CN1288242C - 葡萄糖脱氢酶 - Google Patents

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Abstract

提供了以吡咯并喹啉醌为辅酶的被修饰的水溶性葡萄糖脱氢酶，其中在特异区域内的至少一个氨基酸残基已被另一氨基酸所取代。本发明之水溶性PQQGDH具有改良的热稳定性。

Description

葡萄糖脱氢酶
本申请是第00807553.0号中国专利申请的分案申请。
                    技术领域
本发明涉及以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的制备以及它们在葡萄糖测定上的用途。
                    发明背景
血液葡萄糖是糖尿病的一个重要标志。在使用微生物的发酵生产中，通过测定葡萄糖水平来监测该工艺。传统的葡萄糖测定是以利用葡萄糖氧化酶(GOD)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶促方法为基础的。不过，基于GOD的测定要求在测试系统中添加过氧化氢酶或过氧化物酶以便对葡萄糖氧化反应中产生的过氧化氢进行定量。G6PDH已用于分光光度法的葡萄糖测定中，其中须将辅酶NAD(P)加入反应体系中。
本发明的一个目的是提供热稳定性有所改良被修饰的水溶性PQQGDH。
                    发明内容
我们发现具高稳定性的PQQGDH是酶促葡萄糖测定中另外可选择使用的新酶。由于PQQGDH具有高的葡萄糖氧化活性，并且是无需氧作为电子受体的辅酶结合酶，所以它们可用作葡萄糖传感器的识别元件。
PQQGDH催化葡萄糖氧化产生葡糖酸内酯的反应。PQQGDH包括膜结合的酶以及水溶性的酶。膜结合PQQGDH是分子量87kDa且广泛存在于多种革兰氏阴性菌中的单肽蛋白质。已在乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的多个菌株中鉴定到水溶性PQQGDH(Biosci.Biotech.Biochem.(1995)，59(8)，1548-1555)，且它们的结构基因已被克隆，获得其氨基酸序列(Mol.Gen.Genet.(1989)，217：430-436).来源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH是分子量约50kDa的同型二聚体。
最近，荷兰科学家对水溶性PQQGDH进行了X-射线晶体结构分析，从而得到此酶的较高级结构(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，289，319-333(1999)，来自乙酸钙不动杆菌之脱辅基形式的可溶性醌蛋白质葡萄糖脱氢酶的晶体结构显示了一种新的内部保守序列的重复片段；A.Oubrie等，The EMBO Journal，18(19)5187-5194(1999)，可溶性醌蛋白质葡萄糖脱氢酶的结构和机制，A.Oubrie等，美国国家科学院院报(PNAS)，96(21)，11787-11791(1999)，与甲肼复合的可溶性醌蛋白质葡萄糖脱氢酶的活性位点结构；共价辅因子抑制剂复合物，A.Oubrie等)。这些文献显示，水溶性PQQGDH是含6个W-基元的β-螺旋蛋白质(图7)。
为了开发可用于临床检测或食品分析的被修饰PQQGDH，我们改良了传统的水溶性PQQGDH以增加其热稳定性，作为此项研究的结果，我们通过在水溶性PQQGDH的特定区域引入氨基酸变化而成功地获得了具有很高稳定性的酶。
因此，本发明提供了以吡咯并喹啉醌为辅酶的被修饰葡萄糖脱氢酶，其中对应于由乙酸钙不动杆菌衍生的水溶性PQQGDH(此后也称为野生型PQQGDH)的第231位丝氨酸或第209位谷氨酰胺或第210位谷氨酰胺或第420位的天冬酰胺或第421位丙氨酸被其它氨基酸替代。如此处所用，“被修饰的葡萄糖脱氢酶”指天然存在的葡萄糖脱氢酶中至少一个氨基酸残基被其它氨基酸残基替代而产生的葡萄糖脱氢酶。此处的氨基酸编号由作为第+1位的甲硫氨酸开始。
本发明还提供了以吡咯并喹啉醌为辅酶的被修饰葡萄糖脱氢酶，其中选自下组的一个或多个区域中的至少一个氨基酸残基被其它氨基酸残基替代：SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第48-53位、第60-62位、第69-71位、第79-82位、第91-101位、第110-115位、第127-135位、第147-150位、第161-169位、第177-179位、第186-221位、第227-244位、第250-255位、第261-263位、第271-275位、第282-343位、第349-377位、第382-393位、第400-403位、第412-421位、第427-432位、第438-441位和第449-468位，其特征在于，它比来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH具有更高的热稳定性。优选的，50℃加热10分钟后，本发明的修饰PQQGDH残留活性较野生型PQQGDH高10％以上，更优选高20％以上，还更优选高30％以上。优选的，本发明的修饰PQQGDH在55℃的热失活半寿期比野生型PQQGDH的热失活半寿期长5分钟以上，更优选长15分钟以上。在尤其优选的本发明修饰PQQGDH中，以下区域中至少有一个氨基酸残基被另一氨基酸残基所替代：如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第227-244位、第186-221位或第412-421位残基。在更优选的本发明修饰PQQGDH中，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列内的第231位丝氨酸被赖氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和半胱氨酸之一所替代，或第209位谷氨酰胺被赖氨酸所替代，或第210位谷氨酸被赖氨酸所替代，或第420位天冬氨酸被赖氨酸所替代，或第421位丙氨酸被天冬氨酸所替代。
另一方面，本发明的修饰PQQGDH包含序列：
其中Xaa231是指除丝氨酸之外的其他天然氨基酸残基；
Asn Leu Asp Gly Xaa231 Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn
Gly Val Val Ser
或序列：
Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn
Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Xaa209 Xaa210 Leu Asn Gly
Lys Asp Tyr His Thr Tyr Met Gly
其中Xaa209和Xaa210指任何天然氨基酸残基，条件是当Xaa209代表谷氨酰胺时，Xaa210就不代表谷氨酸；
或序列：
Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Xaa420 Xaa421
其中Xaa420和Xaa421指任何天然氨基酸残基，条件是当Xaa420代表天冬氨酸时，Xaa421就不代表丙氨酸。
本发明还提供了编码任何上述被修饰的葡萄糖脱氢酶的基因，含该基因的载体和含该基因的转化子，以及包含本发明的修饰葡萄糖脱氢酶在内的葡萄糖测定试剂盒和葡萄糖传感器。
本发明之被修饰的PQQGDH酶蛋白质具有高的热稳定性及对葡萄糖的高氧化活性，以致它们可应用于高灵敏度和高选择性的葡萄糖测定中。尤其是，预计这些特性有利于此酶在制备/纯化过程中得以大量生产且失活较少；此酶由于其在溶液中的高稳定性而易于保存；此酶由于其较不易失活，从而可用于制备测定试剂盒或酶传感器；由于其高的热稳定性，用此酶制备的测定试剂盒或酶传感器具有优异的保存特性。
                       附图概述
图1显示本发明所用质粒pGB2的结构。
图2显示制备编码本发明被修饰酶的突变基因的设计。
图3显示本发明之被修饰酶的热稳定性。
图4显示本发明之被修饰酶的底物特异性。
图5显示利用本发明之被修饰PQQGDH进行的葡萄糖测定。
图6显示应用本发明之被修饰PQQGDH的酶传感器的校正曲线。
图7显示水溶性GDH的拓扑结构(Oubrie等，图4)。
                         发明详述
本发明最优选的实施例
被修饰PQQGDH的结构
我们通过易错PCR在编码水溶性PQQGDH的基因编码区内引入随机突变，以构建具有氨基酸变化的水溶性PQQGDH文库。将这些基因转化入大肠杆菌，通过热处理后PQQGDH的残留活性进行筛选，得到表达具有改良的热稳定性之PQQGDH的许多克隆。
对这些克隆之一的核苷酸序列分析显示，第231位丝氨酸已被改变成半胱氨酸。当此氨基酸残基被各种其他氨基酸残基取代时，在每个个案中都得到了热稳定性比野生型水溶性PQQGDH高的突变酶。
水溶性PQQGDH具有含6个W-基元的β-螺旋蛋白质结构。本发明中，已发现用另外的氨基酸残基替代第227-244位环区域的第231位丝氨酸可提高其热稳定性。然后，在其他的环区域内引入定位突变以试图提高其热稳定性。第186-221位残基环区具有谷氨酰胺209赖氨酸或谷氨酸210赖氨酸的突变酶或第412-421位残基环区具有天冬氨酸420赖氨酸或丙氨酸421天冬氨酸的突变酶显示有改良的热稳定性。
因此，已证实在本发明的环区引入合适的改变可构建具有改良热稳定性的水溶性PQQGDH。这可能是因为连接W-基元的环区之间的相互作用利于水溶性PQQGDH中β-螺旋蛋白质结构的稳定性。上述第231位丝氨酸、第209位谷氨酰胺、第210位甘氨酸、第420位天冬氨酸和第421位丙氨酸只是例证性的，而非限制了本发明的范围。本发明在本领域中首先指出了可通过在结构基因环区的特异位点引入改变而提高PQQGDH的热稳定性，从而在此为改善PQQGDH的热稳定性提供了方法学。
本发明的已修饰PQQGDH特征是，在SEQ ID NO：1所示的野生型PQQGDH氨基酸序列的特异区域具有氨基酸残基的变换。因此，本发明还提供了以吡咯并喹啉醌为辅酶的被修饰葡萄糖脱氢酶，其中选自下组的一个或多个区域中的至少一个氨基酸残基被其它氨基酸残基替代：SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第48-53位、第60-62位、第69-71位、第79-82位、第91-101位、第110-115位、第127-135位、第147-150位、第161-169位、第177-179位、第186-221位、第227-244位、第250-255位、第261-263位、第271-275位、第282-343位、第349-377位、第382-393位、第400-403位、第412-421位、第427-432位、第438-441位和第449-468位残基。
在本发明优选的被修饰的PQQGDH中，下述区域中的至少一个氨基酸残基被其它氨基酸残基所替代：SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的第227-244位、第186-221位或第412-421位残基。在特别优选的本发明修饰PQQGDH中，第231位丝氨酸可被赖氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和半胱氨酸之一所替代，或第209位谷氨酰胺被赖氨酸所替代，或第210位谷氨酸被赖氨酸所替代，或第420位天冬氨酸被赖氨酸所替代，或第421位丙氨酸被天冬氨酸所替代。
另一方面，本发明的修饰PQQGDH包含序列：
Asn Leu Asp Gly Xaa231 Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn
Gly Val Val Ser
其中Xaa231是指除丝氨酸之外的其他天然氨基酸残基；
或序列：
Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn
Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Xaa209 Xaa210 Leu Asn Gly
Lys Asp Tyr His Thr Tyr Met Gly
其中Xaa209和Xaa210指任何天然氨基酸残基，条件是当Xaa209代表谷氨酰胺时，Xaa210就不代表谷氨酸；
或序列：
Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Xaa420 Xaa421
其中Xaa420和Xaa421指任何天然氨基酸残基，条件是当Xaa420代表天冬氨酸时，Xaa421就不代表丙氨酸。
在本发明被修饰的葡萄糖脱氢酶中，只要保留葡萄糖脱氢酶的活性，其它的氨基酸残基可被部分删除或取代，或可添加其它的氨基酸残基。有关此类氨基酸残基删除、取代或添加的多种技术是本领域所已知的，例如，可参见文献：Sambrook等，“分子克隆：实验室手册”，第二版，1989，冷泉港实验室出版社，纽约。按本文所教的方法，本领域技术熟练人员可方便地检测含此类删除、取代或添加的葡萄糖脱氢酶是否具有预期的葡萄糖脱氢酶活性。本领域技术熟练人员还可按本文所教的方法预计来自其它细菌之水溶性PQQGDH中的环结构区，并取代此区域的氨基酸残基以获得具改良热稳定性的修饰葡萄糖脱氢酶。尤其是，相应于来自乙酸钙不动杆菌之水溶性PQQGDH第231位丝氨酸、209位谷氨酰胺、210位谷氨酸、第420位天冬氨酸或第421位丙氨酸的氨基酸残基可通过比对比较蛋白质的一级结构而方便地鉴定出来，从而通过按照本发明用其它氨基酸残基取代这些残基可获得被修饰的葡萄糖脱氢酶。这些被修饰的葡萄糖脱氢酶也在本发明的范围内。
制备修饰PQQGDH的过程
编码来自乙酸钙不动杆菌之野生型水溶性PQQGDH的基因序列详见于SEQ ID NO：2。
可通过用编码要取代之氨基酸序列的核苷酸序列替代编码野生型水溶性PQQGDH的基因中编码存在于环区之氨基酸残基的核苷酸序列而构建编码本发明之修饰PQQGDH的基因。这些位点特异的核苷酸序列取代的多种技术是本领域所已知的，例如，可参见文献：Sambrook等，“分子克隆：实验室手册”，第二版，1989，冷泉港实验室出版社，纽约。将这样获得的突变基因插入基因表达载体(例如，质粒)中，并转化合适的宿主(例如，大肠杆菌)。许多用于表达外源蛋白质的载体/宿主系统是已知的，且诸如细菌、酵母或培养细胞之类的多种宿主都是合适的宿主。
通过易错PCR在靶环区域引入随机突变，以构建在环区带突变之修饰水溶性PQQGDH的基因文库。将这些基因转化入大肠杆菌，通过PQQGDH的热稳定性筛选克隆。水溶性PQQGDH表达于大肠杆菌中时被分泌到周质空间，因此它们可通过测定大肠杆菌细胞的酶活而方便的检测到。此文库在60-70℃加热约30分钟，然后与葡萄糖和PMS-DCIP染料结合以目测残留的PQQGDH活性，以便挑选加热后仍显示残留活性的克隆并分析其核苷酸序列以证实突变。
培养由此获得的表达修饰PQQGDH的转化细胞，通过离心或其他方法从培养基中收获细胞，然后用French挤压器或渗透破膜的方法破碎细胞，从而将周质的酶释放到培养基中。可将此酶超速离心得到含水溶性PQQGDH的部分。或者，利用合适的宿主/载体系统可将所表达的PQQGDH分泌到培养基中。用离子交换层析、亲和层析、HPLC等等方法纯化产生的水溶性部分以制备本发明的修饰PQQGDH。
测定酶活的方法
在催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸内酯的反应中，本发明的PQQGDH与作为辅酶的PQQ相结合。
利用氧还反应染料的成色反应可以测定酶活，从而检测PQQGDH催化的葡萄糖氧化作用还原的PQQ的量。合适的成色试剂包括，例如PMS(吩嗪硫酸二甲酯)-DCIP(2，6-二氯靛酚)、铁氰化钾和二茂铁。
热稳定性
通过在高温(例如，55℃)下保温目的酶，以一定的间隔取样并测定酶活以监测酶活性随时间的下降，可评估本发明的修饰PQQGDH的热稳定性。通常地，酶的热稳定性表示为热失活半衰期，即酶活性降低到50％所需要的时间(t1/2)。或者，热稳定性还可表示为酶在热处理一定时间后残留的酶活性(热处理后的活性与热处理前活性的比例)。
本发明的修饰PQQGDH特征在于其热稳定性高于野生型的PQQGDH。因此，它们的优点在于可以在制备/纯化过程中大量生产且失活较少；这些酶由于其在溶液中的高稳定性而易于保存；这些酶由于其较不易失活，从而可用于制备测定试剂盒和酶传感器；由于其高的热稳定性，用这些酶制备的测定试剂盒或酶传感器具有优异的保存特性。
葡萄糖测定试剂盒
本发明还涉及含按本发明之修饰PQQGDH的葡萄糖测定试剂盒。本发明的葡萄糖测定试剂盒包含至少足以作一轮测定的量的本的发明之修饰PQQGDH。除本发明的修饰PQQGDH外，试剂盒通常还包括测定必需的缓冲液、介质、制定校正曲线所用的标准葡萄糖溶液以及说明书。本发明的修饰PQQGDH可以多种形式提供，如冻干粉或在合适保存溶液中的溶液。尽管它们也可以脱辅基酶的形式提供而在使用前转换成全酶，本发明的修饰PQQGDH还是优选以全酶形式提供。
葡萄糖传感器
本发明还涉及使用本发明之修饰PQQGDH的葡萄糖传感器。通过下述方法将本发明的酶固定在合适的电极上，如碳、金和铂等电极：用交联剂；包裹在多聚体基质中；用透析膜包被；利用可光交联的多聚体、电导多聚体或氧还多聚体；用包括二茂铁或其衍生物在内的电介质将酶固定在多聚体中或吸附到电极上；或它们的任何联合形式。尽管它们也可以脱辅基酶形式固定而PQQ作为另外的层或在溶液中提供，但本发明的修饰PQQGDH优选以全酶形式固定在电极上。通常，本发明的修饰PQQGDH通过戊二醛固定在碳电极上，然后用含胺的试剂处理以封闭戊二醛。
葡萄糖水平测定如下。将PQQ、氯化钙和介质加入含缓冲液的恒温孔中，保持恒定的温度。合适的介质包括，例如，铁氰化钾和吩嗪硫酸二甲酯。已固定有本发明之修饰PQQGDH的电极被用作工作电极与相反的电极(如铂电极)和参照电极(如银/氯化银电极)联合使用。在碳电极上加恒定电压达到稳定的电流后，加入含葡萄糖的样品以检测电流的增加。可通过用标准浓度葡萄糖溶液制定的校正曲线计算样品中的葡萄糖水平。
所有此处所引用的专利和文件的内容均收编于此作为参照。本申请要求以日本专利申请文件No.1999-101143和2000-9152为基础的优先权，其内容完全收编于此作为参照。
以下实施例对本发明进行了进一步的描述，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1.
突变PQQGDH基因文库的构建和筛选：
将编码来自乙酸钙不动杆菌之PQQGDH的结构基因插入载体pTrc99A(Pharamacia)的多克隆位点得到质粒pGB2(图1)。此质粒可用作模板通过易错PCR将随机突变引入编码区。进行PCR反应的溶液组分见表1，PCR条件为：先94℃3分钟，再94℃3分钟，50℃2分钟和72℃2分钟，进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。
表1
  Taq DNA聚合酶(5U/μl)   0.5μl
  模板DNA   1.0μl
  正向引物ABF   4.0μl
  反向引物ABR   4.0μl
  10X Taq聚合酶缓冲液   10.0μl
  1Mβ-巯基乙醇   1.0μl
  二甲亚砜   10.0μl
  5mM MnCl2   10.0μl
  10mM dGTP   2.0μl
  2mM dATP   2.0μl
  10mM dCTP   2.0μl
  10mM dTTP   2.0μl
  H2O   51.5μl
  100.0μl
将产生的突变型水溶性PQQGDH文库转化入大肠杆菌，并将所形成的每个克隆转移到微量滴定板上。将此滴定板在60℃加热约30分钟后，加入葡萄糖和PMS-DCIP，目测残留的PQQGDH活性。获得在加热后仍显示PQQGDH活性的许多克隆。
随机选择这些克隆之一，分析核苷酸序列，显示第231位丝氨酸已改变成半胱氨酸。
实施例2.
修饰PQQGDH基因的构建：
以如SEQ ID NO：2所示之来自乙酸钙不动杆菌的PQQGDH结构基因为基础，如图2所示，利用质粒pGB2，按照标准方法，通过定位诱变技术将编码第231位丝氨酸、第209位谷氨酰胺、第420位天冬氨酸或第421位丙氨酸的核苷酸序列替换成编码所给出氨基酸残基的核苷酸序列。表2显示了用于诱变之合成寡核苷酸靶向引物的序列。在表2中，“S231D”指231位丝氨酸被天冬氨酸所取代，其他以此类推。
表2
S231D 5′-C CTT TGG AAT ATC TCC ATC AAG ATT TAA GC-3′
S231H 5′-C CTT TGG AAT ATG TCC ATC AAG ATT TAA GC-3′
S231K 5′-C CTT TGG AAT TTT TCC ATC AAG ATT TAA GC-3′
S231L 5′-C CTT TGG AAT CAT TCC ATC AAG ATT TAA GC-3′
S231M 5′-C CTT TGG AAT AGT TCC ATC AAG ATT TAA GC-3′
S231N 5′-C CTT TGG AAT ATT TCC ATC AAG ATT TAA GC-3′
I278F 5′-C AAT GAG GTT GAA TTC ATC GTC AGA G-3′
Q209K 5′-C ACC ATT CAG TTC TTT TTG AGT TGG C-3′
E210K 5′-C ACC ATT CAG TTT TTG TTG AGT TGG C-3′
D420K 5′-A CAT CGG TAC AGC TTT ATC ATA AGT AG-3′
A421D 5′-A CAT CGG TAC ATC GTC ATC ATA AGT AG-3′
将含有编码来自乙酸钙不动杆菌之PQQGDH的部分基因的KpnI-HindIII片断整合入载体质粒pKF18k(Takara Shuzo Co.，Ltd)，并用作模板。将50fmol的此模板、5pmol MutanTM-Express Km试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)所附的选择引物和50pmol磷酸化靶向引物与相当于总体积(20μl)1/10的试剂盒所附之退火缓冲液混合，混合物在100℃加热3分钟，从而将质粒变性成为单链。选择引物用于回复pKF18k之卡那霉素抗性基因上的双琥珀突变。将混合物冰置5分钟使引物退火。在此混合物中加入3μl试剂盒所附的延伸缓冲液、1μlT4DNA连接酶、1μlT4 DNA聚合酶和5μl无菌水，合成互补链。
将合成链转化DNA错配修复缺失的大肠杆菌菌株BMH71-18mutS，振荡培养过夜以扩增质粒。
然后，从培养物中提取质粒拷贝并转化大肠杆菌MV1184，再从产生的菌落中提取质粒。将这些质粒测序以证实目的突变的引入。为了构建修饰的PQQGDH，用这些片段取代质粒pGB2A上编码野生型PQQGDH之基因的KpnI-HindIII片段。
实施例3.
被修饰的酶的制备：
将编码野生型或各修饰PQQGDH的基因插入大肠杆菌表达载体pTrc99A(Pharmacia)的多克隆位点，产生的质粒转化大肠杆菌菌株DH5α。用Sakaguchi摇瓶在450ml L培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中37℃振荡培养转化子过夜，转接于含1mM氯化钙和500μM PQQ的7升L培养基中。开始培养大约3小时后，加入终浓度为0.3mM的异丙基硫代半乳糖苷，再继续培养1.5小时。从培养物中离心(5,000xg，10分钟，4℃)收获培养细胞，用0.85％的氯化钠溶液洗两次。用Frech挤压器破碎收集的细胞，离心(10,000xg，15分钟，4℃)去除未破碎的细胞。将上清夜超速离心(160,500xg(40,000r.p.m.)，90分钟，4℃)得到水溶性部分，在以后的实施例中用作粗酶样品。
用pH7.0的10mM磷酸缓冲液进一步透析由此获得的水溶性组分过夜。将此透析样品吸附到已用pH7.0的10mM磷酸缓冲液平衡好的阳离子层析柱TSKgel CM-TOYOPEARL 650M(Tosoh Corp.)上。用750mlpH7.0的10mM磷酸缓冲液洗柱，然后用含0-0.2M氯化钠的pH7.0的10mM磷酸缓冲液以5ml/分钟的流速将酶洗脱。回收具有GDH活性的组分并用pH7.0的10mM MOPS-NAOH缓冲液透析过夜。由此得到电泳均一的修饰PQQGDH蛋白。它在随后的实施例中用作纯化的酶样品。
实施例4
酶活性的测定：
在10mM MOPS-NAOH缓冲液(pH7.0)中用PMS(吩嗪硫酸二甲酯)-DCIP(2，6-二氯靛酚)测定酶活性，用分光光度计监测DCIP在600nm处吸收值的变化，酶的反应速率表示为吸收值的下降速率。1分钟内还原1μmol DCIP的酶活性为1U。DCIP在pH7.0的摩尔消光系数是16.3mM-1。
实施例5
粗酶样品热稳定性的评估：
通过与1μM PPQ和1mM氯化钙混合1小时或更长时间，将实施例3中获得的野生型和修饰PQQGDH的各粗酶样品转换成全酶，然后在55℃保温。在一定的时间间隔取等分试样并在冰上快速冷却。用实施例4的方法测定这些样品的酶活性以确定活性降低到50％所需的时间(t1/2)。
结果如表3所示。
表3
  t1/2(min )
  野生型S231KS231LS231DS231CS231MS231HS231NI278FQ209KE210KD420KA421D   10951625501415502540402080
本发明的所有修饰PQQGDH在55℃都具有比野生型PQQGDH长的热失活半衰期，这证明了它们具有比野生型PQQGDH高的热稳定性。
实施例6
纯化后酶样品的热稳定性评估：
以实施例5同样的方式检测野生型酶和实施例3中获得的被修饰酶S231K的纯化样品在55℃的热失活半衰期。野生型酶和被修饰酶S231K的纯化样品其半衰期分别为5分钟和41分钟。
通过与1μM PPQ和1mM氯化钙混合1小时或更长时间，将野生型酶和实施例3中获得的被修饰酶S231K的各纯化样品转换成全酶。然后将各样品于给定温度在含1μM PPQ和1mM氯化钙的10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中保温10分钟，迅速冰置冷却。用实施例4的方法测定这些样品的酶活性以确定相对于热处理前活性的残留活性。
这些结果如图3所显示。在40-62.5℃的多个温度上，被修饰的酶S231K活性均高于野生型酶。
实施例7
酶活性的评估：
通过与1μM PPQ和1mM氯化钙混合1小时或更长时间，将实施例3中获得的被修饰S231K的粗酶样品转换成全酶。将187μl等分试样与3μl活化试剂(制备自48μl 6mM DCIP，8μl 600mM PMS和16μl10mM磷酸缓冲液，pH7.0)和多种浓度的10μl葡萄糖溶液混合，按实施例4所示方法室温测定酶的活性。以底物浓度对酶活性作图确定Km和Vmax。S231K变体对葡萄糖的Km值约为20mM，Vmax值为3300U/mg。据最新报道，野生型PQQGDH对葡萄糖的Km值约为20mM，而Vmax值为2500-7000U/mg(具体取决于测定条件)。这些结果显示，与野生型PQQGDH相比，被修饰的PQQGDH S231K具有高活性。
实施例8
底物特异性的评估：
检测各种被修饰酶粗样品的底物特异性。被检测的底物是葡萄糖、2-脱氧-D-葡萄糖、甘露糖、阿洛糖、3-o-甲基-D-葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖和麦芽糖，在存在1μM PQQ和1mM氯化钙的条件下将各样品与20mM的各底物保温30分钟，用与实施例7相同的方式测定酶活性，以确定对于针对葡萄糖的活性的相对活性。如图4所示，本发明的所有被修饰酶均显示出与野生型酶相似的底物特异性。
实施例9
葡萄糖测定：
将被修饰的PQQGDH用于葡萄糖测定。通过与1μM PQQ和1mM氯化钙混合1小时或更长时间，将被修饰的酶S231K转换成全酶，加入各种浓度的葡萄糖以及5μM PQQ和10mM氯化钙，以DCIP在600nm的吸收值变化为基础，按实施例4所述的方法测定酶活性。如图5所示，被修饰的PQQGDH S231K可用于测定5mM-50mM浓度范围的葡萄糖。
实施例10
酶传感器的制备和评估：
与20mg碳糊冻干5个单位的被修饰酶S231K。彻底混匀后，将混合物放到预先填充有约40mg碳糊并在滤纸上磨光的碳糊电极表面上。用含1％戊二醛的10mM MOPS缓冲液(pH7.0)室温处理此电极30分钟，然后用含20mM赖氨酸的10mM MOPS缓冲液(pH7.0)室温处理此电极20分钟封闭戊二醛。将电极在10mM MOPS缓冲液(pH7.0)中室温平衡1小时以上，然后4℃保存。
这样制备的酶传感器被用于检测葡萄糖的水平。图6显示了作出的校准曲线。因此，本发明被修饰PQQGDH固定其上的酶传感器可用于测定1mM-12mM范围内的葡萄糖。
工业适用性
本发明的被修饰PQQGDH具有优异的热稳定性，以致它们预期具有下述优点：在制备/纯化中利于大量生产而失活较少；这些酶由于其在溶液中的高稳定性而易于保存；这些酶由于其较不易失活，从而可用于制备测定试剂盒和酶传感器；由于其高的热稳定性，用这些酶制备的测定试剂盒或酶传感器具有优异的保存特性。
序列表
<110>Sode，Koji
<120>葡萄糖脱氢酶
<130>YCT477
<150>JP11-101143
<151>1999-4-8
<150>JP2000-9152
<151>2000-1-18
<160>16
<210>1
<211>454
<212>PRT
<213>乙酸钙不动杆菌
<400>1
Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn
  1               5                  10                  15
Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu
             20                  25                  30
Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly
         35                  40                  45
Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe
     50                  55                  60
Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu
 65                  70                  75                  80
Glv Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile
                 85                  90                  95
Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn
            100                 105                 110
Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu
        115                 120                 125
Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His
    130                 135                 140
Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr
145                 150                 155                 160
Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn
                165                 170                 175
Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr
            180                 185                 190
His Thr Tyr Mel Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile
        195                 200                 205
Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr
    210                 215                 220
Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys
225                 230                 235                 240
Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu
                245                 250                 255
Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys
            260                 265                 270
Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys
        275                 280                 285
Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val
    290                 295                 300
Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro
305                 310                 315                 320
Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro
                325                 330                 335
Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser
            340                 345                 350
Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu
        355                 360                 365
Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile
    370                 375                 380
Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met
385                 390                 395                 400
Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly
                405                 410                 415
Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp
            420                 425                 430
Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys
        435                 440                 445
Phe Thr Tyr Lys Ala Lys
    450
<210>2
<211>1612<212>DNA<213>乙酸钙不动杆菌
<400>2
agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat  60
cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc  120
ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc  180
tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc  240
atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct  300
aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc  360
aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt  420
accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc  480
tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac  540
agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga  600
tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc  660
aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg  720
taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga  780
actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg  840
aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg  900
acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca  960
aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc  1020
gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc  1080
caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt  1140
gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac  1200
cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg  1260
gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg  1320
ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt  1380
agatccaac ttatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg  1440
ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc  1500
cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct  1560
cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc          1612
<210>3
<2t1>18
<212>PRT
<213>乙酸钙不动杆菌
<220>
<222>4
<223>Xaa是任何氨基酸残基
<400>3
Asn Leu Asp Gly Xaa Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val
  1               5                  10                  15
Val Ser
<210>4
<211>36
<212>PRT
<213>乙酸钙不动杆菌
<220>
<222>24
<223>Xaa是任何氨基酸残基
<222>25
<223>Xaa是任何氨基酸残基
<400>4
Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn Gln
  1               5                  10                  15
Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Xaa Xaa Leu Asn Gly Lys Asp Tyr His
             20                  25                  30
Thr Tyr Met Gly
         35
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>乙酸钙不动杆菌
<220>
<222>9
<223>Xaa是任何氨基酸残基
<222>10
<223>Xaa是任何氨基酸残基
<400>5
Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Xaa Xaa
  1               5                  10
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>6
cctttggaat atctccatca agatttaagc    30
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>7
cctttggaat atgtccatca agatttaagc    30
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>8
cctttggaat ttttccatca agatttaagc    30
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>9
cctttggaat cattccatca agatttaagc    30
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>10
cctttggaat agttccatca agatttaagc    30
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>11
cctttggaat atttccatca agatttaagc    30
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>12
caatgaggtt gaattcatcg tcagag        26
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>13
gaccattcag ttctttttga gttggc        26
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>14
gaccattcag tttttgttga gttggc        26
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>15
acatcggtac agctttatca taagtag       27
<210>16
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成的序列
<220>
<223>用于点突变的引物
<400>16
acatcggtac atcgtcatca taagtag       27

Claims (12)

1.以吡咯并喹啉醌为辅酶并具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的被修饰的葡萄糖脱氢酶，其中所述被修饰的葡萄糖脱氢酶具有至少一个选自如下组的氨基酸替代：
(1)第231位丝氨酸(SEQ ID NO：1第207位的丝氨酸)被选自赖氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、半胱氨酸的氨基酸所替代；
(2)第209位谷氨酰胺(SEQ ID NO：1第185位的谷氨酰胺)被赖氨酸所替代；
(3)第210位谷氨酸(SEQ ID NO：1第186位的谷氨酸)被赖氨酸所替代；
(4)第420位天冬氨酸(SEQ ID NO：1第396位的天冬氨酸)被赖氨酸所替代；和
(5)第421位丙氨酸(SEQ ID NO：1第397位的丙氨酸)被天冬氨酸所替代。
2.权利要求1的被修饰的葡萄糖脱氢酶，其中第231位丝氨酸(SEQ ID NO：1第207位的丝氨酸)被选自赖氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、半胱氨酸的氨基酸所替代。
3.权利要求1的被修饰的葡萄糖脱氢酶，其中第209位谷氨酰胺(SEQ ID NO：1第185位的谷氨酰胺)被赖氨酸所替代。
4.权利要求1的被修饰的葡萄糖脱氢酶，其中第210位谷氨酸(SEQID NO：1第186位的谷氨酸)被赖氨酸所替代。
5.权利要求1的被修饰的葡萄糖脱氢酶，其中第420位天冬氨酸(SEQ ID NO：1第396位的天冬氨酸)被赖氨酸所替代。
6.权利要求1的被修饰的葡萄糖脱氢酶，其中第421位丙氨酸(SEQID NO：1第397位的丙氨酸)被天冬氨酸所替代。
7.编码权利要求1-6中任一项的被修饰的葡萄糖脱氢酶的基因。
8.含权利要求7之基因的载体。
9.含权利要求7之基因的转化子。
10.权利要求9的转化子，其中所述基因被整合入染色体中。
11.含权利要求1-6中任一项的被修饰葡萄糖脱氢酶的葡萄糖测定试剂盒。
12.含权利要求1-6中任一项的被修饰葡萄糖脱氢酶的葡萄糖传感器。
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