CN1306034C

CN1306034C - 葡萄糖脱氢酶

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Publication number: CN1306034C
Application number: CNB028081404A
Authority: CN
Inventors: 早出广司; 五十岚聪
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-03-13
Filing date: 2002-03-07
Publication date: 2007-03-21
Anticipated expiration: 2022-03-07
Also published as: US7244600B2; EP1369485A4; CA2440576A1; US20040191883A1; IL157829A0; KR20040004555A; WO2002072839A1; CN1501977A; JPWO2002072839A1; EP1369485A1

Abstract

概述了以两个亚基通过二硫键相互连接为特征的水溶性PQQGDH。本发明的水溶性PQQGDH的特征是具有改进的热稳定性。

Description

葡萄糖脱氢酶

技术领域

本发明涉及到以吡咯并喹啉醌作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的制造、以及在葡萄糖的定量中该酶的使用。

背景技术

血中葡萄糖浓度是糖尿病的重要标志。另外在利用微生物的发酵生产中，为了对发酵过程进行监测也要对葡萄糖浓度进行定量。以往，是通过使用葡萄糖氧化酶(GOD)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶法对葡萄糖进行定量。然而，要使用GOD方法，为了对伴随葡萄糖氧化反应而产生的过氧化氢进行定量需要向分析体系中添加过氧化氢酶或过氧化物酶。G6PDH虽然可以用于基于分光光度法的葡萄糖定量，但必须要向反应体系中添加作为辅酶的NAD(P)。

所以，人们尝试使用新的酶PQQGDH代替到目前为止的葡萄糖酶定量方法中一直使用的GOD或G6PDH(特开平10-243786、WO00/66744、WO 00/61730)。PQQGDH由于对葡萄糖具有很高的氧化活性，以及由于PQQGDH是辅酶结合型的酶，可以不需要氧作为电子受体，所以作为葡萄糖传感器的识别元件很有用。

PQQGDH催化葡萄糖氧化，生成葡糖酸内酯的反应。PQQGDH中存在着膜结合性酶和水溶性酶。膜结合性PQQGDH是分子量约为87kDa的信号肽蛋白质，广泛分布于各种革兰氏阴性菌中。水溶性PQQGDH被确认存在于乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的几种菌株中(Biosci.Biotech.Biochem.(1995)，59(8)，1548-1555)，其结构基因已被克隆，氨基酸序列被阐明(Mol.Gen.Genet.(1989)，217：430-436)。来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH是由同一50kDa亚基构成的均二聚体酶。各个亚基含有1分子的PQQ和3个Ca⁺⁺。二聚体蛋白质具有2个活性中心，但单体酶不表现出GDH活性。因此为了表现出GDH活性，形成二聚体结构是必需的。另外，对水溶性PQQGDH进行了X线晶体结构解析，该酶的高级结构已被阐明(J.Mol.Biol.，289，319-333(1999)，A.Oubrie etal.，EMBO Journal，18(19)5187-5194(1999)，A.Oubrie etal.，PNAS，96(21)，11787-11791(1999)，A.Oubrie etal.)。

本发明的目的在于提供具有热稳定性改善的改变型水溶性PQQGDH。

发明内容

本发明提供水溶性PQQGDH，其特征是两个亚基是通过1个或1个以上的二硫键相互连接的。

本说明书中所谓「PQQGDH」指的是以吡咯并喹啉醌作为辅酶的葡萄糖脱氢酶。而所谓「改变型PQQGDH」指的是天然存在的葡萄糖脱氢酶结构的一部分经化学手段改变后的PQQGDH。这样的改变可以通过例如将酶蛋白中的1个或1个以上氨基酸残基用其他天然存在的或天然不存在的氨基酸残基置换，或者是通过缺失或附加1个或1个以上氨基酸来进行。而在本说明书中PQQGDH的氨基酸位置是以起始的蛋氨酸作为第1位编号的。因此序列1所示的起始氨基酸残基Asp是第25位氨基酸残基。

在本说明书中，所谓「二硫键」指的是-S-S-键。而「亚基」指的是构成二聚体的各单体亚基。

优选的本发明水溶性PQQGDH是天然存在的PQQGDH中的1个或1个以上的氨基酸残基(半胱氨酸除外)被半胱氨酸残基置换后的PQQGDH。另外优选的本发明水溶性PQQGDH来自于乙酸钙不动杆菌。

在本发明的PQQGDH的特别优选状态中，序列1所示氨基酸序列中的415位丝氨酸残基被半胱氨酸置换，在分别位于2个亚基上的半胱氨酸残基之间形成二硫键。

在另一个优选状态中，序列1所示氨基酸序列中的414位酪氨酸残基被半胱氨酸残基置换，在分别位于2个亚基上的半胱氨酸残基之间形成二硫键。

在另一个优选状态中，序列1表示的氨基酸序列中的340位天冬氨酸残基以及418位酪氨酸残基都被半胱氨酸残基置换，在分别位于2个亚基上的半胱氨酸残基之间形成二硫键。

在本发明的PQQGDH的特别优选状态中，本发明的PQQGDH含有序列：Pro Thr Tyr Cys Thr Thr Tyr。

在另一个优选状态中，本发明的PQQGDH含有序列：Pro Thr CysCys Thr Thr Tyr。

在另一个优选状态中，本发明的PQQGDH含有序列：Thr Gly LysAsn Phe Val Pro和Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala。

本发明提供编码本发明的PQQGDH的基因，含有该基因的载体和含有改基因的转化体，以及含有本发明PQQGDH的葡萄糖分析试剂盒和葡萄糖传感器。

本发明的改变型PQQGDH的酶蛋白质由于具有很高热稳定性，而且对葡萄糖具有很高的氧化活性，所以可以应用于葡萄糖的高灵敏度而且高选择性的测定中。特别是由于利用在酶的生产中制备/纯化时失活少、收率高，在溶液中稳定性高、酶的保存容易的该酶在制作分析试剂盒或酶传感器的过程中失活少，使用该酶做成的分析试剂盒或酶传感器的热稳定性高，所以预期具有利于保存的优点。

附图的简单说明

图1表示本发明中使用的质粒pGB2的结构。

图2表示制作编码本发明的改变型酶的结构基因的方法。

图3表示本发明的改变型酶的热稳定性。

图4表示本发明的改变型酶的热稳定性。

图5表示使用本发明的改变型PQQGDH分析葡萄糖。

图6表示本发明的改变型酶的热稳定性。

图7表示本发明的改变型酶的热稳定性。

具体实施方式

改变型PQQGDH的结构

本发明的PQQGDH的特征是在均一二聚体中2个亚基是通过1个或1个以上的二硫键连接的，由此表现出很高的热稳定性。这样的连接结构可以通过将位于二聚体结构的各个单体界面上相互靠近的位置上的1个或1个以上氨基酸残基置换成半胱氨酸残基，在亚基之间形成二硫键来构建。

水溶性PQQGDH具有序列1所示的氨基酸序列，根据其X射线晶体结构解析，其高级结构已被阐明(J.Mol.Biol.，289，319-333(1999)，EMBO Journal，18(19)5187-5194(1999))。如果根据这样推定的高级结构构建二聚体酶时，两个单体上的Ser415位于单体界面上相互靠近的位置。将Ser415置换成Cys后，使单体间形成二硫键，结果与野生型相比可以得到具有非常高热稳定性的改变型酶。

我们认为高热稳定性是由于通过二硫键的形成，水溶性PQQGDH二聚体的四级结构的稳定性增大的缘故。这与到目前为止通过利用交联化学修饰(特开2000-262281)或构建粘连结构(tetherstructure)(特开2001-37483)使二聚体结构稳定，从而使PQQGDH的热稳定性增大的见解也一致。

另外在本发明中，通过将PQQGDH-B的二聚体界面上处于面对面位置，而且他们的侧链间距离短的Asn340和Tyr418两个残基都置换成Cys之后，在单体之间形成2个二硫键，可以得到与野生型相比热稳定性非常高的改变型酶。

本领域技术人员根据本发明的教导以及有关酶的推测高级结构的信息，对处于二聚体结构中各个单体界面上位置相互靠近的氨基酸残基进行预测，通过将该残基用半胱氨酸置换，可以得到热稳定性提高的改变型葡萄糖脱氢酶。要置换的氨基酸残基即使不处于各个单体的同一位置也可以。就是说，在各个单体的界面中，一个单体的第1位氨基酸残基与另一个单体上的第2位氨基酸残基处于靠近的位置时，可以将第1位和第2位的氨基酸残基都置换成半胱氨酸残基。此时，在2个地方都形成二硫键。同样，也可以构建含有3个以上二硫键的二聚体。

在本发明的改变型葡萄糖脱氢酶中，只要具有葡萄糖脱氢酶活性，进一步将其他一部分氨基酸残基缺失或置换也可以，另外附加其他的氨基酸残基也可以。用于这样的氨基酸残基的缺失、置换和附加的各种方法都是该技术领域中众所周知的，例如Sambrook等人编写的“Molecular Cloning；A Laboratory Manual”，第2版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York文献记载的方法。本领域技术人员根据本说明书的教导，可以很容易地对含有这样的氨基酸残基缺失、置换或附加的葡萄糖脱氢酶是否具有所期望的葡萄糖脱氢酶活性进行试验。例如，有报道说，通过将水溶性PQQGDH的特定位置的氨基酸残基置换成其他氨基酸残基，可以改善对底物葡萄糖的亲和性(特开2000-31258、特开2000-350588)。

另外，本领域技术人员通过对来自其他生物的水溶性PQQGDH的三级结构进行预测和解析，根据本发明的教导对位于两个单体界面上的氨基酸残基进行预测，通过将这些残基置换成半胱氨酸残基使其形成二硫键，可以得到热稳定性提高的改变型葡萄糖脱氢酶。特别是通过对蛋白质的一级结构、二级结构和三级结构进行比较，可以很容易地了解相当于来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH的415位的丝氨酸残基或414位的酪氨酸残基的氨基酸残基、或相当于340位天冬氨酸残基和418位酪氨酸残基的组合的氨基酸残基组合，根据本发明，这样的残基用半胱氨酸残基置换，可以得到改变型葡萄糖脱氢酶。这些改变型葡萄糖脱氢酶也包括在本发明的范围内。

改变型PQQGDH的制造方法

编码来自乙酸钙不动杆菌的天然水溶性PQQGDH的基因的序列如序列2所规定。

编码本发明的改变型PQQGDH的基因可以通过将在编码天然的水溶性PQQGDH的基因中，将编码目的氨基酸残基的碱基序列置换成编码半胱氨酸残基的碱基序列来构建。用于这样的位点特异的碱基置换的种种方法在该技术领域都是众所周知的，例如Sambrook等人编写的“Molecular Cloning；A Laboratory Manual”，第2版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York文献记载的方法。通过将这样操作得到的变异基因插入到基因表达用载体(例如质粒)，然后将其转化到适当的宿主(例如大肠菌)。用于使外源性蛋白质表达的许多载体和宿主系列在该技术领域内都是众所周知的，例如作为宿主可以使用细菌、酵母、培养细胞等各种宿主。

使水溶性PQQGDH在大肠菌中表达时，由于分泌到(外)周质空间，所以利用菌体本身可以很容易进行酶活性的测定。将得到的转化体于60-70℃下处理约30分钟后，加入葡萄糖和作为色素的PMS-DCIP，通过目视对剩余PQQGDH活性进行判定，选择通过热处理仍表现出剩余活性的克隆，经对基因序列进行解析可以确认其变异。

对上述那样得到的表达改变型PQQGDH的转化体进行培养，从培养液中经离心分离等回收菌体后，将菌体用弗氏压碎器等破碎，或通过渗透(压)休克使周质酶释放到培养基中。然后通过超离心分离可以得到含有PQQGDH的水溶性级分。或者通过使用适当的宿主载体体系，也可以使表达的PQQGDH分泌到培养液中。将得到的水溶性级分通过离子交换层析、亲和层析、HPLC等进行纯化，制备本发明的改变型PQQGDH。

酶活性的测定方法

本发明的PQQGDH以PQQ作为辅酶，具有催化使葡萄糖氧化生成葡糖酸内酯反应的作用。

酶活性的测定可以通过氧化还原色素的呈色反应对伴随着PQQGDH催化葡萄糖的氧化而被还原的PQQ的量进行定量。作为呈色试剂例如可以使用PMS(吩嗪硫酸甲酯)-DCIP(2，6-二氯酚靛酚)、铁氰化钾、二茂(合)铁等。

热稳定性

本发明的改变型PQQGDH的热稳定性可以通过将酶于高温(例如55℃)下温育，每隔一定时间取出等分样品测定酶活性，对随着时间的推移酶活性降低进行监测来评价。典型的酶热稳定性是以热失活半衰期、即酶活性减少到50％所需要的时间(t1/2)作为指标表示的。或者，热稳定性可以用酶在所预定温度下进行预定时间处理后的酶活性的残余率(热处理后活性与热处理前活性的比)表示。

本发明的改变型PQQGDH与野生型PQQGDH相比，其特征是具有很高的热稳定性。因此由于利用在酶的生产中制备/纯化时失活少，收率高，于溶液中稳定性高，酶的保存容易的改变型PQQGDH制作分析试剂盒或酶传感器的过程中，失活少，使用该酶做成的分析试剂盒或酶传感器的热稳定性高，具有利于保存等优点。

葡萄糖分析试剂盒

另外本发明还有一特征，就是含有来自本发明的改变型PQQGDH葡萄糖分析试剂盒。本发明的葡萄糖分析试剂盒至少含有供一次分析用的充足量的来自本发明的改变型PQQGDH。典型的试剂盒除了含有本发明的改变型PQQGDH外，还含有分析所需要的缓冲液、介体(传递质)、用于制作校准曲线的葡萄糖标准溶液以及使用指南。来自本发明的改变型PQQGDH可以以各种形态，例如以冷冻干燥的试剂，或保存在适当的保存溶液中的溶液提供。本发明的改变型PQQGDH优选是以全酶的状态提供，也可以以脱辅基酶的状态提供，使用时再进行全酶化。

葡萄糖传感器

另外本发明还有一特征，就是使用来自本发明的改变型PQQGDH的葡萄糖传感器。作为电极可以使用碳电极、金电极、铂电极等，将本发明的酶固定在电极上。作为固定化方法有使用交联试剂的方法、封入到高分子基质中的方法、用透析膜包被的方法、光交联性聚合物、导电性聚合物、氧化还原聚合物等，或者是与以二茂(合)铁或其衍生物为代表的电子传递体一起固定于聚合物中，或吸附固定于电极上也可以。另外也可以将他们组合起来用。优选的是本发明的改变型PQQGDH以全酶的形态固定于电极上，但也可以以脱辅基酶的形态固定，而将PQQ做成另外的层或于溶液中提供。典型的例子是使用戊二醛将本发明的改变型PQQGDH固定于碳电极上，然后用含有胺基的试剂进行处理后，对戊二醛进行封闭(blocking)。

葡萄糖浓度的测定如下。将缓冲液加入到恒温杯中，加入PQQ、CaCl₂以及传递体后，维持在一定温度下。作为传递体可以使用铁氰化钾、吩嗪硫酸甲酯等。作为作用电极使用固定有本发明的改变型PQQGDH的电极，另外使用相反的一极(例如铂电极)以及参照电极(例如Ag/AgCl电极)。向碳电极上外加一定的电压，电流变得恒定后，加入含有葡萄糖的样品，测定电流的增加量。根据利用标准浓度的葡萄糖溶液制作的校准曲线，可以计算样品中的葡萄糖浓度。

本说明书中明确引用的所有专利以及参考文献的内容由于引用都包括在本说明书中。另外作为成为本申请具有的优先权主张的基础的申请的日本专利申请第2001-70413号说明书记载的内容都作为本说明书的一部分在此引用。

以下通过实施例进一步对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于实施例。

实施例1

编码改变型PQQGDH的基因的构建

以序列2所示的来自乙酸钙不动杆菌的PQQGDH结构基因为基础，按照常规方法通过位点特异性变异法对氨基酸残基进行置换。位点特异性变异使用将编码来自乙酸钙不动杆菌的PQQGDH的结构基因插入到载体pTrc99A(Pharmacia公司生产)的多克隆部位后的质粒pGB2(图2)，按照图2所示方法进行。变异中使用的合成寡核苷酸试剂盒引物的序列如下所示。

Ser415Cys catcataagtagtgcaataagttggatc

Tyr414Cys/Ser415Cys catcataagtagtgcaacaagttggatctaac

Asp167Gly aggtgatgatttctcatgctgtga

Ser231Lys cctttggaatttttcatcaagatttaagc

将含有编码来自乙酸钙不动杆菌的PQQGDH的基因的一部分的KpnI-Hind III片段整合到载体质粒pKF18k(宝酒造(株式会社))，将其作为模板。将该模板50fmol和宝酒造(株式会社)制造的Mutan(注册商标)-Express Km试剂盒附带的筛选引物5pmol、磷酸化的靶引物50pmol与总量(20μl)的1/10量的同一试剂盒的退火缓冲液一起混合，于100℃下，进行3分钟的热处理使质粒变性，变成单链。筛选引物是用于使位于pKF18k的卡那霉素抗性基因上的双重琥珀变异恢复的引物。然后将其于冰上放置5分钟，使引物退火。向其中加入3μl的同一试剂盒延伸缓冲液、1μl的T4 DNA连接酶、1μl的T4 DNA聚合酶以及5μl的灭菌水，合成互补链。

将其转化为作为DNA的错配修复能力缺损株的E.coli BMH 71-18mutS，振荡培养过夜，使质粒扩增。

接下来用从其中提取的质粒转化E.coli MV1184，从其菌落中提取质粒。然后对这些质粒进行测序，对作为目标导入的变异进行确认。将该片段换成编码质粒pGB2上的野生型PQQGDH的基因的Kpn I-Hind III片段，构建改变型PQQGDH的基因。在导入2个以上变异时，重复上述工序。通过这样操作做成编码Ser415Cys、Tyr414Cys/Ser415Cys以及Asp167Gly/Ser231Lys/Ser415Cys 3个变异体的基因。

实施例2

改变型酶的制备

将编码野生型或改变型PQQGDH的基因插入到E.coli用的表达载体pTrc99A(Pharmacia公司生产)的多克隆位点，用构建的质粒转化E.coli DH5α菌株。将该菌株用450ml的L培养基(含有氨卞青霉素50μg/ml、氯霉素30μg/ml)，使用坂口烧瓶于37℃下振荡培养过夜，接种于含1mM CaCl₂、500μM PQQ的7L的L培养基中。培养开始后约3小时添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，使其终浓度为0.3mM，然后培养1.5小时。经离心分离(5000xg、10分钟、4℃)从培养液中回收菌体，将该菌体用0.85％NaCl溶液洗2次。收集的菌体用弗氏压碎器破碎，经离心分离(10000×g、15分钟、4℃)除去未破碎的菌体。上清经超离心分离(160500×g(40000r.p.m.)、90分钟、4℃)，得到水溶性级分。

接下来，将上述得到的水溶性级分于pH7.0的10mM磷酸缓冲液透析过夜。然后使透析后样品吸附于用pH7.0的10mM磷酸缓冲液平衡后的阳离子交换层析用填充柱TSK胶CM-TOYOPEARL 650M(东洋曹达株式会社)。用pH7.0的10mM磷酸缓冲液750ml将该柱洗净后，用含有0-0.2M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)，将酶洗脱出来，流速为5ml/min。回收具有GDH活性的级分，用pH7.0的10mMMOPS-NaOH缓冲液透析过夜。经上述操作可以得到电泳均一的改变型PQQGDH蛋白质。该蛋白质作为纯化酶标准品用于以下实施例。

实施例3

二硫键形成的确认

将实施例2得到的Ser415Cys改变型酶在没有巯基乙醇存在下进行热变性处理，然后进行SDS-PAGE分析，确认在100kDa处出现主带，而在50kDa处出现微量的带。由此可以确认在亚基之间形成了二硫键。

实施例4

酶活性的测定

酶活性的测定是于10mM MOPS-NaOH缓冲液(pH7.0)中使用PMS(吩嗪硫酸甲酯)-DCIP(2，6-二氯酚靛酚)，利用分光光度计追踪DCIP的600nm的吸光度变化，将该吸光度减少速度作为酶的反应速度。此时，将1分钟内使1μmol的DCIP还原的酶活性作为1个单位。另外DCIP于pH7.0的摩尔吸光系数定为16.3mM^-1。

实施例5

热稳定性的评价

将实施例2得到的野生型酶以及各个改变型酶在有1μM PQQ、1mM CaCl₂存在下进行1小时以上的全酶化后，于55℃下温育。每隔一定时间取出等分样品，于冰上急剧冷却。按照实施例4的方法测定这些样品的酶活性。结果如图3所示。

Ser415Cys改变型酶以及Asp167Gly/Ser231Lys/Ser415Cys改变型酶无论哪一个与野生型酶进行比较，55℃下活性的降低都非常少。Ser415Cys/Tyr414 Cys改变型酶经过55℃下的热处理，于10分钟内就降低到初期活性的50％，但以后约50分钟仍保留50％的剩余活性。计算半衰期，即活性降低到50％所需要的时间(t/1/2)时，野生型的纯化酶、Ser415Cys改变型酶以及Asp167Gly/Ser231Lys/Ser415Cys改变型酶的热失活的半衰期分别为14分钟、183分钟和136分钟。

接下来，对本发明的酶的温度特性进行测定。将实施例2得到的野生型酶以及Ser415Cys改变型酶的纯化酶标准品分别在有1μMPQQ、1mM CaCl₂存在下进行1小时以上的全酶化。然后于1μMPQQ、1mM CaCl₂、10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中，于指示的温度下温育10分钟后，于冰上急剧冷却。按照实施例4的方法测定这些样品的酶活性，以相对于热处理前的活性的剩余活性表示。

结果如图4所示。与野生型酶在60℃热处理活性降低到50％以下相比，Ser415Cys改变型酶经过70℃的热处理仍保留90％的剩余活性。

就是说，确认本发明的改变型PQQGDH与野生型PQQGDH相比具有很高的热稳定性。

实施例6

酶活性的评价

将实施例2得到的野生型以及Ser415Cys改变型酶分别在有1μMPQQ、1mM CaCl₂存在下进行1小时以上的全酶化后。各加入187μl上述全酶、3μl的活性试剂(6mMDCIP48μl，8μl的600mMPMS，16μl的pH7.0的10mM磷酸缓冲液)以及各种浓度的D-葡萄糖溶液10μ，按照实施例4的方法于室温下测定酶活性。由相对于底物浓度的酶活性曲线可以求出K_m和V_max。Ser415Cys改变型酶相对于葡萄糖的K_m值约为16mM，k_cat是3461sec^-1。另外野生型的K_m值约为27mM，k_cat是3436sec^-1。由这些结果可知Ser415Cys改变型酶是具有可与野生型PQQGDH匹敌的高活性的酶。

实施例7

底物特异性的评价

就实施例2得到的野生型、Ser415Cys改变型酶以及Asp167Gly/Ser231Lys/Ser415Cys改变型酶进行底物特异性的研究。作为底物分别使用20mM的葡萄糖、阿洛糖、3-o-甲基-D-葡萄糖、半乳糖、乳糖和麦芽糖，在有1μM PQQ、1mM CaCl₂存在下进行30分钟的温育，按照实施例4的方法测定酶活性。测定的值用相对于以葡萄糖为底物时的活性的相对活性表示。就象表1所示那样，本发明的改变型酶、Ser415Cys表现出与野生型酶同样的底物特异性。进行Ser415Cys置换、又进行Ser231Lys以及Asp167Glu置换的变异酶由于Asp167Glu的置换，与野生型酶相比，对葡萄糖的底物特异性变高了。

表1

	野生型		Ser415Cys		Asp167Glu/Ser231Lys/Ser415Cys
	野生型		Ser415Cys		Asp167Glu/Ser231Lys/Ser415Cys		葡萄糖阿洛糖3-o-甲基-D-葡萄糖半乳糖乳糖麦芽糖	K_m(mM)27362951926	k_cat(s^-1)34362509301123216591930	K_m(mM)16212672011	k_cat(s^-1)34613664582333729732477	K_m(mM)538912716531102	k_cat(s^-1)1248301412240507590

实施例8

葡萄糖的分析

使用改变型PQQGDH进行葡萄糖分析。将Ser415Cys改变型酶在有1μM PQQ、1mM CaCl₂存在下进行1小时以上的全酶化，在有各种浓度的葡萄糖以及5μM PQQ、10mM CaCl₂存在下测定酶活性。方法按照实施例4记载的酶活性的测定方法，以DCIP的600nm的吸光度变化作为指标。就象图5所示的那样，使用Ser415Cys改变型PQQGDH可以在5mM-50mM范围内对葡萄糖进行定量。

实施例9

酶传感器的制作和评价

将碳糊20mg加入到5U的Ser415Cys改变型酶中后冷冻干燥。将他们充分混合后，只充填到已经充填了大约40mg的碳糊的碳糊电极的表面，在滤纸上研磨。将该电极于含有1％的戊二醛的10mM MOPS缓冲液(pH7.0)于室温下处理30分钟后，于含有20mM赖氨酸的10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中在室温下处理20分钟后对戊二醛进行封闭。将该电极于10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中在室温下平衡1小时以上。将电极在4℃保存。

使用制作的酶传感器测定葡萄糖浓度。使用固定有本发明的改变型PQQGDH的酶传感器可以在1mM-12mM范围内对葡萄糖进行定量。

实施例10

Asn340Cys/Tyr418Cys改变型酶的制备

将PQQGDH-B的结构根据Oubrie等人的报道(Oubrie A，etal.，(1999)J.Mol.Biol.289：5187-5194，Oubrie A，etal.，(1999)EMBO J.18：5187-5159，Oubrie A，et al.，Biochemistry 96：11787-11791)，用分子模型可视化软件RasMol表示，结果位于PQQGDH-B的二聚体界面的4CD环中的Asn340和5CD环中的Tyr418处于面对面位置，由于他们的侧链间距离在4以下，所以如果将这些氨基酸残基置换成半胱氨酸，存在着形成二硫键的可能性。

按照实施例1记载的方法，通过位点特异的变异法将Asn340Cys/Tyr418Cys导入编码PQQGDH的基因中。使用的引物如下所示。

Asn340Cys gggacaaagcatttaccagtcc

Tyr418Cys catcggtacagcgtcatcacaagtagtgc

按照实施例2记载的方法，制备该改变型酶的纯化酶的标准品。通过非变性SDS-PAGE分析，证实在100kDa附近有带出现，可以确认在亚基之间形成了二硫键。

实施例11

Asn340Cys/Tyr418Cys改变型酶的活性、热稳定性以及底物特异性的评价

象实施例4那样对实施例10制备的Asn340Cys/Tyr418Cys改变型酶的酶活性进行测定，结果野生型的活性值是3347U/mg，改变型酶的活性值是2877U/mg。另外以由各个底物浓度求出的活性值作为基础算出的Km值是18mM，与野生型相同。另外在用葡萄糖、乳糖、2-脱氧葡萄糖、麦芽糖、阿洛糖、3-o-甲基-D-葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖作为底物进行底物特异性评价，结果底物特异性的图与野生型一样。

为了对热稳定性进行评价，在将热处理温度固定在55℃的状态下，将纯化的酶标准品分别处理0、5、10、20、45、60、90、120、150和180分钟，测定活性随时间的变化。此时，野生型酶的热处理只进行到60分钟。结果如图6所示。其中，以热处理时间为0分钟的活性值作为100％，各个处理时间后的活性用比活性表示。由图可知，野生型酶的半衰期在10分钟以下，在60分钟时完全失活，但Asn340Cys/Tyr418Cys改变型酶半衰期在60分钟以上，即使温育180分钟后仍表现出20％的剩余活性。而为了详细地求出半衰期，将该比活性的自然对数对时间作图，求剩余活性为50％的时间，结果野生型酶的半衰期大约在10分钟，而Asn340Cys/Tyr418Cys改变型酶的半衰期为70分钟。

另外对于20℃至80℃的各个温度下进行10分钟热处理后的活性进行了测定。结果如图7所示。其中以20℃时的活性值作为100％来表示剩余活性。野生型酶由50℃至60℃时发现失活，而在50℃时保持80％左右的剩余活性，到了60℃时为10％，到70℃时活性变为0％，与此相对应，Asn340Cys/Tyr418Cys改变型酶于50℃下活性基本为100％，即使60℃也仍保持80％的高剩余活性，既便在野生型酶完全失活的70℃，也仍表现出20％剩余活性。

就是说，Asn340Cys/Tyr418Cys改变型酶与野生型酶进行比较，具有很高的热稳定性。

本发明的改变型水溶性PQQGDH作为葡萄糖传感器的识别元件是有用的。

序列表

<110>Sode，Koji et al.

<120>葡萄糖脱氢酶

<130>PSD-9004WO

<150>JP 2001-70413

<151>2001-03-13

<160>8

<210>1

<211>454

<212>PRT

<213>乙酸钙不动杆菌

<400>1

Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn

1 5 10 15

Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu

20 25 30

Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly

35 40 45

Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe

50 55 60

Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu

65 70 75 80

Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile

85 90 95

Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn

100 105 110

Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu

115 120 125

Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His

130 135 140

Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys IIe Tyr Tyr Thr

145 150 155 160

Ile Gly Asp Gln Gly Asn Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn

165 170 175

Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr

180 185 190

His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile

195 200 205

Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr

210 215 220

Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys

225 230 235 240

Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu

245 250 255

Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys

260 265 270

Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys

275 280 285

Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val

290 295 300

Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro

305 310 315 320

Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro

325 330 335

Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser

340 345 350

Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu

355 360 365

Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Art Ile

370 375 380

Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met

385 390 395 400

Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly

405 410 415

Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp

420 425 430

Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys

435 440 445

Phe Thr Tyr Lys Ala Lys

450

<210>2

<211>1612

<212>DNA

<213>乙酸钙不动杆菌

<400>2

agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60

cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120

ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180

tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240

atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300

aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360

aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420

accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480

tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac 540

agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600

tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660

aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720

taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780

actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840

aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900

acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960

aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020

gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080

caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140

gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200

cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260

gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320

ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt 1380

agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440

ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500

cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560

cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc 1612

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>乙酸钙不动杆菌

<400>3

Pro Thr Tyr Cys Thr Thr Tyr

1 5

<210>4

<211>7

<212>PRT

<213>乙酸钙不动杆菌

<400>4

Pro Thr Cys Cys Thr Ttr Tyr

1 5

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>点突变的引物

<400>5

catcataagt agtgcaataa gttggatc

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>点突变的引物

<400>6

catcataagt agtgcaacaa gttggatcta ac

<210>7

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>点突变的引物

<400>7

aggtgatgat ttctcatgct gtga

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>点突变的引物

<400>8

cctttggaat ttttccatca agatttaagc

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>乙酸钙不动杆菌

<400>9

Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro

1 5

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>乙酸钙不动杆菌

<400>10

Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala

1 5

<210>11

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>点突变的引物

<400>11

gggacaaagc atttaccagt cc

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>点突变的引物

<400>12

catcggtaca gcgtcatcac aagtagtgc

Claims

1.水溶性PQQGDH，其来自于乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)的PQQGDH的415位丝氨酸残基被半胱氨酸残基置换，所述415位丝氨酸残基相当于序列1所示的氨基酸序列中的第391位丝氨酸。

2.水溶性PQQGDH，其来自于乙酸钙不动杆菌的PQQGDH的414位酪氨酸残基以及415位丝氨酸残基都被半胱氨酸残基置换，所述414位酪氨酸残基以及415位丝氨酸残基分别相当于序列1所示的氨基酸序列的第390位酪氨酸和第391位丝氨酸。

3.水溶性PQQGDH，其来自于乙酸钙不动杆菌的PQQGDH的340位天冬酰胺残基以及418位酪氨酸残基都被半胱氨酸残基置换，所述340位天冬酰胺残基以及418位酪氨酸残基分别相当于序列1所示的氨基酸序列的第316位天冬酰胺和394位酪氨酸。

4.编码权利要求1-3中任一项记载的PQQGDH的基因。

5.含有权利要求4记载的基因的载体。

6.含有权利要求4中记载的基因的转化体。

7.权利要求6记载的转化体，其中基因整合到染色体。

8.含有权利要求1-3中任一项记载的PQQGDH的葡萄糖分析试剂盒。

9.含有权利要求1-3中任一项记载的PQQGDH的葡萄糖传感器。