JP6815335B2

JP6815335B2 - 血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セット

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Publication number: JP6815335B2
Application number: JP2017565399A
Authority: JP
Inventors: 嘉哉佐藤; 健行森内; 裕亮駒田
Original assignee: TRUMO KABUSHIKI KAISHA
Current assignee: TRUMO KABUSHIKI KAISHA
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2016-10-27
Publication date: 2021-01-20
Anticipated expiration: 2036-10-27
Also published as: EP3412763A4; HK1257848A1; JP2021052754A; WO2017134878A1; CN108368472B; EP3412763B1; JPWO2017134878A1; US20210388412A1; US11130982B2; CN108368472A; ES2845209T3; EP3412763A1; US10648015B2; US20180305734A1; US20200165660A1

Description

本発明は、血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットに関し、特に、検体としての血液が全血である場合であっても、血液点着前の発色を抑制することができると共に、血液点着後の発色速度を向上させることができる血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットに関する。

従来より、血液中のグルコース成分を測定する血糖値測定装置が広汎に利用されている（例えば、特許文献１参照）。

この血糖値測定装置では、例えば、酵素及び発色色素を含む試薬（例えば、特許文献２参照）を有する血糖値測定チップに血液（全血）を注入し、試薬と血液（全血）とを反応させた際の呈色度合を光学的に測定することにより、血液中のグルコース成分が測定される（例えば、特許文献３参照）。

特開２００６−２１５０３４号公報特許第４３８１４６３号公報国際公開第２０１４／０４９７０４号

しかしながら、全血での血糖値測定に用いられる発色色素（例えば、ＷＳＴ−４等のテトラゾリウム塩）は、試薬に含まれる緩衝剤の存在により、血液点着前に発色してしまうという問題があった。

斯かる問題を解決すべく、緩衝剤を添加しないことを検討したが、緩衝剤を添加しないと、血液点着後の発色（即ち、吸光度）の変化速度が遅くなり、血液点着してから所定時間を経過した後も発色（即ち、吸光度）の変化が継続してしまうという問題があった。

本発明の目的は、血液点着前の発色を抑制することができると共に、血液点着後の発色速度を向上させることができる血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットを提供することである。

本発明の第１の態様としての血糖値測定試薬は、グルコースを基質とする酵素と、電子受容体と、発色色素とを含む血糖値測定試薬において、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素をさらに含むことを特徴とするものである。
これにより、血液点着前の発色を抑制することができると共に、血液点着後の発色速度を向上させることができる。
なお、本明細書において、「芳香族炭化水素」は、複素環式化合物とは異なる炭素環式化合物（環式化合物のうち、環に炭素原子だけを含む化合物）の一種と定義され、アミンを有さない。

本発明の１つの実施形態として、前記芳香族炭化水素が２個以上のスルホン酸基を有することが好ましい。
ここで、前記芳香族炭化水素における芳香族環の周囲全体に亘ってスルホン酸基を配置することで、前記芳香族炭化水素分子内における親水性部分及び疎水性部分のそれぞれが偏在しないため、試薬が血液によって湿潤しやすい（なじみやすい）。

ここで、前記芳香族炭化水素としては、１，３−ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム、又は、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム、がより好ましい。
なお、１，３−ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム及びナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウムは、緩衝能を有さないが、血液自体が備える中性付近の緩衝能を利用することができる。

本発明の１つの実施形態として、前記芳香族炭化水素の含有量が、３０ｍｏｌ％以上であることが好ましい。

本発明の１つの実施形態として、前記発色試薬としてテトラゾリウム塩をさらに含むことが好ましい。

本発明の第２の態様としての血糖値測定チップは、血液が供給される供給口と、該供給口が一端に形成された流路と、該流路内に設けられた試薬と、を備え、前記血液中の血糖値を測定する血糖値測定装置に装着可能な血糖値測定チップであって、前記試薬が、本発明の第１の態様としての血糖値測定試薬であることを特徴とするものである。

本発明の第３の態様としての血糖値測定装置セットは、本発明の第２の態様としての血糖値測定チップと、血液中の血糖値を測定する血糖値測定装置とを備える血糖値測定装置セットであって、前記血糖値測定装置が、前記血液と前記試薬との反応物に光を照射する照射部と、前記反応物を透過又は前記反応物から反射した測定光を受光する受光部と、前記測定光から得られる信号を処理する処理部と、を備えることを特徴とするものである。

本発明によれば、血液点着前の発色を抑制することができると共に、血液点着後の発色速度を向上させることができる血糖値測定試薬、血糖値測定チップ、及び血糖値測定装置セットを提供することができる。

本発明の一実施形態に係る血糖値測定チップを示す平面図である。図１における線Ｉ−Ｉに沿った断面図である。本発明の一実施形態に係る血糖値測定装置セットを示す平面図である。図３に示す血糖値測定装置セットの血糖値測定装置及び血糖値測定チップを示す縦断面図である。各試薬（実施例１〜４、比較例１〜５）の発色速度を示すグラフであり、縦軸は吸光度指標（３０ｓ後の発色量を１００％とした場合の指標）を、横軸は点着後の時間（ｍｓ：ミリセコンド）を示す。各試薬（実施例１〜４、比較例１〜５）の血液点着前における保存安定性を示すグラフであり、縦軸は吸光度（ａｂｓ）を示す。

（血糖値測定試薬）
本発明に係る血糖値測定試薬は、少なくとも、酵素と、電子受容体（メディエータ）と、発色色素と、芳香族炭化水素と、を含有している。また、本発明に係る血糖値測定試薬は、さらに必要に応じて、遷移金属塩等のその他の成分を含有してなる。
なお、血液中のＤ−グルコースと電子受容体（例えば、後述するｍ−ＰＭＳ）とが酵素（例えば、後述するＧＤＨ）によって反応して、その反応により発色色素（例えば、後述するＷＳＴ−４）が発色する。

＜芳香族炭化水素＞
前記芳香族炭化水素としては、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ベンゼンスルホン酸ナトリウム（下記構造式（１）参照）、１，３−ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム（下記構造式（２）参照）、１，３, ５−ベンゼントリスルホン酸三ナトリウム（下記構造式（３）参照）、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（下記構造式（４）参照）、アントラセン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（下記構造式（５）参照）、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、２個以上のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素（例えば、１，３−ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム）が、血液点着後の発色速度をより向上させることができる点で、好ましい。ここで、スルホン酸基（イオン）の数が多い方が、前記芳香族炭化水素の親水性を向上しつつ、界面活性剤として作用を低減させることが可能となるため、全血を試料とした場合でも、発色速度をより向上させることができ、また、少ない含有量で本願発明の効果が得られる。また、芳香族炭化水素が有するスルホン酸基の数が多くても、安定性に悪影響は無い。

前記芳香族炭化水素の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０ｍｏｌ％以上が好ましく、５０ｍｏｌ％以上がより好ましく、７０ｍｏｌ％〜８０ｍｏｌ％が特に好ましい。
前記芳香族炭化水素の血液検体反応時の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ以上がより好ましく、２５０ｍＭ〜４００ｍＭが特に好ましい。
前記芳香族炭化水素の含有量又は血液検体反応時の濃度が、好ましい範囲内、より好ましい範囲内、又は、特に好ましい範囲内であると、血液点着前の発色を確実に抑制することができると共に、血液点着後の発色速度を確実に向上させることができる。

＜酵素＞
前記酵素は、例えば、血液中のグルコースと反応して、グルコースから電子を引き抜く、などの役割を果たす。
前記酵素としては、グルコースを基質とする限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が、テトラゾリウム塩と組み合わせることが容易である点で、好ましい。
なお、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の反応がスムーズに進むｐＨ領域（即ち、至適ｐＨ領域）は中性付近（約ｐＨ６．５〜７．０）であるが、酵素によって至適ｐＨ領域は異なる。例えば、特許文献２（特許４３８１４６３号）の実施例で使用されている緩衝剤（バッファー）としての「グリシン−塩酸」及び「酢酸ナトリウム」は酸性であるので、至適ｐＨ領域が中性付近（約ｐＨ６．５〜７．０）のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）には適さない。

前記酵素の血液検体反応時の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１Ｕ／μＬ以上が好ましく、４Ｕ／μＬ以上がより好ましく、８Ｕ／μＬ〜２０Ｕ／μＬが特に好ましい。
前記血液検体反応時の濃度が、好ましい範囲内、より好ましい範囲内、又は、特に好ましい範囲内であると、速やかに反応を終えることができる。

＜電子受容体（メディエータ）＞
前記電子受容体（メディエータ）は、（ｉ）酵素と血液中のグルコースとの反応を促進する、（ｉｉ）酵素がグルコースから引き抜いた電子を一旦受け取って発色色素に渡す、などの役割を果たす。
前記電子受容体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記電子受容体は、５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ）、ＮＡＤ，ＦＡＤ、ＰＱＱ、フェリシアン化カリウム、などが選択できる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ）が、反応性、安定性ともに優れている点で、好ましい。

前記電子受容体の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記電子受容体の含有量は、０．０１ｍｏｌ％以上が好ましく、０．１ｍｏｌ％以上がより好ましく、０．３ｍｏｌ％〜３ｍｏｌ％が特に好ましい。
前記電子受容体の血液検体反応時の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記電子受容体の血液検体反応時の濃度としては、０．１ｍＭ以上が好ましく、０．５ｍＭ以上がより好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭが特に好ましい。
前記電子受容体の含有量又は血液検体反応時の濃度が、好ましい範囲内、より好ましい範囲内、又は、特に好ましい範囲内であると、速やかに反応を終えることができる。

＜発色色素＞
前記発色色素（還元系発色試薬）は、例えば、酵素とグルコースとの反応によって生じた電子や過酸化水素を受け取って（還元されて）発色する、などの役割を果たす。
前記発色色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、テトラゾリウム塩（例えば、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−５、ＭＴＳ、ＭＴＴ、テトラゾリウム塩（Ａ））、リンモリブデン酸ナトリウム、インディゴカルメン、ジクロロインドフェノール、レサズリン、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ベンゾチアゾイル基を有する、テトラゾリウム塩が好ましく、テトラゾリウム塩（Ａ）、２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−［（２−ソジオスルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム（ＷＳＴ−４）が、発色スペクトルが良好で、溶解性が高い点で、特に好ましい。
テトラゾリウム塩（Ａ）の化学式を以下に示す。

式中Ｘ＝Ｎａである。

前記発色色素の含有量としては、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｏｌ％以上が好ましく、１５ｍｏｌ％以上がより好ましく、３０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％が特に好ましい。
前記発色色素の血液検体反応時の濃度としては、目的に応じて適宜選択することができるが、１０ｍＭ以上が好ましく、５０ｍＭ以上がより好ましく、１００ｍＭ〜２００ｍＭが特に好ましい。
前記発色色素の含有量又は血液検体反応時の濃度が、好ましい範囲内、より好ましい範囲内、又は、特に好ましい範囲内であると、高濃度の血糖値まで対応することができる。

＜遷移金属塩＞
前記発色色素がテトラゾリウム塩である場合、遷移金属塩（遷移金属イオン）とテトラゾリウム塩とを、キレート反応させ、キレート錯体を生成して発色させてもよい。遷移金属塩としては、水性液体（例えば、水、緩衝液、血液、体液）中でイオンを生成するものであれば、目的に応じて適宜選択することができるが、ニッケルやコバルトの塩化物、臭化物、硝酸塩、硫酸塩、有機酸塩が好ましい。

（血糖値測定チップ）
以下、本発明に係る血糖値測定チップを詳細に説明する。
図１は、本発明の一実施形態に係る血糖値測定チップを示す平面図である。また、図２は、図１における線Ｉ−Ｉに沿った断面図である。

図１及び図２に示すように、本実施形態における血糖値測定チップ１００は、供給口１０と、流路２０と、試薬層３０と、を備え、後述する血糖値測定装置に装着可能である。
以下、本実施形態における血糖値測定チップ１００の各部材及び各部材により構成される特徴部の詳細について説明する。

＜＜供給口１０、流路２０、及び試薬層３０＞＞
図１及び図２に示すように、血糖値測定チップ１００は、底面部を形成する第１基材１と、天面部を形成する第２基材２と、これらの第１基材１及び第２基材２の間に、且つ、チップ厚み方向に対して直交する幅方向の両端に設けられた接着部３，４とを備える。
このように、接着部３，４において、第１基材１及び第２基材２の間に任意の厚みを有するスペーサ（図には示していない）を挟んだまま、第１基材１及び第２基材２を接着させることで、第１基材１と第２基材２との間に所定の大きさの空隙が形成される。この所定の大きさの空隙が、供給口１０が一端に形成された流路２０となり、血液を血糖値測定チップ１００内に流入することができる。さらに、流路２０内には、試薬層３０が設けられている。図１及び図２では、試薬層３０は、第１基材１上に形成されているが、これに限定されるものではなく、流路２０を閉塞することなく、流路２０内に設けられていればよい。

第１基材１の材質としては、目的（光の照射・受光）に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタアクリレート、ポリスチレン、環状ポリオレフィン、環状オレフィンコポリマー、ポリカーボネート等の透明な有機樹脂材料；ガラス、石英等の透明性な無機材料；などが挙げられる。

第２基材２の材質としては、目的（光の照射・受光）に応じて適宜選択することができ、例えば、親水処理ポリエステルフィルム（３Ｍ親水化フィルム）等の透明な有機樹脂材料、などが挙げられる。

接着部３，４の厚みは、流路２０のチップ厚み方向の距離を所望の値にするために、適宜調整される。例えば、第１基材と第２基材との間に任意の厚みを有するスペーサを配置してから接着あるいは融着したり、第１基材と第２基材を接着させる接着部材としてスペーサの機能を兼ねる両面テープを用いてもよい。

−試薬層３０−
試薬層３０は、本発明に係る血糖値測定試薬からなる。

−試薬層３０の製造方法−
前記試薬層構造の製造方法は、少なくとも、塗布工程と、乾燥工程とを含み、必要に応じて、その他の工程を含む。

−−塗布工程−−
前記塗布工程は、本発明に係る血糖値測定試薬を含む塗布液を塗布する工程である。
前記塗布方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スプレー塗布法、インクジェット法、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

−−乾燥工程−−
前記乾燥工程は、塗布された塗布液を乾燥する工程である。
前記乾燥工程における、乾燥温度及び乾燥時間としては、目的に応じて適宜選択することができる。

（血糖値測定装置セット）
次に、本発明の一実施形態としての血糖値測定装置セットについて説明する。
本発明の一実施形態としての血糖値測定装置セットは、上述した血糖値測定チップと、該血糖値測定チップが装着され、血液中のグルコース成分を測定する血糖値測定装置とを備える。
以下、血液と血糖値測定試薬としての発色試薬との反応物を透過した光を測定する透過型の血糖値測定装置を備える血糖値測定装置セットについて説明するが、本発明は、これに限定されるものでなく、例えば、前記反応物から反射した光を測定する反射型の血糖値測定装置を備える血糖値測定装置セットであってもよい。

図３は本発明の一実施形態に係る血糖値測定装置セット５００を示す。血糖値測定装置セット５００は、血糖値測定装置１１０と、血糖値測定チップ１００と、を備えている。
当該血糖値測定チップ１００は血糖値測定装置１１０の先端部に装着される。血糖値測定装置１１０は、測定結果や操作内容などを表示するディスプレー１１１と、血糖値測定装置１１０の起動と終了を指示する電源ボタン１１２と、操作ボタン１１３と、血糖値測定チップ１００を取り外す取外レバー１１４と、を備えている。ディスプレー１１１は、液晶またはＬＥＤ等で構成される。

図４は血糖値測定装置セット５００の血糖値測定装置１１０の先端部と血糖値測定チップ１００を別々に示す縦断面図である。血糖値測定装置１１０に血糖値測定チップ１００を装着するため、血糖値測定装置１１０の先端に開口部２１が形成された装着部２２を設け、血糖値測定装置１１０の内部に血糖値測定チップ１００を装着する装着孔２３を区画する。また、血糖値測定装置１１０の内部には、血糖値測定チップ１００に採取した血液のグルコース成分（血糖値）を測定するための光学測定部２４を設ける。また、血糖値測定装置１１０は、測定光から得られる信号を処理し血糖値を算出する処理部２５と、取外レバー１１４（図３参照）と連動し血糖値測定チップ１００を取り外すイジェクトピン２６と、を備えている。以下、各構成について説明する。

測定の際は血糖値測定チップ１００が装着孔２３に装着される。装着作業はユーザーにより手作業で行われる。図示はしないが、手作業より生ずる装着位置のバラツキを最小限にするために、好ましくは、血糖値測定チップ１００を装着孔２３内の所定位置に固定するためのロック機構等を設置する。

光学測定部２４は、血糖値測定試薬としての発色試薬と血液との反応物に光を照射する照射部３１と、反応物を透過した光を測定光として受光する受光部３２と、を備えている。本実施形態では、照射部３１には、発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いるが、ハロゲンランプ、レーザー等であってもよい。受光部３２には、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）を用いる。受光部３２は受光した光を所定の信号に変換できるものであればよく、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等であってもよい。

本実施形態では、照射部３１は、第１の波長を有する光を発する第１の発光素子５１と、第１の波長と異なる第２の波長を有する光を発する第２の発光素子５２とを含む。ここで、第１の波長は、血糖量に応じた発色度合を検出するための波長であり、例えば６００〜９００ｎｍの波長帯にある。第２の波長は、血液中の赤血球濃度を検出するための波長であり、例えば５１０〜５９０ｎｍの波長帯にある。

照射部３１と受光部３２の配置および両者の位置関係を説明する。血糖値測定装置１１０の内部には、第１の空間４１と第２の空間４２とが形成されている。照射部３１は当該第１の空間４１に、受光部３２は当該第２の空間４２に、それぞれ配置されている。血糖値測定チップ１００が血糖値測定装置１１０に装着されていない状態では、当該第１の空間４１と、当該第２の空間４２とは、装着孔２３を挟んで対向する（図４参照）。血糖値測定チップ１００が血糖値測定装置１１０に装着された状態では、当該第１の空間４１と、当該第２の空間４２とは、当該血糖値測定チップ１００上の試薬層３０が保持されている位置を挟んで対向する。なお、照射光３３のエネルギーロスを少なくするために、照射部３１は、照射光３３が血糖値測定チップ１００の底面に垂直に照射できる位置に配置されるのが好ましい。

図示はしないが、照射部３１に白色を照射するハロゲンランプを用いる場合は、特定の波長のみを照射光３３として抽出するために分光フィルタを設ける方法であってもよい。また、低エネルギーの照射で有効に実施するために、集光レンズを備える方法も好適である。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。

（実施例１）
＜試薬水溶液の調製＞
まず、酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、東洋紡株式会社製）４Ｕ／μＬと、電子受容体（メディエータ）としての１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ、株式会社同仁化学研究所製）１ｍＭと、発色色素としての２−ベンゾ−チアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−〔４−（２−スルホエチルカルバモイル）フェニル〕−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−４、株式会社同仁化学研究所製）１００ｍＭと、芳香族炭化水素としてのナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ、東京化成工業株式会社製）２５０ｍＭと、を含む試薬水溶液（ｐＨ６．５）を調製した。

＜血糖値測定チップの作製＞
調製した試薬水溶液を、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（製造会社名：東レ株式会社、商品名：ルミラーＴ６０、厚み１８８μｍ）上に塗布し、２５℃で１０分間乾燥した。乾燥後、試薬層が形成されたＰＥＴフィルムにスペーサ及び接着部としての両面テープ（製造会社名：３Ｍ社、商品名：ポリエステルフィルム基材、両面粘着テープ９９６５、厚み：８０μｍ）を挟んだまま、材質が親水処理ポリエステルフィルム（製造会社名：３Ｍ社、商品名：親水処理ポリエステルフィルム９９０１Ｐ、厚み：１００μｍ）であるカバーフィルムを装着して、図１及び２に示す血糖値測定チップを作製した。

＜血液検体の調製＞
血液（全血、ヘマトクリット（Ｈｔ）４０）に、高濃度のグルコース溶液（４０ｇ／ｄＬ）を添加して、グルコース濃度が１００ｍｇ／ｄＬの血液検体を調製した。

＜検体点着後の吸光度測定＞
調製した血液検体３ｍｍ³を、作製した血糖値測定チップに点着し、紫外可視分光光度計を用いて吸光度測定（測定波長：６５０ｎｍ）を行った。結果を表１及び図５に示す。
なお、図５は、発色速度（タイムコース）を示すグラフであり、縦軸は吸光度指標（３０ｓ後の発色量を１００％とする）を、横軸は点着後の時間（ｍｓ：ミリセコンド）を示す。発色完了までの時間は、０ｓから発色量１００％になるまでの時間で評価した。

＜熱加速試験後の吸光度測定＞
作製直後（イニシャル）の血糖値測定チップ、常温保存（３日間）及び、熱加速試験（６０℃、３日間）後の血糖値測定チップについて、紫外可視分光光度計を用いて、蒸留水３ｍｍ²の点着後の吸光度を測定した（測定波長：６５０ｎｍ〜７５０ｎｍ）。これらの血糖計測定チップの吸光度は、作成直後（イニシャル）の血糖測定チップの吸光度に対する差分として結果を表１及び図６に示す。
なお、図６は、血液点着前における血糖値測定チップの保存安定性を示すグラフであり、縦軸は吸光度（ａｂｓ）を示す。

（実施例２）
実施例１において、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ、東京化成工業株式会社製）を用いて試薬水溶液の調製を行う代わりに、１，３−ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム（ＤＳＢ、ＡｌｆａＡｅａｒ製）を用いて試薬水溶液の調製を行ったこと以外は、実施例１と同様に、試薬水溶液の調製、血糖値測定チップの作製、検体の調製、検体点着後の吸光度測定、及び熱加速試験後の吸光度測定を行った。評価結果を図５及び６に示す。

（実施例３）
実施例１において、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ、東京化成工業株式会社製）を用いて試薬水溶液の調製を行う代わりに、ベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＢＳ、東京化成工業株式会社製）を用いて試薬水溶液の調製を行ったこと以外は、実施例１と同様に、試薬水溶液の調製、血糖値測定チップの作製、検体の調製、検体点着後の吸光度測定、及び熱加速試験後の吸光度測定を行った。評価結果を表１、図５及び６に示す。

（実施例４）
実施例１において、「試薬水溶液の調製」を下記のように行い、「検体点着後の吸光度測定」における吸光度測定を６３０ｎｍ〜９００ｎｍで行ったこと以外は、実施例１と同様に、血糖値測定チップの作製、検体の調製、検体点着後の吸光度測定、及び熱加速試験後の吸光度測定を行った。評価結果を表１、図５及び６に示す。
発色色素としてテトラゾリウム塩Ａを用いた場合、測定開始と同時に一気に反応が進み、約５秒で発色が完了した。実施例４の発色速度及び感度は共に良好であった。

＜試薬水溶液の調製＞
まず、酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、東洋紡株式会社製）４Ｕ／μＬと、電子受容体（メディエータ）としての１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ｍＰＭＳ、株式会社同仁化学研究所製）１ｍＭと、発色色素としてのテトラゾリウム塩Ａ（テルモ株式会社製）１００ｍＭと、遷移金属イオンとしてのニッケルイオン２００ｍＭと、芳香族炭化水素としての１，３−ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム（ＤＳＢ）（ＡｌｆａＡｅａｒ製）２５０ｍＭと、を含む試薬水溶液（ｐＨ６．５）を調製した。

（比較例１）
実施例１において、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ、東京化成工業株式会社製）を添加して試薬水溶液の調製を行う代わりに、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ、東京化成工業株式会社製）を添加せずに試薬水溶液の調製を行ったこと以外は、実施例１と同様に、試薬水溶液の調製、血糖値測定チップの作製、検体の調製、検体点着後の吸光度測定、及び熱加速試験後の吸光度測定を行った。評価結果を表１、図５及び６に示す。

（比較例２）
実施例１において、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ、東京化成工業株式会社製）を用いて試薬水溶液（ｐＨ６．５）の調製を行う代わりに、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ、株式会社同仁化学研究所製）を用いて試薬水溶液（ｐＨ７．０）の調製を行ったこと以外は、実施例１と同様に、試薬水溶液の調製、血糖値測定チップの作製、検体の調製、検体点着後の吸光度測定、及び熱加速試験後の吸光度測定を行った。評価結果を表１、図５及び６に示す。
比較例２のように、ＭＯＰＳ等のグッドバッファー（中性付近に緩衝能を有し、遊離アミンを有するもの）を用いると、試薬水溶液の調製中から徐々に発色が始まり、血液を点着する前の状態（ブランク）において吸光度が著しく上昇してしまう傾向があった。

（比較例３）
実施例１において、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ、東京化成工業株式会社製）を用いて試薬水溶液（ｐＨ６．５）の調製を行う代わりに、イセチオン酸ナトリウム（東京化成工業株式会社製）を用いて試薬水溶液の調製を行ったこと以外は、実施例１と同様に、試薬水溶液の調製、血糖値測定チップの作製、検体の調製、検体点着後の吸光度測定、及び熱加速試験後の吸光度測定を行った。評価結果を表１、図５及び６に示す。

（比較例４）
実施例１において、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ、東京化成工業株式会社製）を用いて試薬水溶液（ｐＨ６．５）の調製を行う代わりに、リン酸緩衝液（和光純薬工業株式会社製）を用いて試薬水溶液（ｐＨ７．０）の調製を行ったこと以外は、実施例１と同様に、試薬水溶液の調製、血糖値測定チップの作製、検体の調製、検体点着後の吸光度測定、及び熱加速試験後の吸光度測定を行った。評価結果を表１、図５及び６に示す。
比較例４のように、グッドバッファーでないリン酸緩衝液（遊離アミンを有さない）を用いると、血液点着前における保存安定性は良好であるが、発色速度が遅くなる傾向があった。

（比較例５）
実施例１において、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ、東京化成工業株式会社製）を用いて試薬水溶液（ｐＨ６．５）の調製を行う代わりに、トレハロース（株式会社林原製）を用いて試薬水溶液の調製を行ったこと以外は、実施例１と同様に、試薬水溶液の調製、血糖値測定チップの作製、検体の調製、検体点着後の吸光度測定、及び熱加速試験後の吸光度測定を行った。評価結果を表１、図５及び６に示す。
比較例５のように、水に溶けやすく、緩衝能がないトレハロースを用いると、血液点着前における保存安定性は良好であるが、発色速度が遅くなる傾向があった。

（比較例６）
実施例４において、１，３−ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム（ＤＳＢ、ＡｌｆａＡｅａｒ製）２５０ｍＭを用いて試薬水溶液（ｐＨ６．５）の調製を行う代わりに、８−メトキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム塩（ＭＰＴＳ、シグマアルドリッチ製）７０ｍＭを用いて試薬水溶液の調製を行ったこと以外は、実施例４と同様に、試薬水溶液の調製を行った。ここで、試薬水溶液（コート液）中に析出物が発生したため、血糖値測定チップの作成ができなかった。評価結果を表１に示す。
なお、８−メトキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム塩（ＭＰＴＳ）の化学式を以下に示す。

なお、表１中の「検体点着後の吸光度（発色量）測定（タイムコース）」及び「熱加速試験後の吸光度測定」の結果の評価基準は以下の通りである。
＜検体点着後の吸光度（タイムコース（発色量））測定＞
◎：１０秒間で反応終点の９０％以上が反応
○：１０秒間で反応終点の６０％以上９０％未満が反応
×：１０秒間で反応終点の６０％未満が反応
＜熱加速試験後の吸光度測定＞
○：６０℃３日間保存後のブランク上昇が０．１未満
×：６０℃３日間保存後のブランク上昇が０．１以上

少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素を含む血糖値測定試薬を用いた実施例１〜４と、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素を含む血糖値測定試薬を用いていない比較例１〜６とを比較することにより、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素を含む血糖値測定試薬を用いることで、血液点着前の発色が抑制されることが分かった。

２個以上のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素を含む血糖値測定試薬を用いた実施例１、２及び４と、１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素を含む血糖値測定試薬を用いた実施例３とを比較することにより、２個以上のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素を含む血糖値測定試薬を用いることで、血液点着前の発色が抑制されるだけでなく、血液点着後の発色速度がより向上した。また、実施例１、２及び４と、比較例２とを比較することにより、実質的に緩衝剤を添加していない、かつ、２個以上のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素を含む血糖値測定試薬は、血液点着前の発色が抑制されるだけでなく、血液点着後の発色速度がより向上することが分かった。

１：第１基材
２：第２基材
３：接着部
４：接着部
１０：供給口
２０：流路
２１：開口部
２２：装着部
２３：装着孔
２４：光学測定部
２５：処理部
２６：イジェクトピン
３０：試薬層（試薬）
３１：照射部
３２：受光部
３３：照射光
４１：第１の空間
４２：第２の空間
５１：第１の発光素子
５２：第２の発光素子
１００：血糖値測定チップ
１１０：血糖値測定装置
１１１：ディスプレー
１１２：電源ボタン
１１３：操作ボタン
１１４：取外レバー
５００：血糖値測定装置セット

Claims

グルコースを基質とする酵素と、
電子受容体と、
発色色素とを含む血糖値測定試薬において、
少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素をさらに含み、
前記芳香族炭化水素が、１，３−ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム、又は、ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウムであることを特徴とする血糖値測定試薬。
前記芳香族炭化水素の含有量が、３０ｍｏｌ％以上であることを特徴とする請求項１に記載の血糖値測定試薬。
前記発色色素としてテトラゾリウム塩をさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の血糖値測定試薬。
血液が供給される供給口と、該供給口が一端に形成された流路と、該流路内に設けられた試薬と、を備え、前記血液中の血糖値を測定する血糖値測定装置に装着可能な血糖値測定チップであって、
前記試薬が、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の血糖値測定試薬であることを特徴とする血糖値測定チップ。
請求項４に記載の血糖値測定チップと、血液中の血糖値を測定する血糖値測定装置とを備える血糖値測定装置セットであって、
前記血糖値測定装置が、
前記血液と前記試薬との反応物に光を照射する照射部と、
前記反応物を透過又は前記反応物から反射した測定光を受光する受光部と、
前記測定光から得られる信号を処理する処理部と、
を備えることを特徴とする血糖値測定装置セット。