KR20040004555A

KR20040004555A - 글루코오스 탈수소효소

Info

Publication number: KR20040004555A
Application number: KR10-2003-7011848A
Authority: KR
Inventors: 고지 소데; 이가라시사또시
Original assignee: 고지 소데
Priority date: 2001-03-13
Filing date: 2002-03-07
Publication date: 2004-01-13
Also published as: US20040191883A1; WO2002072839A1; CN1501977A; US7244600B2; EP1369485A4; CA2440576A1; EP1369485A1; JPWO2002072839A1; CN1306034C; IL157829A0

Abstract

2 개의 서브 유닛이 이황화 결합을 통하여 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 수용성 PQQGDH 가 개시된다. 본 발명의 수용성 PQQGDH 는 개량된 열안정성을 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

글루코오스 탈수소효소 {GLUCOSE DEHYDROGENASE}

혈중 글루코오스 농도는 당뇨병의 중요한 마커이다. 또, 미생물을 사용하는 발효 생산에서는 프로세스를 모니터링하기 위해 글루코오스 농도를 정량한다. 종래, 글루코오스는 글루코오스옥시다아제 (GOD) 또는 글루코오스 6인산 탈수소효소 (G6PDH) 를 사용하는 효소법에 의해 정량되었다. 그러나, GOD 를 사용하는 방법에서는 글루코오스 산화반응에 수반하여 발생되는 과산화수소를 정량하기 위해 카탈라아제 또는 퍼옥시다아제를 분석계에 첨가할 필요가 있었다. G6PDH 는 분광학적 수법에 기초하는 글루코오스 정량에 사용되어 왔는데, 반응계에 조효소인 NAD(P) 를 첨가해야 한다.

이로 인해, 지금까지의 글루코오스 효소 정량 방법에 사용되어 온 GOD 또는 G6PDH 를 대신하는 새로운 효소로서 PQQGDH 의 사용이 시도되고 있다 (일본 공개특허공보 평10-243786, WO00/66744, WO00/61730). PQQGDH 는 글루코오스에 대해 높은 산화 활성을 갖고 있는 점, 및 PQQGDH 는 조효소 결합형 효소이기 때문에 전자 수용체로서 산소를 필요로 하지 않는 점에서 글루코오스 센서의 인식 소자로서유용하다.

PQQGDH 는 글루코오스를 산화시켜 글루코노락톤을 생성하는 반응을 촉매한다. PQQGDH 에는 막결합성 효소와 수용성 효소가 있다. 막결합성 PQQGDH 는 분자량 약 87kDa 의 단일 펩티드 단백질로서 다양한 그람 음성균에서 널리 발견되고 있다. 수용성 PQQGDH 는 아키네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 의 몇가지 주 (株) 에서 그 존재가 확인되고 있고 (Biosci. Biotech. Biochem. (1995), 59 (8), 1548-1555), 그 구조 유전자가 클로닝되어 아미노산 서열이 밝혀지고 있다 (Mol. Gen. Genet. (1989), 217:430-436). 아키네토박터 칼코아세티쿠스 (A. calcoaceticus) 유래의 수용성 PQQGDH 는 동일한 50kDa 의 서브 유닛으로 구성되는 동종 이량체 효소이다. 각 서브 유닛은 1 분자의 PQQ 및 3 개의 Ca⁺⁺를 함유한다. 이량체 단백질은 2 개의 활성 중심을 갖지만, 단량체 효소는 GDH 활성을 나타내지 않는다. 따라서, GDH 활성을 나타내기 위해서는 이량체 구조가 형성되는 것이 필수이다. 또, 수용성 PQQGDH 의 X선 결정 구조 해석이 실시되어 동일 효소의 고차 구조가 밝혀지고 있다 (J. Mol. Biol., 289, 319-333 (1999), A. Oubrie 등, EMBO Journal, 18 (19) 5187-5194 (1999), A. Oubrie 등, PNAS, 96 (21), 11787-11791 (1999), A. Oubrie 등).

본 발명은 개량된 열안정성을 갖는 개변형 수용성 PQQGDH 를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 피롤로퀴놀린퀴논을 조효소로 하는 글루코오스 탈수소효소 (PQQGDH) 의 제조 및, 글루코오스의 정량에서의 그 사용에 관한 것이다.

도 1 은 본 발명에서 사용된 플라스미드 pGB2 의 구조를 나타낸다.

도 2 는 본 발명의 개변형 효소를 코드하는 구조 유전자를 제조하는 방법을 나타낸다.

도 3 은 본 발명의 개변형 효소의 열안정성을 나타낸다.

도 4 는 본 발명의 개변형 효소의 열안정성을 나타낸다.

도 5 는 본 발명의 개변형 PQQGDH 를 사용하는 글루코오스의 분석을 나타낸다.

도 6 은 본 발명의 개변형 효소의 열안정성을 나타낸다.

도 7 은 본 발명의 개변형 효소의 열안정성을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

개변형 PQQGDH 의 구조

본 발명의 PQQGDH 는 동종 이량체 구조에서 2 개의 서브 유닛이 1 또는 그 이상의 이황화 결합을 통하여 연결되어 있고, 이로 인해 높은 열안정성을 나타내는것을 특징으로 한다. 이와 같은 연결 구조는 이량체 구조의 각 단량체 계면에서 서로 근접하는 위치에 배치되는 1 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환하여 서브 유닛간에 이황화 결합을 형성시킴으로써 구축할 수 있다.

수용성 PQQGDH 는 서열번호 1 로 규정되는 아미노산 서열을 갖고, X선 결정구조 해석에 기초하여 그 고차 구조가 밝혀지고 있다 (J. Mol. Biol., 289, 319-333 (1999), EMBO Journal, 18 (19) 5187-5194 (1999)). 이 추정 고차 구조에 따르면, 이량체 효소가 구축되었을 때 양쪽 단량체 상의 Ser415 가 단량체 계면 상에서 서로 근접하는 위치에 배치된다. Ser415 를 Cys 로 치환하여 단량체간에 이황화 결합을 형성시킨 바, 야생형과 비교하여 매우 높은 열안정성을 갖는 개변형 효소를 얻을 수 있었다.

이것은 이황화 결합의 형성에 의해 수용성 PQQGDH 이량체의 4 차 구조의 안정성이 증대하였기 때문으로 생각된다. 이것은 가교 화학 수식 (일본 공개특허공보 2000-262281) 또는 테더 구조의 구축 (일본 공개특허공보 2001-37483) 을 이용하여 이량체 구조를 안정화시킴으로써 PQQGDH 의 열안정성이 증대한다는 지금까지의 지견과도 일치한다.

또한 본 발명에서는 PQQGDH-B 의 이량체 계면에서 대향하는 위치에 있고, 또한 그것들의 측쇄간 거리가 짧은 Asn340 및 Tyr418 을 양쪽 모두 Cys 로 치환하여 단량체간에 2 개소의 이황화 결합을 형성시킴으로써 야생형과 비교하여 매우 높은 열안정성을 갖는 개변형 효소를 얻을 수 있었다.

당업자는 본 발명의 교시 및 효소의 추정 고차 구조에 관한 정보에 기초하여이량체 구조에서 각 단량체 계면에서 서로 근접하는 위치에 배치되는 아미노산 잔기를 예측하고, 이 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 열안정성이 향상된 개변형 글루코오스 탈수소효소를 얻을 수 있다. 치환해야 하는 아미노산 잔기는 각 단량체의 동일한 위치에 존재하지 않아도 된다. 즉, 각 단량체 계면에서 한쪽 단량체 상의 제 1 아미노산 잔기와 다른쪽 단량체 상의 제 2 아미노산 잔기가 근접하는 위치에 배치되는 경우, 이들 제 1 및 제 2 아미노산 잔기를 모두 시스테인 잔기로 치환할 수 있다. 이 경우에는 2 개소에서 이황화 결합이 형성된다. 동일하게 하여 3 개소 이상의 이황화 결합을 갖는 이량체 구조를 구축할 수도 있다.

본 발명의 개변형 글루코오스 탈수소효소에서는 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖는 한, 또한 다른 아미노산 잔기의 일부가 결실 또는 치환되어 있어도 되고, 또 다른 아미노산 잔기가 부가되어 있어도 된다. 그와 같은 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가를 위한 다양한 방법이 해당 기술분야에서 알려져 있고, 예컨대 [Sambrook 외, “Molecular Cloning; A Laboratory Manual”, 제 2 판, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York] 에 기재되어 있다. 당업자는 본 명세서의 교시에 따라, 그와 같은 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가를 포함하는 글루코오스 탈수소효소가 원하는 글루코오스 탈수소효소 활성을 갖고 있는지의 여부를 용이하게 시험할 수 있다. 예컨대 수용성 PQQGDH 의 특정 위치의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써 기질인 글루코오스에 대한 친화성을 개량시킬 수 있음이 보고되어 있다 (일본 공개특허공보 2000-31258, 일본 공개특허공보 2000-350588).

또한, 당업자는 다른 생물에 유래하는 수용성 PQQGDH 에 대해서도 그 3 차원구조를 예측하여 해석함으로써, 본 발명의 교시에 따라 2 개의 단량체 계면에 위치하는 아미노산 잔기를 예측하고, 이들 잔기를 시스테인 잔기로 치환하여 이황화 결합을 형성시킴으로써 열안정성이 향상된 개변형 글루코오스 탈수소효소를 얻을 수 있다. 특히, 단백질의 1 차 구조, 2 차 구조 또는 3 차 구조를 비교함으로써 아키네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 유래의 수용성 PQQGDH 의 415 번째 세린 잔기 또는 414 번째 티로신 잔기에 상당하는 아미노산 잔기, 또는 340 번째 아스파라긴산 잔기 및 418 번째 티로신 잔기의 조합에 상당하는 아미노산 잔기의 조합을 용이하게 이해할 수 있고, 본 발명에 따라 이러한 잔기를 시스테인 잔기로 치환하여 개변형 글루코오스 탈수소효소를 얻을 수 있다. 이들 개변형 글루코오스 탈수소효소도 본 발명의 범위내이다.

개변형 PQQGDH 의 제조방법

아키네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 유래의 천연 수용성 PQQGDH 를 코드하는 유전자의 서열은 서열번호 2 로 규정된다.

본 발명의 개변형 PQQGDH 를 코드하는 유전자는 천연 수용성 PQQGDH 를 코드하는 유전자에서, 목적으로 하는 아미노산 잔기를 코드하는 염기서열을, 시스테인 잔기를 코드하는 염기서열로 치환함으로써 구축할 수 있다. 이와 같은 부위 특이적 염기서열 치환을 위한 다양한 방법이 해당 기술분야에서 알려져 있고, 예컨대 [Sambrook 외, “Molecular Cloning; A Laboratory Manual”, 제 2 판, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York] 에 기재되어 있다. 이와 같이 하여 얻은 변이 유전자를 유전자 발현용 벡터 (예컨대 플라스미드) 에 삽입하고, 이것을 적당한 숙주 (예컨대 대장균) 로 형질전환한다. 외래성 단백질을 발현시키기 위한 많은 벡터ㆍ숙주계가 해당 기술분야에서 알려져 있고, 숙주로는 예컨대 세균, 효모, 배양 세포 등 다양한 것을 사용할 수 있다.

수용성 PQQGDH 는 대장균에서 발현시켰을 때 주변세포질 (periplasm) 공간에 분비되기 때문에 균체 자체를 사용하여 용이하게 효소 활성을 검정할 수 있다. 얻어진 형질전환체를 60∼70℃ 에서 약 30 분 동안 처리한 후, 글루코오스 및 색소로서 PMS-DCIP 를 첨가하여 잔존하는 PQQGDH 의 활성을 육안에 의해 판정하고, 열처리에 의해서도 잔존 활성을 나타내는 클론을 선택하여 유전자 서열을 해석하여 그 변이를 확인한다.

상기 서술한 바와 같이 얻어진 개변형 PQQGDH 를 발현시키는 형질전환체를 배양하고, 배양액으로부터 원심분리 등에 의해 균체를 회수한 후, 균체를 프렌치 프레스 등에 의해 파쇄하거나, 또는 삼투압 쇼크에 의해 주변세포질 효소를 배지중에 방출시킨다. 이것을 초원심분리하여 PQQGDH 를 함유하는 수용성 분획을 얻을 수 있다. 또는 적당한 숙주 벡터계를 사용함으로써 발현된 PQQGDH 를 배양액 중에 분비시킬 수도 있다. 얻어진 수용성 분획을 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, HPLC 등에 의해 정제함으로써 본 발명의 개변형 PQQGDH 를 조제한다.

효소 활성의 측정방법

본 발명의 PQQGDH 는 PQQ 를 조효소로서 글루코오스를 산화시켜 글루코노락톤을 생성하는 반응을 촉매하는 작용을 갖는다.

효소 활성의 측정은 PQQGDH 에 의한 글루코오스의 산화에 따라 환원되는 PQQ 의 양을 산화 환원 색소의 정색 (呈色) 반응에 의해 정량할 수 있다. 정색 시약으로는 예컨대 PMS (페나딘메토설페이트)-DCIP (2,6-디클로로페놀인도페놀), 페리시안화칼륨, 페로센 등을 사용할 수 있다.

열안정성

본 발명의 개변형 PQQGDH 의 열안정성은 효소를 고온 (예컨대 55℃) 에서 인큐베이트하고, 일정한 시간마다 분취량을 취하여 효소 활성을 측정하고, 시간 경과에 따른 효소 활성의 저하를 모니터함으로써 평가할 수 있다. 전형적으로는 효소의 열안정성은 열 실활 반감기, 즉 효소 활성이 50% 로 감소하기까지 필요로 하는 시간 (t_1/2) 을 지표로 나타낸다. 또는, 열안정성은 효소를 소정 온도에서 소정 시간 처리한 후의 효소 활성의 잔존율 (열처리전의 활성에 대한 열처리후의 활성 비) 로 나타낼 수 있다.

본 발명의 개변형 PQQGDH 는 야생형 PQQGDH 와 비교하여 높은 열안정성을 갖는 것을 특징으로 한다. 이로써, 효소 생산에서 조제/정제시의 실활이 적어 수율이 높은 점, 용액 중에서의 안정성이 높아 효소의 보존이 용이한 점, 본 효소를 사용하여 분석 키트 또는 효소 센서를 제조하는 과정에서 실활이 적고, 본 효소를 사용하여 제조된 분석 키트 또는 효소 센서의 열안정성이 높은 점에서 보존성 등이 우수하다는 이점을 갖는다.

글루코오스 분석 키트

본 발명은 또, 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 를 함유하는 글루코오스 분석 키트를 특징으로 한다. 본 발명의 글루코오스 분석 키트는 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 를 적어도 1 회의 분석에 충분한 양으로 함유한다. 전형적으로는 키트는 본 발명의 개변형 PQQGDH 에 추가하여 분석에 필요한 완충액, 메디에이터, 보정 곡선 제작을 위한 글루코오스 표준 용액, 그리고 사용 지침을 포함한다. 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 는 다양한 형태로서, 예컨대 동결 건조된 시약으로서 또는 적절한 보존 용액 중의 용액으로서 제공할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 개변형 PQQGDH 는 홀로화된 형태로 제공되지만, 아포 효소의 형태로 제공하여 사용시에 홀로화시킬 수도 있다.

글루코오스 센서

본 발명은 또, 본 발명에 따른 개변형 PQQGDH 를 사용하는 글루코오스 센서를 특징으로 한다. 전극으로는 카본 전극, 금 전극, 백금 전극 등을 사용하고 이 전극 상에 본 발명의 효소를 고정화시킨다. 고정화 방법으로는 가교 시약을 사용하는 방법, 고분자 매트릭스 중에 봉입하는 방법, 투석막으로 피복하는 방법, 광가교성 폴리머, 도전성 폴리머, 산화 환원 폴리머 등이 있거나, 또는 페로센 또는 그 유전체로 대표되는 전자 메디에이터와 함께 폴리머 중에 고정 또는 전극 상에 흡착 고정시켜도 되고, 또 이들을 조합하여 사용해도 된다. 바람직하게는 본 발명의 개변형 PQQGDH 는 홀로화된 형태로 전극 상에 고정화되는데, 아포 효소의 형태로 고정화시켜 PQQ 를 다른 층으로 또는 용액 중에서 제공할 수도 있다.전형적으로는 글루타르알데히드를 사용하여 본 발명의 개변형 PQQGDH 를 카본 전극 상에 고정화시킨 후, 아민기를 갖는 시약으로 처리하여 글루타르알데히드를 블로킹한다.

글루코오스 농도의 측정은 이하와 같이 하여 실시할 수 있다. 항온 셀에 완충액을 넣고 PQQ 및 CaCl₂, 및 메디에이터를 첨가하여 일정 온도로 유지한다. 메디에이터로는 페리시안화칼륨, 페나딘메토설페이트 등을 사용할 수 있다. 작용 전극으로서 본 발명의 개변형 PQQGDH 를 고정화시킨 전극을 사용하고, 대극 (예컨대 백금 전극) 및 참조 전극 (예컨대 Ag/AgCl 전극) 을 사용한다. 카본 전극에 일정한 전압을 인가하여 전류가 정상이 된 후, 글루코오스를 함유하는 시약을 첨가하여 전류의 증가를 측정한다. 표준 농도의 글루코오스 용액에 의해 제작한 보정 곡선에 따라 시료 중의 글루코오스 농도를 계산할 수 있다.

본 명세서에서 명시적으로 인용되는 모든 특허 및 참고문헌의 내용은 모두 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 한다. 또, 본 출원이 갖는 우선권 주장의 기초가 되는 출원인 일본 특허출원 제2001-70413호의 명세서에 기재된 내용은 모두 본 명세서의 일부로서 여기에 인용한다.

본 발명은 2 개의 서브 유닛이 1 또는 그 이상의 이황화 결합을 통하여 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 수용성 PQQGDH 를 제공한다.

본 명세서에서「PQQGDH」란, 피롤로퀴놀린퀴논을 조효소로 하는 글루코오스 탈수소효소를 의미한다. 또,「개변형 PQQGDH」란, 천연에 존재하는 글루코오스 탈수소효소의 구조의 일부가 화학적으로 개변되어 있는 PQQGDH 를 의미한다. 이러한 개변은, 예컨대 효소 단백질의 1 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 다른 천연의 또는 천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기로 치환함으로써, 또는 1 또는 그 이상의 아미노산을 결실시키거나 또는 부가함으로써 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서에서는 PQQGDH 의 아미노산 위치는 개시 메티오닌을 1 로서 번호를 매긴다. 따라서, 서열번호 1 에 나타내는 최초 아미노산 잔기 Asp 는 25 번째 아미노산 잔기이다.

본 명세서에서「이황화 결합」이란, -S-S- 결합을 의미한다. 또,「서브 유닛」이란, 이량체를 구성하는 각 단량체 서브 유닛을 말한다.

바람직하게는, 본 발명의 수용성 PQQGDH 는 천연에 존재하는 PQQGDH 의, 1 또는 그 이상의 시스테인 이외의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있다. 또 바람직하게는, 본 발명의 수용성 PQQGDH 는 아키네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 유래이다.

본 발명의 PQQGDH 의 특히 바람직한 양태에서는 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열의 415 번째 세린 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있고, 2 개의 서브 유닛 상의 각각의 시스테인 잔기간에 이황화 결합이 형성되어 있다.

또 다른 바람직한 양태에서는 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열의 414 번째 티로신 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있고, 2 개의 서브 유닛 상의 각각의 시스테인 잔기간에 이황화 결합이 형성되어 있다.

또 다른 바람직한 양태에서는 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열의 340 번째 아스파라긴산 잔기 및 418 번째 티로신 잔기가 양쪽 모두 시스테인 잔기로 치환되어 있고, 2 개의 서브 유닛 상의 각각의 시스테인 잔기간에 이황화 결합이 형성되어 있다.

본 발명의 PQQGDH 의 특히 바람직한 양태에서는, 본 발명의 PQQGDH 는 서열:

Pro Thr Tyr Cys Thr Thr Tyr

을 함유한다.

또 다른 바람직한 양태에서는 본 발명의 PQQGDH 는 서열:

Pro Thr Cys Cys Thr Thr Tyr

을 함유한다.

또 다른 바람직한 양태에서는 본 발명의 PQQGDH 는 서열:

Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro 및 Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala

을 함유한다.

본 발명은 또, 본 발명의 PQQGDH 를 코드하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 벡터 및 이 유전자를 함유하는 형질전환체, 그리고 본 발명의 PQQGDH 를 함유하는 글루코오스 분석 키트 및 글루코오스 센서를 제공한다.

본 발명의 개변형 PQQGDH 의 효소 단백질은 높은 열안정성을 갖고, 또한 글루코오스에 대해 높은 산화 활성을 갖고 있기 때문에 글루코오스의 고감도 그리고 고선택적인 측정에 응용할 수 있다. 특히, 효소 생산에서 조제/정제시의 실활이 적어 수율이 높은 점, 용액 중에서의 안정성이 높아 효소의 보존이 용이한 점, 본 효소를 사용하여 분석 키트 또는 효소 센서를 제조하는 과정에서 실활이 적고, 본 효소를 사용하여 제조된 분석 키트 또는 효소 센서의 열안정성이 높은 점에서 보존성이 우수하다는 이점이 기대된다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 실시예 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

개변형 PQQGDH 를 코드하는 유전자의 구축

서열번호 2 에 나타낸 아키네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 유래의 PQQGDH 의 구조 유전자를 기초로 통상의 방법에 따라 부위 특이적 변이법에 의해 아미노산 잔기를 치환하였다. 부위 특이적 변이는 벡터 pTrc99A (파마시아사 제조) 의 다중 클로닝 부위에 아키네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 유래의 PQQGDH 를 코드하는 구조 유전자를 삽입한 플라스미드 pGB2 (도 1) 를 사용하여 도 2 에 나타내는 방법에 의해 실시하였다. 변이에 사용된 합성 올리고뉴클레오티드 표적 프라이머의 서열을 이하에 나타낸다.

Ser415Cyscatcataagtagtgcaataagttggatc

Tyr414Cys/Ser415Cyscatcataagtagtgcaacaagttggatctaac

Asp167Glyaggtgatgatttctcatgctgtga

Ser231Lyscctttggaatttttccatcaagatttaagc

벡터 플라스미드 pKF18k (타카라슈조(주)) 에 아키네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 유래 PQQGDH 를 코드하는 유전자의 일부를 함유하는 KpnI-HindIII 단편을 삽입하여 이것을 주형으로 하였다. 이 주형 50fmol 과 타카라슈조(주) 제조 Mutan (등록상표)-Express Km 키트에 부속하는 선택 프라이머 5pmol, 인산화된 표적 프라이머 50pmol 을 전체 (20㎕) 의 1/10 량의 동일 키트의 어닐링 버퍼와 함께 혼합하여, 100℃, 3 분 동안의 열처리로 플라스미드를 변성시켜 1 개 사슬로 하였다. 선택 프라이머는 pKF18k 의 카나마이신 내성 유전자 상에 있는 이중 앰버 변이를 복귀시키기 위한 것이다. 이것을 5 분 동안 빙상에 두고 프라이머를 어닐링시켰다. 이것에 3㎕ 의 동일 키트 신장 버퍼, 1㎕ 의 T4 DNA 리가아제, 1㎕ 의 T4 DNA 중합효소 및 5㎕ 의 멸균수를 사용하여 상보쇄를 합성하였다.

이것을 DNA 의 불일치 (mismatch) 수복능 결손주인 대장균 (E.coli) BMH71-18 mutS 로 형질전환하여 밤새 진탕 배양하여 플라스미드를 증폭시켰다.

이어서, 여기에서 추출한 플라스미드를 대장균 MV1184 로 형질전환하고, 그 콜로니로부터 플라스미드를 추출하였다. 그리고 이들 플라스미드에 대해 염기서열 결정을 실시하여 목적으로 한 변이의 도입을 확인하였다. 이 단편을 플라스미드 pGB2 상의 야생형 PQQGDH 를 코드하는 유전자의 KpnI-HindIII 단편과 교체하여 개변형 PQQGDH 의 유전자를 구축하였다. 2 개소 이상에 변이를 도입하는 경우에는 상기 서술한 공정을 반복하였다. 이와 같이 하여 Ser415Cys, Tyr414Cys/Ser415Cys, 및 Asp167Gly/Ser231Lys/Ser415Cys 의 3 개의 변이체를 코드하는 유전자를 제조하였다.

실시예 2

개변형 효소의 조제

야생형 또는 개변형 PQQGDH 를 코드하는 유전자를 대장균용 발현 벡터인 pTrc99A (파마시아사) 의 다중 클로닝 사이트에 삽입하고, 구축된 플라스미드를 대장균 DH5α주로 형질전환하였다. 이것을 450㎖ 의 L 배지 (앰피실린 50㎍/㎖, 클로람페니콜 30㎍/㎖ 함유) 에서 사카구치 플라스크를 사용하여 37℃ 에서 밤새진탕 배양하여, 1mM CaCl₂, 500μM PQQ 를 함유하는 71 의 L 배지로 식균시켰다. 배양 개시 후 약 3 시간 동안 이소프로필티오갈락토시드를 최종 농도 0.3mM 이 되도록 첨가한 후 1.5 시간 배양하였다. 배양액으로부터 원심분리 (5000×g, 10 분, 4℃) 에 의해 균체를 회수하고, 이 균체를 0.85% NaCl 용액으로 2 회 세정하였다. 집균된 균체를 프렌치 프레스에 의해 파쇄하고 원심분리 (10000×g, 15 분, 4℃) 에 의해 미파쇄된 균체를 제거하였다. 상청을 초원심분리 (160500×g (40000r.p.m), 90 분, 4℃) 하여 수용성 분획을 얻었다.

이어서, 이렇게 얻은 수용성 분획을 10mM 인산 완충액 pH7.0 으로 밤새 투석하였다. 투석된 샘플을 10mM 인산 완충액 pH7.0 으로 평형화시킨 양이온 교환 크로마토그래피용 충전 컬럼 TSKgel CM-TOYOPEARL 650M (도소 주식회사) 에 흡착시켰다. 이 컬럼을 10mM 인산 완충액 pH7.0, 750㎖ 로 세정한 후, O-0.2M NaCl 를 함유하는 10mM 인산 완충액 pH7.0 을 사용하여 효소를 용출시켰다. 유속은 5㎖/분으로 실시하였다. GDH 활성을 갖는 분획을 회수하여 10mM MOPS-NaOH 완충액 (pH7.0) 으로 밤새 투석하였다. 이렇게 하여 전기 영동적으로 균일한 개변형 PQQGDH 단백질을 얻었다. 이것을 정제 효소 표품으로서 이하의 실시예에서 사용하였다.

실시예 3

이황화 결합 형성의 확인

실시예 2 에서 얻어진 Ser415Cys 개변형 효소를 메르캅토에탄올의 비존재하에서 열변성 처리하여 SDS-PAGE 분석을 실시한 바, 100kDa 에 주밴드, 및 50kDa 에 미량의 밴드가 확인되었다. 이것에 의해, 서브 유닛간에 디술피드가 형성되어 있음이 확인되었다.

실시예 4

효소 활성의 측정

효소 활성의 측정은 10mM MOPS-NaOH 완충액 (pH7.0) 중에서 PMS (페나딘메토설페이트)-DCIP (2,6-디클로로페놀인도페놀) 을 사용하고, DCIP 의 600㎚ 의 흡광도 변화를 분광 광도계를 사용하여 추적하고, 그 흡광도의 감소 속도를 효소의 반응 속도로 하였다. 이 때, 1 분 동안 1μ㏖ 의 DCIP 가 환원되는 효소 활성을 1 유닛으로 하였다. 또, DCIP 의 pH7.0 에서의 몰흡광계수는 16.3mM^-1로 하였다.

실시예 5

열안정성의 평가

실시예 2 에서 얻어진 야생형 효소 및 각 개변형 효소를 1μM PQQ, 1mM CaCl₂존재하에서 1 시간 이상 홀로화시킨 후, 55℃ 에서 인큐베이트하였다. 일정한 시간마다 분취량을 취하여 빙상에서 급랭시켰다. 이들 샘플의 효소 활성을 실시예 4 의 방법에 따라 측정하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다.

Ser415Cys 개변형 효소 및 Asp167Gly/Ser231Lys/Ser415Cys 개변형 효소는 모두 야생형 효소와 비교하여 55℃ 에서의 활성 저하가 매우 적었다.Ser415Cys/Tyr414Cys 개변형 효소는 55℃ 에서의 열처리에 의해 10 분 동안 초기 활성의 50% 까지 저하하였지만, 그 후 약 50 분 동안 50% 의 잔존 활성이 유지되었다. 반감기, 즉 활성이 50% 로 저하되는 데에 필요한 시간 (t_1/2) 을 계산한 바, 야생형 정제 효소, Ser415Cys 개변형 효소 및 Asp167Gly/Ser231Lys/Ser415Cys 개변형 효소의 열 실활의 반감기는 각각 14 분, 183 분 및 136 분이었다.

이어서, 본 발명의 효소의 온도 특성을 측정하였다. 실시예 2 에서 얻어진 야생형 효소 및 Ser415Cys 개변형 효소의 정제 효소 표품을 각각 1μM PQQ, 1mM CaCl₂존재하에서 1 시간 이상 홀로화시켰다. 이어서, 1μM PQQ, 1mM CaCl₂, 10mM MOPS 완충액 (pH7.0) 중에서 지시된 온도에서 10 분 동안 인큐베이트한 후, 빙상에서 급랭시켰다. 이들 시료의 효소 활성을 실시예 4 의 방법에 따라 측정하고, 열처리전의 활성에 대한 잔존 활성으로 나타냈다.

결과를 도 4 에 나타낸다. 야생형 효소가 60℃ 에서의 열처리에 의해 활성이 50% 이하로 저하된 것에 반해, Ser415Cys 개변형 효소는 70℃ 에서도 90% 의 잔존 활성을 나타냈다.

즉, 본 발명의 개변형 PQQGDH 는 야생형 PQQGDH 와 비교하여 높은 열안정성을 가짐이 확인되었다.

실시예 6

효소 활성의 평가

실시예 2 에서 얻어진 야생형 및 Ser415Cys 개변형 효소를 각각 1μM PQQ,1mM CaCl₂존재하에서 1 시간 이상 홀로화시켰다. 이것을 187㎕ 씩 나누어 따르고, 3㎕ 의 활성 시약 (6mM DCIP 48㎕, 600mM PMS 8㎕, 10mM 인산 완충액 pH7.0 16㎕) 및 각 농도의 D-글루코오스 용액 10㎕ 를 첨가하여 실시예 4 에 나타내는 방법에 의해 실온에서 효소 활성을 측정하였다. 기질 농도 대 효소 활성의 플롯으로부터, Km 및 Vmax 를 구하였다. Ser415Cys 개변형 효소의 글루코오스에 대한 Km 값은 약 16mM 이며, kcat 는 3461sec^-1이었다. 한편, 야생형 Km 값은 약 27mM, kcat 는 3436sec^-1이었다. 이 결과에서 Ser415Cys 개변형 효소는 야생형 PQQGDH 에 필적하는 높은 활성을 갖는 효소임을 알 수 있다.

실시예 7

기질 특이성의 평가

실시예 2 에서 얻어진 야생형, Ser415Cys 개변형 효소 및 Asp167Gly/Ser231Lys/Ser415Cys 개변형 효소에 대해 기질 특이성을 조사하였다. 기질로서 각각 20mM 의 글루코오스, 알로오스, 3-O-메틸-D-글루코오스, 갈락토오스, 락토오스 및 말토오스를 사용하고, 1μM PQQ 및 1mM CaCl₂의 존재하에서 30 분 동안 인큐베이트하여 실시예 4 에 나타내는 방법에 의해 효소 활성을 측정하였다. 값은 글루코오스를 기질로 했을 때의 활성에 대한 상대 활성으로 나타냈다. 표 1 에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 개변형 효소, Ser415Cys 는 야생형 효소와 동일한 기질 특이성을 나타냈다. 또, Ser415Cys 로 치환되고, 또한 Ser231Lys 및Asp167Glu 로 치환되어 있는 변이 효소는 Asp167Glu 의 치환에 의해 야생형 효소보다 글루코오스에 대해 기질 특이성이 높다.

	야생형	Ser415Cys	Asp167Glu/Ser231Lys/Ser415Cys
	Km(mM)	kcat(s^-1)	Km(mM)	kcat(s^-1)	Km(mM)	kcat(s^-1)
글루코오스	27	3436	16	3461	53	1248
알로오스	36	2509	21	3664	89	301
3-O-m-글루코오스	29	3011	26	5823	127	412
갈락토오스	5	232	7	337	165	240
락토오스	19	1659	20	2973	31	507
말토오스	26	1930	11	2477	102	590

실시예 8

글루코오스의 분석

개변형 PQQGDH 를 사용하여 글루코오스를 분석하였다. Ser415Cys 개변형 효소를 1μM PQQ, 1mM CaCl₂존재하에서 1 시간 이상 홀로화시키고, 각종 농도의 글루코오스 및 5μM PQQ, 10mM CaCl₂존재하에서 효소 활성을 측정하였다. 방법은 실시예 4 에 기재된 효소 활성의 측정법에 준하여 DCIP 의 600㎚ 의 흡광도 변화를 지표로 하였다. 도 5 에 나타내는 바와 같이, Ser415Cys 개변형 PQQGDH 를 사용하여 5mM-50mM 의 범위에서 글루코오스의 정량을 실시할 수 있었다.

실시예 9

효소 센서의 제작 및 평가

5U 의 Ser415Cys 개변형 효소에 카본 페이스트 20㎎ 을 첨가하여 동결 건조시켰다. 이것을 충분히 혼합한 후, 이미 카본 페이스트가 약 40㎎ 충전된 카본페이스트 전극의 표면에만 충전하여 여과지 상에서 연마하였다. 이 전극을 1% 의 글루타르알데히드를 함유하는 10mM MOPS 완충액 (pH7.0) 중에서 실온에서 30 분 동안 처리한 후, 20mM 리신을 함유하는 10mM MOPS 완충액 (pH7.0) 중에서 실온에서 20 분 동안 처리하여 글루타르알데히드를 블로킹하였다. 이 전극을 10mM MOPS 완충액 (pH7.0) 중에서 실온에서 1 시간 이상 평형화시켰다. 전극은 4℃ 에서 보존하였다.

제작된 효소 센서를 사용하여 글루코오스 농도를 측정하였다. 본 발명의 개변형 PQQGDH 를 고정화시킨 효소 센서를 사용하여 1mM-12mM 의 범위에서 글루코오스의 정량을 실시할 수 있었다.

실시예 10

Asn340Cys/Tyr418Cys 개변형 효소의 조제

PQQGDH-B 의 구조를, Oubrie 외의 보고 (Oubrie A, 등, (1999) J. Mol. Biol. 289: 5187-5194; Oubrie A, 등, (1999) EMBO J. 18: 5187-5159; Oubrie A, 등, Biochemistry 96: 11787-11791) 에 기초하여 분자 모델 가시화 소프트 Ras Mol 로 표시한 바, PQQGDH-B 의 이량체 계면에 위치하는 4CD 루프 중의 Asn340 과 5CD 루프 중의 Tyr418 이 대향하는 위치에 있고, 그것들의 측쇄간 거리가 4Å 이하인 점에서 이들 아미노산 잔기를 시스테인으로 치환하면 이황화 결합이 형성될 가능성이 있는 것으로 생각된다.

실시예 1 에 기재된 방법에 따라 부위 특이적 변이법에 의해 PQQGDH 를 코드하는 유전자 중에 Asn340Cys/Tyr418Cys 변이를 도입하였다. 사용된 프라이머는다음과 같다.

Asn340Cysgggacaaagcatttaccagtcc

Tyr418Cyscatcggtacagcgtcatcacaagtagtgc

실시예 2 에 기재된 방법에 따라 이 개변형 효소의 정제 효소 표품을 조제하였다. 비변성 SDS-PAGE 분석에 의해 100kDa 부근에 밴드가 관찰되고, 서브 유닛간에 디술피드가 형성되고 있음이 확인되었다.

실시예 11

Asn340Cys/Tyr418Cys 개변형 효소의 활성, 열안정성 및 기질 특이성의 평가

실시예 10 에서 조제한 Asn340Cys/Tyr418Cys 개변형 효소의 효소 활성을 실시예 4 와 동일하게 측정한 바, 야생형 활성값은 3347U/㎎ 이며, 개변형 효소의 활성값은 2877U/㎎ 이었다. 또 각 기질 농도로부터 구한 활성값을 기초로 산출된 Km 값은 18mM 로 야생형과 동일하였다. 또, 글루코오스, 락토오스, 2-데옥시글루코오스, 말토오스, 알로오스, 3-O-메틸-D-글루코오스, 갈락토오스, 자일로오스, 만노오스를 기질로서 사용하여 기질특이성을 평가한 바, 기질 특이성의 패턴은 야생형과 동일하였다.

이어서, 열안정성을 평가하기 위해 열처리온도를 55℃ 로 고정시킨 상태에서 0, 5, 10, 20, 45, 60, 90, 120, 150, 180 분 동안 정제 효소 표품을 처리하여 활성의 시간경과에 따른 변화를 측정하였다. 이 때 야생형 효소의 열처리는 60 분까지로 하였다. 결과를 도 6 에 나타낸다. 여기에서는, 열처리 시간 0 분의 활성값을 100% 로 하여 각 처리 시간 후의 활성이 비활성으로 표시되고 있다.도면에서 알 수 있는 바와 같이, 야생형 효소의 반감기는 10 분 이하로 생각되며 60 분에서 완전히 실활되었지만, Asn340Cys/Tyr418Cys 개변형 효소에서는 반감기가 60 분 이상이며, 180 분의 인큐베이트 후에도 20% 의 잔존 활성을 나타냈다. 또 상세하게 반감기를 구하기 위해, 그 비활성 자연 로그를 시간에 대해 플롯하여 잔존 활성이 50% 가 되는 시간을 구한 바, 야생형 효소의 반감기는 대략 10 분인 것에 반해, Asn340Cys/Tyr418Cys 개변형 효소의 반감기는 70 분이었다.

또한, 20℃ 내지 80℃ 까지의 각 온도에서 10 분 동안 열처리한 후의 활성을 측정하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다. 여기에서는 20℃ 일 때의 활성값을 100% 로 하여 잔존 활성을 나타내고 있다. 야생형에서는 50℃ 내지 60℃ 에 걸쳐 실활이 관찰되고, 50℃ 에서는 80% 정도 유지하던 잔존 활성도 60℃ 가 되면 10%, 70℃ 에서는 0% 가 되었다. 그에 반해, Asn340Cys/Tyr418Cys 개변형 효소에서는 50℃ 에서는 거의 100%, 60℃ 에서도 80% 로 높은 잔존 활성을 유지하고, 야생형이 완전히 실활된 70℃ 에서도 20% 의 잔존 활성을 나타냈다.

즉, Asn340Cys/Tyr418Cys 개변형 효소는 야생형 효소와 비교하여 높은 열안정성을 지녔다.

본 발명의 개변형 수용성 PQQGDH 는 글루코오스 센서의 인식 소자로서 유용하다.

Claims

2 개의 서브 유닛이 1 또는 그 이상의 이황화 결합을 통하여 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 수용성 PQQGDH.
제 1 항에 있어서, 천연에 존재하는 PQQGDH 의, 1 또는 그 이상의 시스테인 이외의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있는 PQQGDH.
제 1 항에 있어서, 상기 PQQGDH 가 아키네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 유래인 PQQGDH.
제 3 항에 있어서, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열의 415 번째 세린 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있는 PQQGDH.
제 3 항에 있어서, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열의 414 번째 티로신 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있는 PQQGDH.
제 3 항에 있어서, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열의 414 번째 티로신 잔기 및 415 번째 세린 잔기가 양쪽 모두 시스테인 잔기로 치환되어 있는 PQQGDH.
제 3 항에 있어서, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열의 340 번째 아스파라긴산 잔기 및 418 번째 티로신 잔기가 양쪽 모두 시스테인 잔기로 치환되어 있는 PQQGDH.
서열:

Pro Thr Tyr Cys Thr Thr Tyr

을 함유하는 수용성 PQQGDH.
서열:

Pro Thr Cys Cys Thr Thr Tyr

을 함유하는 수용성 PQQGDH.
서열:

Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro 및 Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala

을 함유하는 수용성 PQQGDH.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 PQQGDH 를 코드하는 유전자.
제 11 항에 기재된 유전자를 함유하는 벡터.
제 11 항에 기재된 유전자를 함유하는 형질전환체.
제 13 항에 있어서, 유전자가 주염색체에 도입되어 있는 형질전환체.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 PQQGDH 를 함유하는 글루코오스 분석 키트.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 PQQGDH 를 함유하는 글루코오스 센서.