CN1693473A - 果葡糖浆制备新方法与耐高温葡萄糖异构酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种果葡糖浆制备新方法。本发明还公开了一系列葡萄糖异构酶突变体的氨基酸序列及编码这些酶的核苷酸序列，以及获得这些葡萄糖异构酶突变体的基因与蛋白工程技术及制备方法。利用本发明之葡萄糖异构酶突变体及果葡糖浆制备方法可以直接在70℃以上的高温反应条件下生产果糖含量≥50％的高果糖浆。
Description
技术领域 本发明涉及分子生物学领域与生物技术领域，具体地说，涉及果葡糖浆制备新方法及一系列耐高温葡萄糖异构酶突变体和这些葡萄糖异构酶突变体的制备方法。
技术背景 葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，简称GI；E.C.5.3.1.5)，又称木糖异构酶(Xylose isomerase)是催化转化葡萄糖为果糖，该酶也是将木聚糖转化为乙醇途径中的关键酶。因此，葡萄糖异构酶在工业上可用于生产果葡糖浆，或生产酒精。
淀粉(玉米淀粉、薯干淀粉等)经化学或生物酶制剂转化产生葡萄糖，葡萄糖异构酶转化葡萄糖产生果葡糖浆。目前，食品及饮料行业是果葡糖浆最大的消费者。市场上存在F42(称第一代果葡糖浆)、F55(称第二代果葡糖浆)和F90(称第三代果葡糖浆)三种类型的果葡糖浆。
淀粉经淀粉酶等水解后产生葡萄糖液，葡萄糖再经葡萄糖异构酶作用后产生果糖，葡萄糖与果糖的混合糖浆称为果葡糖浆。目前，国内外工业界利用葡萄糖异构酶只能生产果糖含量为42％的果葡糖浆(或称F42)，后者经用色谱分离技术将这类产品中的果糖和葡萄糖分离得含果糖90％(或称F90)以上的果葡糖浆，将F90与F42按一定比例混合，得果糖含量为55％的果葡糖浆(或称F55)。
由于果葡糖浆的甜度高，因此它一直是作为在食品、饮料领域替代蔗糖的主要淀粉糖种类。据中国发酵协会统计，1992年到2002年，淀粉糖工业快速发展。淀粉糖产量从1992年的21万吨发展到2002年的200万吨，十年翻了近10倍，2002年比1992年增长了89.5％。品种4～5个发展到24个，而且出现了淀粉糖(干基)单价低于蔗糖的新情况。国际淀粉糖生产中果葡糖占主要位置。以美国为例，2000年美国淀粉糖总产量1490.7万吨，其中果葡糖浆1080.4万吨，占72.47％。1996-2000年美国果葡糖浆产量从956.3万吨上升到1080.4万吨，平均年递增3.1％。国内果葡糖浆目前处于启动阶段。发展粮食深加工，加快发展淀粉糖行业，可以解决农民增产不增收的制约瓶颈。
酶法生产果葡糖浆，产品中果糖的含量取决于反应的温度。目前工业上使用的葡萄糖异构酶不仅酶活低而且在高温(如高于60℃)下极不稳定。因此，工业上通常在60℃制备果葡糖浆，产物中果糖的含量也就较低，通常不超过44％。更高果糖含量的果葡糖浆只能依靠层析分离的方法产生，这一额外步骤增加成本。本发明从Thermoanaerobacteriumsachcharolyticum B6A菌中(ATCC 49915，USA)分离到葡萄糖异构酶(Lee Y.E.etal.，Journal of General Microbiology 1993，139：1227-1234)，其核苷酸序列如序列表SEQ.ID NO.1，氨基酸序列为序列表SEQ.ID NO.2。然后，本发明通过基因与蛋白工程技术改良了本发明分离到的葡萄糖异构酶，使其催化转化葡萄糖为果糖之活性有了显著提高，并且葡萄糖异构酶突变体之耐高温稳定性及其在大肠杆菌中的表达水平有了显著提高。这些葡萄糖异构酶突变体可用于生产果糖含量高于50％的果葡糖浆。
发明内容 本发明的目的之一是提供一种果葡糖浆制备方法；本发明的目的之二是提供编码一系列耐高温葡萄糖异构酶突变体的核苷酸序列；本发明的目的之三是提供一系列耐高温葡构酶突变体的氨基酸序列；本发明的目的之四是提供使用本发明所述的耐高温葡萄糖异构酶在高于70℃反应条件下转化葡萄糖至果糖，直接(即无需色谱分离技术、或类似技术辅助)生产果糖含量≥50％的果葡糖浆。本发明的目的还在于提供这些耐高温葡萄糖异构酶的工程与制备方法。
本发明一方面提供一种果葡糖浆制备方法，该方法包括以下步骤：
1)溶解(来源于玉米、或小麦、或土豆、或红薯、或水稻淀粉之)葡萄糖；
2)加入本发明提供的一种液相或固相耐高温葡萄糖异构酶突变体；
3)在高于70℃反应条件下搅拌反应，葡萄糖异构酶转化葡萄糖至果糖，生产果糖含量≥50％的果葡糖浆；
4)按常规方法脱色再收集生成的果葡糖浆。
本发明另一方面提供编码一系列耐高温葡萄糖异构酶突变体的核苷酸序列，所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.ID NO.3、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.ID NO.7、或SEQ.ID NO.9的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突变形式(≥75％的同源性)，所述的突变包括：缺失、无义、插入、错义，所述的突变不包括公知的密码子简并性变化。
本发明进一步提供由序列表SEQ.ID NO.3、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.ID NO.7、或SEQ.IDNO.9的核苷酸序列编码的相应的序列表SEQ.ID NO.4、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.IDNO.6、或SEQ.ID NO.10氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式(≥90％的同源性)，该修饰形式功能上相当或与耐高温葡萄糖异构酶相关。
本发明进一步提供耐高温葡萄糖异构酶突变体的工程方法，该方法包括以下步骤：
1)根据基因库(L09699)基因序列设计引物TF：5′AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGAA 3′和TR：5′ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATACT 3′，利用引物对TF和TR及常规PCR技术从Thermoanaerobacterium saccharolyticum(购自ATCC 49915，USA)中扩增出亲本葡萄糖异构酶基因(TS-F)；
2)分析亲本葡萄糖异构酶之二级结构与三级结构，选择位点R81、W139、R182、V186、Q59及T182六位点进行单个位点或/和多位点组合突变；
3)通过PCR技术突变产生突变基因，将产生的突变基因与载体pGEMT-Easy(Promega，USA)连接，得含突变基因的质粒；
4)将质粒转入感受态细菌细胞HB101，在1％ MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆；
5)从克隆中提取质粒DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。
本发明进一步提供耐高温葡萄糖异构酶突变体的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)将含葡萄糖异构酶突变体基因的质粒转化感受态细菌细胞HB101，涂在MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上，37℃选择培养36小时，产生具有葡萄糖异构酶活性的克隆；
2)接种单个克隆于液体LB培养基(含50mg/L氨苄青霉素)中培养；
3)离心收集菌体，并悬于磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中，加CoCl2和MgCl2至终浓度分别为250μM和5mM。然后用超声波裂解细菌细胞；
4)离心并收集上清液；
5)上清液经80℃热处理10分钟后，离心并进一步收集上清液。上清液即为部分纯化的葡萄糖异构酶。
在本发明制备耐高温葡萄糖异构酶突变体的方法中，所述的载体可选用本领域已知的各种载体，包括但不限于原核表达载体pGEMT-Easy，pRSET和pET21。在生产本发明提供的耐高温葡萄糖异构酶时，可以将耐高温葡萄糖异构酶基因序列与表达调控序列相连，进而形成耐高温葡萄糖异构酶表达载体。表达载体含有复制起始点和表达调控序列、启动子、或/和增强子、或/和必要的加工信息位点、或/和信号肽编码序列。表达载体还必须含有可供选择的标记基因，如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因。这些表达载体可以用本领域公知的重组DNA技术制备，可参考Sambrook，et al.，Molecularcloning：A laboratory manual.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
在本发明制备葡萄糖异构酶的方法中，所述的葡萄糖异构酶可以在原核细胞(如HB101、BL21、DH5α)或真核细胞(如酿酒酵母、毕赤巴斯德酵母)内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞外表达。
本发明获得的耐高温的葡萄糖异构酶可用于生产果糖含量高于50％的果葡糖浆，或直接用于生产果糖含量为55％(即F55)的果葡糖浆。
附图表说明 下列附图表用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1亲本葡萄糖异构酶TS-F之二级结构。
图2亲本葡萄糖异构酶TS-F之模拟三级结构。
图3葡萄糖异构酶突变体MACROGI1聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4亲本葡萄糖异构酶TS-F与葡萄糖异构酶突变体的比活性。
图5葡萄糖异构酶突变体MACROGI1于80℃下制备果葡糖浆。
图6亲本葡萄糖异构酶TS-F与葡萄糖异构酶突变体MACROGI1在80℃的热稳定。
图7 pH对亲本葡萄糖异构酶TS-F与葡萄糖异构酶突变体MCROGI1的影响。
表1亲本葡萄糖异构酶TS-F与葡萄糖异构酶突变体扩增反应之引物。
具体实施方式 下列实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。实施实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1：亲本基因(TS-F)的扩增及其载体的构建
根据基因库(L09699)基因序列设计引物TF和TR(见表1)。利用引物对TF和TR从T.saccharolyticum中扩增葡萄糖异构酶编码亲本基因(TS-F)。
扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM引物TR，1.5UPfu(Promega，USA)DNA聚合酶，用接种环挑取少许T.saccharolyticum菌体，再用无菌水调反应体积至50μl。
PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，40圈循环：95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 10分钟。扩增的基因连接至载体pGEMT-Easy(Promega，USA)上，得质粒pGMT-TS-F。利用快速质粒制备试剂盒(Marligen Bioscience，USA)提取质粒pGMT-TS-F，经DNA测序确定TS-F葡萄糖异构酶的核苷酸序列为序列表SEQ.ID NO.1，相应的氨基酸序列为序列表SEQ.ID NO.2。
实施例2：葡萄糖异构酶二级结构与三级结构分析
利用PSIPRED软件获得亲本基因编码的葡萄糖异构酶之二级结构(参见McGufGIn L.J.etal.，Bioinformatics 2000，16：404-405)。葡萄糖异构酶二级结构结果见图1。利用SWISS-PROT软件分析获得亲本基因编码的葡萄糖异构酶之模拟三级结构(参见Reutrakul S.etal.，The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2001，86(10)：5039-5044)。葡萄糖异构酶之模拟三级结构见图2。利用BLAST软件(见网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)将亲本葡萄糖异构酶基因与基因库中其它葡萄糖异构酶基因(特别是来源于耐热菌的葡萄糖异构酶基因，如基因库号A72225、P45687和P29441的GI基因)进行比较，获得葡萄糖异构酶基因的保守序列信息。再在亲本GI二级结构与三级结构的基础上，选择位点Q59、R81、W139、R182、V186及T299四位点进行单个位点和多位点组合突变(见实施例3、4和5)。
实施例3：葡萄糖异构酶之多位点组合突变MACROGI1
定点突变技术参考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)：51-59一文之描述。以质粒pGEMT-TS-F为模板，设计引物对81AF和81AR、139FF和139FR、182AF和182AR、186TF和186TR、以及299QF和299QR(见表1)。引物TF和TR见实施例1。用引物对TF和81AR，扩增TFAR片段；引物对81AF和139FR，扩增AFFR片段；引物对139FF和182AR，扩增FFAR片段；引物对182AF和186TR，扩增AFTR片段；引物对186TF和299QR，扩增TFQR片段；引物对299QF和TR，扩增QFTR片段。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM单个引物(来自一对引物)，1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，美国)，40ng pGMT-TS-F，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用试剂盒QIAquickDNA(QIAGEN，德国)回收，分别得到TFAR片段、AFFR片段、FFAR片段、AFTR片段、TFQR和QFTR片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM TR，1.5U PfuDNA聚合酶，40ng TFAR片段，40ng AFFR片段，40ng FFAR片段，40ng AFTR片段，40ng TFQR片段和40ng QFTR片段，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用试剂盒QIAquick DNA回收，得到全长突变基因MACROGI1。将MACROGI1与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-MACROGI1。将质粒pGEMT-MACROGI1转入感受态细菌细胞HB101，在1％ MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-MACROGI1 DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。MACROGI1序列见序列表SEQ.ID NO.3-4。
实施例4：葡萄糖异构酶之多位点组合突变MACROGI2
定点突变技术参考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)：51-59一文之描述。以质粒pGEMT-TS-F为模板，设计引物对59PF和59PR、81AF和81AR、139FF和139FR、182AF和182AR、以及299QF和299QR(见表1)。引物TF和TR见实施例1。用引物对TF和59PR，扩增TFPR片段；用引物对59PF和81AR，扩增PFAR片段；引物对81AF和139FR，扩增AFFR片段；引物对139FF和182AR，扩增FFAR片段；引物对182AF和299QR，扩增AFQR片段；引物对299QF和TR，扩增QFTR片段。诸片段的扩增反应条件皆为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM单个引物(来自一对引物)，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ngpGMT-TS-F，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用试剂盒QIAquick DNA回收，分别得到TFPR片段、PFAR片段、AFFR片段、FFAR片段、AFQR和QFTR片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mMdNTP，400nM引物TF和400nM TR，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng TFPR片段，40ngPFAR片段，40ng AFFR片段，40ng FFAR片段，40ng AFQR片段和40ng QFTR片段，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick DNA回收，得到全长突变基因MACROGI2。将MACROGI2与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-MACROGI2。将质粒pGEMT-MACROGI2转入感受态细菌细胞HB101，在1％MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-MACROGI2 DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。MACROGI2序列见序列表SEQ.ID NO.5-6。
实施例5：葡萄糖异构酶之单一位点突变
定点突变技术参考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)：51-59一文之描述。以质粒pGEMT-MACROGI2(参见实施例4)为模板，设计引物对139CF和139CR(见表1)，将MACROGI2氨基酸序列中第139位点的Phe(F)突变为Cys(C)，获得突变体GI-F139C。引物TF和TR见实施例1。利用引物对TF和139CR，扩增TFCR片段；引物对139CF和TR，扩增CFTR片段。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM单个引物(来自一对引物)，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng pGEMT-MACROGI2，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick DNA回收，得到TFCR片段和CFTR片段。然后扩增全长基因。扩增反应条件为：20mM Tris-HCl，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM TR，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng TFCR与40ng CFTR，再用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。经1％琼脂糖胶电泳分离并用QIAquick DNA回收，得到全长突变基因GI-F139C。将GI-F139C与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-GI-F139C。将质粒pGEMT-GI-F139C转入感受态细菌细胞HB101，在1％MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。从克隆中提取质粒pGEMT-GI-F139C DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误。GI-F139C序列见序列表SEQ.ID NO.7-8。
按照类似步骤，以质粒pGEMT-MACROGI2(参见实施例4)为模板，设计引物对182SF和182SR(见表1)，将MACROGI1氨基酸序列中第182位点的Ala(A)突变为Ser(S)，构建突变体GI-A182S，将突变体与载体pGEMT-Easy连接，得质粒pGEMT-GI-A182S。GI-A182S序列见序列表SEQ.ID NO.9-10。
实施例6：葡萄糖异构酶TS-F的提取与纯化
葡萄糖异构酶的提取与纯化主要参考Lee Y.E.etal.，Journal of GeneralMicrobiology.1993，139：1227-1234。
将含亲本葡萄糖异构酶基因的质粒pGEMT-TS-F转化感受态细菌细胞HB101，在MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上，37℃选择培养36小时。接种单个克隆在5ml LB液体培养基(含50mg/L氨苄青霉素)中培养16小时。离心收集菌体，并悬浮于1ml 20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中，加CoCl2和MgCl2至终浓度分别为250μM和5mM。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，15,000g，15分钟)并收集上清液。上清液经80℃热处理10分钟后，离心(10℃，15,000g，15分钟)并收集上清液。上清液即为部分纯化的葡萄糖异构酶，可用于酶活性的测定和精液果糖含量测定。
实施例7：葡萄糖异构酶突变体的提取与纯化葡萄糖异构酶突变体MACROGI1的提取与纯化与实施例6同，只是所用质粒为pGEMT-MACROGI1。纯化的葡萄糖异构酶见图3。其它葡萄糖异构酶突变体也照此所述提取与纯化。
实施例8：亲本葡萄糖异构酶TS-F活性的测定
取10μl按实施例6制备的葡萄糖异构酶，加入至90μl 1.0M的果糖和20mM磷酸钠缓冲溶液中(pH 6.5)，并含CoCl2和MgCl2终浓度分别为250μM和5mM，反应于80℃进行10分钟。将反应物置冰上以终止反应。反应产物D-葡萄糖由D-葡萄糖氧化酶法测定，测定方法参见Trinder，P.Ann.Clin.Biochem.1981，18：64-67，以及上海科华-东菱诊断用品有限公司的葡萄糖试剂盒使用说明书。用Coomassie Plus Protein AssayReagent Kit(PIERCE，USA)测定酶蛋白浓度。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔果糖为葡萄糖所需的酶量。图4显示亲本TS-F葡萄糖异构酶之比活性。
实施例9：葡萄糖异构酶突变体MACROGI1活性测定
葡萄糖异构酶突变体MACROGI1活性测定与实施例8同。其它葡萄糖异构酶突变体的活性也照此所述测定。图4显示葡萄糖异构酶突变体突变体与亲本TS-F葡萄糖异构酶比活性之差异。
实例10：用葡萄糖异构酶突变体制备直接F55果葡糖浆
取按实例7步骤获得的部分纯化的葡萄糖异构酶MACROGI1酶液20μg，加入至6ml50％(W/V)葡萄糖，并含20mM磷酸钠缓冲溶液中(pH 6.5)，并加入CoCl2和MgCl2至终浓度分别为250μM和5mM。80℃反应24小时后，加入100μl 20％三氯醋酸终止反应，离心(10℃，15,000g，15分钟)并收集上清液。取10μl上清液稀释100倍后，用国标法测定产生的果糖含量(参考中华人民共和国国家标准：GB 8274-87)。图5显示葡萄糖异构酶突变体MACROGI1将D-葡萄糖转化至果糖之转化率。
实例11：亲本葡萄糖异构酶TS-F热稳定性测定
取按实例6获得的部分纯化的葡萄糖异构酶TS-F转入7只1.5ml离心管中。每只离心管分别加入200μl酶液，并加入200μl矿物油，将离心管置于80℃水浴中，0小时、2小时、4小时、小时、16小时、32小时、72小时后分别取出一管酶液，离心(10℃，15,000g，20分钟)后，取上清液，按实例8测定葡萄糖异构酶残余蛋白和残余比活性。图6显示亲本葡萄糖异构酶TS-F在80℃的热稳定。
实例12：葡萄糖异构酶突变体MACROGI1热稳定性测定
葡萄糖异构酶突变体MACROGI1热稳定性测定与实例11同。图6显示葡萄糖异构酶突变体MACROGI1在80℃的热稳定。
实例13：pH对亲本葡萄糖异构酶TS-F的影响
取按实例6收集的菌体，分别悬浮于1ml pH4.5醋酸钠缓冲溶液(20mM)、或1ml pH5.0醋酸钠缓冲溶液(20mM)、或1ml pH 5.5醋酸钠缓冲溶液(20mM)中，或1ml pH6.0磷酸钠缓冲溶液(20mM)、1ml pH 6.5磷酸钠缓冲溶液(20mM)、1ml pH 7.0磷酸钠缓冲溶液(20mM)或1ml pH 7.5磷酸钠缓冲溶液(20mM)中，加CoCl2和MgCl2至终浓度为250μM，加MgCl2至终浓度为5mM。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，15,000g，15分钟)收集上清液。上清液经80℃热处理10分钟后，离心(10℃，15,000g，15分钟)并收集上清液，上清液即为部分纯化的葡萄糖异构酶，按实例8测定葡萄糖异构酶活性。图7显示pH对亲本葡萄糖异构酶TS-F的影响。
实例14：pH对葡萄糖异构酶突变体MACROGI1的影响
pH对葡萄糖异构酶突变体MACROGI1的影响的测定与实例13同。图7显示pH对葡萄糖异构酶突变体MACROGI1的影响。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。
表1亲本葡萄糖异构酶TS-F与葡萄糖异构酶突变体PCR扩增反应之引物
| 亲本 | 引物对 |
| TS-F | TF：5′AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGAA 3′TR：5′ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATACT3′ |
| 突变体 | 引物对 |
| MACROGI1 | 81AF：5′TAGCGAAAGCAAGGGTAGAAGCAGCATTTGA 3′81AR：5′TCTACCCTTGCTTTCGCTATATCCATAGGAT 3′139FF：5′AAGTTTTGTTTGGTACCGCAAATCTTTTCTC 3′139FR：5′GCGGTACCAAACAAAACTTTTGTCTTGCTGG 3′182AF：5′AGCTTGGCGCGGAAAACTACGTATTTTGGGG 3′182AR：5′TAGTTTTCCGCGCCAAGCTCCTTAGTAATCT 3′186TF：5′AAAACTACACATTTTGGGGTGGAAGAGAAGG 3′186TR：5′CCCCAAAATGTGTAGTTTTCGCGGCCAAGCT 3′299QF：5′ACGCAAATCAAGGCGACATGCTTTTGGGATG 3′299QR：5′ATGTCGCCTTGATTTGCGTCAATTGATCCTA 3′ |
| MACROGI2 | 59PF：5′GAACAGATCCGTTTGGCAAGGCTACTATGCA 3′59PR：5′TTGCCAAACGGATCTGTTCCATCAGCAGTAA 3′81AF：5′TAGCGAAAGCAAGGGTAGAAGCAGCATTTGA 3′81AR：5′TCTACCCTTGCTTTCGCTATATCCATAGGAT 3′139FF：5′AAGTTTTGTTTGGTACCGCAAATCTTTTCTC 3′139FR：5′GCGGTACCAAACAAAACTTTTGTCTTGCTGG 3′182AF：5′AGCTTGGCGCGGAAAACTACGTATTTTGGGG 3′182AR：5′TAGTTTTCCGCGCCAAGCTCCTTAGTAATCT 3′299QF：5′ACGCAAATCAAGGCGACATGCTTTTGGGATG 3′299QR：5′ATGTCGCCTTGATTTGCGTCAATTGATCCTA 3′ |
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| GI-A182S | 182SF：5′AGCTTGGCAGCGAAAACTACGTATTTTGGGG 3′182SR：5′TAGTTTTCGCTGCCAAGCTCCTTAGTAATCT 3′ |
序列表
序列(SEQ.ID NO.)1
(a)序列特征：
*长度：1320碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat
61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag
121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt
181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa
241 cgaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc
301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat
361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtggggt
421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct
481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt
541 ggccgcgaaa actacgtatt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca
601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca
661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa
721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac
781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa
841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatacaggc
901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt
961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca
1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg
1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac
1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc
1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac
1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa
序列(SEQ.ID NO.)2
(a)序列特征：
*长度：440个氨基酸残基
*类型：多肽
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：Protein
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
mnkyfenvsk ikyegpksnn pysfkfynpe evidgktmee hlrfsiaywh tftadgtdqf
gkatmqrpwn hytdpmdiak rrveaafeff dkinapffcf hdrdiapegd tlretnknld
tivamikdyl ktsktkvlwg tanlfsnprf vhgastscna dvfaysaaqv kkaleitkel
grenyvfwgg regyetllnt dmeleldnfa rflhmavdya keigfegqfl iepkpkeptk
hqydfdvanv laflrkydld kyfkvniean hatlafhdfq helryaring vlgsidantg
dmllgwdtdq fptdirmttl amyevikmgg fdkgglnfda kvrrasfepe dlflghiagm
dafakgfkva yklvkdgvfd kfieeryasy kegigadivs gkadfkslek yalehsqivn
ksgrqelles ilnqylfae
序列(SEQ.ID NO.)3
(a)序列特征：
*长度：1320碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
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(a)序列特征：
*长度：440个氨基酸残基
*类型：多肽
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(b)分子类型：Protein
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(a)序列特征：
*长度：1320碱基对
*类型：核酸
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*长度：440个氨基酸残基
*类型：多肽
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序列(SEQ.ID NO.)7
(a)序列特征：
*长度：1320碱基对
*类型：核酸
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(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
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序列(SEQ.ID NO.)8
(a)序列特征：
*长度：440个氨基酸残基
*类型：多肽
*链型：单链
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(b)分子类型：Protein
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharalyticum B6A。
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序列(SEQ.ID NO.)9
(a)序列特征：
*长度：1320碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
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841 catgagctAa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatcaaggc
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1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc
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1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa
序列(SEQ.ID NO.)10
(a)序列特征：
*长度：440个氨基酸残基
*类型：多肽
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：Protein
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
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GSENYVFWGGREGYETLLNTDMELELDNFARFLHMAVDYAKEIGFEGQFLIEPKPKEPTK
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KSGRQELLESILNQYLFAE*
Claims (15)
1.一种果葡糖浆制备新方法，其特征在于：该方法使用了一种耐高温葡萄糖异构酶。
2.按照权利要求1项所述的制备方法，其特征还在于：用权利要求1项所述的耐高温葡萄糖异构酶在高于70℃反应条件下转化葡萄糖至果糖，直接生产果糖含量≥50％的果葡糖浆。
3.按照权利要求2项所述的耐高温葡萄糖异构酶，其特征在于：耐高温葡萄糖异构酶以液相或固相形式起作用。
4.按照权利要求1项所述的制备方法，其特征还在于：用含有权利要求1项所述的耐高温葡萄糖异构酶之固相化细菌或真菌细胞在高于70℃反应条件下转化葡萄糖至果糖，直接生产果糖含量≥50％的果葡糖浆。
5.一种分离的DNA分子，其特征在于：它是编码权利要求1项所述的耐高温葡萄糖异构酶的核苷酸序列。
6.权利要求5项所述的DNA分子，其特征在于：所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.IDNO.3的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突变形式(具有与SEQ.ID NO.3的核苷酸序列≥75％的同源性)，所述的突变包括：缺失、无义、插入、错义。
7.权利要求6项所述的DNA分子，其特征在于：所述的核苷酸序列编码序列表SEQ.IDNO.4中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式(具有与SEQ.ID NO.4的核苷酸序列≥90％的同源性)，该修饰形式功能上相当或与高活性葡萄糖异构酶相关。
8.权利要求5项所述的DNA分子，其特征还在于：所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.IDNO.5的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突变形式(具有与SEQ.ID NO.5的核苷酸序列≥75％的同源性)，所述的突变包括：缺失、无义、插入、错义。
9.权利要求8项所述的DNA分子，其特征在于：所述的核苷酸序列编码序列表SEQ.IDNO.6中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式(具有与SEQ.ID NO.6的核苷酸序列≥90％的同源性)，该修饰形式功能上相当或与高活性葡萄糖异构酶相关。
10.权利要求5项所述的DNA分子，其特征还在于：所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.ID NO.7的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突变形式(具有与SEQ.ID NO.7的核苷酸序列≥75％同源性)，所述的突变包括：缺失、无义、插入、错义。
11.权利要求10项所述的DNA分子，其特征在于：所述的核苷酸序列编码序列表SEQ.ID NO.8中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式(具有与SEQ.ID NO.8的核苷酸序列≥90％同源性)，该修饰形式功能上相当或与高活性葡萄糖异构酶相关。
12.权利要求5项所述的DNA分子，其特征还在于：所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.ID NO.9的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突变形式(具有与SEQ.ID NO.9的核苷酸序列≥75％的同源性)，所述的突变包括：缺失、无义、插入、错义。
13.权利要求12项所述的DNA分子，其特征在于：所述的核苷酸序列编码序列表SEQ.ID NO.10中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式(具有与SEQ.ID NO.10的核苷酸序列≥90％的同源性)，该修饰形式功能上相当或与高活性葡萄糖异构酶相关。
14.权利要求1项所述的葡萄糖异构酶是未经纯化的粗酶。
15.权利要求1项所述的葡萄糖异构酶是部分纯化或完全纯化的酶。
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| CN 200410037441 CN1693473A (zh) | 2004-05-08 | 2004-05-08 | 果葡糖浆制备新方法与耐高温葡萄糖异构酶突变体 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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