．５）０．１ｍｌを加え上記と同様に操作を行っ
て、１分間当たりの吸光度変化を求める（△ＯＤブラン
ク）。
【００３９】計算式
【数１】
【００４０】１３．３：キノンイミン色素の上記測定条
件下でのミリモル吸光係数（ｃｍ2 ／μＭ） １／２ ：酵素反応で生成した過酸化水素１分子から形
成するキノンイミン色素は１／２分子であることの係数 １．０ ：光路長（ｃｍ） ０．１ ：添加酵素液量（ｍｌ）
件下でのミリモル吸光係数（ｃｍ2 ／μＭ） １／２ ：酵素反応で生成した過酸化水素１分子から形
成するキノンイミン色素は１／２分子であることの係数 １．０ ：光路長（ｃｍ） ０．１ ：添加酵素液量（ｍｌ）
【００４１】参考例１ 染色体ＤＮＡの分離 アルカリゲネス・フェカリスＴＥ３５８１の染色体ＤＮ
Ａを次の方法で分離した。該菌体（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
２３７）を１５０ｍｌの普通ブイヨン培地で３０℃一晩
振盪培養した後、遠心分離（８０００ｒｍｐ，１０分
間）により集菌した。１０％シュークロース、５０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含ん
だ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム溶液（１０
ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃１５分間保温し、次いで１
ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液を加えた。この溶液に等量のク
ロロホルム・フェノール溶液（１：１）を加え、攪拌混
合し、１０，０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離で水層と
溶媒層に分離し、水層を分取した。この水層に２倍量の
エタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり攪拌し
ながら、ＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。こ
のＤＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩
酸、ｐＨ８．０溶液（以下、ＴＥと略記）で溶解した。
これを等量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後、
遠心分離により水層を分取し、２倍量のエタノールを加
えて上記方法で、もう一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴ
Ｅで溶解した。
Ａを次の方法で分離した。該菌体（ＦＥＲＭ Ｐ−１４
２３７）を１５０ｍｌの普通ブイヨン培地で３０℃一晩
振盪培養した後、遠心分離（８０００ｒｍｐ，１０分
間）により集菌した。１０％シュークロース、５０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含ん
だ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム溶液（１０
ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃１５分間保温し、次いで１
ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液を加えた。この溶液に等量のク
ロロホルム・フェノール溶液（１：１）を加え、攪拌混
合し、１０，０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離で水層と
溶媒層に分離し、水層を分取した。この水層に２倍量の
エタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり攪拌し
ながら、ＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。こ
のＤＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩
酸、ｐＨ８．０溶液（以下、ＴＥと略記）で溶解した。
これを等量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後、
遠心分離により水層を分取し、２倍量のエタノールを加
えて上記方法で、もう一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴ
Ｅで溶解した。
【００４２】参考例２ クレアチニンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子
を含有するＤＮＡ断片および該ＤＮＡ断片を有する組換
えベクターの調製 参考例１で得たＤＮＡ２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
（東洋紡製）で部分分解し、シュークロース密度勾配遠
心分離法により２〜１０ｋｂｐの断片を回収した。一
方、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡製）で切断したｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）をバクテリアルアルカリホ
スファターゼ（東洋紡製）により脱リン酸化処理した
後、両ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１ユニ
ットで１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。
連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコ
ンピテントセル（東洋紡製）を用いて形質転換し、クレ
アチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒天培地〔０．
５％酵母エキス、０．２％肉エキス、０．５％ポリペプ
トン、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．
０５％ＭｇＳＯ4 ／７Ｈ2 Ｏ、１．１５％クレアチン、
１０Ｕ／ｍｌザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製）、
０．５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡製）、０．０
１％ｏ−ジアニシジン、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、
１．５％寒天〕に塗布した。クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ活性の検出は、上記培地に生育し、且つ茶色に染
色されるコロニーを指標に行った。使用したＤＮＡ１μ
ｇ当たり約１×１０5 個の形質転換体のコロニーが得ら
れた。
を含有するＤＮＡ断片および該ＤＮＡ断片を有する組換
えベクターの調製 参考例１で得たＤＮＡ２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
（東洋紡製）で部分分解し、シュークロース密度勾配遠
心分離法により２〜１０ｋｂｐの断片を回収した。一
方、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡製）で切断したｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）をバクテリアルアルカリホ
スファターゼ（東洋紡製）により脱リン酸化処理した
後、両ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１ユニ
ットで１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。
連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコ
ンピテントセル（東洋紡製）を用いて形質転換し、クレ
アチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒天培地〔０．
５％酵母エキス、０．２％肉エキス、０．５％ポリペプ
トン、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．
０５％ＭｇＳＯ4 ／７Ｈ2 Ｏ、１．１５％クレアチン、
１０Ｕ／ｍｌザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製）、
０．５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡製）、０．０
１％ｏ−ジアニシジン、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、
１．５％寒天〕に塗布した。クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ活性の検出は、上記培地に生育し、且つ茶色に染
色されるコロニーを指標に行った。使用したＤＮＡ１μ
ｇ当たり約１×１０5 個の形質転換体のコロニーが得ら
れた。
【００４３】約１２，０００個のコロニーをスクリーニ
ングした結果、６株茶色に染色されるコロニーを見いだ
した。これらの株をＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、
０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン）で培養し、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ活性を測定したところ、いずれの株からもクレア
チンアミジノヒドロラーゼ活性が検出された。これらの
株のうち、最もクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性の
高かった株の保有するプラスミドには、約５ｋｂｐの挿
入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＣＲ
Ｈ１７とした。次いでｐＣＲＨ１７の挿入ＤＮＡの制限
酵素ＥｃｏＲＶ（東洋紡製）とＰｓｔＩ（東洋紡製）に
て切り出し、同制限酵素で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＫＳ（＋）に連結してｐＣＲＨ１７３を作成した。
ングした結果、６株茶色に染色されるコロニーを見いだ
した。これらの株をＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、
０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン）で培養し、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ活性を測定したところ、いずれの株からもクレア
チンアミジノヒドロラーゼ活性が検出された。これらの
株のうち、最もクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性の
高かった株の保有するプラスミドには、約５ｋｂｐの挿
入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＣＲ
Ｈ１７とした。次いでｐＣＲＨ１７の挿入ＤＮＡの制限
酵素ＥｃｏＲＶ（東洋紡製）とＰｓｔＩ（東洋紡製）に
て切り出し、同制限酵素で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＫＳ（＋）に連結してｐＣＲＨ１７３を作成した。
【００４４】実施例１ 組換えプラスミドｐＣＲＨ２７
３の作製 参考例２の組換えプラスミドｐＣＲＨ１７３を用い、ベ
クター由来のβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子から挿
入ＤＮＡのクレアチンアミジノヒドロラーゼ構造遺伝子
上流部分を、配列番号３に記載した合成ＤＮＡと市販の
変異導入キット(Transformer TM ; Clonetech 製）によ
り削除して、組換えプラスミドｐＣＲＨ１７３Ｍを作製
した。なお、変異の導入の詳細な方法については、キッ
ト添付のプロトコールに準拠した。更にｐＣＲＨ１７３
Ｍを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡製）で切断した後、セ
ルフライゲーションさせてｐＣＲＨ２７３を作製した
（図１）。
３の作製 参考例２の組換えプラスミドｐＣＲＨ１７３を用い、ベ
クター由来のβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子から挿
入ＤＮＡのクレアチンアミジノヒドロラーゼ構造遺伝子
上流部分を、配列番号３に記載した合成ＤＮＡと市販の
変異導入キット(Transformer TM ; Clonetech 製）によ
り削除して、組換えプラスミドｐＣＲＨ１７３Ｍを作製
した。なお、変異の導入の詳細な方法については、キッ
ト添付のプロトコールに準拠した。更にｐＣＲＨ１７３
Ｍを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡製）で切断した後、セ
ルフライゲーションさせてｐＣＲＨ２７３を作製した
（図１）。
【００４５】実施例２ クレアチンアミジノヒドロラー
ゼ遺伝子への変異の導入 実施例１で作製したｐＣＲＨ２７３で市販の大腸菌コン
ピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬＩ−Ｒｅｄ；Ｃｌｏ
ｎｅｔｅｃｈ製）形質転換した後、全量をアンピシリン
を含んだ（５０μｇ／ｍｌ；ナカライテスク製）３ｍｌ
のＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキ
ス、１．０％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪培
養した。この培養液全量から常法によりプラスミドを回
収した。このプラスミドで再度市販の大腸菌コンピテン
トセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９；東洋紡製）を形質
転換し、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒
天培地に塗布して３７℃一晩培養した。こうして得られ
た変異クレアチンアミジノヒドロラーゼライブラリーか
らクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を強く発現して
いる株（着色の強い株）を選抜した。
ゼ遺伝子への変異の導入 実施例１で作製したｐＣＲＨ２７３で市販の大腸菌コン
ピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬＩ−Ｒｅｄ；Ｃｌｏ
ｎｅｔｅｃｈ製）形質転換した後、全量をアンピシリン
を含んだ（５０μｇ／ｍｌ；ナカライテスク製）３ｍｌ
のＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキ
ス、１．０％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪培
養した。この培養液全量から常法によりプラスミドを回
収した。このプラスミドで再度市販の大腸菌コンピテン
トセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９；東洋紡製）を形質
転換し、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒
天培地に塗布して３７℃一晩培養した。こうして得られ
た変異クレアチンアミジノヒドロラーゼライブラリーか
らクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を強く発現して
いる株（着色の強い株）を選抜した。
【００４６】実施例３ Ｋｍ値の減少したクレアチンア
ミジノヒドロラーゼのスクリーニング 実施例２で選抜した候補株をアンピシリンを含んだ（２
００μｇ／ｍｌ）３ｍｌのＴＢ培地（１．２％ポリペプ
トン、２．４％酵母エキス、０．４％グリセロール、
０．０２３１％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．１２５４％Ｋ2 ＨＰ
Ｏ4 ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養した。その培養
液１ｍｌから遠心分離により菌体を回収し、ガラスビー
ズ破砕により粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液を
用いて前述した活性測定法によりクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼを測定した。 また、基質濃度のみを１／１
０に減らした活性測定試薬を用いて、同様にクレアチン
アミジノヒドロラーゼ活性を測定した。この２種類の活
性値の比率（１／１０基質濃度の活性÷常法の活性）が
野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べ上昇した
株をＫｍ値の減少した変異体として選抜した。上記の方
法により約２０，０００株についてスクリーニングした
結果、３株のクレアチンに対するＫｍ値の小さくなった
変異体を取得することができ、それぞれの有する組換え
プラスミドをｐＣＲＨ２７３Ｍ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５
３７４）、ｐＣＲＨ２７３Ｍ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３
７５）、ｐＣＲＨ２７３Ｍ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３７
６）と命名した。
ミジノヒドロラーゼのスクリーニング 実施例２で選抜した候補株をアンピシリンを含んだ（２
００μｇ／ｍｌ）３ｍｌのＴＢ培地（１．２％ポリペプ
トン、２．４％酵母エキス、０．４％グリセロール、
０．０２３１％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．１２５４％Ｋ2 ＨＰ
Ｏ4 ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養した。その培養
液１ｍｌから遠心分離により菌体を回収し、ガラスビー
ズ破砕により粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液を
用いて前述した活性測定法によりクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼを測定した。 また、基質濃度のみを１／１
０に減らした活性測定試薬を用いて、同様にクレアチン
アミジノヒドロラーゼ活性を測定した。この２種類の活
性値の比率（１／１０基質濃度の活性÷常法の活性）が
野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べ上昇した
株をＫｍ値の減少した変異体として選抜した。上記の方
法により約２０，０００株についてスクリーニングした
結果、３株のクレアチンに対するＫｍ値の小さくなった
変異体を取得することができ、それぞれの有する組換え
プラスミドをｐＣＲＨ２７３Ｍ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５
３７４）、ｐＣＲＨ２７３Ｍ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３
７５）、ｐＣＲＨ２７３Ｍ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３７
６）と命名した。
【００４７】実施例４ エシェリヒア・コリーＪＭ１０
９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ１）からのクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造 ６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注
し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後
別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカラ
イテスク製）、及び２００ｍＭ ＩＰＴＧ（日本精化
製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地で
あらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・
コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ１）（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３７４）の培養液６０ｍｌを接種し、３７℃で
２４時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンア
ミジノヒドロラーゼ活性は８．７Ｕ／ｍｌであった。上
記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ リン酸緩衝
液，ｐＨ７．０に懸濁した。
９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ１）からのクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造 ６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注
し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後
別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカラ
イテスク製）、及び２００ｍＭ ＩＰＴＧ（日本精化
製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地で
あらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・
コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ１）（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３７４）の培養液６０ｍｌを接種し、３７℃で
２４時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンア
ミジノヒドロラーゼ活性は８．７Ｕ／ｍｌであった。上
記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ リン酸緩衝
液，ｐＨ７．０に懸濁した。
【００４８】上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕
し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を
硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア バ
イオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロー
スＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方
法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、こ
の時の比活性は１８．４Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであ
った。表１にこれまでの精製のまとめを示す。また表２
に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの理化学的性質を示す。
し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を
硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア バ
イオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロー
スＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方
法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、こ
の時の比活性は１８．４Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであ
った。表１にこれまでの精製のまとめを示す。また表２
に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの理化学的性質を示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】実施例５ エシェリヒア・コリーＪＭ１０
９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ２）からのクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造 ６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注
し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後
別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカラ
イテスク製）、及び２００ｍＭ ＩＰＴＧ（日本精化
製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地で
あらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・
コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ２）（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３７５）の培養液６０ｍｌを接種し、３７℃で
２４時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンア
ミジノヒドロラーゼ活性は５．６Ｕ／ｍｌであった。上
記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ リン酸緩衝
液，ｐＨ７．０に懸濁した。
９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ２）からのクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造 ６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注
し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後
別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカラ
イテスク製）、及び２００ｍＭ ＩＰＴＧ（日本精化
製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地で
あらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・
コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ２）（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３７５）の培養液６０ｍｌを接種し、３７℃で
２４時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンア
ミジノヒドロラーゼ活性は５．６Ｕ／ｍｌであった。上
記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ リン酸緩衝
液，ｐＨ７．０に懸濁した。
【００５２】上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕
し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を
硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア バ
イオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロー
スＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方
法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、こ
の時の比活性は１４．３Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであ
った。表３にこれまでの精製のまとめを示す。また表４
に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの理化学的性質を示す。
し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を
硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア バ
イオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロー
スＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方
法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、こ
の時の比活性は１４．３Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであ
った。表３にこれまでの精製のまとめを示す。また表４
に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの理化学的性質を示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
【表４】
【００５５】実施例６ エシェリヒア・コリーＪＭ１０
９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ３）からのクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造 ６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注
し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後
別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカラ
イテスク製）、及び２００ｍＭ ＩＰＴＧ（日本精化
製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地で
あらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・
コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ３）（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３７６）の培養液６０ｍｌを接種し、３７℃で
２４時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンア
ミジノヒドロラーゼ活性は８．３Ｕ／ｍｌであった。上
記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ リン酸緩衝
液、ｐＨ７．０に懸濁した。
９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ３）からのクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造 ６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注
し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後
別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカラ
イテスク製）、及び２００ｍＭ ＩＰＴＧ（日本精化
製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地で
あらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・
コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ３）（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３７６）の培養液６０ｍｌを接種し、３７℃で
２４時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンア
ミジノヒドロラーゼ活性は８．３Ｕ／ｍｌであった。上
記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ リン酸緩衝
液、ｐＨ７．０に懸濁した。
【００５６】上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕
し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を
硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア バ
イオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロー
スＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方
法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、こ
の時の比活性は１４．８Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであ
った。表５にこれまでの精製のまとめを示す。また表６
に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの理化学的性質を示す。
し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を
硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア バ
イオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロー
スＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク）カラムクロマ
トグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方
法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、こ
の時の比活性は１４．８Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであ
った。表５にこれまでの精製のまとめを示す。また表６
に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの理化学的性質を示す。
【００５７】
【表５】
【００５８】
【表６】
【００５９】下記表７に本発明の新規なクレアチンアミ
ジノヒドロラーゼと野生型クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼのクレアチンに対するＫｍ値をまとめた。表７から
も明らかなように本発明の新規なクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼが野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに
比べて、Ｋｍ値が低下したことが判る。
ジノヒドロラーゼと野生型クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼのクレアチンに対するＫｍ値をまとめた。表７から
も明らかなように本発明の新規なクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼが野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに
比べて、Ｋｍ値が低下したことが判る。
【００６０】
【表７】
【００６１】実施例７ 実施例５にて調製した精製クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼと野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼを用い
て、下記組成を有するクレアチニン測定用試液を調製
し、クレアチンアミジノヒドロラーゼのクレアチニン測
定用試液での必要量を比較した。 実施例５のクレアチンアミジノヒドロラーゼ ２０，４０，６０Ｕ／ｍｌ または野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼ クレアチニンアミドヒドロラーゼ １５０Ｕ／ｍｌ ザルコシンオキシダーゼ ７Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ３ＰＵ／ｍｌ ＭＯＰＳバッファー ０．１Ｍ、ｐＨ８．０ トリトンＸ−１００ ０．１％ ４−アミノアンチピリン ０．１５ｍＭ ＴＯＯＳ（アニリン誘導体） ０．２ｍＭ
ーゼと野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼを用い
て、下記組成を有するクレアチニン測定用試液を調製
し、クレアチンアミジノヒドロラーゼのクレアチニン測
定用試液での必要量を比較した。 実施例５のクレアチンアミジノヒドロラーゼ ２０，４０，６０Ｕ／ｍｌ または野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼ クレアチニンアミドヒドロラーゼ １５０Ｕ／ｍｌ ザルコシンオキシダーゼ ７Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ３ＰＵ／ｍｌ ＭＯＰＳバッファー ０．１Ｍ、ｐＨ８．０ トリトンＸ−１００ ０．１％ ４−アミノアンチピリン ０．１５ｍＭ ＴＯＯＳ（アニリン誘導体） ０．２ｍＭ
【００６２】クレアチニン１００ｍｇ／ｄｌを含有する
試料６０μｌに、上記試液３ｍｌを添加し、吸光度変化
を３７℃、波長５４６ｎｍで測定した。その測定結果
（タイムコース）を図２に示す。図中、Ｗｉｌｄは野性
型クレアチンアミジノヒドロラーゼを示し、ｐＣＲＨ２
７３Ｍ２は本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼを
示す。図２から明らかなように、５分間で測定反応を終
結させるとすると、本発明のクレアチンアミジノヒドロ
ラーゼは野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べ
て、少ない酵素量（約１／３量）で測定が可能であっ
た。また、測定後半の反応性、つまり試料中のクレアチ
ニン量が少なくなった時の反応性が良好であることが確
認された。
試料６０μｌに、上記試液３ｍｌを添加し、吸光度変化
を３７℃、波長５４６ｎｍで測定した。その測定結果
（タイムコース）を図２に示す。図中、Ｗｉｌｄは野性
型クレアチンアミジノヒドロラーゼを示し、ｐＣＲＨ２
７３Ｍ２は本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼを
示す。図２から明らかなように、５分間で測定反応を終
結させるとすると、本発明のクレアチンアミジノヒドロ
ラーゼは野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べ
て、少ない酵素量（約１／３量）で測定が可能であっ
た。また、測定後半の反応性、つまり試料中のクレアチ
ニン量が少なくなった時の反応性が良好であることが確
認された。
【００６３】
【発明の効果】本発明により診断薬用酵素として有用
な、Ｋｍ値の小さい新規クレアチンアミジノヒドロラー
ゼを創出し、工業的に大量に該クレアチンアミジノヒド
ロラーゼを生産できる。
な、Ｋｍ値の小さい新規クレアチンアミジノヒドロラー
ゼを創出し、工業的に大量に該クレアチンアミジノヒド
ロラーゼを生産できる。
【００６４】
配列番号：１ 配列の長さ：４０４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：アルカリゲネス・フェカリス 株名：ＴＥ３５８１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２３７） 配列の情報：クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有
する蛋白質 配列 Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Asn Asp 20 25 30 Val Arg Gly Trp Met Ala Lys Asn Asn Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr 35 40 45 Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu Tyr Cys Tyr Phe 50 55 60 Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp His Asn Asn Ala Thr Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp 85 90 95 Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Arg Ala Val 100 105 110 Arg Gln Leu Thr Thr Gly Ala Lys Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His 115 120 125 Val Asn Leu Asp Phe Arg Arg Gln Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val 130 135 140 Glu Phe Val Asp Ile Ser Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Ile Lys 145 150 155 160 Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Val Cys Asp 165 170 175 Val Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gly Val Pro Glu 180 185 190 His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Ile Arg Glu Ile Ala 195 200 205 Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln 210 215 220 Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile 225 230 235 240 Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe 245 250 255 Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp 260 265 270 Asp Ala Ser Leu Asp Ile Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg 275 280 285 Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile 290 295 300 Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser 305 310 315 320 Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Cys His Tyr Tyr Gly Arg 325 330 335 Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Glu Leu Lys Pro 340 345 350 Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Met 355 360 365 Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu 370 375 380 Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn 385 390 395 400 Ile Ile Arg Asn 404
する蛋白質 配列 Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Asn Asp 20 25 30 Val Arg Gly Trp Met Ala Lys Asn Asn Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr 35 40 45 Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu Tyr Cys Tyr Phe 50 55 60 Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp His Asn Asn Ala Thr Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp 85 90 95 Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Arg Ala Val 100 105 110 Arg Gln Leu Thr Thr Gly Ala Lys Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His 115 120 125 Val Asn Leu Asp Phe Arg Arg Gln Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val 130 135 140 Glu Phe Val Asp Ile Ser Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Ile Lys 145 150 155 160 Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Val Cys Asp 165 170 175 Val Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gly Val Pro Glu 180 185 190 His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Ile Arg Glu Ile Ala 195 200 205 Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln 210 215 220 Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile 225 230 235 240 Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe 245 250 255 Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp 260 265 270 Asp Ala Ser Leu Asp Ile Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg 275 280 285 Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile 290 295 300 Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser 305 310 315 320 Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Cys His Tyr Tyr Gly Arg 325 330 335 Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Glu Leu Lys Pro 340 345 350 Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Met 355 360 365 Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu 370 375 380 Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn 385 390 395 400 Ile Ile Arg Asn 404
【００６５】配列番号：２ 配列の長さ：１２１２ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アルカリゲネス・フェカリス 株名：ＴＥ３５８１（微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ１４
２３７） 配列 ATG ACT GAC GAC ATG TTG CAC GTG ATG AAA TGG CAC AAC GGC GAG AAA 48 Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys 1 5 10 15 GAT TAT TCG CCG TTT TCG GAT GCC GAG ATG ACC CGC CGC CAA AAC GAC 96 Asp Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Asn Asp 20 25 30 GTT CGC GGC TGG ATG GCC AAG AAC AAT GTC GAT GCG GCG CTG TTC ACC 144 Val Arg Gly Trp Met Ala Lys Asn Asn Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr 35 40 45 TCT TAT CAC TGC ATC AAC TAC TAT TCC GGC TGG CTG TAC TGC TAT TTC 192 Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu Tyr Cys Tyr Phe 50 55 60 GGA CGC AAG TAC GGC ATG GTC ATC GAC CAC AAC AAC GCC ACG ACG ATT 240 Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp His Asn Asn Ala Thr Thr Ile 65 70 75 80 TCG GCC GGC ATC GAC GGC GGC CAG CCC TGG CGC CGC AGC TTC GGC GAC 288 Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp 85 90 95 AAC ATC ACC TAC ACC GAC TGG CGC CGC GAC AAT TTC TAT CGC GCC GTG 336 Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Arg Ala Val 100 105 110 CGC CAG CTG ACC ACG GGC GCC AAG CGC ATC GGC ATC GAG TTC GAC CAC 384 Arg Gln Leu Thr Thr Gly Ala Lys Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His 115 120 125 GTC AAT CTC GAC TTC CGC CGC CAG CTC GAG GAA GCC CTA CCG GGC GTC 432 Val Asn Leu Asp Phe Arg Arg Gln Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val 130 135 140 GAC TTC GTC GAC ATC AGC CAG CCC TCG ATG TGG ATG CGC ACC ATC AAG 480 Glu Phe Val Asp Ile Ser Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Ile Lys 145 150 155 160 TCG CTC GAA GAG CAG AAG CTG ATC CGC GAA GGC GCC CGC GTG TGT GAC 528 Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Val Cys Asp 165 170 175 GTC GGC GGC GCG GCC TGC GCG GCT GCC ATC AAG GCC GGC GTG CCC GAG 576 Val Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gly Val Pro Glu 180 185 190 CAT GAA GTG GCG ATC GCC ACC ACC AAT GCG ATG ATC CGC GAG ATC GCC 624 His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Ile Arg Glu Ile Ala 195 200 205 AAA TCG TTC CCC TTC GTG GAG CTG ATG GAC ACC TGG ACC TGG TTC CAG 672 Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln 210 215 220 TCG GGC ATC AAC ACC GAC GGC GCG CAC AAT CCG GTC ACC AAC CGC ATC 720 Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile 225 230 235 240 GTG CAA TCC GGC GAC ATC CTT TCG CTC AAC ACC TTC CCG ATG ATC TTC 768 Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe 245 250 255 GGC TAC TAC ACC GCG CTG GAG CGC ACG CTG TTC TGC GAC CAT GTC GAT 816 Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp 260 265 270 GAC GCC AGC CTC GAC ATC TGG GAG AAG AAC GTG GCC GTG CAT CGC CGC 864 Asp Ala Ser Leu Asp Ile Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg 275 280 285 GGG CTC GAG CTG ATC AAG CCG GGC GCG CGC TGC AAG GAC ATC GCC ATC 912 Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile 290 295 300 GAG CTC AAC GAG ATG TAC CGC GAG TGG GAC CTG CTG AAG TAC CGC TCC 960 Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser 305 310 315 320 TTC GGC TAT GGC CAC TCC TTC GGC GTG CTG TGC CAC TAC TAC GGT CGC 1008 Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Cys His Tyr Tyr Gly Arg 325 330 335 GAG GCC GGC GTG GAG CTG CGC GAG GAC ATC GAC ACC GAG CTG AAG CCC 1056 Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Glu Leu Lys Pro 340 345 350 GGC ATG GTG GTC TCC ATG GAG CCG ATG GTG ATG CTG CCG GAG GGC ATG 1104 Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Met 355 360 365 CCC GGT GCC GGC GGC TAT CGC GAG CAC GAC ATC CTG ATC GTC GGG GAG 1152 Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu 370 375 380 GAC GGT GCC GAG AAC ATC ACC GGC TTC CCG TTC GGT CCG GAA CAC AAC 1200 Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn 385 390 395 400 ATC ATC CGC AAC 1212 Ile Ile Arg Asn 404
２３７） 配列 ATG ACT GAC GAC ATG TTG CAC GTG ATG AAA TGG CAC AAC GGC GAG AAA 48 Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys 1 5 10 15 GAT TAT TCG CCG TTT TCG GAT GCC GAG ATG ACC CGC CGC CAA AAC GAC 96 Asp Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Asn Asp 20 25 30 GTT CGC GGC TGG ATG GCC AAG AAC AAT GTC GAT GCG GCG CTG TTC ACC 144 Val Arg Gly Trp Met Ala Lys Asn Asn Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr 35 40 45 TCT TAT CAC TGC ATC AAC TAC TAT TCC GGC TGG CTG TAC TGC TAT TTC 192 Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu Tyr Cys Tyr Phe 50 55 60 GGA CGC AAG TAC GGC ATG GTC ATC GAC CAC AAC AAC GCC ACG ACG ATT 240 Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp His Asn Asn Ala Thr Thr Ile 65 70 75 80 TCG GCC GGC ATC GAC GGC GGC CAG CCC TGG CGC CGC AGC TTC GGC GAC 288 Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp 85 90 95 AAC ATC ACC TAC ACC GAC TGG CGC CGC GAC AAT TTC TAT CGC GCC GTG 336 Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Arg Ala Val 100 105 110 CGC CAG CTG ACC ACG GGC GCC AAG CGC ATC GGC ATC GAG TTC GAC CAC 384 Arg Gln Leu Thr Thr Gly Ala Lys Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His 115 120 125 GTC AAT CTC GAC TTC CGC CGC CAG CTC GAG GAA GCC CTA CCG GGC GTC 432 Val Asn Leu Asp Phe Arg Arg Gln Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val 130 135 140 GAC TTC GTC GAC ATC AGC CAG CCC TCG ATG TGG ATG CGC ACC ATC AAG 480 Glu Phe Val Asp Ile Ser Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Ile Lys 145 150 155 160 TCG CTC GAA GAG CAG AAG CTG ATC CGC GAA GGC GCC CGC GTG TGT GAC 528 Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Val Cys Asp 165 170 175 GTC GGC GGC GCG GCC TGC GCG GCT GCC ATC AAG GCC GGC GTG CCC GAG 576 Val Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ile Lys Ala Gly Val Pro Glu 180 185 190 CAT GAA GTG GCG ATC GCC ACC ACC AAT GCG ATG ATC CGC GAG ATC GCC 624 His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Ile Arg Glu Ile Ala 195 200 205 AAA TCG TTC CCC TTC GTG GAG CTG ATG GAC ACC TGG ACC TGG TTC CAG 672 Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln 210 215 220 TCG GGC ATC AAC ACC GAC GGC GCG CAC AAT CCG GTC ACC AAC CGC ATC 720 Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile 225 230 235 240 GTG CAA TCC GGC GAC ATC CTT TCG CTC AAC ACC TTC CCG ATG ATC TTC 768 Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe 245 250 255 GGC TAC TAC ACC GCG CTG GAG CGC ACG CTG TTC TGC GAC CAT GTC GAT 816 Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp 260 265 270 GAC GCC AGC CTC GAC ATC TGG GAG AAG AAC GTG GCC GTG CAT CGC CGC 864 Asp Ala Ser Leu Asp Ile Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg 275 280 285 GGG CTC GAG CTG ATC AAG CCG GGC GCG CGC TGC AAG GAC ATC GCC ATC 912 Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile 290 295 300 GAG CTC AAC GAG ATG TAC CGC GAG TGG GAC CTG CTG AAG TAC CGC TCC 960 Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser 305 310 315 320 TTC GGC TAT GGC CAC TCC TTC GGC GTG CTG TGC CAC TAC TAC GGT CGC 1008 Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Cys His Tyr Tyr Gly Arg 325 330 335 GAG GCC GGC GTG GAG CTG CGC GAG GAC ATC GAC ACC GAG CTG AAG CCC 1056 Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Glu Leu Lys Pro 340 345 350 GGC ATG GTG GTC TCC ATG GAG CCG ATG GTG ATG CTG CCG GAG GGC ATG 1104 Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Met 355 360 365 CCC GGT GCC GGC GGC TAT CGC GAG CAC GAC ATC CTG ATC GTC GGG GAG 1152 Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu 370 375 380 GAC GGT GCC GAG AAC ATC ACC GGC TTC CCG TTC GGT CCG GAA CAC AAC 1200 Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn 385 390 395 400 ATC ATC CGC AAC 1212 Ile Ile Arg Asn 404
【００６６】配列番号：３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAACATGTCG TCAGTCATAT GTGTTTCCTG TGTGAAATT 39
【図１】組換えプラスミドｐＣＲＨ２７３を示す図面で
ある。
ある。
【図２】本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼおよ
び野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼを使用して、
試料中のクレアチニンを測定した場合の測定結果（タイ
ムコース）を示す図面である。
び野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼを使用して、
試料中のクレアチニンを測定した場合の測定結果（タイ
ムコース）を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/78 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 下記理化学的性質を有する新規なクレア
チンアミジノヒドロラーゼ。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５ - 【請求項２】 下記理化学的性質を有する新規なクレア
チンアミジノヒドロラーゼ。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約４．５±１．０ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５ - 【請求項３】 下記理化学的性質を有する新規なクレア
チンアミジノヒドロラーゼ。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約６．５±１．０ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５ - 【請求項４】 下記理化学的性質を有する新規なクレア
チンアミジノヒドロラーゼ。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約９．０±１．０ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５ - 【請求項５】 下記理化学的性質を有する新規なクレア
チンアミジノヒドロラーゼを生産する微生物を栄養培地
にて培養し、新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを
採取することを特徴とする新規なクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼの製造法。 作用：クレアチン ＋ Ｈ2 Ｏ → ザルコシン ＋
尿素 至適温度：約４０℃〜５０℃ 至適ｐＨ：約８．０〜９．０ 熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間） ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役
酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対する
Ｋｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ 分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 等電点：約３．５ - 【請求項６】 請求項１記載の新規なクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化
水素検出用組成物を含有することを特徴とする試料中の
クレアチン定量用試薬。 - 【請求項７】 クレアチニンアミドヒドロラーゼ、請求
項１記載の新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザ
ルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を
含有することを特徴とする試料中のクレアチニン定量用
試薬。
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