JP7208219B2 - 生体試料中の分析対象物濃度を測定するための、方法、試薬およびチップ - Google Patents

生体試料中の分析対象物濃度を測定するための、方法、試薬およびチップ Download PDF

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Description

本発明は、生体試料（例えば、血液サンプル）に含まれる、グルコース等の分析対象物の濃度を測定するために使用される、方法、試薬およびチップに関する。
従来から、臨床化学検査において、血液や尿等の生体試料中に含まれる分析対象物（例えば、グルコース）を電気化学的手段や光学的手段（比色法）により測定する技術が知られている。
例えば、特開２００８－１４８６５６号公報には、試料を点着する側の面の細孔の大きさが、発色を検出する側の面の細孔の大きさよりも大きい異方性膜から構成される、血液中のグルコース等を測定するための乾式分析要素に関する発明が記載されている。
特開２００８－１４８６５６号公報に記載の発明では、試料を点着する側の面に径の大きい孔を有し、発色を検出する側の面に径の小さい孔を有する異方性膜を用いている。これにより、血液に由来する成分のうち、赤血球のようなサイズの大きい成分は、異方性膜の発色を検出する側まで到達できずに濾別される。このため、特開２００８－１４８６５６号公報に記載の発明では、赤血球のようなサイズの大きい成分の非存在下で発色反応が行われる。しかしながら、かような異方性膜を用いた場合、試料に由来する成分や夾雑物等によって細孔が目詰まりを起こす可能性があり、これによって測定精度に影響を及ぼし得る。また、かような血液サンプルに由来する成分の分画を必要とする手法では、測定の迅速さの観点から十分でない場合がある。
一方で、血液サンプルに由来する成分の分画をせずに光学的手段により分析対象物の測定を行うとベースラインが高くなり（すなわち、ノイズが強くなり）、高精度での測定が困難となることが知られている。
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、血液等の生体試料に由来する成分（生体成分）の分画を必要とせずに、分析対象物濃度を高精度に測定し得る手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、散乱光調整剤を用いて、生体試料と発色試薬との混合前後の散乱光を実質的に同等にした分析サンプルを用いて分析対象物の濃度を測定することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明の完成に至った。
本発明の第１の側面は、生体試料中の分析対象物濃度を測定する方法であって、
（１）前記生体試料を準備し、
（２）前記生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合して、散乱光が前記生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得て、
（３）前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物濃度を測定すること、を含む、方法に関する。
本発明の第２の側面は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含む、分析対象物濃度測定試薬に関する。
本発明の第３の側面は、反応部を有する、生体試料中の分析対象物濃度を測定するためのチップであって、前記反応部は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含む、チップに関する。
図１は、ヘマトクリット値が２０ならびに血中グルコース濃度が０ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ０）、１００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ１００）及び４００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ４００）の血液サンプルに対する実施例１の試薬の５００～１０００ｎｍの波長領域での透過率（％Ｔ）を示すグラフである。 図２は、ヘマトクリット値が４０ならびに血中グルコース濃度が０ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ０）、１００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ１００）及び４００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ４００）の血液サンプルに対する実施例１の試薬の５００～１０００ｎｍの波長領域での透過率（％Ｔ）を示すグラフである。 図３は、ヘマトクリット値が６０ならびに血中グルコース濃度が０ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ０）、１００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ１００）及び４００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ４００）の血液サンプルに対する実施例１の試薬の５００～１０００ｎｍの波長領域での透過率（％Ｔ）を示すグラフである。 図４は、ヘマトクリット値が２０ならびに血中グルコース濃度が０ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ０）、１００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ１００）及び４００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ４００）の血液サンプルに対する比較例１の試薬の５００～１０００ｎｍの波長領域での透過率（％Ｔ）を示すグラフである。 図５は、ヘマトクリット値が４０ならびに血中グルコース濃度が０ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ０）、１００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ１００）及び４００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ４００）の血液サンプルに対する比較例１の試薬の５００～１０００ｎｍの波長領域での透過率（％Ｔ）を示すグラフである。 図６は、ヘマトクリット値が６０ならびに血中グルコース濃度が０ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ０）、１００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ１００）及び４００ｍｇ／ｄｌ（ＢＧ４００）の血液サンプルに対する比較例１の試薬の５００～１０００ｎｍの波長領域での透過率（％Ｔ）を示すグラフである。 図７は、本形態に係る測定用チップが装着された血糖計（成分測定装置）を概略的に示す平面図である。図７中、１０は血糖計を；１２は測定用チップを；１４は測定部を；１８はチップ本体部を；４０は筺体を；４２は制御部を；４４は箱体部を；４６は測光部を；４８は電源ボタンを；５０は操作ボタンを；５２はディスプレイを；および５４はイジェクトレバーを、それぞれ、示す。 図８は、図７の測定用チップと装置本体の測光部を拡大して示す斜視図である。図８中、１０は血糖計を；１２は測定用チップを；１４は測定部を；１６は装置本体を；１８はチップ本体部を；２０は空洞部を；２０ａは先端口部を；２０ｂは基端口部を；２２は長辺を；２４は短辺を；３０は板片を；３２はスペーサを；４０は筺体を；４６は測光部を；５６はイジェクトピンを；５６ａは棒部を；５６ｂは受部を；５８は挿入孔を；５８ａは挿入開口部を；５９は測定用孔部を；６０はチップ装着部を；６０ａはフランジ部を；６２は壁部を；６８は発光素子を；７０は発光部を；７２は受光素子を；７４は受光部を；および７６はコイルバネを、それぞれ、示す。 図９は、図７の測定用チップを示す側面図である。図９中、１２は測定用チップを；１８はチップ本体部を；２０は空洞部を；２０ａは先端口部を；２０ｂは基端口部を；２２は長辺を；２２ａは上側長辺を；２２ｂは下側長辺を；２４は短辺を；２４ａは先端辺を；２４ｂは基端辺を；２６は試薬を；２８は測定対象部を；３０は板片を；および３２はスペーサを、それぞれ、示す。 図１０Ａは、図７の測定用チップと装置本体の装着動作を示す第１平面図である。図１０Ａ中、１２は測定用チップを；１４は測定部を；１６は装置本体を；２０は空洞部を；２６は試薬を；２８は測定対象部を；３０は板片を；３２はスペーサを；４０は筺体を；４６は測光部を；４６ａは固定壁を；５６はイジェクトピンを；５６ａは棒部を；５６ｂは受部を；５８は挿入孔を；５８ａは挿入開口部を；５９は測定用孔部を；６０はチップ装着部を；６０ａはフランジ部を；６２は壁部を；６４は素子収容空間を；６６は導光部を；６８は発光素子を；６８ａは第１発光素子を；６８ｂは第２発光素子を；７０は発光部を；７２は受光素子を；７４は受光部を；および７６はコイルバネを、それぞれ、示す。 図１０Ｂは、図１０Ａに続く装着動作を示す第２平面断面図である。図１０Ｂ中、１２は測定用チップを；１４は測定部を；１６は装置本体を；２０は空洞部を；２０ａは先端口部を；２６は試薬を；３０は板片を；３２はスペーサを；４０は筺体を；４６は測光部を；４６ａは固定壁を；５６はイジェクトピンを；５６ａは棒部を；５６ｂは受部を；６０はチップ装着部を；６０ａはフランジ部を；６２は壁部を；６８は発光素子を；６８ａは第１発光素子を；６８ｂは第２発光素子を；７０は発光部を；７２は受光素子を；７４は受光部を；および７６はコイルバネを、それぞれ、示す。 図１１Ａは、実施例および比較例で用いた血糖計センサの模式図である。図１１Ａ中、２は試薬片を；３は試薬塗布面を；４は両面テープを；５はＰＥＴフィルムを；６は流路を；および７はＰＥＴフィルムを、それぞれ、示す。 図１１Ｂは、図１１Ａの血糖計センサの内面の長さ、幅、厚みを説明するための図である。図１１Ｂ中、１は測定チップを；２は試薬片を；３は試薬塗布面を；４は両面テープを；５はＰＥＴフィルムを；および７はＰＥＴフィルムを、それぞれ、示す。
本発明の第１の側面は、生体試料中の分析対象物濃度を測定する方法であって、
（１）前記生体試料を準備し、
（２）前記生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合して、散乱光が前記生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得て、
（３）前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物濃度を測定すること、
を含む、方法に関する。
本発明の第２の側面は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含む、分析対象物濃度測定試薬に関する。
本発明の第３の側面は、反応部を有する、生体試料中の分析対象物濃度を測定するためのチップであって、前記反応部は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含む、チップに関する。
本明細書において、上記の本発明のある側面についての記載は、他の側面に相互に適宜改変されて適用され得る。
本発明によれば、血液等の生体試料に由来する成分（生体成分）の分画を必要とせずに、分析対象物濃度を高精度に測定できる。本発明者らは、生体試料（例えば、血液サンプル）に由来する生体成分の分画をせずに光学的手段により分析対象物の測定を行った場合にベースラインが高くなることで、測定精度を悪化させる原因を種々検討した。例えば、生体試料が血液サンプルである場合には、血液サンプルに由来する成分の分画をせずに光学的手段により分析対象物の測定を行うと、赤血球と赤血球外液（すなわち、サンプル中に存在する赤血球以外の成分）との間の屈折率差により散乱光が発生する。これにより、散乱光に由来するベースラインが高くなって測定精度を低下させることを本発明者らは見出した。かような問題に対し、本発明者らは、散乱光調整剤を使用して、散乱光が生体試料と分析サンプルとで実質的に同じにすることが有効な手段であることを見出した。以下では、生体試料が血液サンプルの場合を例にとって詳細に説明する。
通常、ヘモグロビン等の存在により、赤血球内の屈折率は赤血球外液の屈折率よりも高い。発色試薬などの試薬を血液（全血）に添加すると、試薬の溶解にともなって赤血球外液の浸透圧が上昇する。一方、赤血球外液の浸透圧の上昇に伴い、赤血球と赤血球外液との浸透圧差により赤血球が収縮し、赤血球内液の屈折率はさらに上昇する。ここで、試薬に屈折率の高い物質を更に添加することにより、赤血球外液の屈折率の上昇を意図的に促進させて赤血球内外の屈折率をほぼ同一として、赤血球内外の屈折率差を調整することができる。しかし、生体試料が血液サンプルの場合には、ヘマトクリット値の高低や、赤血球内液（水分）の放出による赤血球外液の希釈効果によって、赤血球外液の屈折率の低下度合にバラつきが生じる。このため、幅広いヘマトクリット値を有する血液サンプルに対して、赤血球内外の屈折率を同一に調整することは困難であった。上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、試薬混合前後の屈折率差変化を最小限にとどめることが有効であることを見出した。上記手段についてさらに鋭意検討を行った結果、散乱光調整剤の使用により、試薬添加前の赤血球内の屈折率（ｎＲＢＣ－１）と試薬添加後の赤血球内の屈折率（ｎＲＢＣ－２）との変化（すなわち、ΔｎＲＢＣ＝ｎＲＢＣ－１－ｎＲＢＣ－２）、および試薬添加前の赤血球外液の屈折率（ｎＳ－１）と試薬添加後の赤血球外液の屈折率（ｎＳ－２）との変化（すなわち、ΔｎＳ＝ｎＳ－１－ｎＳ－２）を、それぞれ、低く抑えることが、血液サンプルの測定において有効なことを見出した。また、本発明は、散乱光調整剤の使用により、試薬混合前後の、赤血球内の屈折率変化量（ΔｎＲＢＣ＝ｎＲＢＣ－１－ｎＲＢＣ－２）と、赤血球外液の屈折率変化量（ΔｎＳ＝ｎＳ－１－ｎＳ－２）とが、実質的に同程度になるように赤血球の収縮を調節することで、試薬混合前後における２つの屈折率変化量を同程度とすることができる。このように試薬混合前後の赤血球／赤血球外液の屈折率差の変動を減少させることで、結果として試薬混合前後の散乱光を実質的に同じに（光の散乱変化を抑制）できるため、測定誤差を低減できる。また、幅広いヘマトクリット値を有する血液サンプルにおいても、分析対象物の測定精度を向上できる。上記効果は、散乱光調整剤を遷移金属化合物と併用した場合に、特に有効に達成できる。なお、上記メカニズムは推測であり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
本明細書において、「赤血球外液」とは、赤血球以外の分画を意味し、試薬混合前では赤血球以外の血液サンプル由来成分（血漿）を意図し、試薬混合後では赤血球以外の血液サンプル由来成分（血漿）、発色試薬、酸化還元酵素、散乱光調整剤、および任意に用いられ得るその他の物質（例えば、遷移金属化合物）を含む液を意図する。また、本明細書では、発色試薬、酸化還元酵素、散乱光調整剤、および任意に用いられ得るその他の物質（例えば、遷移金属化合物）を含む混合物を「分析対象物濃度測定試薬」または単に「試薬」とも称する。
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で行う。
＜血液サンプル中の分析対象物検出方法＞
本発明の一側面は、生体試料中の分析対象物濃度を測定する方法であって、
（１）前記生体試料を準備し（工程（１））、
（２）前記生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合して、散乱光が前記生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得て（工程（２））、
（３）前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物濃度を測定する（工程（３））こと、
を含む、方法に関する。本発明の一側面に係る方法によると、光の散乱を誘発する生体試料（例えば、赤血球を含むサンプル）であっても、生体成分の分画を必要とせずに、分析対象物を高精度に検出し得る。
［工程（１）］
本工程では、生体試料を準備する。ここで、生体試料（生体成分測定対象）は、目的とする分析対象物（生体成分）を含むものであれば特に制限されない。具体的には、血液、ならびに尿、唾液、間質液等の体液などが挙げられる。これらのうち、血液、特に全血が生体試料として好ましい。また、生体試料の源は、特に制限されない。生体試料は、ヒト、または非ヒト動物に由来するものであってもよい。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター等の実験動物；イヌ、ネコ、ウサギ等のペット；ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ等の家畜類や家禽類が例示できるがこれらに限定されない。好ましくは、生体試料はヒトに由来する。すなわち、生体試料は、ヒトの血液であることが好ましく、ヒトの全血であることが特に好ましい。
生体試料の準備方法は、特に制限されない。例えば、血液から血漿を分離するなどの公知の方法が適用できるが、生体試料をそのまま使用してもよい。特に好ましい実施形態では、生体試料は、ヒトから採取した末梢血または静脈血である。
［工程（２）］
本工程では、上記工程（１）で準備された生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合して、散乱光が前記生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得る。
本工程（２）で、散乱光調整剤を使用することにより、生体試料と分析サンプルでの散乱光を実質的に同じにできる。詳細には、例えば、生体試料が血液サンプルである場合には、発色試薬などの試薬を血液サンプルに添加すると、赤血球内液と赤血球外液との屈折率差が増加する。これに対して、散乱光調整剤を併用すると、試薬混合前後の赤血球内液及び赤血球外液の屈折率変化を低く抑え、その結果、試薬混合前後の赤血球内の屈折率変化（ΔｎＲＢＣ）および赤血球外液の屈折率変化（ΔｎＳ）を実質的に同程度になるように赤血球の収縮を適切に調節できる。ゆえに、試薬混合前後の赤血球／赤血球外液の屈折率差が減少し、結果として試薬混合前後の散乱光を実質的に同じに（光の散乱変化を抑制）できる。このため、次工程（３）にて、生体試料中の分析対象物濃度を高精度で測定することができる。なお、上記メカニズムは推測であり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
本明細書における「散乱光調整剤」は、分析サンプルの散乱光を生体試料と実質的に同じにすることができるものであれば特に制限されない。ここで、「分析サンプルの散乱光が生体試料と実質的に同じである」とは、試薬を構成する成分（発色試薬、酸化還元酵素、散乱光調整剤、および遷移金属化合物等の任意に用いられ得るその他の物質）、特に発色試薬による影響が実質的にない波長領域での試薬混合前後の平均透過率が、実質的に同様であることを意味する。ここで、「発色試薬による影響が実質的にない波長領域」とは、被測定物質と反応して生成した色素成分の吸光度が、測定波長における吸光度の３％以下、好ましくは１％以下である波長領域のうち、長波長側の波長領域を指す。本発明では、このような波長領域として８００～１０００ｎｍが好ましく、特に、８５０～１０００ｎｍの波長領域において、被測定物質と反応した発色試薬による影響を受けない（図１～６を参照）。このため、本明細書では、発色試薬による影響が実質的に存在しない波長領域を「８５０～１０００ｎｍ」と設定する。上記点を考慮して、本明細書における「分析サンプルの散乱光が生体試料と実質的に同じである」とは、試薬混合後の分析サンプルの波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（ａｖｅＴanalyte（％））と試薬混合前の生体試料の波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（ａｖｅＴsample（％））との差（＝ａｖｅＴanalyte（％）－ａｖｅＴsample（％））が－１５．０％を超え１５．０％未満であることを意味する。本明細書では、試薬混合後の分析サンプルの波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（ａｖｅＴanalyte（％））と試薬混合前の生体試料の波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（ａｖｅＴsample（％））との差（＝ａｖｅＴanalyte（％）－ａｖｅＴsample（％））を、単に「平均透過率差」とも称する。上記平均透過率差は、好ましくは－１０％～１０％であり、より好ましくは－９．０％～９．０％、特に好ましくは－７．５％を超えて７．５％未満である。すなわち、本発明の好ましい形態では、工程（２）において、分析サンプルの波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（Ｔanalyte（％））と生体試料の波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（Ｔsample（％））との差（＝ａｖｅＴanalyte（％）－ａｖｅＴsample（％））が－１０％以上１０％以下である。本発明のより好ましい形態では、工程（２）において、分析サンプルの波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（Ｔanalyte（％））と生体試料の波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（Ｔsample（％））との差（＝ａｖｅＴanalyte（％）－ａｖｅＴsample（％））が－９．０％以上９．０％以下である。
本明細書において、サンプル（生体試料、分析サンプル）について、８５０ｎｍ～１０００ｎｍの波長領域において連続的に透過率スペクトルを測定し、得られたスペクトルにおいて少なくとも１ｎｍ毎（即ち、測定幅≦１ｎｍ）の透過率を測定した。「平均透過率」は、下記式（Ａ）に従って各波長での透過率差を算出し、これらの透過率差の平均を求めることによって決定する。
Figure 0007208219000001
本明細書において、生体試料や分析サンプルの「透過率」および「吸光度」は光路長５０μｍで測定される値または、光路長５０μｍに補正した値である。例えば、血糖値検出用チップ（スペーサ厚さ：５０μｍ）を用いて、以下のスペクトル解析によって求めることができる。
＜スペクトル解析＞
スペクトル測定に用いた評価システムの概要を以下に示す。また、評価システムの概要を以下に示す：
Figure 0007208219000002
（評価システムの概要）
光源 ハロゲン光源 ＳＰＬ－２Ｈ（ケイエルブイ株式会社）
ファイバコネクタ ＳＭＡ
適合ファイバ：コア径＝２００μ以上
分光計 小型ファイバ光学分光器 ＵＳＢ２０００＋
（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ社）
ディテクタ範囲 ２００～１１００ｎｍ。
分析対象物濃度測定試薬を用いて、例えば、実施例に記載されるような血糖値検出用チップ（スペーサ厚さ（流路厚さ）：５０μｍ、試薬層厚さ１μｍ～４μｍ）を作製する。この血糖値検出用チップを用いて、吸光度（実測値）を測定する。このとき、実測値は、流路厚さと試薬層厚さとの差（クリアランス）を光路長として得られる吸光度の実測値である。各測定波長（４００～１０００ｎｍ）における吸光度（実測値）を、光路長５０μｍの場合に補正し、補正後の吸光度（Ａｂｓ）から下記式（Ｂ）に従って透過率（Ｔ（％））を求める。なお、吸光度の補正は、各測定波長における吸光度（実測値）を各チップにおいて実測したクリアランス（ＣＬ）（μｍ）の値で除し、さらに５０（μｍ）を乗じることで行う。
Figure 0007208219000003
次いで、上記の血糖値検出用チップに血液サンプルを点着し、点着後５～１５秒（例えば、９秒）におけるスペクトル解析を行う。得られたスペクトル解析結果を元に、点着前と同様にして吸光度を補正して透過率を求める。
なお、本発明の一側面に係る方法が実施例に記載される検出用チップを用いた手法に限定されるものではない。例えば、光路長１０ｍｍのセルを用いて分析した場合は、ランベルト・ベールの法則に従い、測定セル内に存在する血液サンプル中の分析対象物の濃度を考慮した補正を行って求めた吸光度から、「透過率（％）」を求めてもよい。
また、上述したように、本発明では、平均透過率差が－１５．０％を超え１５．０％未満であるが、好ましくは、試薬を構成する成分、特に発色試薬による影響が実質的に存在しない全波長領域において、試薬混合前後の透過率が実質的に同様である。すなわち、試薬混合後の分析サンプルの全波長領域８５０～１０００ｎｍでの透過率（Ｔanalyte（％））と試薬混合前の生体試料の全波長領域８５０～１０００ｎｍでの透過率（Ｔsample（％））との差（＝Ｔanalyte（％）－Ｔsample（％））の絶対値が、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは９．０％以下であり、特に好ましくは７．５％未満である。本明細書では、試薬混合後の分析サンプルの全波長領域８５０～１０００ｎｍでの透過率（Ｔanalyte（％））と試薬混合前の生体試料の全波長領域８５０～１０００ｎｍでの透過率（Ｔsample（％））との差（＝Ｔanalyte（％）－Ｔsample（％））の絶対値を、単に「透過率差（絶対値）」または「透過率差」とも称する。
本明細書において、透過率差（絶対値）は、サンプル（生体試料、分析サンプル）について、８５０ｎｍ～１０００ｎｍの波長領域において、連続的に透過率スペクトルを測定し、得られたスペクトルにおいて少なくとも１ｎｍ毎（即ち、測定幅≦１ｎｍ）の透過率を測定し、下記式（Ｃ）に従って各波長での透過率差を絶対値にて算出し、これらの最大値を求め、この最大値が上記特定範囲にあるか否かを評価する。すなわち、本明細書において、「透過率差（絶対値）が１０％以下である」とは、測定エラーや外れ値を除き、上記最大値が１０％以下である（上記すべての測定点において透過率差が１０％以下である）ことを意味する。
Figure 0007208219000004
本発明で使用できる散乱光調整剤は、上記したように分析対象物濃度測定用試薬の混合前後で散乱光が実質的に同等になるようなものであれば特に制御されない。具体的には、下記式（１）で表されるような色素や色原体、多糖類、糖アルコール、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素のようなイオン性の官能基を有する芳香族炭化水素化合物などが例示できる。これらの化合物は塩の形態であってもよく、より具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、メチルアミン塩、エチルアミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、モノエタノールアミン塩、および塩化物等のハロゲン化物等であってもよいが、これらに限定されない。好ましくは、上記の塩は、ナトリウム塩、またはカリウム塩である。上記散乱光調整剤は、１種を単独で使用されてもまたは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。これらのうち、散乱光調整剤は、下記式（１）で表される化合物、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素および二糖類、ならびにこれらの塩からなる群から選択される１種以上であることが好ましく、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素またはこの塩であることがより好ましい。上記好ましい散乱光調整剤であれば、赤血球の収縮をより適切に制御して、生体試料と分析対象物濃度測定用試薬との混合前後での散乱光をより同じにでき（平均透過率差をより小さくでき）、分析対象物濃度をより高精度に測定できる。
上記散乱光調整剤として、下記式（１）で表される化合物を使用できる。
Figure 0007208219000005
ただし、上記式（１）において、Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、１以上の置換基を有していてもよいアリール基または含窒素複素環基を表す。
式（１）で表される化合物において、「アリール基」としては、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、およびフェナントリル基等が例示でき、好ましくはフェニル基、およびナフチル基からなる群から選択される。
式（１）で表される化合物において、「含窒素複素環基」としては、ピロリジル基、ピロリル基、ピペリジル基、ピリジル基、イミダゾイル基、ピラゾイル基、ピラゾロニル基、オキサゾイル基、チアゾイル基、ピラジル基、インドイル基、イソインドイル基、およびベンゾイミダゾイル基等が例示でき、好ましくはイミダゾイル基、ピラゾイル基、およびピラゾロニル基からなる群から選択される。
上記のアリール基や含窒素複素環基は、１以上の置換基を有していてもよい。ここで、置換基としては、特に制限されないが、例えば、上記のアリール基や含窒素複素環基は、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、およびイソプロピル基）、炭素数１～３のアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポシキ基、およびイソプロポシキ基）、カルボキシ基、スルホ基、アミノ基、カルバモイル基、スルファモイル基、フェニル基、カルボキシフェニル基、およびスルホフェニル基からなる群から選択される置換基を１つ以上有していてもよい。また、アリール基や含窒素複素環基の置換基であるフェニル基は、上記のハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、およびイソプロピル基）、炭素数１～３のアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポシキ基、およびイソプロポシキ基）、カルボキシ基、スルホ基、アミノ基、カルバモイル基、スルファモイル基、フェニル基、カルボキシフェニル基、およびスルホフェニル基からなる群から選択される１以上の置換基によってさらに置換されていてもよい。
分析対象物濃度の高精度な測定の観点から、好ましい一実施形態では、Ｑ１は、下記構造を有する。
Figure 0007208219000006
上記構造式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２１、Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、カルボキシ基、カルボン酸塩の基、スルホ基、スルホン酸塩の基、カルバモイル基、およびスルファモイル基からなる群から選択される。
分析対象物濃度の高精度な測定の観点から、好ましい一実施形態では、Ｑ２は、下記構造を有する。
Figure 0007208219000007
上記構造式中、Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ４１は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルキル基、カルボキシ基、カルボン酸塩の基、スルホ基、スルホン酸塩の基、アミノ基、カルバモイル基、およびスルファモイル基からなる群から選択され；Ｒ３３およびＲ４２は、それぞれ独立して、水素原子、カルボキシ基、カルボン酸塩の基、スルホ基、およびスルホン酸塩の基からなる群から選択され；Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルボン酸塩の基、スルホ基、スルホン酸塩の基、カルバモイル基、およびスルファモイル基からなる群から選択される。
より好ましい一実施形態では、Ｑ２は、下記構造を有する（下記構造式中、Ｒ３１、Ｒ３２およびＲ３３は、上述のとおりである。）。
Figure 0007208219000008
好ましい一実施形態では、式（１）で表される化合物は、下記構造を有する（下記構造式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、上述のとおりである。）。
Figure 0007208219000009
上記の式（１）で表される化合物としては、より具体的には、Ａｃｉｄ Ｙｅｌｌｏｗ １１、Ａｃｉｄ Ｙｅｌｌｏｗ ２３、Ａｃｉｄ Ｙｅｌｌｏｗ ４９、Ａｃｉｄ Ｙｅｌｌｏｗ ５９、Ａｃｉｄ Ｏｒａｎｇｅ １２、Ｏｒａｎｇｅ Ｇ、Ａｃｉｄ Ｒｅｄ １８、Ａｃｉｄ Ｒｅｄ ２６、Ａｃｉｄ Ｒｅｄ ２７、Ａｃｉｄ Ｒｅｄ ８８、Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ５、Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ６、Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １１、Ｆｏｏｄ Ｙｅｌｌｏｗ ３、Ｆｏｏｄ Ｙｅｌｌｏｗ ５等が例示できる。このうち、Ａｃｉｄ Ｙｅｌｌｏｗ １１、Ａｃｉｄ Ｙｅｌｌｏｗ ２３、Ａｃｉｄ Ｙｅｌｌｏｗ ４９、Ａｃｉｄ Ｙｅｌｌｏｗ ５９、およびＦｏｏｄ Ｙｅｌｌｏｗ ３からなる群から選択される化合物が好ましく用いられる。より好ましい一実施形態では、Ａｃｉｄ Ｙｅｌｌｏｗ ２３が散乱光調整剤として使用される。
散乱光調整剤として使用される少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素としては、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ここで、芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセンなどが挙げられ、好ましくはベンゼン、ナフタレンであり、より好ましくはベンゼンである。また、上記芳香族炭化水素が有するスルホン酸基の数は、特に制限されず、芳香族炭化水素の種類によっても異なるが、１～３個であることが好ましく、２～３個であることがより好ましく、２個であることが特に好ましい。さらに、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素は、水和物の形態であってもよい。また、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素中のスルホン酸基は塩の形態であってもよく、この際、塩の形態としては、特に制限されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、メチルアミン塩、エチルアミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、モノエタノールアミン塩、および塩化物等のハロゲン化物等がある。上記の塩は、好ましくはナトリウム塩またはカリウム塩であり、より好ましくはナトリウム塩である。すなわち、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素の具体例としては、ベンゼンスルホン酸、１，２－ベンゼンジスルホン酸、１，３－ベンゼンジスルホン酸、１，４－ベンゼンジスルホン酸、１，２，４－ベンゼントリスルホン酸、１，３，５－ベンゼントリスルホン酸、１－ナフタレンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２，７－ジスルホン酸、ナフタレン－１，３，５－トリスルホン酸、ナフタレン－１，３，６－トリスルホン酸、アントラセン－１－スルホン酸、アントラセン－２－スルホン酸、アントラセン－３－スルホン酸、アントラセン－１，３，６－トリスルホン酸等が例示できる。
散乱光調整剤として使用される二糖類としては、例えば、スクロース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、トレハロース、スクラロース、セロビオース、ラクツロース、ツラノース、ガラクトスクロース、トレハロサミン、マルチトール、ラクチトール等が例示できるが、これらに限定されない。二糖類としては、スクロース、トレハロース、スクラロース、ガラクトスクロース、トレハロサミン、マルチトール、ラクチトール等の非還元性糖が好ましく、より好ましくはトレハロース、および／またはスクラロースが用いられる。特に、浸透圧の低いスクラロースは赤血球の収縮抑制効果が大きく、分析サンプルに多く溶解させることができるという点から好ましい。
これらの散乱光調整剤のうち、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素またはその塩が好ましい。散乱光調整剤は、１，２－ベンゼンジスルホン酸、１，３－ベンゼンジスルホン酸、および１，４－ベンゼンジスルホン酸、ならびにこれらのナトリウム塩およびカリウム塩からなる群から選択されることがより好ましい。さらにより好ましくは、少なくとも１個のスルホン酸基を有する芳香族炭化水素は、ベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＢＳ）（下記構造式（１）参照）、１，３－ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム（ＤＳＢ）（下記構造式（２）参照）、１，３，５－ベンゼントリスルホン酸三ナトリウム（下記構造式（３）参照）、ナフタレン－１，３，６－トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ）（下記構造式（４）参照）、アントラセン－１，３，６－トリスルホン酸三ナトリウム（下記構造式（５）参照）、ならびにこれらの水和物から選択される。特に好ましくは、１，３－ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム（ＤＳＢ）、ナフタレン－１，３，６－トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＳＮ）が散乱光調整剤として使用される。これらの散乱光調整剤であれば、赤血球の収縮を適切に制御できる。すなわち、生体試料と分析対象物濃度測定用試薬との混合前後での散乱光変化を同じ程度とすることができる（平均透過率差をより小さくできる）。また、これらの散乱光調整剤は血液溶解性に優れるため、分析サンプル中の溶け残りを抑制できるだけでなく、血漿量が少ない高ヘマトクリット値の血液サンプルへの溶解性もよい。このため、散乱光や分析対象物の測定に影響を与えない。したがって、分析対象物をさらに高精度に測定できる。これらの散乱光調整剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
Figure 0007208219000010
散乱光調整剤の生体試料への混合量は、分析対象物濃度測定試薬の混合前後で散乱光を実質的に同じにできる量であれば特に制限されないが、生体試料の水性画分における散乱光調整剤の量（濃度）が、例えば、０．５～２１５ｍＭであり、好ましくは１～１５０ｍＭであり、より好ましくは２～６０ｍＭであり、特に好ましくは３ｍＭを超えて４０ｍＭ未満である。上記散乱光調整剤の混合量は、生体試料がヘマトクリット値が２０～６０の全血サンプルである場合に特に有効である。このような量であれば、試薬混合後の散乱光をより有効に抑制し、分析対象物をより高精度に検出できる。なお、上記散乱光調整剤などの分析対象物濃度測定試薬を構成する各成分の量は、下記計算方法により求めた値である。
（分析対象物濃度測定試薬を構成する各成分の量の測定方法）
本明細書では、試薬を構成する各成分（発色試薬、酸化還元酵素、散乱光調整剤、および任意に用いられ得るその他の物質（例えば、遷移金属化合物））の量を、下記方法に従って測定する。詳細には、分析対象物濃度測定試薬を用いて、例えば、実施例に記載されるような血糖値検出用チップを作製する。このチップ内に１０００μＬのＲＯ水（グルコース濃度０ｍｇ／１０００μＬ）を加えて、分析対象物濃度測定試薬を完全に溶解する（溶出させる）（サンプル）。このサンプル中の発色試薬濃度を、ＵＰＬＣ（超高速高分離液体クロマトグラフィーＳＨＩＭＡＤＺＵ ＮＥＸＥＲＡ Ｘ２、（株）島津製作所製）により測定する。各チップに塗布された発色試薬の質量（ｍｇ）に基づいて、試薬部空間に、ＲＯ水が流入して溶解した際の、発色試薬の濃度を算出する。また、発色色素以外の各成分に関しては、分析対象物濃度測定試薬の組成（各成分の濃度比）に基づいて、試薬部空間にＲＯ水が流入して試薬部空間体積を満たした際（すなわち、溶解した際）の各成分の濃度を算出する。
なお、試薬を構成する上記量（濃度）は、試薬を溶解する媒体における量（濃度）であり、生体試料がすべて液体（水性画分）であると仮定した場合の値である。例えば、生体試料が血液サンプルである場合には、水性画分は赤血球を除いた赤血球外液となる。このため、上記各成分の量（濃度）は、血液サンプルのヘマトクリット値を考慮して赤血球外液中の数値に換算する必要がある。例えば、上記方法により、ヘマトクリット値が４０の血液サンプル（生体試料）での散乱光調整剤の濃度がＡ（ｍＭ）であると測定された場合には、散乱光調整剤の混合量（濃度）は、Ａ×５／３（＝Ａ／（１－０．４））（ｍＭ）となる。
また、本発明では、試薬混合後の散乱光をより有効に抑制するという観点から、発色試薬を適切に選択することも有効である。具体的には、発色試薬は、下記式（２）：
Figure 0007208219000011
で示される、２－置換ベンゾチアゾリル－３－置換フェニル－５－置換スルホ化フェニル－２Ｈ－テトラゾリウム塩であることが好ましい。また、下記に詳述するが、本発明の第２の側面に係る分析対象物濃度測定試薬および本発明の第３の側面に係るチップにおいては、発色試薬は、上記式（２）で示される、２－置換ベンゾチアゾリル－３－置換フェニル－５－置換スルホ化フェニル－２Ｈ－テトラゾリウム塩であることが好ましい。本明細書において、上記式（２）の２－置換ベンゾチアゾリル－３－置換フェニル－５－置換スルホ化フェニル－２Ｈ－テトラゾリウム塩を、単に「本発明に係るテトラゾリウム塩」または「テトラゾリウム塩」とも称する。
本発明に係るテトラゾリウム塩から生じるホルマザン化合物は、極大吸収波長が血液の吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上、特に６３０ｎｍ以上）にある。このため、本発明に係るテトラゾリウム塩を用いることによって、生体試料に由来するノイズを減らすことができる。すなわち、生体成分に関するシグナルを感度よく検出できる。詳細には、本発明に係るテトラゾリウム塩は、テトラゾール骨格の２位のベンゾチアゾリル基がアルコキシ基で置換されている。このため、例えば、遷移金属化合物をさらに使用する場合には、テトラゾリウム塩から生じるホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物の極大吸収波長を、長波長側にシフトすることが可能である。また、テトラゾール環の２位に存在するベンゾチアゾリル基により、本発明に係るテトラゾリウム塩から生成するホルマザンはＣｏ２＋やＮｉ２＋等の遷移金属イオンと効率よくかつ速やかにキレート化合物を形成することができる。これはベンゾチアゾリル基の窒素原子によるものと考えられる。ここで、ベンゾチアゾリル基をアルコキシ基で置換した場合、アルコキシ基が電子供与性であるため、ベンゾチアゾリル基の電子密度が高まり、ホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物の形成が一層速やかに行われると考えられる。したがって、テトラゾール環の２位に存在するベンゾチアゾリル基上にアルコキシ基を導入することが、テトラゾリウム塩から生じるホルマザンの遷移金属化合物とのキレート能を維持しつつ、極大吸収波長を長波長側にシフトできる。よって、本発明に係るテトラゾリウム塩によれば、本発明に係るテトラゾリウム塩から生成するホルマザン化合物の極大吸収波長を、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上、特に６３０ｎｍ以上）にさらにシフトできる。このため、極大吸収波長が血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上）で生体成分濃度を測定することが可能となり、本発明に係るテトラゾリウム塩を用いることによって、全血サンプル中の生体成分濃度であっても正確に測定することができる。
さらに、本発明に係るテトラゾリウム塩は、テトラゾール骨格の５位のフェニル基が１または２のスルホ基（－ＳＯ３ －）を有し、かつ、テトラゾール骨格の３位のフェニル基が０または１のスルホ基（－ＳＯ３ －）を有する。ゆえに、テトラゾリウム塩は、化合物中に、１～３のスルホ基（－ＳＯ３ －）を有する。このため、テトラゾリウム塩は、水溶性および血液溶解性に優れる。また、本発明に係るテトラゾリウム塩は安定性に優れる。
したがって、本発明に係るテトラゾリウム塩を用いることによって、感度よくかつすみやかに生体成分濃度を測定できる。また、本発明に係るテトラゾリウム塩を用いることによって、長期間保存した後であっても、生体成分濃度を感度良く測定できる。なお、上記メカニズムは推測であり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
本発明に係るテトラゾリウム塩は、下記式（２）：
Figure 0007208219000012
の構造を有する。
上記式（２）において、テトラゾール骨格の２位には置換ベンゾチアゾリル基が存在する。上記式（２）において、テトラゾール環の２位にベンゾチアゾリル基が存在することにより、例えば、遷移金属化合物をさらに使用する場合には、遷移金属化合物と効率よくかつ速やかにキレート化合物を形成できる（ホルマザン化合物の極大吸収波長を長波長域にシフトできる）。そして、テトラゾール骨格の２位のベンゾチアゾリル基に、少なくとも１のメトキシ基またはエトキシ基（－ＯＲ３）が導入されることで、さらに生成するホルマザンとＮｉ２＋等の遷移金属イオンとのキレート時の極大吸収波長が長波長側にシフトする。
ここで、ｑは１または２であり、１であることが好ましい。ここで、ｑ＝１の場合、Ｒ３は、メチル基またはエチル基であり、水溶性の観点からはメチル基であることが好ましい。Ｒ３が炭素原子数３以上のアルキル基である場合には、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンは、水溶性に劣るため好ましくない。
式（２）において、Ｎｉ２＋等の遷移金属イオンとのキレート時の長波長側への極大吸収波長のシフトの効果の点で、テトラゾール骨格の２位に存在する置換ベンゾチアゾリル基の－ＯＲ３の少なくとも１がベンゾチアゾリル基の６位に結合することが好ましい。
ｑ＝１の場合、テトラゾール骨格の２位に存在するベンゾチアゾリル基の置換基である－ＯＲ３の置換位置は特に限定されるものではなく、４位、５位、６位、または７位のいずれであってもよい。Ｎｉ２＋等の遷移金属イオンとのキレート時の長波長側への極大吸収波長のシフトの効果の点では、－ＯＲ３の置換位置は、ベンゾチアゾリル基の６位に結合することが好ましい。
ｑ＝２の場合、Ｒ３は、水素原子、メチル基またはエチル基であり、少なくとも一がメチル基、またはエチル基である。また、ｑが２である場合、各ＯＲ３は隣接して配置され、各ＯＲ３が互いに環を形成してもよい。この際、好適な組み合わせとしては、Ｒ３が、水素原子およびメチル基の組み合わせ、メチル基およびメチル基の組み合わせである。ｑ＝２の場合、テトラゾール骨格の２位に存在するベンゾチアゾリル基の置換基である－ＯＲ３の置換位置は２つの－ＯＲ３が隣接して配置されれば特に限定されるものではなく、４，５位、５，６位、または６，７位のいずれであってもよい。Ｎｉ２＋等の遷移金属イオンとのキレート時の長波長側への極大吸収波長のシフトの効果の点では、少なくとも一の－ＯＲ３の置換位置は、ベンゾチアゾリル基の６位に結合することが好ましく、すなわち、２つの－ＯＲ３の置換位置は、５，６位、または６，７位であることが好ましい。具体的には、ｑが２である場合、テトラゾール骨格の２位に存在する置換ベンゾチアゾリル基は以下のいずれかの置換基であることが好ましい。
Figure 0007208219000013
さらには、ｑが２である場合、テトラゾール骨格の２位に存在する置換ベンゾチアゾリル基は上記いずれかの置換基である場合、テトラゾール骨格の３位に存在する置換スルホ化フェニル基が、４－メトキシ－５－スルホフェニル基であることが、Ｎｉ２＋等の遷移金属イオンとのキレート時の長波長側への極大吸収波長のシフトの効果の点で好ましい。
式（２）において、テトラゾール骨格の５位には置換スルホ化フェニル基が存在する。該スルホ化フェニル基の置換基であるＲ１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、およびエトキシ基からなる群から選択されるいずれか一つである。テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性を向上させるという観点からは、Ｒ１は、水素原子または水酸基であることが好ましく、幅広いｐＨ領域で遷移金属イオンとのキレートを安定的に形成できることから、Ｒ１は水素原子であることがより好ましい。また、Ｒ１が水酸基、メトキシ基、およびエトキシ基である場合の置換位置は特に限定されないが、４位であることが好ましい。
テトラゾール骨格の５位には、スルホ基（－ＳＯ３ －）が少なくとも１個存在する（ｍ＝１または２）。これにより、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性や血液溶解性が向上するものと考えられる。式（２）において、ｍは、スルホ基（－ＳＯ３ －）がテトラゾール骨格の５位のフェニル基に結合する数であり、１または２である。特にスルホ基が２位または４位にある場合、さらには、２，４位にある場合には、よりいっそうの水溶性の向上が発揮出来る。さらにスルホ基が２，４位にある場合には合成するためのビルディングブロックの合成が容易である点で、有利である。水溶性が高く、また、幅広いｐＨ領域で遷移金属イオンとのキレート化合物を安定的に形成することができる、または水溶性が向上することから、ｍ＝２であることが好ましく、ｍ＝２であり、Ｒ１が水素原子であることがより好ましい。
ここで、ｍ＝２である場合には、スルホ基（－ＳＯ３ －）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であるｐが１であることが好ましい。かような置換基数を選択することで、テトラゾリウム塩およびこれから生じるホルマザンの水溶性や血液溶解性が一層向上する。
なお、水溶性及び血液溶解性の観点からは、下記（１）～（４）：（１）ｍ＝２かつｐ＝１である、（２）ｍ＝１かつｎ＝０である、（３）テトラゾール骨格の５位に存在するフェニル基において、Ｒ１が水酸基であり、この際、スルホ基（ＳＯ３－）および水酸基が２，４位、または４，６位にある、（４）ｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基である、のいずれかを満たすことが好ましく、（１）ｍ＝２かつｐ＝１または、（４）ｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基であることがより好ましい。また、上記（３）では、スルホ基（ＳＯ３－）および水酸基が、ベンゼン環上で隣接した置換基として存在しないため、水素結合することがなく、または少なく、両置換基が効率的に水溶性に寄与できるためであると考えられる。
ここで、テトラゾール骨格の５位に存在するフェニル基へのスルホ基（－ＳＯ３ －）の結合位置は特に制限されない。テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性のさらなる向上効果、極大吸収波長を長波長側へシフトすることができることの点から、ｍ＝２の場合には、スルホ基（－ＳＯ３ －）は、フェニル基の、２，４位、３，５位に存在することが好ましい。フェニル基の２，４位にスルホ基が存在することが特に好ましく、高濃度の遷移金属イオンの存在下でも沈殿が発生しないテトラゾリウム塩化合物とすることができる。すなわち、このテトラゾリウム塩を発色試薬として使用することで、生体成分が高濃度な場合であっても、定量可能な生体成分測定試薬組成物を調製できる。すなわち、本発明の好ましい形態では、テトラゾール骨格の５位のフェニル基が、スルホ基（－ＳＯ３ －）が２，４位に存在するフェニル基であることが好ましい。
式（２）において、テトラゾール骨格の３位には置換フェニル基が存在する。フェニル基は必須に置換されるため、ｎ＋ｐは１以上である。
テトラゾール骨格の３位のフェニル基の置換基としてのＲ２は、ニトロ基、－ＯＲ４、およびカルボキシル基からなる群から選択されるいずれか一つである。Ｒ２は、ホルマザンと遷移金属イオンとのキレート形成性の観点からは、ニトロ基または－ＯＲ４であることが好ましく、水溶性や血液溶解性の観点からは、カルボキシル基であることが好ましい。また、ｎは、Ｒ２がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０～２の整数である。下記に記載のように、Ｒ２を導入することで、化合物の極大吸収波長を長波長域に移動させることや、化合物の安定性を向上させることが可能となるため、ｎ＝１または２であることが好ましく、ｎ＝１であることがより好ましい。Ｒ２が２個存在する場合、すなわち、ｎ＝２である場合、Ｒ２は同じであっても異なるものであってもよい。
ｎ＝１または２である場合、少なくとも１のＲ２が－ＯＲ４基であることが好ましい。すなわち、本発明の好適な形態は、ｎが１または２であり、かつ、少なくとも１のＲ２が－ＯＲ４基である。フェニル基の置換基としてアルコキシ基を導入することで、化合物の安定性が向上する。テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性や血液溶解性を向上させるという観点からは、－ＯＲ４基がメトキシ基であることが好ましい。ここで、Ｒ４は、メチル基またはエチル基であり、水溶性や血液溶解性の観点からはメチル基であることが好ましい。Ｒ４が炭素原子数３以上のアルキル基である場合には、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンは、水溶性や血液溶解性に劣るため好ましくない。
ｎが１または２である場合の、Ｒ２の置換位置は特に限定されないが、テトラゾール骨格の３位に存在する置換スルホフェニル基の２位、３位、４位、５位または６位であることが好ましく、少なくとも一のＲ２が２位または４位にあることが好ましく、２位および／または４位であることが好ましい。かような構造とすることで、水溶性や血液溶解性が向上するとともに、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの安定性を向上させることができる。
ｐは、スルホ基（－ＳＯ３ －）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０または１である。テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性や血液溶解性を向上させるという観点からは、ｐ＝１であることが好ましい。なお、ｐ＝１の場合、スルホ基は電子吸引性基であるため、他の電子吸引性基（例えば、ニトロ基）があると、テトラゾリウム環上の窒素原子のカチオン電荷を不安定化させ、化合物の安定性を低下させる場合がある。上述したとおり、フェニル基の置換基としてアルコキシ基を導入することで、化合物の安定性が向上するが、ニトロ基が同時に導入されると、アルコキシ基導入による安定性の向上が発揮されない場合がある。このため、安定性向上という観点からは、ｐ＝１の場合には、ｎが１または２であり、好ましくは、ｎが１であり、かつ、Ｒ２は、－ＯＲ４、およびカルボキシル基からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、Ｒ２は－ＯＲ４であることがより好ましい。または、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性や血液溶解性を向上させるという観点からは、ｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基であることが好ましい。すなわち、好適な実施形態は、式（２）において、ｐが１である、またはｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基である。より好適には、ｍ＝２かつｐ＝１である、またはｐ＝０かつ少なくとも一のＲ２がカルボキシル基である。
ｐ＝１である場合、テトラゾール骨格の３位のフェニル基を置換するスルホ基（－ＳＯ３ －）の置換位置は特に限定されるものではないが、３位または５位であることが好ましく、３位であることがより好ましい。この位置にスルホ基が置換することで、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの安定性をより有効に向上できる。
また、式（２）において、テトラゾール骨格の３位に存在する置換基が、４－メトキシ－３－スルホフェニル基、２－メトキシ－５－スルホフェニル基、２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル基、２－メトキシ－４－ニトロフェニル基、４－スルホフェニル基、４－カルボキシ－２－メトキシフェニル基、５－カルボキシ－２－メトキシフェニル基、３－カルボキシ－４－メトキシフェニル基、または４－メトキシ－５－スルホフェニル基が好ましく、４－メトキシ－３－スルホフェニル基、２－メトキシ－５－スルホフェニル基、３－カルボキシ－４－メトキシフェニル基、または４－メトキシ－５－スルホフェニル基であることがより好ましく、４－メトキシ－３－スルホフェニル基、４－メトキシ－５－スルホフェニル基、または、２－メトキシ－５－スルホフェニル基であることが特に好ましい。かような構造とすることで、発色感度が向上し、水溶性や血液溶解性が向上するとともに、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの安定性を向上させることができる。また、ホルマザン化合物自体の極大吸収波長をより長波長域にすることができることから、テトラゾール骨格の３位に存在するフェニル基が、４－メトキシ－３－スルホフェニル基であることが特に好ましい。
式（２）に存在するスルホ基の総数（ｍ＋ｐ）は、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンの水溶性を向上させるという観点から、２以上であることが好ましく、３であることがより好ましい。
上記式（２）において、Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす。ここで、Ｘは、アニオン（スルホ基（－ＳＯ３ －））を中和するために存在する。このため、アルカリ金属の種類は特に制限されず、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムのいずれでもよい。
テトラゾリウム塩の好ましい例としては、以下のものが挙げられる。なお、下記構造において、Ｘは、アルカリ金属を表わす。
Figure 0007208219000014
Figure 0007208219000015
Figure 0007208219000016
Figure 0007208219000017
Figure 0007208219000018
本発明に係るテトラゾリウム塩の製造方法は、特に制限されず、従来公知の方法が同様にしてまたは適宜修飾して適用できる。例えば、アルデヒドとヒドラジンの脱水縮合によりヒドラゾンを合成し、次いで、対応するジアゾニウム塩を水性溶媒中、塩基性条件下で反応させて、ホルマザンを得る。ここで、塩基性化剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。次いで得られたホルマザンを亜硝酸エチル、亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を用いアルコール溶媒（例えば、メタノール、エタノール）中で酸化し、式（２）のテトラゾリウム塩を得ることができる。一実施形態を挙げると、下記構造：
Figure 0007208219000019
を有するヒドラジノ置換ベンゾチアゾールと、下記構造：
Figure 0007208219000020
を有する置換スルホ化ベンズアルデヒドとを反応させて、下記構造：
Figure 0007208219000021
を有するヒドラゾン化合物を得る。一方、下記構造：
Figure 0007208219000022
を有する置換スルホ化アニリンを氷冷しながら塩酸を加え、さらに亜硝酸ナトリウム溶液を滴下して、下記構造：
Figure 0007208219000023
を有する塩化ベンゼンジアゾニウム化合物を得る。上記にて得られたヒドラゾン化合物と塩化ベンゼンジアゾニウム化合物とを塩基性条件（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム存在）下で反応させて、下記構造：
Figure 0007208219000024
を有するホルマザン化合物を得る。次いで、このようにして得られたホルマザン化合物を、酸化剤（例えば、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸エチル、亜硝酸ブチル等の亜硝酸エステル）を用いてアルコール溶媒（例えば、メタノール、エタノール）中で酸化することによって、本発明に係るテトラゾリウム塩が得られる。
本発明に係るテトラゾリウム塩から生成するホルマザン、またはホルマザンと遷移金属イオン（遷移金属化合物をさらに使用する場合）とのキレート化合物は、単独でまたは遷移金属化合物とのキレート化合物を形成することにより、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上、特に６５０ｎｍ以上）に極大吸収波長を有する。また、本発明に係るテトラゾリウム塩は、高い水溶性を有する。このため、本発明に係るテトラゾリウム塩を用いることによって、生体試料、特に全血サンプルに対しても感度よく生体成分濃度を測定できる。具体的には、本発明に係るテトラゾリウム塩から生成したホルマザン、またはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）は、好ましくは６００ｎｍ以上、より好ましくは６３０ｎｍ以上、特に好ましくは６５０ｎｍ以上である。このような極大吸収波長を有するホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物（ゆえに、このようなホルマザンを生成できるテトラゾリウム塩）であれば、血液の吸収の影響を受けにくく、生体成分濃度をより正確にかつ良好な感度で測定できる。ここで、本発明に係るテトラゾリウム塩から生成したホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）の上限は、特に制限されないが、通常、９００ｎｍ以下であり、好ましくは８００ｎｍ以下である。なお、本明細書において、極大吸収波長（λｍａｘ）は、下記方法に従って測定された値を採用する。
（極大吸収波長（λｍａｘ）の評価）
各ホルマザン化合物の終濃度が５０～２００ｍＭとなるように、１０ｍＭ ＭＯＰＳ水溶液を加えて、試料を１００μＬ作製する。別途、１Ｍのニッケルイオン水溶液を作製する。上記試料１００μＬに、１Ｍ ニッケルイオン水溶液を１０μＬ加え、素早く攪拌して、混合溶液を調製する。この混合溶液について、スペクトルを、分光光度計（測定セル長：１０ｍｍ）にて測定する（ｎ＝１）。各スペクトルに基づいて、各化合物のホルマザンでの極大吸収波長（λｍａｘ）（ｎｍ）を求める。
発色試薬（特に上記式（２）のテトラゾリウム塩）の生体試料への混合量は、所望の分析対象物（生体成分）濃度を測定できる量であれば特に制限されないが、テトラゾリウム塩が所望の分析対象物の存在量に対して十分量含まれることが好ましい。上記観点及び通常測定すべき生体成分濃度などを考慮すると、生体試料の水性画分における発色試薬の量（濃度）が、例えば、好ましくは１０～１５０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭを超えて１３０ｍＭ未満である。上記発色試薬の混合量は、生体試料が、ヘマトクリット値２０～６０である全血サンプルである場合に特に有効である。このような量であれば、発色試薬は、生体試料に含まれる実質的にすべて（例えば、９５モル％以上、好ましくは９８モル％以上、特に好ましくは１００モル％）の分析対象物（生体成分）の量に応じて反応する。また、上記量であれば、発色試薬は生体試料中に実質的に完全に溶解する。このため、不溶分による散乱を抑制するため、測定精度を向上できる。このため、所望の生体成分濃度を正確にかつ良好な感度で速やかに測定できる。
また、本発明で使用できる酸化還元酵素は、特に制限されず、測定される対象である生体成分の種類によって適切に選択されうる。具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ－ＧＤＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ－ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ－ＮＡＤ）およびニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするもの（ＧＤＨ－ＮＡＤＰ）等のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、尿酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。ここで、酸化還元酵素は、１種を単独で使用しても、または２種以上を組み合わせてもよい。例えば、生体成分がグルコースである場合には、酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼやグルコースオキシダーゼであることが好ましい。また、生体成分がコレステロールである場合には、酸化還元酵素がコレステロールデヒドロゲナーゼやコレステロールオキシダーゼであることが好ましい。
酸化還元酵素の生体試料への混合量は、特に制限されず、用いる酵素や発色試薬の種類、目的とする分析対象物の範囲に応じて適宜設定できる。酸化還元酵素の混合量は、発色試薬１モルに対して、例えば、０．２０～１．０モルであり、好ましくは０．３～０．８モルである。または、酸化還元酵素の混合量は、分析サンプル中の酸化還元酵素の濃度が例えば２～５０ＭＵ（×１０６Ｕ）／Ｌ、好ましくは３～３５ＭＵ／Ｌとなるような量であってもよい。上記散乱光調整剤の混合量は、生体試料が、ヘマトクリット値２０～６０の全血サンプルである場合に特に有効である。
また、本工程では、上記工程（１）で準備された生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合すればよいが、さらに遷移金属化合物を添加することが好ましい。遷移金属化合物を散乱光調整剤と併用することにより、生体試料と分析サンプルでの散乱光を実質的により同じにすることができる。ここで、遷移金属化合物は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤と一緒に混合しても、または発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤との混合前後に混合してもよい。好ましくは、遷移金属化合物は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤と一緒に混合する。
工程（２）で遷移金属化合物を生体試料に混合する際に使用できる遷移金属化合物は、イオン形態で発色試薬（特に上記式（２）のテトラゾリウム塩）とキレート化合物を生成するものであれば特に制限されない。また、発色試薬が上記式（２）のテトラゾリウム塩である場合には、このように遷移金属イオンと発色試薬とのキレート形成により、極大吸収波長をさらに長波長側にシフトすることができる。例えば、発色試薬が上記式（２）のテトラゾリウム塩であり、かつ遷移金属イオンがニッケルイオンである場合には、その構造式を考慮すると、ニッケルイオンと上記式（２）のテトラゾリウム塩は、１：２のモル比（ニッケルイオン：上記式（２）のテトラゾリウム塩のモル比）でキレート化合物を形成する。また、生体試料（全血サンプル）中の生体成分濃度を測定する場合であっても、ホルマザンが血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ以上）に極大吸収波長を有する。このため、生体試料、特に全血サンプルに対しても、生体成分濃度の測定感度をさらに向上できる。分析対象物濃度測定試薬が遷移金属化合物を含む場合に使用できる遷移金属化合物としては、特に制限されない。具体的には、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）、銅イオン（Ｃｕ２＋）などの遷移金属イオンを生成できる化合物が使用できる。このようなイオンであれば、ホルマザンの極大吸収波長を、より長波長側にシフトできる。これらのうち、ニッケルイオンが好ましい。ニッケルイオンは、酸化や還元作用を受けにくいため、測定誤差をより有効に低減できる。すなわち、本発明の好ましい形態によると、遷移金属化合物は、ニッケル化合物である。また、上記遷移金属イオンを生成する化合物は特に制限されないが、水性液体（例えば、水、緩衝液、血液、体液）中でイオンを生成するものであることが好ましい。例えば、上記遷移金属の、塩化物、臭化物、硫酸塩、有機酸塩（例えば、グルコン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩）などが挙げられる。上記遷移金属化合物塩は、遷移金属の有機酸塩であることが好ましい。この場合、血球への影響を制御しやすくなる。上記遷移金属化合物は、１種を単独で使用しても、または２種以上を併用してもよい。
上記形態において、遷移金属化合物の生体試料への混合量は、発色試薬と十分キレート化合物を形成できる量より化学量論的に多ければ特に制限されず、発色試薬の量によって異なり得る。例えば、遷移金属化合物の量は、発色試薬 １モルに対して、好ましくは４．０モル以上であり、より好ましくは４．０モルを超え、特に好ましくは４．５モル以上である。すなわち、本発明の好ましい形態では、工程（２）において、遷移金属化合物は、発色試薬 １モルに対して、４．０モル以上の割合で混合される。また、下記に詳述するが、本発明の第２の側面に係る分析対象物濃度測定試薬は、遷移金属化合物を、前記発色試薬 １モルに対して４．０モル以上（より好ましくは４．０モルを超え、特に好ましくは４．５モル以上）の割合でさらに含むことが好ましい。同様にして、本発明の第３の側面に係るチップにおいて、反応部は、前記発色試薬 １モルに対して４．０モル以上（より好ましくは４．０モルを超え、特に好ましくは４．５モル以上）の割合で、遷移金属化合物をさらに含むことが好ましい。上記遷移金属化合物の量は、発色試薬が上記式（２）のテトラゾリウム塩である場合に特に有効である。また、上記散乱光調整剤の混合量は、生体試料が、ヘマトクリット値２０～６０の全血である場合に特に有効である。このような量であれば、ホルマザン化合物の極大吸収波長を所望の波長域にまでシフトできる。なお、遷移金属化合物の上記混合量の上限は、特に制限されないが、分析サンプルでの不溶分の抑制効果などを考慮すると、発色試薬（特に２－置換ベンゾチアゾリル－３－置換フェニル－５－置換スルホ化フェニル－２Ｈ－テトラゾリウム塩） １モルに対して、好ましくは８モル以下、より好ましくは７モル以下である。
上記形態において、試薬混合後の散乱光をより有効に抑制するという観点から、散乱光調整剤と遷移金属化合物との混合比を適切に調節することも有効である。具体的には、散乱光調整剤が、遷移金属化合物 １モルに対して、好ましくは０モルを超え０．２４モル以下、より好ましくは０．０３～０．１２モル、特に好ましくは０．０５～０．１０モルである。すなわち、本発明の好ましい形態では、工程（２）において、遷移金属化合物を、遷移金属化合物に対する散乱光調整剤の混合比（遷移金属化合物１モルに対する散乱光調整剤のモル）が０モルを超え０．２４モル以下となるような割合で、さらに生体試料に混合する。また、本発明のより好ましい形態では、工程（２）において、遷移金属化合物を、遷移金属化合物に対する散乱光調整剤の混合比（遷移金属化合物１モルに対する散乱光調整剤のモル）が０．０３～０．１２モルとなるような割合で、さらに生体試料に混合する。本発明の特に好ましい形態では、工程（２）において、遷移金属化合物を、遷移金属化合物に対する散乱光調整剤の混合比（遷移金属化合物１モルに対する散乱光調整剤のモル）が０．０５～０．１０モルとなるような割合で、さらに生体試料に混合する。このような混合比であれば、試薬混合前後の赤血球内液及び赤血球外液の屈折率変化をより低く抑え、その結果、試薬混合前後の赤血球内の屈折率変化量（ΔｎＲＢＣ＝ｎＲＢＣ－１－ｎＲＢＣ－２）および赤血球外液の屈折率変化量（ΔｎＳ＝ｎＳ－１－ｎＳ－２）を実質的に同程度になるように赤血球の収縮をより適切に調節できる。ゆえに、分析対象物濃度をより高精度に測定できる。
上記に加えて、試薬混合後の散乱光をより有効に抑制するという観点から、散乱光調整剤と遷移金属化合物との合計濃度を適切に調節することが有効である。具体的には、生体試料の水性画分における散乱光調整剤および遷移金属化合物の合計濃度は、好ましくは８１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは７５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、さらにより好ましくは５０～６６５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌを超え６６５ｍｍｏｌ／Ｌ未満である。このような少ない量とすることにより、試薬混合前後の赤血球内液及び赤血球外液の屈折率変化をより低く抑え、その結果、試薬混合前後の赤血球内の屈折率変化量（ΔｎＲＢＣ＝ｎＲＢＣ－１－ｎＲＢＣ－２）および赤血球外液の屈折率変化量（ΔｎＳ＝ｎＳ－１－ｎＳ－２）を実質的に同程度になるように赤血球の収縮をより適切に調節できる。ゆえに、分析対象物濃度をより高精度に測定できる。
このようにして分析サンプルが調製される。ここで、分析サンプルの透過率は、生体試料と散乱光が実質的に同じである（生体試料との平均透過率差が－１５．０％を超え１５．０％未満である）限り、制限されない。例えば、分析サンプルの８００ｎｍ～９５０ｎｍの波長範囲内における透過率が、５０％未満であることが好ましい。また、７５０ｎｍ～８５０ｎｍの波長領域において、分析サンプルの透過率が生体試料の透過率よりも低いことが好ましい。このような場合には、分析サンプルの散乱光（透過率）を生体試料の散乱光（透過率）との差異が小さい状態で測定することができる（生体試料との平均透過率差をより小さくできる）ため、分析精度を向上できる。
なお、上述したように、本発明は、散乱光調整剤と遷移金属化合物とを組み合わせて分析サンプルの散乱光が生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得ることを特徴とするが、上記に加えて、下記（ａ）～（ｃ）の少なくとも一を行うことが試薬混合後の散乱光をより有効に抑制するという観点で好ましい：
（ａ）上記式（２）の２－置換ベンゾチアゾリル－３－置換フェニル－５－置換スルホ化フェニル－２Ｈ－テトラゾリウム塩を使用する；
（ｂ）工程（２）において、遷移金属化合物を、遷移金属化合物に対する散乱光調整剤の混合比（遷移金属化合物１モルに対する散乱光調整剤のモル）が０モルを超え０．２４モル以下（より好ましくは０．０３～０．１２モル、特に好ましくは０．０５～０．１０モル）となるような割合で、さらに生体試料に混合する；および
（ｃ）工程（２）において、遷移金属化合物を、発色試薬 １モルに対して、４．０モル以上の割合で混合する。上記のうち、（ａ）を少なくとも行うことが好ましく、（ａ）と（ｂ）および／または（ｃ）とを行うことがより好ましく、（ａ）と（ｂ）とを少なくとも行うことがさらにより好ましく、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）すべてを行うことが特に好ましい。
また、上記（ｂ）を行う場合には、下記（ｄ）を合わせて行うことが好ましい：
（ｄ）散乱光調整剤と遷移金属化合物との合計濃度を７５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下（より好ましくは５０～６６５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌを超え６６５ｍｍｏｌ／Ｌ未満）に設定する。
［工程（３）］
本工程では、上記工程（２）において得られた分析サンプルを用いて、分析対象物濃度を測定する。これにより、生体試料中に含まれる特定の分析対象物（生体成分）濃度を高精度で測定できる。ここで、測定方法は、特に制限されず、測定対象となる生体成分の種類に応じて適宜選択できる。例えば、生体成分がβ－Ｄ－グルコース（ＢＧ）であり、酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）である場合には、グルコースがＧＤＨによって酸化されてグルコン酸を生成するが、その際にＧＤＨの補酵素または電子伝達物質が還元されることを利用したものである。具体的には、電子の授受の結果として還元されたテトラゾリウム塩（ゆえにホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物）の呈色度合を光学的に測定する方法（比色法）と、酸化還元反応によって生じた電流を測定する方法（電極法）と、に大別される。上記方法のうち、比色法による血糖値の測定は、血糖値の算出の際にヘマトクリット値を用いた補正を行ないやすい、製造工程が簡易である等の利点を有している。このため、分析対象物濃度測定試薬は比色法に好適に使用できる。特に全血サンプル中のグルコース濃度を測定する場合には、比色法が好ましく使用され、発色試薬上記式（２）のテトラゾリウム塩を用いることが特に好ましい。しかしながら、電極法においても、分析サンプルと、生体試料の差異が小さい状態で測定することも可能である。
＜分析対象物濃度測定試薬＞
上述したように、本発明の方法によると、分析対象物濃度をより高精度に測定できる。したがって、本発明の第２の側面では、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含む、分析対象物濃度測定試薬が提供される。好ましくは、本発明の分析対象物濃度測定試薬は、発色試薬、酸化還元酵素、遷移金属化合物および散乱光調整剤を含む。ここで、発色試薬、酸化還元酵素、遷移金属化合物および散乱光調整剤の好ましい形態（種類、含有量、混合比など）は、上記第１の側面と同様であるため、ここでは説明を省略する。
分析対象物（生体成分測定対象）は、目的とする生体成分を含むものであれば特に制限されない。具体的には、血液、ならびに尿、唾液、間質液等の体液などが生体成分測定対象として挙げられる。また、生体成分は、特に制限されず、通常、比色法または電極法により測定される生体成分が同様にして使用できる。具体的には、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、尿酸などが挙げられる。すなわち、本発明の第２の側面における好ましい形態によると、本発明の分析対象物濃度測定試薬は、血液または体液中の、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、尿酸の濃度の測定のために使用される。
本発明の分析対象物濃度測定試薬の使用形態は、特に制限されず、固体、ゲル状、ゾル状、または液体のいずれの形態であってもよい。また、本発明の分析対象物濃度測定試薬は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含み、好ましくは、発色試薬、酸化還元酵素、遷移金属化合物および散乱光調整剤を含むが、上記に加えて、さらに他の成分を含んでもよい。ここで、他の成分としては、通常、測定対象である生体成分の種類に応じて適切に選択され、生体成分濃度を測定するために添加される成分が同様にして使用できる。具体的には、電子伝達体、緩衝剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、水（例えば、ＲＯ水）などが挙げられる。ここで、上記他の成分は、それぞれ、１種を単独で使用しても、または２種以上を組み合わせてしてもよい。また、上記他の成分のそれぞれは、１種を単独で使用しても、または２種以上を併用してもよい。
電子伝達体は、特に制限されず、公知の電子伝達体を使用してもよい。具体的には、ジアホラーゼ、フェナジンメチルサルフェート（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）（ＰＭＳ）、１－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェート（１－ｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）（１－Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳまたはｍ－ＰＭＳ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）などが挙げられる。なお、電子伝達体は必ずしも含む必要はなく、使用する酸化還元酵素の種類によっては、電子伝達体を配合しなくともよい。電子伝達体を使用する場合は、１種を単独で使用しても、または２種以上を組み合わせてもよい。また、分析対象物濃度測定試薬が電子伝達体を含む場合の、電子伝達体の含有量は、特に制限されず、例えば、発色試薬の量に応じて適宜選択できる。例えば、電子伝達体の含有量は、発色試薬に対して、好ましくは０．０５～１０質量％、より好ましくは０．１～５質量％である。このような量であれば、還元反応をより効率的に進行できる。ここで、例えば、発色試薬が上記式（２）のテトラゾリウム塩であり、生体成分がβ－Ｄ－グルコースであり、遷移金属イオンがニッケルイオンであり、酸化還元酵素がフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ－ＦＡＤ）であり、電子伝達体が１－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェート（ｍ－ＰＭＳ）である場合には、まず、β－Ｄ－グルコース及びｍ－ＰＭＳがＧＤＨ－ＦＡＤの作用を受けて、グルコン酸及び還元型のｍ－ＰＭＳになり、この還元型のｍ－ＰＭＳ及びテトラゾリウム塩からｍ－ＰＭＳおよびホルマザンになり、発色する。また、このホルマザンがニッケルイオンとキレート化合物を形成して、極大吸収波長がより長波長域側（例えば、６００ｎｍ以上）にシフトする。このため、本発明の分析対象物濃度測定試薬を用いることによって、血色素の吸収による影響を低減できるため、生体試料、特に全血サンプルに対しても感度よく生体成分濃度を測定できる。
緩衝剤（バッファー）は、特に制限されず、一般的に生体成分濃度を測定する際に使用されるバッファーが同様にして使用できる。具体的には、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸－リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン－ＨＣｌ緩衝剤（トリス塩酸緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤（２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤）、ＴＥＳ緩衝剤（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤）、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤（３－モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤）、ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝剤などのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン－塩酸緩衝剤、グリシン－ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン－ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン－ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤、トリス－ホウ酸緩衝剤、ホウ酸－ＮａＯＨ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤、またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸－リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝剤が好ましい。ここで、緩衝剤の濃度としては、特に制限されないが、０．０１～１．０Ｍであるのが好ましい。なお、本発明において緩衝剤の濃度とは、水性溶液中に含まれる緩衝剤の濃度（Ｍ、ｍｏｌ／Ｌ）をいう。また、緩衝液のｐＨは、生体成分に対して作用を及ぼさないことが好ましい。上記観点から、緩衝液のｐＨは、中性付近、例えば、５．０～８．０程度であることが好ましい。
ｐＨ調整剤もまた、特に制限されず、一般的に生体成分濃度を測定する際に適用されるｐＨとなるように、酸（塩酸、硫酸、リン酸など）または塩基（水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムなど）が適宜選択・使用される。また、ｐＨ調整剤は、そのまま使用されてもまたは水溶液の形態で使用されてもよい。また、ｐＨ調整剤の量は、特に制限されないが、試薬のｐＨが、中性付近、例えば、５．０～８．０程度となるような量であることが好ましい。
また、界面活性剤やアルコール等の溶剤も、試薬調整時に適宜目的に応じて添加することができる。
＜分析対象物濃度測定用チップ＞
本発明の分析対象物濃度測定試薬は、そのままの形態で生体成分濃度の測定に使用されてもよいが、分析対象物（生体成分）濃度測定用チップに組み込まれてもよい。すなわち、本発明は、反応部を有する、生体試料中の分析対象物濃度を測定するためのチップであって、前記反応部は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含む、チップをも提供する。好ましくは、本発明のチップの反応部は、発色試薬、酸化還元酵素、遷移金属化合物および散乱光調整剤を含む。
本発明の分析対象物濃度測定方法や測定用試薬は、自動分析機や測定キット、簡易血糖計等に組み込まれ、日常的な臨床検査に使用できる。また、本発明の試薬を市販のバイオセンサに組み込むことも可能である。なお、分析対象物濃度測定試薬を分析対象物（生体成分）濃度測定用チップに組み込む場合には、１チップ当たりの試薬の含有量は、特に制限されず、通常当該分野において使用される量が同様にして採用できるが、発色試薬が所望の生体成分の存在量に対して十分量で含まれることが好ましい。上記観点及び通常測定すべき生体成分濃度などを考慮すると、発色試薬（特に式（２）のテトラゾリウム塩）の量（濃度）は、１チップ当たり、好ましくは２．５ｎｍｏｌ以上、より好ましくは３．０～５０．０ｎｍｏｌ、特に好ましくは５～３０ｎｍｏｌである。このような量であれば、発色試薬は、生体試料に含まれる実質的にすべての生体成分の量に応じて反応する。このため、所望の生体成分濃度を正確にかつ良好な感度で速やかに測定できる。
以下では、比色法により血糖値を測定するに使用される本発明の測定用チップ（比色式血糖計）の形態を、図を参照しながら説明する。しかしながら、本発明は、本発明の分析対象物（生体成分）の濃度を測定するための方法および当該測定用の試薬を使用することを特徴とし、チップの構造は特に制限されない。このため、本発明の分析対象物濃度測定試薬を、市販の測定用チップやＷＯ ２０１４／０４９７０ならびにＷＯ ２０１６／０５１９３０等の公報に記載されるチップに適用してもよい。同様にして、下記実施形態では、血糖値の測定を目的としたチップの具体的な形態を説明するが、測定用チップは当該用途に限定されず、他の用途にも同様にしてまたは適切に修飾して適用できる。また、図面の説明において、同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
図７は、本実施形態に係る測定用チップを用いたグルコース（血糖）の検出に用いられる血糖計を概略的に示す平面図である。
図７において、血糖計１０は、血液サンプル中のグルコース（血糖）を測定する機器として構成されている。この血糖計１０は、主に、ユーザ（被検者）が操作するパーソナルユースとして用いられ得る。ユーザは、食前の血糖を測定して自身の血糖管理を行うこともできる。また、医療従事者が被検者の健康状態を評価するために血糖計１０を使用することもでき、この場合、血糖計１０を適宜改変して医療施設等に設置可能な構成としてもよい。
血糖計１０は、血液サンプル中に含まれるグルコースの含有量（血糖値）を光学的に測定する、比色法の原理を採用している。特に、この血糖計１０は、所定波長の測定光を分析サンプル（血液）に照射し、分析サンプルを透過した光を受光する、透過タイプの測定部１４により血糖測定を行う。
血糖計１０は、血液を取り込んだ測定用チップ１２を装着して、または測定用チップ１２を装着した状態で測定用チップ１２に血液を取り込み、測定部１４によりグルコースを検出する。測定用チップ１２は、１回の測定毎に廃棄するディスポーザブルタイプに構成されてもよい。一方、血糖計１０は、ユーザが測定を簡易に繰り返すことができるように、携帯可能且つ頑強な機器に構成されることが好ましい。
測定用チップ１２は、図８に示すように、板状に形成されたチップ本体部１８と、チップ本体部１８の内部で板面の面方向に延びる空洞部２０（液体用空洞部）とを備える。
チップ本体部１８は、図８に示すように、血糖計１０の挿入および離脱方向（血糖計１０の先端および基端方向、すなわち図７中のＢ方向）に長い長辺２２を有すると共に、Ａ方向に短い短辺２４を有する長方形状に形成されている。例えば、チップ本体部１８の長辺２２の長さは、短辺２４の２倍以上の長さに設定されるとよい。これにより測定用チップ１２は、血糖計１０に対して充分な挿入量が確保される。
また、チップ本体部１８の厚みは、長方形状に形成された側面に比べて極めて小さく（薄く）形成される（図８では、敢えて十分な厚みを有するように図示している）。例えば、チップ本体部１８の厚みは、上述した短辺２４の１／１０以下に設定されることが好ましい。このチップ本体部１８の厚みについては、血糖計１０の挿入孔５８の形状に応じて適宜設計されるとよい。
測定用チップ１２は、空洞部２０を有するように、一対の板片３０と、一対のスペーサ３２とによりチップ本体部１８を構成している。
図９は、図７の測定用チップを示す上面視図である。図９中では、チップ本体部１８の角部が尖っているが、例えば角部は丸角に形成されてもよい。また、チップ本体部１８は、薄板状に限定されるものではなく、その形状を自由に設計してよいことは勿論である。例えば、チップ本体部１８は、上面視で、正方形状や他の多角形状、または円形状（楕円形状を含む）等に形成されてもよい。
チップ本体部１８の内部に設けられる空洞部２０は、チップ本体部１８の短軸方向中間位置にあり、チップ本体部１８の長手方向にわたって直線状に形成される。この空洞部２０は、チップ本体部１８の先端辺２４ａに形成された先端口部２０ａと、基端辺２４ｂに形成された基端口部２０ｂにそれぞれ連なり、チップ本体部１８の外側に連通している。空洞部２０は、先端口部２０ａからユーザの血液を取り込むと、毛細管現象に基づき延在方向に沿って血液を流動させ得る。空洞部２０を流動する血液は少量であり、基端口部２０ｂまで移動しても張力により漏れが抑止される。なお、チップ本体部１８の基端辺２４ｂ側には、血液を吸収する吸収部（例えば、後述するスペーサ３２を基端側のみ多孔質体としたもの等）が設けられていてもよい。
また、空洞部２０の所定位置（例えば、図９中に示す先端口部２０ａと基端口部２０ｂの中間点よりも若干基端寄りの位置）には、血液中のグルコース（血糖）と反応することにより血液中のグルコース（血糖）濃度に応じた色に呈色する試薬（発色試薬）２６が塗布され、血糖計１０により測定がなされる測定対象部２８が設定されている。空洞部２０を基端方向に流動する血液が測定対象部２８に塗布された試薬２６と接触し、血液と試薬２６とが反応することで呈色する。なお、空洞部２０の長手方向上において、試薬２６の塗布位置と測定対象部２８は互いにずれていてもよく、例えば試薬２６が塗布された反応部を測定対象部２８の血液流動方向上流側に設けてもよい。
測定用チップ１２は、以上の空洞部２０を有するように、一対の板片３０と、一対のスペーサ３２とによりチップ本体部１８を構成している。一対の板片３０は、側面視でそれぞれ上述した長方形状に形成され、互いに積層方向に配置される。つまり、一対の板片３０は、チップ本体部１８の両側面（上面および下面）を構成している。各板片３０の板厚は、非常に小さく、例えば、５～５０μｍ程度の同一寸法に設定されるとよい。２つ（一組）の板片３０の厚みは、相互に異なっていてもよい。
一対の板片３０は、面方向と直交する方向からある程度の押圧力が加えられても、板形状を維持して塑性変形しない強度を有する。また、各板片３０は、測定光が透過可能となるように透明部又は半透明部分を備える。さらに、各板片３０は、空洞部２０において血液を流動させ得るように適度な親水性を有する平坦状の板面に形成されていることが好ましい。
各板片３０を構成する材料は、特に限定されるものではないが、熱可塑性樹脂材料、ガラス、石英等を適用するとよい。熱可塑性樹脂材料としては、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプ口ピレンなど）、シクロオレフィンポリマー、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテフタレート、ポリエチレンナフタレートなど）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリアミド、フッ素樹脂等の高分子材料又はこれらの混合物が挙げられる。
また、一対のスペーサ３２は、一対の板片３０の間に挟まれるように配置され、所定の接合手段（接着剤等）よりに各板片３０の対向面に強固に接着される。つまり各スペーサ３２は、一対の板片３０同士を離間させるように間に配置されることで、一対の板片３０と一対のスペーサ３２自体の間に空洞部２０を形成させる部材である。この場合、一方のスペーサ３２は、図９中のチップ本体部１８の上側長辺２２ａに接し、この上側長辺２２ａに沿って先端および基端方向に延びるように配置される。他方のスペーサ３２は、図９中のチップ本体部１８の下側長辺２２ｂに接し、この下側長辺２２ｂに沿って先端および基端方向に延びるように配置される。
一対のスペーサ３２を構成する材料（基材）は、特に限定されるものではないが、例えば、スチレン系、ポリオレフィン系、ポリウレタン系、ポリエステル系、ポリアミド系、ポリブタジエン系、トランスポリイソプレン系、フッ素ゴム系、塩素化ポリエチレン系等の各種熱可塑性エラストマーが挙げられる。または、熱可塑性エス卜ラマ一以外にも、弾性変形可能な種々の材料を適用してもよく、また弾性変形可能な多孔質体（例えばスポンジ）等の構造体を適用してもよい。さらに、一対の板片３０の間で硬化状態又は半硬化状態となることにより板片３０同士を接着する接着剤を基材の一方または両面に有するスペーサ３２として適用してもよい。またさらに、スペーサ３２は、試薬２６を含有することで、空洞部２０に試薬２６を溶出する構成であってもよい。
板片３０やスペーサ３２は、親水化処理されたものであってもよい。親水化処理の方法としては、例えば界面活性剤、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、水溶性シリコーンの他、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等の親水性高分子を含有した水溶液を浸漬法またはスプレー法等により塗布する方法や、プラズマ照射、グロー放電、コロナ放電、紫外線照射（例えば、エキシマ光照射）等の方法等が挙げられ、これらの方法を単独又は組み合わせてもよい。
次に、血糖計１０の装置本体１６について説明する。図７に示すように、血糖計１０は、外観を構成する筐体４０を有する。筐体４０は、ユーザが把持操作し易い大きさでその内部に血糖計１０の制御部４２を収容する箱体部４４と、箱体部４４の一辺（先端側）から先端方向に突出し内部に光学系の測定部１４を収容する筒状の測光部４６とを含む。また、箱体部４４の上面には、電源ボタン４８、操作ボタン５０、ディスプレイ５２が設けられ、測光部４６の上面にはイジェク卜レバー５４が設けられている。
電源ボタン４８は、ユーザの操作下に、血糖計１０の起動と起動停止を切り換える。操作ボタン５０は、起動状態となった血糖計１０において、ユーザの操作に基づき、血糖値の測定や表示を行う、測定結果（過去の測定結果を含む）の表示を切り換える等の操作部として機能する。ディスプレイ５２は、液晶や有機ＥＬ等により構成され、測定結果の表示やエラー表示等のように測定操作においてユーザに提供する情報を表示する。
イジェク卜レバー５４は、先端および基端方向に移動可能に設けられ、測光部４６内に設けられる図示しないイジェク卜ピンのロックを解除して、イジェク卜ピンを先端方向に進出可能とする。
一方、装置本体１６の測光部４６は、ユーザの指等に先端を押し当てるために、箱体部４４から先端方向に長く延出している。図８に示すように、この測光部４６には、挿入孔５８を有するチップ装着部６０と、血中のグルコース（血糖）を光学的に検出する測定部１４とが設けられる。
チップ装着部６０は、高い硬質性（剛性）を有する材料（例えば、ステンレス）により、外方向に突出するフランジ部６０ａを先端側に備え、軸方向に所定長さを有する筒状に形成される。このチップ装着部６０は、樹脂材料で構成された測光部４６の先端面と軸心部（中心部）にわたって位置決め固定される。測光部４６の内面には、図１０Ａに示すように、チップ装着部６０を強固に固定する固定壁４６ａが突出形成されている。
チップ装着部６０を構成する材料としては、例えば、ステンレスやチタン等の金属、アルマイト皮膜処理をしたアルミニウム、液晶ポリマー、ガラスやマイカ等のフィラーを添加したプラスティック、ニッケルめっき等で表面を硬化皮膜したプラスティック、カーボンファイバー、ファインセラミック等、硬質で安易に寸法が変化せず、また繰り返し測定用チップの抜き差しをしても摩耗しにくく、且つ寸法精度良く加工可能な材料が挙げられる。この中でも金属材料を適用すれば、チップ装着部６０の製造（射出成形やプレス成形等）時に、高い寸法精度且つ容易に挿入孔５８を成形することができる。なお、装置本体１６は、測光部４６自体を硬質な材料（例えば、金属材料）により構成することで、チップ装着部６０を一体成形していてもよい。
チップ装着部６０の軸心部には、このチップ装着部６０の壁部６２に囲われることにより挿入孔５８が設けられる。挿入孔５８は、挿入方向（Ｂ方向）に長く、左右幅方向（Ａ方向）に短い断面長方形状に形成されている。挿入孔５８は、チップ装着部６０が測光部４６に固着された状態で、その先端面から奥部（基端方向）に向かって所定深さを有する。
チップ装着部６０の先端側には、挿入孔５８に連なると共に、外部に連通する挿入開口部５８ａが形成される。この挿入開口部５８ａの挿入方向（Ｂ方向）の寸法は、測定用チップ１２の短辺２４の寸法（Ａ方向の長さ）に一致している。また、挿入開口部５８ａの左右幅方向の寸法、すなわち挿入孔５８の側面を構成する一対の壁部６２の間隔は、図１０Ａに示すように、測定用チップ１２の積層方向の厚み（図１０Ａ中のＴａｌｌ）と実質的に同じである。
チップ装着部６０は、挿入孔５８（測定用孔部５９）が延在する途中位置に、測光部４６の固定壁４６ａと協働して一対の素子収容空間６４を形成している。一対の素子収容空間６４は、測定部１４の一部であり、挿入孔５８を挟んで互いに対向位置に設けられ、チップ装着部６０により形成された各導光部６６を介して測定用孔部５９に連通している。
測定部１４は、一方の素子収容空間６４に発光素子６８を収容することで発光部７０を構成し、他方の素子収容空間６４に受光素子７２を収容することで受光部７４を構成している。チップ装着部６０の導光部６６は、適宜な直径を有する円形状の穴に形成されることで、所謂アパーチャの役割を果たしている。
発光部７０の発光素子６８は、第１の波長を有する測定光を測定用チップ１２に照射する第１発光素子６８ａと、第１の波長とは異なる第２の波長を有する測定光を測定用チップ１２に照射する第２発光素子６８ｂとを含む（図８中では図示を省略する）。第１発光素子６８ａと第２発光素子６８ｂは、素子収容空間６４の導光部６６を臨む位置に並設されている。
発光素子６８（第１及び第２発光素子６８ａ、６８ｂ）は、発光ダイオード（ＬＥＤ）で構成され得る。第１の波長は、血糖量に応じた試薬２６の呈色濃度を検出するための波長であり、例えば、６００ｎｍ～６８０ｎｍである。第２の波長は、血液中の赤血球濃度を検出するための波長であり、例えば、５１０ｎｍ～５４０ｎｍである。箱体部４４内の制御部４２は、駆動電流を供給して、第１及び第２発光素子６８ａ、６８ｂをそれぞれ所定タイミングで発光させる。この場合、呈色濃度から得られる血糖値を赤血球濃度から得られるヘマトクリット値を用いて補正し、血糖値を求める。なお、さらに他の測定波長で測定することで、血球に起因するノイズを補正してもよい。
受光部７４は、素子収容空間６４の導光部６６を臨む位置に１つの受光素子７２を配置して構成される。この受光部７４は、測定用チップ１２からの透過光を受光するものであり、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）で構成され得る。
また、挿入孔５８の底部（基端面）には、イジェクトレバー５４に連結されたイジェクトピン５６（イジェクト部）が設けられている。イジェクトピン５６は、測光部４６の軸方向に沿って延びる棒部５６ａと、棒部５６ａの先端部で径方向外側に大径な受部５６ｂとを備える。受部５６ｂには、挿入孔５８に挿入された測定用チップ１２の基端辺２４ｂが接触する。また、挿入孔５８の底部とイジェクトピン５６の受部５６ｂの間には、イジェクトピン５６を非接触に囲うコイルバネ７６が設けられている。コイルバネ７６は、イジェクトピン５６の受部５６ｂを弾性的に支持する。
測定用チップ１２の挿入が完了すると、図１０Ｂに示すように、測定用チップ１２の測定対象部２８が導光部６６に重なる位置に配置される。
イジェクトピン５６は、ユーザによる測定用チップ１２の挿入に伴い受部５６ｂが押されることで基端方向に変位し、筐体４０内に設けられた図示しないロック機構によりロック（固定）される。コイルバネ７６は、受部５６ｂの変位に従って弾性的に収縮する。そして、ユーザのイジェクトレバー５４の操作により、イジェクトピン５６が多少移動するとロック機構のロックが解除され、コイルバネ７６の弾性復元力により先端方向にスライドする。これにより、測定用チップ１２がイジェクトピン５６に押し出されて、挿入孔５８から取り出される。
図７に戻り、装置本体１６の制御部４２は、例えば、図示しない演算部、記憶部、入出力部を有する制御回路によって構成される。この制御部４２は、周知のコンピュータを適用することが可能である。制御部４２は、例えば、ユーザの操作ボタン５０の操作下に、測定部１４を駆動制御して血中のグルコースを検出及び算出し、ディスプレイ５２に算出した血糖値を表示する。
例えば、測定用チップ１２に対し測定光を透過させて分析対象物（例えば、グルコース）を測定する血糖計１０において、制御部４２は、以下の式（Ｄ）で示すＢｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔ則に基づいて測定結果を算出する。
Figure 0007208219000025
上記式（Ｄ）において、ｌ０は血液サンプルに入射する前の光の強度、ｌ１は血液サンプルから出射した後の光の強度、αは吸光係数、Ｌは測定光が通過する距離（セル長）である。
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、下記実施例において、特記しない限り、操作は室温（２５℃）で行われた。また、特記しない限り、「％」および「部」は、それぞれ、「質量％」および「質量部」を意味する。
製造例１：テトラゾリウム化合物１の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（２－（６－メトキシベンゾチアゾリル）－３－（３－スルホ－４－メトキシ－フェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム塩：テトラゾリウム化合物１）（分子量（Ｍｗ）＝６９３）を合成した。
Figure 0007208219000026
１．ヒドラゾン化合物１の合成
４－ホルミルベンゼン－１，３－ジスルホン酸二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４－Ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ－１，３－ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（東京化成工業株式会社製）１．５９ｇ及び（６－メトキシベンゾチアゾール－２－イル）ヒドラジン（２－Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ－６－ｍｅｔｈｏｘｙ－１，３－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１．０ｇをＲＯ水６０ｍＬに懸濁させた。この懸濁液を、酢酸酸性下、ウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去した。この残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿をドラフト中で乾燥させて、ヒドラゾン化合物１を得た。１．８ｇ回収し、収率７０質量％であった。
２．ホルマザン化合物１の合成
上記１．のヒドラゾン化合物１ ０．７６ｇをＲＯ水１０ｍＬおよびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。ｐ－アニシジン－３－スルホン酸（ｐ－ａｎｉｓｉｄｉｎ－３－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（東京化成工業株式会社製）０．２６４ｇをＲＯ水４．０９ｍＬに懸濁させ、１０Ｎ ＮａＯＨ １３０μＬを加え溶解させた。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２８０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を－２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ３００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物１を含む溶液（ホルマザン化合物１溶液）を調製した。このホルマザン化合物１溶液を、９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物１を得た。
３．ホルマザン化合物１の精製およびテトラゾリウム化合物１の合成
上記２．のホルマザン化合物１をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物１溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８－ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１溶液を精製した。採取したフラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）－エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃）遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物１の回収
上記３．の反応溶液に対し、ジエチルエーテル加えて、テトラゾリウム化合物１を沈殿させた。この沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物１を得た（１２０ｍｇ、収率：１１．８質量％）。このようにして得られたテトラゾリウム化合物１について、極大吸収波長（λｍａｘ）を測定したところ、６３０ｎｍであった。
実施例１～６、比較例１：血糖計センサでの評価
＜塗布液（コート液）の調製＞
まず、酸化還元酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ－ＦＡＤ）（表中、「ＧＤＨ」）と、散乱光調整剤としての１，３－ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム（ＤＳＢ、Ａｌｆａ Ａｅａｒ製）と、発色色素としての上記製造例１で合成したテトラゾリウム化合物１と、遷移金属化合物としての酢酸ニッケル（表中、「酢酸Ｎｉ」）と、ｐＨ調整剤としての水酸化ナトリウム水溶液（適量）とを含む試薬水溶液（ｐＨ６．５～７）を下記表１に示される組成となるように調製し、塗布液１～６（それぞれ、実施例１～６）及び比較塗布液１（比較例１）を得た。
Figure 0007208219000027
＜血糖値測定チップの作製＞
１．試薬片の調製
上記＜塗布液（コート液）の調製＞にて調製した塗布液１～６および比較塗布液１を、それぞれ、ステージ上に載置されたポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（製造会社名：東レ株式会社、商品名：ルミラーＴ６０、厚み１８８μｍ、８ｍｍ×８０ｍｍ）上に、インクジェット装置（（株）マイクロジェット製、Ｌａｂｏｊｅｔ－５００Ｂｉｏ）を用いて、±５μｍ以内のパターニング精度および１ｐＬ～１０００ｐＬの吐出液量のヘッドで塗布し、常温（２５℃）で１晩乾燥した。乾燥後、試薬層が形成されたＰＥＴフィルムを、所定の大きさに切り出して試薬片を作製した。
２．塗布された各成分量の測定
上記１．にて作製された各試薬片に塗布された各成分量（濃度）を次のようにして求めた。詳細には、後述の血糖計センサ（チップ形状）に組み立てた状態で、チップ内に１０００μＬのＲＯ水を加えて血糖値測定試薬を完全に溶解して、サンプルとした。このサンプル中の発色試薬濃度を、ＵＰＬＣ（超高速高分離液体クロマトグラフィーＳＨＩＭＡＤＺＵ ＮＥＸＥＲＡ Ｘ２、株式会社島津製作所製）により求めた。各チップに塗布された発色試薬の質量（ｍｇ）から、試薬部空間に、ＲＯ水が流入して溶解した際の、発色試薬（テトラゾリウム化合物１）の濃度を算出し、その結果を下記表２に示す。また、上記表１に記載の塗布液（コート液）の濃度比から、発色色素以外の成分についても、試薬部空間にＲＯ水が流入して試薬部空間体積を満たした際（すなわち、溶解した際）の試薬成分の濃度を算出し、その結果を下記表２に示す。なお、血糖値測定チップ１個あたりの各成分の質量は、試薬部空間体積と、下記表２に記載の濃度から算出できる。
Figure 0007208219000028
３．血糖計センサ（血糖値測定チップ）の組み立て
図１１Ａは血糖計センサ（血糖値測定チップ）の組み立てを示す模式図である。図１１Ａにおいて、第２基材としてのＰＥＴフィルム５（製造会社名：３Ｍ社、商品名：親水処理ポリエステルフィルム９９０１Ｐ、厚み：１００μｍ）の両側に、両面テープ（製造会社名：日東電工（株）、商品名：両面粘着テープ、厚み：５０μｍ）４がスペーサ及び接着部として形成されたチップ土台を作製した。このチップ土台に、上記１．にて作製した試薬片２を、試薬層（試薬塗布面）３がチップ土台となるＰＥＴフィルム５と対向し、且つ、流路６の中心となるように貼り付けた。
図１１Ａにおいて、試薬片２の試薬塗布面３を下面にしてＰＥＴフィルム５の両端に配置されたスペーサとしての一対の両面テープ４上に設置する。次に、ＰＥＴフィルム５と同じ形状のＰＥＴフィルムを準備する。ＰＥＴフィルムの、試薬片２と対向する面の長手方向両側に、両面テープ（製造会社名：３Ｍ社、商品名；両面粘着テープ、厚み：８０μｍ）（図示せず）を貼り、ＰＥＴフィルム７とする。このＰＥＴフィルム７を、試薬片２の上から、スペーサ及び両面テープ（接着部）４の上に貼り付けることで、内面の血液流路６が段差形状の血糖値測定チップ１～６（それぞれ、実施例１～６）及び比較血糖値測定チップ１（比較例１）を得た。図１１Ｂは、血糖計センサ（測定チップ）の、縦または横方向の断面図である。ここでは、図１１Ｂに示される、流路部（流路６）の流路長さ（Ｌ１）、流路幅（Ｗ）、流路厚み（ｔ１）、および試薬塗布部に相当する試薬部（測定部）３の流路長さ（Ｌ２）、流路幅（Ｗ）、流路厚み（ｔ２）としては下記表３のサイズのものを用いた。図１１Ｂにおいて、血糖計センサ（測定チップ）の流路は、試薬塗布面が配置されてなる試薬部と、流路において、試薬塗布面が配置されていない流路を流路部とからなる。
Figure 0007208219000029
ここで、測定部の容積は、流路６を画成する内壁のうち、血糖値測定試薬からなる試薬層３が形成された流路内の面である試薬形成面と、試薬層３の厚み方向において試薬層３と対向する対向面とで挟まれる隙間（即ち、血糖値測定試薬と血液とが溶解状態となる領域）の容積Ｂである。すなわち、容積Ｂは、図１１ＢにおいてＬ２×Ｗ×ｔ２で算出される空間である。
なお、流路部におけるチップ厚み方向に対して直交する方向（流路長手方向）の長さＬ１としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５～１０ｍｍが好ましい。ここで、長さＬ１は、長いと、成分測定装置への装着（挿入）が容易となる点、および光学測定部への外乱光の進入が減少するという点で有利である。長さＬ１が短いと、検体量を少なくできる点で有利となる。よって、成分測定装置への装着（挿入）のしやすさ、外乱光の影響、及び検体量のバランスを考慮して、長さＬ１の上限と下限が決定される。試薬部における流路のチップ厚み方向に対して直交する方向（流路長手方向）の長さＬ２としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１～４ｍｍが好ましい。ここで、長さＬ２は、長い方が、照射スポットの面積を長さ方向に大きく取れるため、精度良く測定ができる点で有利であるが、短い方が、検体量を少なくできる点で有利となる。よって、測定精度と検体量とのバランスを考慮して、長さＬ２の上限と下限が決定される。
作製した各血糖計センサの流路入口に、ヒト全血サンプル１（Ｈｔ２０、ＢＧ０）（ヘマトクリット値２０％、グルコース濃度０ｍｇ／ｄＬ）、全血サンプル２（Ｈｔ２０、ＢＧ４００）（ヘマトクリット値２０％、グルコース濃度４００ｍｇ／ｄＬ）、全血サンプル３（Ｈｔ４０、ＢＧ０）（ヘマトクリット値４０％、グルコース濃度０ｍｇ／ｄＬ）、全血サンプル４（Ｈｔ４０、ＢＧ４００）（ヘマトクリット値４０％、グルコース濃度４００ｍｇ／ｄＬ）、全血サンプル５（Ｈｔ６０、ＢＧ０）（ヘマトクリット値６０％、グルコース濃度０ｍｇ／ｄＬ）および全血サンプル６（Ｈｔ６０、ＢＧ４００）（ヘマトクリット値６０％、グルコース濃度４００ｍｇ／ｄＬ）を、それぞれ、４μＬ点着した。なお、上記表２で示した血糖値測定試薬の各成分量は、ヘマトクリット値が０のサンプル（グルコース濃度０ｍｇの水溶液、すなわちＲＯ水）を血糖計センサ内に導入した際の、容積Ｂの空間における濃度である。上述したように、各成分量は血液サンプルのヘマトクリット値を考慮して血漿中の数値に換算する必要がある。例えば、実施例１の酢酸ニッケルはヘマトクリット値が０のサンプルで６２．５ｍＭであるため、ヘマトクリット値が４０の全血サンプルでは、実施例１の酢酸ニッケルは約１０４．１７（＝６２．５×１／０．６）ｍＭとなる。上記各全血サンプルでの換算後の試薬の各成分量を、下記表４～６（それぞれ、ヘマトクリット値が２０（Ｈｔ２０）、４０（Ｈｔ４０）及び６０（Ｈｔ６０））に示す。
Figure 0007208219000030
Figure 0007208219000031
Figure 0007208219000032
各全血サンプルは、以下のように作製した；まず、ヘパリン入りの採血管に全血を採取し、この全血サンプルのヘマトクリット値を測定し、事前に分離して得た血漿を適宜加える、または全血サンプルの血漿を抜き取って全血サンプルのヘマトクリット値が所定の値（Ｈｔ２０、４０及び６０）になるよう全血サンプルを調製した。次に、上記ヘマトクリット値を調整した全血サンプルに、高濃度グルコース溶液（４０ｇ／ｄＬ）を適宜添加し、血中グルコース濃度が４００ｍｇ／ｄＬの全血サンプル（Ｈｔ２０、４０及び６０、４００ｍｇ／ｄＬ）を作製した。また、上記と同様にして血中グルコース濃度が１００ｍｇ／ｄＬの全血サンプル（Ｈｔ２０、４０及び６０）を作製した。上記各ヘマトクリット値の全血サンプル（Ｈｔ２０、４０及び６０、１００ｍｇ／ｄＬ）１ｍＬに対し、グルコースオキシダーゼ（東洋紡株式会社製、ＧＬＯ－２０１）を０．１ｍｇ添加した。添加してから５分間、室温（２５℃）で放置して、血中グルコース濃度が０ｍｇ／ｄＬの全血サンプル（Ｈｔ２０、４０及び６０、０ｍｇ／ｄＬ）を作製した。
各全血サンプル１～６を、それぞれ、上記にて作製したチップの試薬部に点着してから９秒後に、上記＜スペクトル解析＞に記載の方法に従って、ファイバ分光光度計を用いて、４００～１０００ｎｍの波長域のスペクトルを測定した。
これらのスペクトルに基づいて、平均透過率差を算出し、結果を表７に示す。ここで、「平均透過率差」は、分析サンプル（試薬混合後）の波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（ａｖｅＴanalyte（％））と全血サンプル（試薬混合前）の波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（ａｖｅＴsample（％））との差（＝ａｖｅＴanalyte（％）－ａｖｅＴsample（％））である。
また、全血サンプル３、４に関する透過率差（絶対値）を算出し、結果を表８に示す。ここで、「透過率差（絶対値）」は、分析サンプル（試薬混合後）の波長領域８５０～１０００ｎｍでの透過率（Ｔanalyte（％））と全血サンプル（試薬混合前）の波長領域８５０～１０００ｎｍでの透過率（Ｔsample（％））との差（＝Ｔanalyte（％）－Ｔsample（％））の絶対値のうちの最大値である。
Figure 0007208219000033
Figure 0007208219000034
また、実施例１の試薬を用いた全血サンプル（Ｈｔ２０）１、２のスペクトルを図１に、実施例１の試薬を用いた全血サンプル（Ｈｔ４０）３、４のスペクトルを図２に、実施例１の試薬を用いた全血サンプル（Ｈｔ６０）５、６のスペクトルを図３に、比較例１の試薬を用いた全血サンプル（Ｈｔ２０）１、２のスペクトルを図４に、比較例１の試薬を用いた全血サンプル（Ｈｔ４０）３、４のスペクトルを図５に、比較例１の試薬を用いた全血サンプル（Ｈｔ６０）５、６のスペクトルを図６に、それぞれ、示す。なお、図中、「Ｔ％」は「透過率（％）」を示す。
これらの結果から、実施例１～６の試薬を用いることによって、比較例１の試薬を使用する場合に比して、赤血球内外の平均透過率差を有意に減少できる。即ち、試薬混合後の分析サンプルで生じる散乱光と、生体試料で生じる散乱光とを近い状態とすることができる。このため、実施例１～６の試薬を用いることにより、散乱光に由来するベースライン変動の影響を低減することで、生体試料中の分析対象物濃度を高精度で測定することができると考察される。本方法は、ヘマトクリット値や血色素量等、血液の情報に基づいた補正を適用する際にも、精度をより向上させることができる。また、表８の結果から、本発明の試薬を用いる場合には、８５０～１０００ｎｍの全波長領域にわたって、透過率差が１０％以内である（即ち、上記全波長範囲にわたって試薬前後の散乱光を実質的に同じである）ことが示される。
実施例７～１２、比較例２：溶解性の評価
以下のようにして、ヘマトクリット値が６０％である全血サンプルにおける溶解性を評価した。上記実施例１～６、比較例１と同様にして、血糖値測定チップ７～１２（それぞれ、実施例７～１２）及び比較血糖値測定チップ２（比較例２）を作製した。
作製した各血糖値測定チップの流路入口に、血漿２μＬを点着した。実際の全血サンプルを用いた場合は、赤血球の存在により溶解性を確認することが実質的に困難である。このため、ヘマトクリット値が６０％である全血サンプル ５μＬに含まれる血漿（２μＬ）を点着した場合を想定して、溶解性を評価した。該血漿を点着してから９秒後の試薬の溶解状態を目視にて観察した。結果を下記表９に示す。なお、表中、〇は試薬が完全に溶解していることを示し、×は試薬の溶け残りがあったことを示す。
Figure 0007208219000035
本出願は、２０１８年３月７日に出願された日本特許出願番号２０１８－０４０８８７号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。
１ 血糖計センサ（測定チップ）、
２ 試薬片、
３ 試薬塗布面、
４ 両面テープ、
５ ＰＥＴフィルム、
６ 流路、
７ ＰＥＴフィルム、
１０ 血糖計、
１２ 測定用チップ、
１４ 測定部、
１６ 装置本体、
１８ チップ本体部、
２０ 空洞部、
２０ａ 先端口部、
２０ｂ 基端口部、
２２ 長辺、
２２ａ 上側長辺、
２２ｂ 下側長辺、
２４ 短辺、
２４ａ 先端辺、
２４ｂ 基端辺、
２６ 試薬、
２８ 測定対象部、
３０ 板片、
３２ スペーサ、
４０ 筺体、
４２ 制御部、
４４ 箱体部、
４６ 測光部、
４８ 電源ボタン、
５０ 操作ボタン、
５２ ディスプレイ、
５４ イジェクトレバー、
５６ イジェクトピン、
５６ａ 棒部、
５６ｂ 受部、
５８ 挿入孔、
５８ａ 挿入開口部、
５９ 測定用孔部、
６０ チップ装着部、
６０ａ フランジ部、
６２ 壁部、
６４ 素子収容空間、
６６ 導光部、
６８ 発光素子、
７０ 発光部、
７２ 受光素子、
７４ 受光部、
７６ コイルバネ。

Claims (9)

  1. 生体試料中の分析対象物濃度を測定する方法であって、
    （１）前記生体試料を準備し、
    （２）前記生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合して、散乱光が前記生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得て、
    （３）前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物濃度を測定すること、
    を含み、
    前記工程（２）において、遷移金属化合物を、前記発色試薬 １モルに対して、４．０モルを超える割合で、さらに生体試料に混合し、
    前記生体試料中の分析対象物濃度は全血中のグルコース濃度であり、
    前記発色試薬は、下記式（２）：
    Figure 0007208219000036
    式（２）において、Ｒ１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、およびエトキシ基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ２は、ニトロ基、－ＯＲ４、およびカルボキシル基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ３は、水素原子、メチル基またはエチル基であり、少なくとも１はメチル基またはエチル基であり、Ｒ４は、メチル基またはエチル基であり、ｍは、スルホ基（－ＳＯ３ －）がテトラゾール骨格の５位のフェニル基に結合する数であり、１または２であり、ｎは、Ｒ２がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０～２の整数であり、ｐは、スルホ基（－ＳＯ３ －）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０または１であり、ｎ＋ｐは１以上であり、ｑは１または２であり、ｑが２の場合、各ＯＲ３は隣接して配置され、この際、各ＯＲ３が互いに環を形成してもよく、Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす、
    で示される、２－置換ベンゾチアゾリル－３－置換フェニル－５－置換スルホ化フェニル－２Ｈ－テトラゾリウム塩であり、
    前記遷移金属化合物は、ニッケル化合物であり、
    前記散乱光調整剤は、１，３－ベンゼンジスルホン酸二ナトリウムまたはその水和物である、方法。
  2. 前記工程（２）において、前記分析サンプルの波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（ａｖｅＴａｎａｌｙｔｅ（％））と前記生体試料の波長領域８５０～１０００ｎｍでの平均透過率（ａｖｅＴｓａｍｐｌｅ（％））との差（＝ａｖｅＴａｎａｌｙｔｅ（％）－ａｖｅＴｓａｍｐｌｅ（％））が－１０％以上１０％以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記工程（２）において、前記遷移金属化合物を、遷移金属化合物に対する散乱光調整剤の混合比（遷移金属化合物１モルに対する散乱光調整剤のモル）が０モルを超え０．２４モル以下となるような割合で、生体試料に混合する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記工程（２）において、前記生体試料の水性画分における前記遷移金属化合物および前記散乱光調整剤の合計濃度が、７５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記工程（２）において、前記遷移金属化合物は、前記発色試薬 １モルに対して、４．５モル以上の割合で混合される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含み、遷移金属化合物を、前記発色試薬 １モルに対して４．０モルを超える割合でさらに含み、
    前記発色試薬は、下記式（２）：
    Figure 0007208219000037
    式（２）において、Ｒ１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、およびエトキシ基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ２は、ニトロ基、－ＯＲ４、およびカルボキシル基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ３は、水素原子、メチル基またはエチル基であり、少なくとも１はメチル基またはエチル基であり、Ｒ４は、メチル基またはエチル基であり、ｍは、スルホ基（－ＳＯ３ －）がテトラゾール骨格の５位のフェニル基に結合する数であり、１または２であり、ｎは、Ｒ２がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０～２の整数であり、ｐは、スルホ基（－ＳＯ３ －）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０または１であり、ｎ＋ｐは１以上であり、ｑは１または２であり、ｑが２の場合、各ＯＲ３は隣接して配置され、この際、各ＯＲ３が互いに環を形成してもよく、Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす、
    で示される、２－置換ベンゾチアゾリル－３－置換フェニル－５－置換スルホ化フェニル－２Ｈ－テトラゾリウム塩であり、
    前記遷移金属化合物は、ニッケル化合物であり、
    前記散乱光調整剤は、１，３－ベンゼンジスルホン酸二ナトリウムまたはその水和物である、全血中のグルコース濃度測定試薬。
  7. 前記散乱光調整剤を、前記遷移金属化合物１モルに対して、０モルを超え０．２４モル以下の割合で含む、請求項６に記載の全血中のグルコース濃度測定試薬。
  8. 反応部を有する、生体試料中の分析対象物濃度を測定するためのチップであって、
    前記反応部は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含み、遷移金属化合物を、前記発色試薬 １モルに対して４．０モルを超える割合でさらに含み、
    前記生体試料中の分析対象物濃度は全血中のグルコース濃度であり、
    前記発色試薬は、下記式（２）：
    Figure 0007208219000038
    式（２）において、Ｒ１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、およびエトキシ基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ２は、ニトロ基、－ＯＲ４、およびカルボキシル基からなる群から選択されるいずれか一つであり、Ｒ３は、水素原子、メチル基またはエチル基であり、少なくとも１はメチル基またはエチル基であり、Ｒ４は、メチル基またはエチル基であり、ｍは、スルホ基（－ＳＯ３ －）がテトラゾール骨格の５位のフェニル基に結合する数であり、１または２であり、ｎは、Ｒ２がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０～２の整数であり、ｐは、スルホ基（－ＳＯ３ －）がテトラゾール骨格の３位のフェニル基に結合する数であり、０または１であり、ｎ＋ｐは１以上であり、ｑは１または２であり、ｑが２の場合、各ＯＲ３は隣接して配置され、この
    際、各ＯＲ３が互いに環を形成してもよく、Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす、
    で示される、２－置換ベンゾチアゾリル－３－置換フェニル－５－置換スルホ化フェニル－２Ｈ－テトラゾリウム塩であり、
    前記遷移金属化合物は、ニッケル化合物であり、
    前記散乱光調整剤は、１，３－ベンゼンジスルホン酸二ナトリウムまたはその水和物である、チップ。
  9. 前記反応部は、前記遷移金属化合物１モルに対して、０モルを超え０．２４モル以下の割合で、前記散乱光調整剤を含む、請求項８に記載のチップ。
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