MX2007002224A - Metodo para determinar la concentracion de analitos en muestras por mediacion directa de enzimas. - Google Patents

Abstract

El contenido de glucosa en sangre puede determinarse al poner en contacto una muestra de sangre con una tira de prueba que contiene una glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ (o derivados o isomeros de la misma) como un co-factor, un indicador de sal de tetrazolio, pero en ausencia de un mediador. La figura mas representativa de la invencion es la numero a.

Description

MÉTODO PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE ANALITOS EN MUESTRAS POR MEDIACIÓN DIRECTA DE ENZIMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere generalmente a métodos para determinar la cantidad de un analito en fluidos biológicos. Más particularmente, la invención incluye métodos para medir el contenido de glucosa en sangre u otros fluidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La determinación cuantitativa de analitos en fluidos biológicos tales como sangre entera es de gran importancia en el diagnóstico y el tratamiento de ciertas condiciones médicas. Por ejemplo, la determinación del nivel de glucosa en sangre de individuos diabéticos, quienes deben verificar frecuentemente el nivel de glucosa en su sangre para regular sus dietas y medicación. La medición del contenido de glucosa en sangre se puede realizar por medio de varios métodos. Un método emplea un biosensor electroquímico. Otro método proporciona una indicación visual del contenido de glucosa tal como al desarrollar un color por la reacción de un indicador. La presente invención es de este último tipo, aunque también puede tener aplicación en métodos electroquímicos.

Los métodos electroquímicos han sido descritos en muchas patentes. Éstos pueden dividirse en varias categorías que incluyen coulométricos, amperométricos y de voltametría cíclica. Una solicitud de patente norteamericana recientemente publicada es 2003/0094384A1. La solicitud japonesa, publicada No. 2000171428A2 describe la preparación de un sensor electrolítico de glucosa. Ha habido muchas patentes que describen métodos que emplean indicadores los cuales desarrollan un color u otras respuestas mensurables cuando son oxidados químicamente como el último paso en una serie de reacciones. En general, estos métodos pueden dividirse ampliamente en aquellos que emplean analito oxidasas {por ejemplo, glucosa oxidasa) y aquellos que emplean analito deshidrogenasas {por ej emplo, glucosa deshidrogenasa) . Los procedimientos utilizados son similares, pero emplean diferentes enzimas, mediadores e indicadores. Los métodos que utilizan enzimas glucosa oxidasa son enseñados en muchas patentes y solicitudes de patente norteamericanas. Los ejemplos representativos son las patentes norteamericanas Nos. 4,211,845; 4,808,529; 5,116,729; 5,264,348; 5,620,863 y la solicitud de patente norteamericana No. 2003/0077702 Al. Estas patentes/solicitudes de patente enseñan un método en el cual la glucosa es oxidada a ácido glucónico con la liberación de peróxido de hidrógeno. Se dice que el peróxido de hidrógeno oxida un indicador en presencia de una peroxidasa para producir un color mensurable, indicando el contenido de glucosa de la muestra de sangre . Algunas patentes recientes sugieren un proceso en el cual la glucosa se convierte primero a ácido glucónico y luego a gluconolactona con la liberación de peróxido de hidrógeno. También se ha sugerido que la gluconolactona se forma primero y luego se hidroliza a ácido glucónico. Sin tener en cuenta qué esquema de proceso es correcto, las enzimas glucosa oxidasa han sido utilizadas ampliamente en tiras secas y en otras técnicas para medir el contacto de glucosa en sangre . Se han empleado varios indicadores en los sensores de glucosa, tales como indicadores de tipo benzidina y azinas heterocíclicas. Por ejemplo, 3, 3', 5,5'-tetrametilbenzidina y siringaldazina, luminol , o-tolidina, o-dianisitina, entre otros. Una familia de indicadores es aquella de los precursores de tintes de tetrazolio. Los ejemplos de patentes que describen estos indicadores incluyen las patentes norteamericanas Nos. 5,126,275, 5,322,680, 5,300,637, 5,290,536, 5,360,595 y 6,586,199. Los indicadores de tetrazolio se utilizan en la invención que es descrita a continuación. El método descrito en el documento U.S. 6,200,773 y su patente norteamericana No. 5,902,731 es de particular interés con respecto a la presente invención. En estas patentes, una prueba del contenido de glucosa en sangre emplea glucosa deshidrogenasa (GDH) , con NAD o PQQ o sus derivados, como un co- factor, un precursor de tinte de tetrazolio, una enzima diaforasa o un análogo y una sal de nitrito. La Figura 5 de la patente ? 773 es un diagrama del proceso mediante el cual se detecta la glucosa por medio del desarrollo de un color a partir de la reducción del precursor de tinte de tetrazolio a un formazan. La PQQ (pirroloquinolina-quinona o sus derivados o isómeros) como un co-factor para las enzimas glucosa deshidrogenasa (GDH) ha sido de reciente interés, como es evidente a partir de las descripciones en los documentos U.S. 2002/0076751 Al; EP 1 167 519 Al; U.S. 6,103,509 y JP 11243949 A2. En general, estas descripciones enseñan la modificación genética de las enzimas glucosa deshidrogenasa que se dice que proporcionan un desempeño mejorado en los sensores de glucosa. Los presentes inventores han descubierto inesperadamente que un proceso similar a aquel descrito en la patente norteamericana No. 6,200,773 se puede llevar a cabo en ausencia de un mediador, tal como la enzima diaforasa. Este descubrimiento hace posible un método más simple para detectar la glucosa en muestras de sangre, como será observado en la siguiente descripción de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto que ciertas combinaciones de co-factor de glucosa deshidrogenasa se pueden utilizar para proporcionar una respuesta colorimétrica a partir de indicadores de tetrazolio cuando están en contacto con soluciones de glucosa pero sin incluir el mediador que se requiere normalmente. En particular, se ha demostrado que la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ (PQQ-GDH) proporciona una respuesta similar a la glucosa, tanto con un mediador como sin el mismo. Se espera que otras enzimas deshidrogenasa dependientes de quinona proporcionen un desempeño similar con sus compuestos donadores correspondientes. En un aspecto, la invención es una solución de reactivo para medir la concentración de glucosa en sangre. Una glucosa deshidrogenasa (GDH) dependiente de pirroloquinolina-quinona (PQQ) (o sus derivados o isómeros) como un co-factor se utiliza con un precursor de tinte de tetrazolio, pero sin incluir un mediador tal como PMS (metosulfato de fenazina) o una diaforasa. En otro aspecto, la invención es una tira de prueba seca que contiene una GDH, PQQ (o un derivado o isómero) como un co-factor y un precursor de tinte de tetrazolio, pero con la ausencia del mediador usual. La tira estará en contacto con la sangre que contiene glucosa y el color desarrollado será medido y correlacionado con el contenido de glucosa. La invención también es un método mejorado para medir el contenido de glucosa de sangre entera utilizando las tiras de prueba que contienen GDH y PQQ (o un derivado o isómero) como un co-factor y un precursor de tinte de tetrazolio en ausencia sustancial de un mediador.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica de los resultados del Ejemplo 1. La Figura 2 es una gráfica de los resultados del Ejemplo 2. La Figura 3 es una gráfica de los resultados del Ejemplo 3. La Figura 4 es una gráfica de los resultados del Ejemplo 4.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Medición de Glucosa en Sangre En los métodos los cuales emplean glucosa oxidasa, esas enzimas se hacen reaccionar con glucosa, produciendo glucosa oxidada y peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno oxida un compuesto indicador en presencia de una peroxidasa. El indicador oxidado produce un color que es correlacionado con el contenido de glucosa de la muestra de sangre. En la presente invención, se utiliza una glucosa deshidrogenasa, junto con un co-factor y un precursor de tinte de tetrazolio para producir una respuesta de color proporcional al contenido de glucosa de la muestra. Estas reacciones son descritas normalmente por la siguiente secuencia de reacciones: Glucosa + co-factoroxld-GDH ? Gluconolactona + co-factorrTd.GDH co-factorred.GDH + Mediadoroxld ? co-factoroxld-GDH + ed¡adorred Med¡adorred + indicador de tetrazolio ? Mediadoroxld + Formazan De acuerdo con esta secuencia de reacciones , la glucosa es convertida a gluconolactona mientras que el cofactor de deshidrogenasa es reducido y luego re-oxidado por un mediador para la reacción adicional con la glucosa disponible. El mediador puede ser cualquiera de aquellos que son familiares para las personas expertas en el campo, tales como PMS (metosulfato de fenazina) , PES (etosulfato de fenazina) DCIP (2 , 6-diclorofenolindofenol) y ferroceno. Se ha considerado que el mediador es necesario para obtener una respuesta útil al reducir el indicador de tetrazolio a formazan. Sin embargo, en la presente invención, no es necesario un mediador y se obtiene una respuesta útil en su ausencia, como será mostrado en los ejemplos posteriores. Los inventores han descubierto que no se requiere el mediador cuando la glucosa deshidrogenasa es clasificada como EC 1.1.99.17 (ahora EC1.1.5.2) (International Union of Biochemistry and Molecular Biology; Nomenclature and Classification of Enzyme-Catalyzed Reactions; NC-IUBMB) . Estas enzimas son dependientes de ciertos co-factores, en este caso, el co-factor es pirroloquinolina-quinona (PQQ) o derivados o isómeros de la misma. Otras enzimas glucosa deshidrogenasa son dependientes de otras coenzimas o cofactores, tales como dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD) , dinucleótido de flavina-adenina (FAD) y sus análogos. La razón para el uso exitoso de GDH dependiente de PQQ en ausencia sustancial de un mediador no se entiende en este momento. Mientras que no es limitada por una teoría, se puede asociar con la capacidad de la sal de tetrazolio para entrar en contacto más directo con la enzima y/o su capacidad para ser menos limitada por la difusión con respecto al co-factor. De esta manera, en el método de la invención parece que el indicador de tetrazolio es reducido por el co-factor de deshidrogenasa reducido de acuerdo con la siguiente secuencia de reacción: Glucosa + co-factoroxld-GDH -» Gluconolactona + co.factorrTd.GDH co-factorred.GDH + indicador de tetrazolio ? Formazan + co-factor0Xld-GDH Deshidrogenasas Las enzimas glucosa deshidrogenasa son comercialmente disponibles de Toyoba, Kyowa, Amano, Genzyme, Biozyme, entre otros y son ya sea enzimas nativas o enzimas recombinantes que son producidas por medio de la fermentación clásica y/o métodos recombinantes. A fin de ser efectivas, las deshidrogenasas requieren un co-factor, tal como NAD, FAD y PQQ y sus derivados o isómeros. Puesto que las deshidrogenasas se han obtenido de sus proveedores en combinación con un co-factor, éstas han sido caracterizadas por sus proveedores y su carácter no se conoce completamente en este momento. Las combinaciones de enzimas deshidrogenasa con co-factores conocidos han sido sometidas a prueba, los resultados se muestran en los ejemplos. Como se observará, las enzimas GDH dependientes de PQQ no requirieron la presencia de un mediador. Los presentes inventores descubrieron que la glucosa deshidrogenasa dependiente de PQQ (o derivados o isómeros) no requirió un mediador a fin de medir la reacción con glucosa en presencia de un indicador de sal de tetrazolio. Se cree que otras enzimas deshidrogenasa con quinonas como aceptor (clase EC 1.1.5) se pueden comportar de manera similar en alcoholes oxidantes u otros compuestos donadores de CH-OH.

Mediadores Se ha considerado necesario incluir en un sistema de prueba un mediador para reoxidar el co-factor de deshidrogenasa reducido después de la reacción con glucosa para formar la lactona correspondiente. Una diaforasa o un PMS (metosulfato de fenazina) son mediadores típicos. Una característica de la presente invención es que no es necesario un mediador. Como se mostrará en los ejemplos posteriores, se observará que el nuevo sistema de reactivos se comporta de manera similar si son incluidos los mediadores o no. Indicadores de Tetrazolio Los indicadores de tetrazolio se describen generalmente en las patentes norteamericanas mencionadas al principio. En el documento U.S. 6,200,773, se listan ciertos precursores de tinte de tetrazolio que son particularmente útiles en reacciones con combinaciones de co-factor de deshidrogenasa. Entre éstos se encuentra el compuesto de tetrazolio designado WST-4, utilizado en los ejemplos posteriores.

Ejemplo 1 Detección de Glucosa con Glucosa Deshidrogenasa No dependiente de NAD y WST-4 Una tira de una membrana de poliétersulfona 0.8 µm se sumergió en una solución que contenía amortiguador de fosfato 370 mM, pH 7, polímero al 0.5% {por ejemplo, Teleostatina) , surfactantes {por ej emplo, Cremofor ELMR al 0.1% y Tritón X305MR al 0.2%), 5.5 mg de glucosa deshidrogenasa no dependiente de NAD(P) [una GDH dependiente de quinona designada EC 1.1.99.17 (ahora EC1.1.5.2)] de Toyobo, 800 U/mg y 60 mM del indicador (WST-4 de Dojindo) pero que no contenía mediador. Las muestras de glucosa se prepararon a partir de muestras de sangre entera con 40% de hematocrito y la concentración se midió utilizando el analizador de glucosa YSIMR (Yellow Springs Instruments) como sigue: a) 0 mg/dL de plasma humano b) 48 mg/dL de plasma humano c) 101 mg/dL de plasma humano d) 201 mg/dL de plasma humano e) 397 mg/dL de plasma humano f) 607 mg/dL de plasma humano Cuando la tira de reactivo se puso en contacto con soluciones de glucosa, se desarrolló un cambio en el color que fue proporcional a la concentración de glucosa agregada. El cambio de color se midió después de un tiempo de desarrollo de 50 segundos por medio del uso de un dispositivo de medición de reflectancia. La reflectancia se convirtió a K/S, una función de linearización desarrollada a partir de las ecuaciones de Kubelka-Munk. K/S es igual a (1-R2)/2R, donde R es la reflectancia medida. La respuesta de cada una de las dos muestras de glucosa duplicadas se muestra en la Figura 1. Los resultados del Ejemplo 1 muestran que se obtuvo una respuesta mensurable y sustancialmente lineal aunque no se incluyó un mediador {por ejemplo, PMS) en la mezcla de reacción como se describe en la técnica clásica de sensores de glucosa basados en deshidrogenasa.

Ejemplo 2 Comparación de la Determinación de Glucosa mediante la Detección Directa con aquella de la Mediación Clásica Una tira de polietilentereftalato (PET, MelenexMR de Dupont) se revistió con una mezcla de amortiguador (fosfato 0.25M, pH 7.4) y los ingredientes inactivos {por ej emplo, agentes de modificación de la reología opacificadores y surfactantes) . En este ejemplo, una mezcla incluyó 0.6 g/L de poliacrilato, 0.6 g/L de alcohol polivinílico, 1.5 g/L de dióxido de titanio, 1 g/L de carbonato de calcio, 0.001 a 0.006% de Silwet L-7600MR, Gerepon T-77MR, Surfonyl DF37MR y que contenía un indicador 120 mM {por ej emplo, WST-4) y 6 KU/mL de glucosa deshidrogenasa no dependiente de NAD(P) (EC1.1.99.17 , ahora EC1.1.5.2 de Bayer, patente pendiente) . Otra tira se revistió con la misma mezcla a la cual se agregó 5 mM de mediador (PMS) . Las muestras de glucosa plasmática de sangre entera se aplicaron a las muestras del reactivo revestido anteriormente y el cambio en el color se midió como se describe en el Ejemplo 1. Las muestras de glucosa se prepararon a partir de muestras de sangre entera con 40% de hematocrito y la concentración de cada una se midió utilizando el analizador de glucosa YSIMR (Yellow Springs Instruments) como sigue: a) 1 mg/dL de plasma humano b) 56 mg/dL de plasma humano c) 112 mg/dL de plasma humano d) 224 mg/dL de plasma humano e) 448 mg/dL de plasma humano f) 678 mg/dL de plasma humano La reflectancia promedio de dos duplicados para cada una de las muestras de glucosa se registró en tanto 7 como 33 segundos después de que se aplicó la muestra al reactivo de glucosa. Los resultados del ejemplo 2 (véase Figura 2) muestran que una respuesta mensurable y sustancialmente lineal se obtuvo con el método de mediación directa y que la respuesta observada fue sustancialmente la misma que aquella del método de mediación clásica. También se demostró que la velocidad de la detección era sustancialmente la misma que el método de detección clásico como es evidente por la reflectancia de punto final medida en tiempos de prueba de 7 segundos y 33 segundos.

Ejemplo 3 El Ejemplo 2 se repitió excepto que se utilizó un indicador diferente de sal de tetrazolio. La mediación directa con otra sal de tetrazolio se demostró al sustituir un análogo de HTC-45 (una sal de triazolil-tetrazolio de Bayer Corporation, véase la Patente Norteamericana No. 5,126,275, columna 21) por WST-4 en el Ejemplo 1. Después de un tiempo de reacción de 7 segundos, se demostró una respuesta a una dosis dada sustancialmente lineal para la glucosa, como se puede observar en la Figura 3. Ejemplo 4 (Comparativo) Una tira de una membrana de poliétersulfona 0.8 µm (Osmonics) se sumergió en una solución que contenía NAD como un co-factor con GDH dependiente de NAD (EC1.1.1.47) y un indicador de sal de tetrazolio, pero sin un mediador. La tira tratada se puso en contacto con soluciones de glucosa que tenían concentraciones conocidas. Se descubrió que sustancialmente ninguna respuesta se midió, como se puede observar en la Figura 4.

Modalidad Alternativa A Un reactivo para medir la concentración de glucosa en sangre que comprende : (a) una glucosa deshidrogenasa (GDH) ; (b) un co-factor para GDH, pirrolo-quinolina quinona (PQQ) o un derivado o isómero de PQQ, la GDH y el co-factor son capaces de reducir un indicador de sal de tetrazolio a un formazan coloreado en ausencia sustancial de un mediador; y (c) un indicador de sal de tetrazolio. Modalidad Alternativa B Un reactivo de la modalidad A en donde la glucosa deshidrogenasa de (a) es clasificada de acuerdo con NC-IUBMB como EC1.1.99.17 (ahora EC1.1.5.2). Modalidad Alternativa C Un reactivo de la modalidad A en donde el cofactor es PQQ. Modalidad Alternativa D Un reactivo de la modalidad A en donde el co-factor es un derivado o isómero de PQQ. Modalidad Alternativa E Un reactivo de la modalidad A en donde el indicador de sal de tetrazolio es WST-4. Modalidad Alternativa F Un reactivo de la modalidad A en donde el indicador de sal de tetrazolio es un análogo de HTC-45. Modalidad Alternativa G Una tira de prueba para medir la glucosa en sangre que comprende : (a) un soporte; (b) una capa de reactivo dispuesta sobre el soporte, el sistema de reactivo que comprende; (1) una glucosa deshidrogenasa (GDH) ; (2) un co-factor para GDH, pirrolo-quinolina-quinona (PQQ) o un derivado o isómero de PQQ, la GDH y el co-factor son capaces de reducir un indicador de sal de tetrazolio a un formazan coloreado en ausencia sustancial de un mediador; y (3) un indicador de sal de tetrazolio. Modalidad Alternativa H Una tira de prueba de la modalidad G en donde la glucosa deshidrogenasa de (b) (1) es clasificada de acuerdo con NC-IUBMB como EC1.1.99.17 (ahora EC1.1.5.2) . Modalidad Alternativa I Una tira de prueba de la modalidad G en donde el co-factor es PQQ. Modalidad Alternativa J Una tira de prueba de la modalidad G en donde el co-factor es un derivado o isómero de PQQ.

Modalidad Alternativa K Una tira de prueba de la modalidad G en donde el indicador de sal de tetrazolio es WST-4. Modalidad Alternativa L Una tira de prueba de la modalidad G en donde el indicador de sal de tetrazolio es un análogo de HTC-45. Modalidad Alternativa M Un método para medir la glucosa en sangre que comprende : (a) un soporte; (b) un sistema de reactivo dispuesto sobre el soporte, el sistema de reactivo comprende una glucosa deshidrogenasa (GDH) , como un co-factor para GDH pirrolo-quinolina quinona (PQQ) o un análogo de (PQQ) , la GDH y el co-factor son capaces de reducir un indicador de sal de tetrazolio a un formazan coloreado en ausencia de un mediador y un indicador de sal de tetrazolio; (c) medir el color desarrollado del indicador de sal de tetrazolio; y (d) correlacionar el color desarrollado en el paso (b) con el contenido de glucosa de la muestra de sangre . Modalidad Alternativa N El método de la modalidad M en donde la glucosa deshidrogenasa es clasificada como EC1.1.99.17.

Modalidad Alternativa 0 El método de la modalidad M en donde el co-factor es PQQ. Modalidad Alternativa P El método de la modalidad M en donde el co-factor es un derivado o isómero de PQQ. Modalidad Alternativa Q El método de la modalidad M en donde el indicador de sal de tetrazolio es WST-4. Modalidad Alternativa R El método de la modalidad M en donde el indicador de sal de tetrazolio es un análogo de HTC-45. Mientras que la invención es susceptible a varias modificaciones y formas alternativas, las modalidades específicas se muestran a manera de ejemplo en los dibujos y se describen con mayor en este documento. Sin embargo, se debe entender que no se propone que la invención sea limitada a las formas particulares que se describen. Preferiblemente, la invención es para cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que se encuentran dentro del espíritu y alcance de la invención definida por las reivindicaciones anexas.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES 1. Un reactivo para medir la concentración de glucosa en sangre, caracterizado porque comprende: (a) una glucosa deshidrogenasa (GDH) ; (b) como un co-factor para GDH, pirrolo-quinolina-quinona (PQQ) o un derivado o isómero de PQQ, la GDH y el co-factor son capaces de reducir un indicador de sal de tetrazolio a un formazan coloreado en ausencia sustancial de un mediador; y (c) un indicador de sal de tetrazolio.
2. 2. Un reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la glucosa deshidrogenasa de (a) es clasificada de acuerdo con NC-IUBMB como EC1.1.99.17 (ahora EC1.1.5.2).
3. 3. Un reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el co-factor es PQQ.
4. 4. Un reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el co-factor es un derivado o isómero de PQQ.
5. 5. Un reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el indicador de sal de tetrazolio es WST-4.
6. 6. Un reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el indicador de sal de tetrazolio es un análogo de HTC-45.
7. 7. Una tira de prueba para medir la glucosa en sangre, caracterizada porque comprende: (a) un soporte; (b) una capa de reactivo dispuesta sobre el soporte, el sistema de reactivo comprende; (1) una glucosa deshidrogenasa (GDH); (2) como un co-factor para GDH, pirrolo-quinolina-quinona (PQQ) o un derivado o isómero de PQQ, la GDH y el co-factor son capaces de reducir un indicador de sal de tetrazolio a un formazan coloreado en ausencia sustancial de un mediador, y (3) un indicador de sal de tetrazolio.
8. 8. Un tira de prueba de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la glucosa deshidrogenasa de (b) (1) es clasificada de acuerdo con NC-IUBMB como EC1.1.99.17 (ahora EC1.1.5.2).
9. 9. Un tira de prueba de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el co-factor es PQQ.
10. 10. Un tira de prueba de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el co-factor es un derivado o isómero de PQQ.
11. 11. Un tira de prueba de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el indicador de sal de tetrazolio es WST-4.
12. 12. Un tira de prueba de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el indicador de sal de tetrazolio es un análogo de HTC-45.
13. 13. Un método para medir la glucosa en sangre, caracterizado porque comprende: (a) un soporte; (b) un sistema de reactivo dispuesto sobre el soporte, el sistema de reactivo comprende una glucosa deshidrogenasa (GDH) , como un co-factor para GDH, pirrolo-quinolina-quinona (PQQ) o un análogo de (PQQ) , la GDH y el co-factor son capaces de reducir un indicador de sal de tetrazolio a un formazan coloreado en ausencia de un mediador y un indicador de sal de tetrazolio; (c) medir el color desarrollado del indicador de sal de tetrazolio; y (d) correlacionar el color desarrollado en el paso (b) con el contenido de glucosa de la muestra de sangre.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la glucosa deshidrogenasa es clasificada como EC1.1.99.17.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el co-factor es PQQ.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el co-factor es un derivado o isómero de PQQ.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el indicador de sal de tetrazolio es WST-4.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el indicador de sal de tetrazolio es un análogo de HTC-45.