JPWO2019171731A1 - 生体試料中の分析対象物濃度を測定するための、方法、試薬およびチップ - Google Patents
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Abstract
Description
(1)前記生体試料を準備し、
(2)前記生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合して、散乱光が前記生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得て、
(3)前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物濃度を測定すること、を含む、方法に関する。
(1)前記生体試料を準備し、
(2)前記生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合して、散乱光が前記生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得て、
(3)前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物濃度を測定すること、
を含む、方法に関する。
本発明の一側面は、生体試料中の分析対象物濃度を測定する方法であって、
(1)前記生体試料を準備し(工程(1))、
(2)前記生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合して、散乱光が前記生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得て(工程(2))、
(3)前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物濃度を測定する(工程(3))こと、
を含む、方法に関する。本発明の一側面に係る方法によると、光の散乱を誘発する生体試料(例えば、赤血球を含むサンプル)であっても、生体成分の分画を必要とせずに、分析対象物を高精度に検出し得る。
本工程では、生体試料を準備する。ここで、生体試料(生体成分測定対象)は、目的とする分析対象物(生体成分)を含むものであれば特に制限されない。具体的には、血液、ならびに尿、唾液、間質液等の体液などが挙げられる。これらのうち、血液、特に全血が生体試料として好ましい。また、生体試料の源は、特に制限されない。生体試料は、ヒト、または非ヒト動物に由来するものであってもよい。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター等の実験動物;イヌ、ネコ、ウサギ等のペット;ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ等の家畜類や家禽類が例示できるがこれらに限定されない。好ましくは、生体試料はヒトに由来する。すなわち、生体試料は、ヒトの血液であることが好ましく、ヒトの全血であることが特に好ましい。
本工程では、上記工程(1)で準備された生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合して、散乱光が前記生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得る。
スペクトル測定に用いた評価システムの概要を以下に示す。また、評価システムの概要を以下に示す:
光源 ハロゲン光源 SPL−2H(ケイエルブイ株式会社)
ファイバコネクタ SMA
適合ファイバ:コア径=200μ以上
分光計 小型ファイバ光学分光器 USB2000+
(Ocean Optics社)
ディテクタ範囲 200〜1100nm。
本明細書では、試薬を構成する各成分(発色試薬、酸化還元酵素、散乱光調整剤、および任意に用いられ得るその他の物質(例えば、遷移金属化合物))の量を、下記方法に従って測定する。詳細には、分析対象物濃度測定試薬を用いて、例えば、実施例に記載されるような血糖値検出用チップを作製する。このチップ内に1000μLのRO水(グルコース濃度0mg/1000μL)を加えて、分析対象物濃度測定試薬を完全に溶解する(溶出させる)(サンプル)。このサンプル中の発色試薬濃度を、UPLC(超高速高分離液体クロマトグラフィーSHIMADZU NEXERA X2、(株)島津製作所製)により測定する。各チップに塗布された発色試薬の質量(mg)に基づいて、試薬部空間に、RO水が流入して溶解した際の、発色試薬の濃度を算出する。また、発色色素以外の各成分に関しては、分析対象物濃度測定試薬の組成(各成分の濃度比)に基づいて、試薬部空間にRO水が流入して試薬部空間体積を満たした際(すなわち、溶解した際)の各成分の濃度を算出する。
各ホルマザン化合物の終濃度が50〜200mMとなるように、10mM MOPS水溶液を加えて、試料を100μL作製する。別途、1Mのニッケルイオン水溶液を作製する。上記試料100μLに、1M ニッケルイオン水溶液を10μL加え、素早く攪拌して、混合溶液を調製する。この混合溶液について、スペクトルを、分光光度計(測定セル長:10mm)にて測定する(n=1)。各スペクトルに基づいて、各化合物のホルマザンでの極大吸収波長(λmax)(nm)を求める。
(a)上記式(2)の2−置換ベンゾチアゾリル−3−置換フェニル−5−置換スルホ化フェニル−2H−テトラゾリウム塩を使用する;
(b)工程(2)において、遷移金属化合物を、遷移金属化合物に対する散乱光調整剤の混合比(遷移金属化合物1モルに対する散乱光調整剤のモル)が0モルを超え0.24モル以下(より好ましくは0.03〜0.12モル、特に好ましくは0.05〜0.10モル)となるような割合で、さらに生体試料に混合する;および
(c)工程(2)において、遷移金属化合物を、発色試薬 1モルに対して、4.0モル以上の割合で混合する。上記のうち、(a)を少なくとも行うことが好ましく、(a)と(b)および/または(c)とを行うことがより好ましく、(a)と(b)とを少なくとも行うことがさらにより好ましく、(a)、(b)および(c)すべてを行うことが特に好ましい。
(d)散乱光調整剤と遷移金属化合物との合計濃度を750mmol/L以下(より好ましくは50〜665mmol/L、特に好ましくは100mmol/Lを超え665mmol/L未満)に設定する。
本工程では、上記工程(2)において得られた分析サンプルを用いて、分析対象物濃度を測定する。これにより、生体試料中に含まれる特定の分析対象物(生体成分)濃度を高精度で測定できる。ここで、測定方法は、特に制限されず、測定対象となる生体成分の種類に応じて適宜選択できる。例えば、生体成分がβ−D−グルコース(BG)であり、酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)である場合には、グルコースがGDHによって酸化されてグルコン酸を生成するが、その際にGDHの補酵素または電子伝達物質が還元されることを利用したものである。具体的には、電子の授受の結果として還元されたテトラゾリウム塩(ゆえにホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物)の呈色度合を光学的に測定する方法(比色法)と、酸化還元反応によって生じた電流を測定する方法(電極法)と、に大別される。上記方法のうち、比色法による血糖値の測定は、血糖値の算出の際にヘマトクリット値を用いた補正を行ないやすい、製造工程が簡易である等の利点を有している。このため、分析対象物濃度測定試薬は比色法に好適に使用できる。特に全血サンプル中のグルコース濃度を測定する場合には、比色法が好ましく使用され、発色試薬上記式(2)のテトラゾリウム塩を用いることが特に好ましい。しかしながら、電極法においても、分析サンプルと、生体試料の差異が小さい状態で測定することも可能である。
上述したように、本発明の方法によると、分析対象物濃度をより高精度に測定できる。したがって、本発明の第2の側面では、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含む、分析対象物濃度測定試薬が提供される。好ましくは、本発明の分析対象物濃度測定試薬は、発色試薬、酸化還元酵素、遷移金属化合物および散乱光調整剤を含む。ここで、発色試薬、酸化還元酵素、遷移金属化合物および散乱光調整剤の好ましい形態(種類、含有量、混合比など)は、上記第1の側面と同様であるため、ここでは説明を省略する。
本発明の分析対象物濃度測定試薬は、そのままの形態で生体成分濃度の測定に使用されてもよいが、分析対象物(生体成分)濃度測定用チップに組み込まれてもよい。すなわち、本発明は、反応部を有する、生体試料中の分析対象物濃度を測定するためのチップであって、前記反応部は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含む、チップをも提供する。好ましくは、本発明のチップの反応部は、発色試薬、酸化還元酵素、遷移金属化合物および散乱光調整剤を含む。
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物(2−(6−メトキシベンゾチアゾリル)−3−(3−スルホ−4−メトキシ−フェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム塩:テトラゾリウム化合物1)(分子量(Mw)=693)を合成した。
4−ホルミルベンゼン−1,3−ジスルホン酸二ナトリウム(Disodium 4−Formylbenzene−1,3−disulfonate)(東京化成工業株式会社製)1.59g及び(6−メトキシベンゾチアゾール−2−イル)ヒドラジン(2−Hydrazino−6−methoxy−1,3−benzothiazole)(Santa Cruz Biotechnology社製)1.0gをRO水60mLに懸濁させた。この懸濁液を、酢酸酸性下、ウォーターバスにて60℃で2時間、加熱・攪拌した。加熱攪拌終了後、溶媒を除去した。この残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿をドラフト中で乾燥させて、ヒドラゾン化合物1を得た。1.8g回収し、収率70質量%であった。
上記1.のヒドラゾン化合物1 0.76gをRO水10mLおよびN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)10mLの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物1溶液を調製した。p−アニシジン−3−スルホン酸(p−anisidin−3−sulfonic acid)(東京化成工業株式会社製)0.264gをRO水4.09mLに懸濁させ、10N NaOH 130μLを加え溶解させた。この溶液を0℃に保持しつつ、9.6N HCl 280μLを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を−20℃に保持し、ヒドラゾン化合物1溶液に滴下した。滴下終了後、10N NaOH300μLを滴下し、2時間室温(25℃)で攪拌して、ホルマザン化合物1を含む溶液(ホルマザン化合物1溶液)を調製した。このホルマザン化合物1溶液を、9.6N HClにてpHを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させ、ホルマザン化合物1を得た。
上記2.のホルマザン化合物1をRO水10mLに溶解して、ホルマザン化合物1溶液を調製した。ディスポーザブルカラム(大きさ:20cm×5cm)に、カラムクロマトグラフィー用充填剤(ナカライテスク株式会社製、COSMOSIL 40C18−PREP)を充填し、カラム分取システム(日本ビュッヒ社製、商品名:セパコア)にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物1溶液を精製した。採取したフラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分にメタノール15mL、9.6N HCl 250μL、15%亜硝酸エチル(CH3CH2NO2)−エタノール溶液5mLを加えて、72時間、室温(25℃)遮光にて攪拌した。
上記3.の反応溶液に対し、ジエチルエーテル加えて、テトラゾリウム化合物1を沈殿させた。この沈殿を遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物1を得た(120mg、収率:11.8質量%)。このようにして得られたテトラゾリウム化合物1について、極大吸収波長(λmax)を測定したところ、630nmであった。
<塗布液(コート液)の調製>
まず、酸化還元酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH−FAD)(表中、「GDH」)と、散乱光調整剤としての1,3−ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム(DSB、Alfa Aear製)と、発色色素としての上記製造例1で合成したテトラゾリウム化合物1と、遷移金属化合物としての酢酸ニッケル(表中、「酢酸Ni」)と、pH調整剤としての水酸化ナトリウム水溶液(適量)とを含む試薬水溶液(pH6.5〜7)を下記表1に示される組成となるように調製し、塗布液1〜6(それぞれ、実施例1〜6)及び比較塗布液1(比較例1)を得た。
1.試薬片の調製
上記<塗布液(コート液)の調製>にて調製した塗布液1〜6および比較塗布液1を、それぞれ、ステージ上に載置されたポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム(製造会社名:東レ株式会社、商品名:ルミラーT60、厚み188μm、8mm×80mm)上に、インクジェット装置((株)マイクロジェット製、Labojet−500Bio)を用いて、±5μm以内のパターニング精度および1pL〜1000pLの吐出液量のヘッドで塗布し、常温(25℃)で1晩乾燥した。乾燥後、試薬層が形成されたPETフィルムを、所定の大きさに切り出して試薬片を作製した。
上記1.にて作製された各試薬片に塗布された各成分量(濃度)を次のようにして求めた。詳細には、後述の血糖計センサ(チップ形状)に組み立てた状態で、チップ内に1000μLのRO水を加えて血糖値測定試薬を完全に溶解して、サンプルとした。このサンプル中の発色試薬濃度を、UPLC(超高速高分離液体クロマトグラフィーSHIMADZU NEXERA X2、株式会社島津製作所製)により求めた。各チップに塗布された発色試薬の質量(mg)から、試薬部空間に、RO水が流入して溶解した際の、発色試薬(テトラゾリウム化合物1)の濃度を算出し、その結果を下記表2に示す。また、上記表1に記載の塗布液(コート液)の濃度比から、発色色素以外の成分についても、試薬部空間にRO水が流入して試薬部空間体積を満たした際(すなわち、溶解した際)の試薬成分の濃度を算出し、その結果を下記表2に示す。なお、血糖値測定チップ1個あたりの各成分の質量は、試薬部空間体積と、下記表2に記載の濃度から算出できる。
図11Aは血糖計センサ(血糖値測定チップ)の組み立てを示す模式図である。図11Aにおいて、第2基材としてのPETフィルム5(製造会社名:3M社、商品名:親水処理ポリエステルフィルム9901P、厚み:100μm)の両側に、両面テープ(製造会社名:日東電工(株)、商品名:両面粘着テープ、厚み:50μm)4がスペーサ及び接着部として形成されたチップ土台を作製した。このチップ土台に、上記1.にて作製した試薬片2を、試薬層(試薬塗布面)3がチップ土台となるPETフィルム5と対向し、且つ、流路6の中心となるように貼り付けた。
以下のようにして、ヘマトクリット値が60%である全血サンプルにおける溶解性を評価した。上記実施例1〜6、比較例1と同様にして、血糖値測定チップ7〜12(それぞれ、実施例7〜12)及び比較血糖値測定チップ2(比較例2)を作製した。
2 試薬片、
3 試薬塗布面、
4 両面テープ、
5 PETフィルム、
6 流路、
7 PETフィルム、
10 血糖計、
12 測定用チップ、
14 測定部、
16 装置本体、
18 チップ本体部、
20 空洞部、
20a 先端口部、
20b 基端口部、
22 長辺、
22a 上側長辺、
22b 下側長辺、
24 短辺、
24a 先端辺、
24b 基端辺、
26 試薬、
28 測定対象部、
30 板片、
32 スペーサ、
40 筺体、
42 制御部、
44 箱体部、
46 測光部、
48 電源ボタン、
50 操作ボタン、
52 ディスプレイ、
54 イジェクトレバー、
56 イジェクトピン、
56a 棒部、
56b 受部、
58 挿入孔、
58a 挿入開口部、
59 測定用孔部、
60 チップ装着部、
60a フランジ部、
62 壁部、
64 素子収容空間、
66 導光部、
68 発光素子、
70 発光部、
72 受光素子、
74 受光部、
76 コイルバネ。
Claims (12)
- 生体試料中の分析対象物濃度を測定する方法であって、
(1)前記生体試料を準備し、
(2)前記生体試料に、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を混合して、散乱光が前記生体試料と実質的に同じである分析サンプルを得て、
(3)前記分析サンプルを用いて、前記分析対象物濃度を測定すること、
を含む、方法。 - 前記発色試薬は、下記式(2):
で示される、2−置換ベンゾチアゾリル−3−置換フェニル−5−置換スルホ化フェニル−2H−テトラゾリウム塩である、請求項1に記載の方法。 - 前記工程(2)において、前記分析サンプルの波長領域850〜1000nmでの平均透過率(aveTanalyte(%))と前記生体試料の波長領域850〜1000nmでの平均透過率(aveTsample(%))との差(=aveTanalyte(%)−aveTsample(%))が−10%以上10%以下である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程(2)において、遷移金属化合物を、遷移金属化合物に対する散乱光調整剤の混合比(遷移金属化合物1モルに対する散乱光調整剤のモル)が0モルを超え0.24モル以下となるような割合で、さらに生体試料に混合する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(2)において、前記生体試料の水性画分における前記遷移金属化合物および前記散乱光調整剤の合計濃度が、750mmol/L以下である、請求項4に記載の方法。
- 前記工程(2)において、前記遷移金属化合物は、前記発色試薬 1モルに対して、4.0モル以上の割合で混合される、請求項4または5に記載の方法。
- 発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含む、分析対象物濃度測定試薬。
- 前記発色試薬は、下記式(2):
で示される、2−置換ベンゾチアゾリル−3−置換フェニル−5−置換スルホ化フェニル−2H−テトラゾリウム塩である、請求項7に記載の分析対象物濃度測定試薬。 - 遷移金属化合物を、前記発色試薬 1モルに対して4.0モル以上の割合でさらに含む、請求項7または8に記載の分析対象物濃度測定試薬。
- 反応部を有する、生体試料中の分析対象物濃度を測定するためのチップであって、
前記反応部は、発色試薬、酸化還元酵素および散乱光調整剤を含む、チップ。 - 前記発色試薬は、下記式(2):
で示される、2−置換ベンゾチアゾリル−3−置換フェニル−5−置換スルホ化フェニル−2H−テトラゾリウム塩である、請求項10に記載のチップ。 - 前記反応部は、前記発色試薬 1モルに対して4.0モル以上の割合で、遷移金属化合物をさらに含む、請求項11に記載のチップ。
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