JP6893215B2 - ２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２ｈ−テトラゾリウム塩、ならびに当該塩を含む生体成分濃度測定用試薬および当該塩を用いる生体成分濃度の測定方法 - Google Patents

２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２ｈ−テトラゾリウム塩、ならびに当該塩を含む生体成分濃度測定用試薬および当該塩を用いる生体成分濃度の測定方法 Download PDF

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Description

本発明は、２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、ならびに当該塩を含む生体成分濃度測定用試薬および当該塩を用いる生体成分濃度の測定方法に関する。
臨床化学検査では、血液や尿等の生体の体液に含まれる生体成分の量を色素量として検出定量する方法があり、この方法に用いる試薬を発色試薬と呼んでいる。
例えば、特開平８−５３４４４号公報（特許文献１）では、下記構造：
Figure 0006893215
（Ｒ１は水素原子またはメトキシ基を表わし、Ｒ２は水素原子、カルボキシル基またはスルホン酸を表わす）を有する水溶性テトラゾリウム塩化合物を用いて還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドを定量する方法が開示されている。特開平８−５３４４４号公報によると、上記水溶性テトラゾリウム塩化合物を用いることにより、得られるホルマザンの水溶性が向上し、測定機器への沈着がなく、また、極大吸収波長が５１０〜５５０ｎｍであるため生体成分の干渉を受けず、自動分析装置による測定が可能であるとしている。
特開平８−５３４４４号公報
上記特開平８−５３４４４号公報のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンは高い水溶性を有するが、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ超）での発色強度が十分でない。このため、上記特開平８−５３４４４号公報のテトラゾリウム塩では、全血サンプルに対しては十分な感度を達成することができない。
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、水溶性は維持しつつ全血サンプルに対しても十分な感度で生体成分を定量できる手段を提供することを目的とする。
本発明の他の目的は、水溶性は維持しつつ全血サンプルに対しても十分な感度でかつ安定的に生体成分を定量できる手段を提供することである。
本発明者は、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、テトラゾール環の、２位に置換チアゾリル基を、３位にアルコキシ基及びニトロ基（−ＮＯ２）を有するフェニル基を、ならびに５位に２個のスルホ基（−ＳＯ３ −；−Ｓ（＝Ｏ）２Ｏ−；以下同様）を有するフェニル基を有するテトラゾリウム塩が上記課題を解決することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、上記目的は、下記式（１）：
Figure 0006893215
ただし、Ｒ１は、メチル基またはエチル基を表わし；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、メトキシ基またはエトキシ基を表わし；および
Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす、
で示される、２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩によって達成できる。
図１は、テトラゾリウム化合物１から生成するホルマザンおよびＮｉ２＋のキレート化合物のスペクトルを示す図である。 図２は、テトラゾリウム化合物１及びＷＳＴ−４に関するグルコース濃度と生成ホルマザンの吸光度との関係を示すグラフである。 図３は、テトラゾリウム化合物１の安定性評価結果を示す図である。 図４は、本形態に係る測定用チップが装着された血糖計（成分測定装置）を概略的に示す平面図である。図４において、１０は血糖計を表し、１２は測定用チップを表し、１４は測定部を表し、１８はチップ本体部を表し、４０は筺体を表し、４２は制御部を表し、４４は箱体部を表し、４６は測光ブロックを表し、４８は電源ボタンを表し、５０は操作ボタンを表し、５２はディスプレイを表し、５４はイジェクトレバーを表す。 図５は、図４の測定用チップと装置本体の測光ブロックを拡大して示す斜視図である。図５において、１０は血糖計を表し、１２は測定用チップを表し、１４は測定部を表し、１６は装置本体を表し、１８はチップ本体部を表し、２０は空洞部を表し、２０ａは先端口部を表し、２０ｂは基端口部を表し、２２は長辺を表し、２４は短辺を表し、３０は板片を表し、３２はスペーサを表し、４０は筺体を表し、４６は測光ブロックを表し、５６はイジェクトピン、５６ａは棒部を表し、５６ｂは受部を表し、５８は挿入口を表し、５８ａは挿入開口部を表し、５９は測定用孔部を表し、６０はチップ装着部を表し、６０ａはフランジ部を表し、６２は壁部を表し、６８は発光素子を表し、７０は発光部を表し、７２は受光素子を表し、７４は受光部を表し、７６はコイルバネを表す。 図６は、図４の測定用チップを示す側面図である。図６において、１２は測定用チップを表し、１８はチップ本体部を表し、２０は空洞部を表し、２０ａは先端口部を表し、２０ｂは基端口部を表し、２２は長辺を表し、２２ａは上側長辺を表し、２２ｂは下側長辺を表し、２４は短辺を表し、２４ａは先端辺を表し、２４ｂは基端辺を表し、２６は試薬を表し、２８は測定対象部を表し、３０は板片を表し、３２はスペーサを表す。 図７Ａは、図４の測定用チップと装置本体の装着動作を示す第１平面図である。図７Ａにおいて、１２は測定用チップを表し、１４は測定部を表し、１６は装置本体を表し、２０は空洞部を表し、２６は試薬を表し、３０は板片を表し、３２はスペーサを表し、４０は筺体を表し、４６は測光ブロックを表し、４６ａは固定壁を表し、５６はイジェクトピン、５６ａは棒部を表し、５６ｂは受部を表し、５８は挿入口を表し、５８ａは挿入開口部を表し、５９は測定用孔部を表し、６０はチップ装着部を表し、６０ａはフランジ部を表し、６２は壁部を表し、６４は素子収容空間を表し、６６は導光部を表し、６８は発光素子を表し、６８ａは第１発光素子を表し、６８ｂは第２発光素子を表し、７０は発光部を表し、７２は受光素子を表し、７４は受光部を表し、７６はコイルバネを表す。 図７Ｂは、図７Ａに続く装着動作を示す第２平面断面図である。図７Ｂにおいて、１２は測定用チップを表し、１４は測定部を表し、１６は装置本体を表し、２０は空洞部を表し、２０ａは先端口部を表し、２６は試薬を表し、３０は板片を表し、３２はスペーサを表し、４０は筺体を表し、４６は測光ブロックを表し、４６ａは固定壁を表し、５６はイジェクトピン、５６ａは棒部を表し、５６ｂは受部を表し、６０はチップ装着部を表し、６０ａはフランジ部を表し、６２は壁部を表し、６８は発光素子を表し、６８ａは第１発光素子を表し、６８ｂは第２発光素子を表し、７０は発光部を表し、７２は受光素子を表し、７４は受光部を表し、７６はコイルバネを表す。
本発明の第一の側面では、下記式（１）：
Figure 0006893215
の構造を有する２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩が提供される。本明細書において、上記式（１）の２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩を、単に「本発明のテトラゾリウム塩」または「テトラゾリウム塩」とも称する。
本発明のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物は、水溶性に優れる。また、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ超）に極大吸収波長を有する。このため、血液中に存在する着色物質の影響が少なく、測定誤差を減らすことができる。ゆえに、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、全血サンプルに対しても感度よく生体成分濃度を測定できる。なお、本明細書において、本発明のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物を、単に「本発明に係るホルマザン」または「ホルマザン化合物」とも称する。
上記特開平８−５３４４４号公報に記載のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンは５１０〜５５０ｎｍに極大吸収を有する（段落「００１１」）。事実、上記特開平８−５３４４４号公報の実施例３では、ＮＡＤＨ濃度を５５０ｎｍにおける吸光度で定量している（段落「００２９」、図２）。一方、全血サンプルを用いて生体成分（例えば、グルコース）濃度を測定する場合には、測定する吸光度が、血色素の主な吸収帯と重ならない波長域にあることが必要である。血液中の赤血球濃度を検出するための波長が５１０〜５４０ｎｍ程度であり、酸素化ヘモグロビンの極大吸収波長は５５０ｎｍ前後である。このため、ホルマザンの極大吸収波長が６００ｎｍ超（特に６５０ｎｍ以上）にあることが好ましい。してみると、特開平８−５３４４４号公報に記載のテトラゾリウム塩から生じるホルマザンでは、血球による影響を十分排除することはできず、良好な感度で生体成分濃度を測定することは困難であった。このため、特開平８−５３４４４号公報に記載のテトラゾリウム塩の極大吸収波長をより長波長域側にシフトさせる必要がある。一般的に、ホルマザンを遷移金属イオン（例えば、ニッケルイオンやコバルトイオン）とキレート化合物を生成させることにより、極大吸収波長を長波長側にシフトすることができる。しかし、特開平８−５３４４４号公報の実施例３において、長波長側にシフトさせるために遷移金属イオン（例えば、ニッケルイオン）をさらに添加すると、沈殿物を形成する。このため、特開平８−５３４４４号公報に記載のテトラゾリウム塩は、全血サンプルに対しては試薬として好適に使用できるとは言い難い。
これに対して、本発明のテトラゾリウム塩は、２００ｍＭ以上の濃度で水に可溶であり、水溶性に優れる。また、本発明のテトラゾリウム塩から生じるホルマザン（本発明に係るホルマザン）も、優れた水溶性を有する。さらに、本発明に係るホルマザンは、遷移金属イオンの存在下でも沈殿物を形成せず、また、極大吸収波長が血液の吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ超、特に６５０ｎｍ以上）にある。このため、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、全血サンプルに対しても感度よく生体成分濃度を測定できる。上記効果を奏する詳細なメカニズムは依然として不明であるが、以下のように考えられる。なお、以下のメカニズムは推測であり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。詳細には、本発明のテトラゾリウム塩は、テトラゾール環の、２位に置換チアゾリル基が結合し、３位にアルコキシ基及びニトロ基（−ＮＯ２）を有するフェニル基が結合し、ならびに５位に２個のスルホ基（−ＳＯ３ −）を有するフェニル基が結合する構造を有する。ここで、スルホ基（−ＳＯ３ −）を２個有するため、テトラゾリウム塩およびホルマザン化合物は２００ｍＭ以上の濃度で水に溶解し、水溶性に優れる。また、ニトロ基が存在するため、テトラゾリウム塩から生じるホルマザン（またはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物）の極大吸収波長を長波長側にシフトすることが可能である（下記実施例１と比較例２との比較参照）。また、テトラゾール環の２位に存在するチアゾリル基により、本発明に係るホルマザンはＣｏ２＋やＮｉ２＋等の遷移金属イオンと効率よくかつ速やかにキレート化合物を形成する。このようなキレート化合物の形成により、その極大吸収波長はさらに長波長側にシフトする、すなわち、極大吸収波長を血液の吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ超、特に６５０ｎｍ以上）にさらにシフトできる。このため、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、全血サンプル中の生体成分濃度であっても高感度で正確に測定することができる。また、本発明のテトラゾリウム塩は安定性に優れる。
したがって、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、感度よくかつすみやかに生体成分濃度を測定できる。また、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、長期間保存した後であっても、生体成分濃度を感度よくかつすみやかに測定できる。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明のテトラゾリウム塩は、水溶性であり、かつその還元体であるホルマザン化合物の極大吸収波長が血液の吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ超）である。このため、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、全血サンプルに対しても感度よく生体成分濃度を測定できる。また、本発明のテトラゾリウム塩は安定性に優れる。
本発明のテトラゾリウム塩は、下記式（１）：
Figure 0006893215
に示されるように、テトラゾール環の、２位に置換チアゾリル基が、３位にアルコキシ基及びニトロ基（−ＮＯ２）を有するフェニル基が、ならびに５位に２個のスルホ基（−ＳＯ３ −）を有するフェニル基が導入されている。上記構造を有するテトラゾリウム塩において、テトラゾール環が主に光を吸収する部分である。
上記式（１）において、テトラゾール環の２位に置換チアゾリル基が存在することにより、遷移金属化合物と効率よくかつ速やかにキレート化合物を形成できる（ホルマザン化合物の極大吸収波長を長波長域にシフトできる）。ここで、Ｒ２およびＲ３は、メチル基、エチル基、メトキシ基またはエトキシ基を表わす。ここで、Ｒ２およびＲ３は、同じであってもまたは異なるものであってもよい。ここで、Ｒ２およびＲ３が炭素原子数３以上のアルキル基である場合には、得られるテトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンは、水溶性に劣る。また、Ｒ２およびＲ３が水素原子である場合には、チアゾリル環の電子密度が低くなるため好ましくない。
上記式（１）において、テトラゾール環の３位にアルコキシ基及びニトロ基（−ＮＯ２）を有するフェニル基が存在する。ここで、ニトロ基が存在することによって、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンは、６００ｎｍ超（特に６５０ｎｍ以上）という長波長側に極大吸収波長（λｍａｘ）を有する。また、アルコキシ基（−ＯＲ１）が存在することによって、テトラゾリウム塩の安定性が向上する。ここで、Ｒ１は、メチル基またはエチル基を表わす。なお、Ｒ１が炭素原子数３以上のアルキル基である場合には、得られるテトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンは、水溶性に劣る。なお、ニトロ基（−ＮＯ２）及びアルコキシ基（−ＯＲ１）のフェニル基への結合位置は特に制限されない。最大吸収波長の長波長側へのシフトの点から、ニトロ基（−ＮＯ２）は、フェニル基の４位に存在することが好ましい。また、安定性のさらなる向上効果の点から、アルコキシ基（−ＯＲ１）は、フェニル基の、２位、４位に存在することが好ましく、立体障害の点から２位に存在することが特に好ましい。すなわち、本発明の好ましい形態では、上記式（１）において、３位のフェニル基が、アルコキシ基（−ＯＲ１）が２位におよびニトロ基（−ＮＯ２）が４位に存在するフェニル基である。
上記式（１）において、テトラゾール環の５位に２個のスルホ基（−ＳＯ３ −）を有するフェニル基が存在する。ここで、スルホ基（−ＳＯ３ −）が２個存在することによって、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンは、高い水溶性を発揮できる。なお、スルホ基が１個であると、テトラゾリウム塩およびテトラゾリウム塩から生じるホルマザンは水溶性に劣る。ここで、スルホ基（−ＳＯ３ −）のフェニル基への結合位置は特に制限されない。水溶性のさらなる向上効果の点から、スルホ基（−ＳＯ３ −）は、フェニル基の、２，４位、３，５位に存在することが好ましく、水溶性の点より２，４位に存在することが特に好ましい。すなわち、本発明の好ましい形態では、上記式（１）において、５位のフェニル基が、スルホ基（−ＳＯ３ −）が２，４位または３，５位に存在するフェニル基である。
上記式（１）において、Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす。ここで、Ｘ＋は、２個のアニオン（スルホ基（−ＳＯ３ −））及び１個のテトラゾール環のカチオンを中和するために存在する。このため、アルカリ金属の種類は特に制限されず、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムのいずれでもよい。これらのうち、汎用性の点から、ナトリウムおよびカリウムが好ましく、ナトリウムがより好ましい。
すなわち、本発明のテトラゾリウム塩の好ましい構造としては、下記がある。なお、下記構造において、Ｘは、アルカリ金属を表わす。
Figure 0006893215
本発明のテトラゾリウム塩の製造方法は、特に制限されず、従来公知の方法が同様にしてまたは適宜修飾して適用できる。具体的には、下記構造：
Figure 0006893215
を有するヒドラジノ置換チアゾールと、下記構造：
Figure 0006893215
を有するホルミルベンゼン２スルホン酸ナトリウムとを反応させて、下記構造：
Figure 0006893215
を有するヒドラゾン化合物を得る。一方、下記構造：
Figure 0006893215
を有するアルコキシニトロベンゼンを氷冷しながら塩酸を加え、さらに亜硝酸ナトリウム溶液を滴下して、下記構造：
Figure 0006893215
を有する塩化ベンゼンジアゾニウム化合物を得る。上記にて得られたヒドラジン化合物と塩化ベンゼンジアゾニウム化合物とを塩基性条件（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム存在）下で反応させて、下記構造：
Figure 0006893215
を有するホルマザン化合物を得る。次いで、このようにして得られたホルマザン化合物を、酸化剤（例えば、亜硝酸エチル、亜硝酸ブチル等の亜硝酸エステル）を用いてアルコール溶媒（例えば、メタノール、エタノール）中で酸化することによって、本発明のテトラゾリウム塩が得られる。
本発明のテトラゾリウム塩は、高い水溶性を有する。また、当該テトラゾリウム塩から生成するホルマザン、またはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物（本発明に係るホルマザン、ホルマザン化合物）は、単独でまたは遷移金属化合物とのキレート化合物を形成することにより、高い水溶性を有しかつ血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ超、特に６５０ｎｍ以上）に極大吸収波長を有する。このため、本発明のテトラゾリウム塩を用いることによって、生体試料、特に全血サンプルに対しても感度よく生体成分濃度を測定できる。具体的には、本発明のテトラゾリウム塩から生成したホルマザン、またはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）は、好ましくは６００ｎｍ超、より好ましくは６５０ｎｍ以上である。このような極大吸収波長を有するホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物（ゆえに、このようなホルマザンを生成できるテトラゾリウム塩）であれば、血液色由来の吸収の影響を受けにくい。本発明のテトラゾリウム塩を用いることで、生体成分濃度をより正確にかつ良好な感度で測定できる。ここで、本発明のテトラゾリウム塩から生成したホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）の上限は、特に制限されないが、通常、９００ｎｍ以下であり、好ましくは８００ｎｍ以下である。なお、本明細書において、極大吸収波長（λｍａｘ）は、下記実施例に記載の方法に従って測定された値を採用する。
したがって、本発明の第二の側面では、本発明の２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩を含む生体成分濃度測定用試薬が提供される。また、本発明の第三の側面では、生体試料に、本発明の２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、酸化還元酵素および遷移金属化合物を添加して、発色量を測定し、当該発色量に基づいて前記生体試料中の生体成分の濃度を定量することを有する、生体成分濃度の測定方法が提供される。
本発明において、生体成分測定対象は、目的とする生体成分を含むものであれば特に制限されない。具体的には、血液、ならびに尿、唾液、間質液等の体液などが挙げられる。また、生体成分は、特に制限されず、通常、比色法または電極法により測定される生体成分が同様にして使用できる。具体的には、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、尿酸などが挙げられる。すなわち、本発明の第二の側面における好ましい形態によると、本発明の生体成分濃度測定用試薬は、血液または体液中の、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または尿酸の濃度の測定のために使用される。また、本発明の第三の側面における好ましい形態によると、生体試料中の生体成分が、血液または体液中の、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または尿酸である。
本発明の生体成分濃度測定用試薬は、本発明のテトラゾリウム塩を必須に含む。上述したように、生体成分濃度測定用試薬では、テトラゾリウム塩の還元反応により生成したホルマザンは、遷移金属イオンとキレート化合物を生成することにより、極大吸収波長をより長波長側にシフトすることができる。このため、特に全血サンプル中の生体成分濃度を測定する場合には、生体成分濃度測定用試薬中に遷移金属化合物を含むことが好ましい。すなわち、本発明の好ましい形態では、生体成分濃度測定用試薬は、さらに遷移金属化合物を含む。当該形態によると、全血サンプル中の生体成分濃度を測定する場合であっても、ホルマザンが血色素の主な吸収帯と重ならない波長域（６００ｎｍ超、特に６５０ｎｍ以上）に極大吸収波長を有する。このため、生体試料、特に全血サンプルに対しても、生体成分濃度の測定感度をさらに向上できる。生体成分濃度測定用試薬が遷移金属化合物を含む場合に使用できる遷移金属化合物としては、特に制限されない。具体的には、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）および銅イオン（Ｃｕ２＋）イオンなどの遷移金属イオンを生成できる化合物が使用できる。このようなイオンであれば、ホルマザンの極大吸収波長をより長波長側にシフトできる。これらのうち、ニッケルイオンが好ましい。ニッケルイオンは、酸化や還元作用を受けにくいため、測定誤差をより有効に低減できる。すなわち、本発明の好ましい形態によると、遷移金属化合物は、ニッケル化合物である。また、上記遷移金属イオンを生成する化合物は特に制限されないが、水性液体（例えば、水、緩衝液、血液、体液）中でイオンを生成するものであることが好ましい。例えば、上記遷移金属イオンを生成する化合物は、上記遷移金属の、塩化物、臭化物、硫酸塩、酢酸塩等の有機酸塩などが挙げられる。上記遷移金属化合物は、生体成分濃度測定試薬中に、１種を単独で使用しても、または２種以上を併用してもよい。また、本形態において、遷移金属化合物の含有量は、特に制限されないが、ホルマザン化合物の所望の極大吸収波長に応じて適切に選択できる。具体的には、遷移金属化合物の含有量は、遷移金属（遷移金属イオン）が、テトラゾリウム塩 １モルに対して、好ましくは０．１〜１０モル、より好ましくは０．５〜４モルとなるような量である。このような量であれば、ホルマザン化合物の極大吸収波長を所望の波長域にまでシフトできる。
生体成分濃度測定用試薬は、上記遷移金属化合物に加えてまたは上記遷移金属化合物に代えて、さらに他の成分を含んでもよい。ここで、他の成分としては、通常、測定対象である生体成分の種類に応じて適切に選択され、生体成分濃度を測定するために添加される成分が同様にして使用できる。具体的には、酸化還元酵素、電子伝達体、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤などが挙げられる。ここで、生体成分濃度測定用試薬に含まれる上記他の成分は、それぞれ、１種を単独で使用しても、または２種以上を組み合わせてしてもよい。また、上記他の成分のそれぞれは、１種を単独で使用しても、または２種以上を併用してもよい。
ここで、酸化還元酵素は、特に制限されず、測定される対象である生体成分の種類によって適切に選択されうる。具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（例えば、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＮＡＤ）およびニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＮＡＤＰ）等）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＬＤＨ）、乳酸オキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、ウリカーゼ、尿酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。ここで、酸化還元酵素は、１種を単独で使用しても、または２種以上を組み合わせてしてもよい。例えば、生体成分がグルコースである場合には、酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼやグルコースオキシダーゼであることが好ましい。また、生体成分がコレステロールである場合には、酸化還元酵素がコレステロールデヒドロゲナーゼやコレステロールオキシダーゼであることが好ましい。生体成分濃度測定用試薬が酸化還元酵素を含む場合の、酸化還元酵素の含有量は、特に制限されず、テトラゾリウム塩の量に応じて適宜選択できる。例えば、酸化還元酵素の含有量は、テトラゾリウム塩に対して、好ましくは１〜１００質量％、より好ましくは５〜５０質量％である。このような量であれば、酸化還元酵素を生体成分に十分作用させることができる。このため、生体成分濃度の測定感度をさらに向上できる。
電子伝達体は、特に制限されず、公知の電子伝達体を使用してもよい。具体的には、ジアホラーゼ、フェナジンメチルサルフェート(phenazine methosulfate)（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート(1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate)（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳまたはｍ−ＰＭＳ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）などが挙げられる。ここで、電子伝達体は、１種を単独で使用しても、または２種以上を組み合わせてしてもよい。生体成分濃度測定用試薬が電子伝達体を含む場合の、電子伝達体の含有量は、特に制限されず、テトラゾリウム塩の量に応じて適宜選択できる。例えば、電子伝達体の含有量は、テトラゾリウム塩に対して、好ましくは０．０５〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％である。このような量であれば、還元反応をより効率よく進行できる。このため、生体成分濃度の測定感度をさらに向上できる。
上記のうち、生体成分濃度測定用試薬は、遷移金属化合物及び酸化還元酵素をさらに含むことが好ましく、遷移金属化合物、酸化還元酵素及び電子伝達体をさらに含むことがより好ましい。すなわち、本発明の好ましい形態によると、生体成分濃度測定用試薬は、本発明の２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、遷移金属化合物及び酸化還元酵素を含む。また、本発明のより好ましい形態によると、生体成分濃度測定用試薬は、本発明の２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、遷移金属化合物、酸化還元酵素及び電子伝達体を含む。ここで、例えば、生体成分がβ−Ｄ−グルコースであり、遷移金属化合物が塩化ニッケルであり、酸化還元酵素がフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＦＡＤ）であり、電子伝達体が１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート（ｍ−ＰＭＳ）である場合について説明する。まず、β−Ｄ−グルコース及びｍ−ＰＭＳがＧＤＨ−ＦＡＤの作用を受けて、グルコン酸及び還元型のｍ−ＰＭＳになり、この還元型のｍ−ＰＭＳ及びテトラゾリウム塩からｍ−ＰＭＳおよびホルマザンになり、発色する。また、このホルマザンがニッケルイオンとキレート化合物を形成して、極大吸収波長がより長波長域側（例えば、６００ｎｍ超）にシフトする。このため、本発明の生体成分濃度測定用試薬を用いることによって、測定対象の測定波長において血色素の主な吸収帯が及ぼす影響を低減できるため、生体試料、特に全血サンプルに対しても感度よく生体成分濃度を測定できる。
生体成分濃度測定用試薬の使用形態は、特に制限されず、固体の形態であってもまたは液体の形態であってもいずれでもよい。後者の場合には、生体成分濃度測定用試薬は、さらに水、緩衝液、界面活性剤を含むことが好ましく、水および／または緩衝液を含むことがより好ましい。ここで、緩衝液は、特に制限されず、一般的に生体成分濃度を測定する際に使用される緩衝剤が同様にして使用できる。具体的には、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝剤（トリス塩酸緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤）、ＴＥＳ緩衝剤（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤）、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤）、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤などのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン−塩酸緩衝剤、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤、トリス−ホウ酸緩衝剤、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤、またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤が好ましい。ここで、緩衝剤の濃度としては、特に制限されないが、０．０１〜１．０Ｍであるのが好ましい。なお、本発明において緩衝剤の濃度とは、水性溶液中に含まれる緩衝剤の濃度（Ｍ、ｍｏｌ／Ｌ）をいう。また、緩衝液のｐＨは、生体成分に対して作用を及ぼさないことが好ましい。上記観点から、緩衝液のｐＨは、中性付近、例えば、５．０〜８．０程度であることが好ましい。なお、生体成分濃度測定用試薬が液状である場合の、テトラゾリウム塩の濃度は、所望の生体成分濃度を測定できる濃度であれば特に制限されないが、テトラゾリウム塩が所望の生体成分の存在量に対してより多い量で含まれることが好ましい。上記観点及び通常測定すべき生体成分濃度などを考慮すると、テトラゾリウム塩の濃度は、生体成分濃度測定用試薬において、好ましくは０．００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。乾燥状態の試薬を調製する際においても、テトラゾリウム塩の濃度は、基材に塗布する前の溶液状態で、０．００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。このような量であれば、テトラゾリウム塩は、生体試料に含まれる実質的にすべて（例えば、９５モル％以上、好ましくは９８モル％以上、特に好ましくは１００モル％）の生体成分の量に応じて反応する。このため、所望の生体成分濃度を正確にかつ良好な感度で速やかに測定できる。
本発明の生体成分濃度測定用試薬を用いることにより、生体試料中に含まれる特定の生体成分濃度を良好な感度にて測定できる。ここで、測定方法は、特に制限されず、測定対象となる生体成分の種類に応じて適宜選択できる。例えば、生体成分がβ−Ｄ−グルコースであり、酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）であるグルコース還元酵素法の場合には、グルコースがＧＤＨによって酸化されてグルコン酸を生成するが、その際にＧＤＨの補酵素または電子伝達物質が還元されることを利用したものであり、具体的には結果として還元されたテトラゾリウム塩（ゆえにホルマザンまたはホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物）の呈色度合を光学的に測定する方法（比色法）、および酸化還元反応によって生じた電流を測定する方法（電極法）に大別される。上記方法のうち、比色法による血糖値の測定は、血糖値の算出の際にヘマトクリット値を用いた補正を行ないやすい、製造工程が簡易である等の利点を有している。このため、生体成分濃度測定用試薬は比色法に好適に使用できる。特に全血サンプル中のグルコース濃度を測定する場合には、比色法が好ましく使用される。
本発明の生体成分濃度測定用試薬は、そのままの形態で生体成分濃度の測定に使用されてもよいが、生体成分濃度測定用チップに組み込まれてもよい。すなわち、本発明は、本発明の生体成分濃度測定用試薬を含む生体成分濃度測定用チップ（以下では、単に「測定用チップ」とも称する）をも提供する。また、本発明の生体成分濃度測定用試薬や方法は、自動分析機や測定キット、簡易血糖計等に組み込まれ、日常的な臨床検査に使用できる。また、本発明の試薬を市販のバイオセンサに組み込むことも可能である。なお、生体成分濃度測定用試薬を生体成分濃度測定用チップに組み込む場合には、１チップ当たりの試薬の含有量は、特に制限されず、通常当該分野において使用される量が同様にして採用できるが、テトラゾリウム塩が所望の生体成分の存在量に対して十分量で含まれることが好ましい。上記観点及び通常測定すべき生体成分濃度などを考慮すると、テトラゾリウム塩の量は、１チップ当たり、好ましくは３〜５０ｎｍｏｌ、より好ましくは１０〜３０ｎｍｏｌである。このような量であれば、テトラゾリウム塩は、生体試料に含まれる実質的にすべて（例えば、９５モル％以上、好ましくは９８モル％以上、特に好ましくは１００モル％）の生体成分の量に応じて反応する。このため、所望の生体成分濃度を正確にかつ良好な感度で速やかに測定できる。
以下では、比色法により血糖値を測定するに使用される本発明の測定用チップ（比色式血糖計）の形態を、図を参照しながら説明する。しかしながら、本発明は、本発明の生体成分濃度測定用試薬を使用することを特徴とし、チップの構造は特に制限されない。このため、本発明の生体成分濃度測定用試薬を、市販の測定用チップならびにＷＯ２０１４／０４９７０やＷＯ ２０１６／０５１９３０等の公報に記載されるチップに適用してもよい。同様にして、下記実施形態では、血糖値の測定を目的としたチップの具体的な形態を説明するが、測定用チップは当該用途に限定されず、他の用途にも同様にしてまたは適切に修飾して適用できる。
図４は、本実施形態に係る測定用チップを用いたグルコース（血糖）の検出に用いられる血糖計を概略的に示す平面図である。
図４において、血糖計１０は、血液サンプル中のグルコース（血糖）を測定する機器として構成されている。この血糖計１０は、主に、ユーザ（被検者）が操作するパーソナルユースとして用いられ得る。ユーザは、食前の血糖を測定して自身の血糖管理を行うこともできる。また、医療従事者が被検者の健康状態を評価するために血糖計１０を使用することもでき、この場合、血糖計１０を適宜改変して医療施設等に設置可能な構成としてもよい。
血糖計１０は、血液サンプル中に含まれるグルコースの含有量（血糖値）を光学的に測定する、比色法の原理を採用している。測定方法としては、反射光測定、透過光測定、吸光度測定のいずれかを採用してもよい。特に、この血糖計１０は、所定波長の測定光を分析サンプル（血液）に照射し、分析サンプルを透過した光を受光する、透過光測定用の測定部１４により血糖測定を行う。
血糖計１０は、血液を取り込んだ測定用チップ１２を装着して、または測定用チップ１２を装着した状態で測定用チップ１２に血液を取り込み、測定部１４によりグルコースを検出する。測定用チップ１２は、１回の測定毎に廃棄するディスポーザブルタイプに構成されてもよい。一方、血糖計１０は、ユーザが測定を簡易に繰り返すことができるように、携帯可能且つ頑強な機器に構成されることが好ましい。
測定用チップ１２は、図５に示すように、板状に形成されたチップ本体部１８と、チップ本体部１８の内部で板面の面方向に延びる空洞部２０（液体用空洞部）とを備える。
チップ本体部１８は、図５に示すように、側面視で、血糖計１０の挿入および離脱方向（血糖計１０の先端および基端方向）に長い長辺２２を有すると共に、上下方向に短い短辺２４を有する長方形状に形成されている。例えば、チップ本体部１８の長辺２２の長さは、短辺２４の２倍以上の長さに設定されるとよい。これにより測定用チップ１２は、血糖計１０に対して充分な挿入量が確保される。
また、チップ本体部１８の厚みは、長方形状に形成された側面に比べて極めて小さく（薄く）形成される（図５では、敢えて十分な厚みを有するように図示している）。例えば、チップ本体部１８の厚みは、上述した短辺２４の１／１０以下に設定されることが好ましい。このチップ本体部１８の厚みについては、血糖計１０の挿入孔５８の形状に応じて適宜設計されるとよい。
測定用チップ１２は、空洞部２０を有するように、一対の板片３０と、一対のスペーサ３２とによりチップ本体部１８を構成している。
図６は、図４の測定用チップを示す側面図である。図６中では、チップ本体部１８の角部が尖っているが、例えば角部は丸角に形成されてもよい。また、チップ本体部１８は、薄板状に限定されるものではなく、その形状を自由に設計してよいことは勿論である。例えば、チップ本体部１８は、側面視で、正方形状や他の多角形状、または円形状（楕円形状を含む）等に形成されてもよい。
チップ本体部１８の内部に設けられる空洞部２０は、チップ本体部１８の上下方向中間位置にあり、チップ本体部１８の長手方向にわたって直線状に形成される。この空洞部２０は、チップ本体部１８の先端辺２４ａに形成された先端口部２０ａと、基端辺２４ｂに形成された基端口部２０ｂにそれぞれ連なり、チップ本体部１８の外側に連通している。空洞部２０は、先端口部２０ａからユーザの血液を取り込むと、毛細管現象に基づき延在方向に沿って血液を流動させ得る。空洞部２０を流動する血液は少量であり、基端口部２０ｂまで移動しても張力により漏れが抑止される。なお、チップ本体部１８の基端辺２４ｂ側には、血液を吸収する吸収部（例えば、後述するスペーサ３２を基端側のみ多孔質体としたもの等）が設けられていてもよい。
また、空洞部２０の所定位置（例えば、図６中に示す先端口部２０ａと基端口部２０ｂの中間点よりも若干基端寄りの位置）には、血液中のグルコース（血糖）と反応することにより血液中のグルコース（血糖）濃度に応じた色に呈色する試薬（発色試薬）２６が塗布され、血糖計１０により測定がなされる測定対象部２８が設定されている。空洞部２０を基端方向に流動する血液が測定対象部２８と接触し、測定対象部２８に塗布された試薬２６反応することで呈色する。なお、空洞部２０の長手方向上において、試薬２６の塗布位置と測定対象部２８は互いにずれていてもよく、例えば試薬２６が塗布された反応部を測定対象部２８の血液流動方向上流側に設けてもよい。
測定用チップ１２は、以上の空洞部２０を有するように、一対の板片３０と、一対のスペーサ３２とによりチップ本体部１８を構成している。一対の板片３０は、側面視でそれぞれ上述した長方形状に形成され、互いに積層方向に配置される。つまり、一対の板片３０は、チップ本体部１８の両側面（左側面および右側面）を構成している。各板片３０の板厚は、非常に小さく、例えば、５〜５０μｍ程度の同一寸法に設定されるとよい。２つ（一組）の板片３０の厚みは、相互に異なっていてもよい。
一対の板片３０は、面方向と直交する方向からある程度の押圧力が加えられても、板形状を維持して塑性変形しない強度を有する。また、各板片３０は、測定光が透過可能となるように透明又は半透明に構成される。さらに、各板片３０は、空洞部２０において血液を流動させ得るように適度な親水性を有する平坦状の板面に形成されている（又は板面に塗布剤が塗布されている）ことが好ましい。
各板片３０を構成する材料は、特に限定されるものではないが、熱可塑性樹脂材料、ガラス、石英等を適用するとよい。熱可塑性樹脂材料としては、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプ口ピレンなど）、シクロオレフィンポリマー、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテフタレート、ポリエチレンナフタレートなど）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリアミド、フッ素樹脂等の高分子材料又はこれらの混合物が挙げられる。
また、一対のスペーサ３２は、一対の板片３０の間に挟まれるように配置され、所定の接合手段（接着剤等）よりに各板片３０の対向面に強固に接着される。つまり各スペーサ３２は、一対の板片３０同士を離間させるように間に配置されることで、一対の板片３０と一対のスペーサ３２自体の間に空洞部２０を形成させる部材である。この場合、一方のスペーサ３２は、図６中のチップ本体部１８の上側長辺２２ａに接し、この上側長辺２２ａに沿って先端および基端方向に延びるように配置される。他方のスペーサ３２は、図６中のチップ本体部１８の下側長辺２２ｂに接し、この下側長辺２２ｂに沿って先端および基端方向に延びるように配置される。
一対のスペーサ３２を構成する材料（基材）は、特に限定されるものではないが、例えば、スチレン系、ポリオレフィン系、ポリウレタン系、ポリエステル系、ポリアミド系、ポリブタジエン系、トランスポリイソプレン系、フッ素ゴム系、塩素化ポリエチレン系等の各種熱可塑性エラストマーが挙げられる。または、熱可塑性エス卜ラマ一以外にも、弾性変形可能な種々の材料を適用してもよく、また弾性変形可能な多孔質体（例えばスポンジ）等の構造体を適用してもよい。さらに、一対の板片３０の間で硬化状態又は半硬化状態となることにより板片３０同士を接着する接着剤を基材の一方または両面に有するスペーサ３２として適用してもよい。またさらに、スペーサ３２は、試薬２６を含有することで、空洞部２０に試薬２６を溶出する構成であってもよい。
板片３０やスペーサ３２は、親水化処理されたものであってもよい。親水化処理の方法としては、例えば界面活性剤、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、水溶性シリコーンの他、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等の親水性高分子を含有した水溶液を浸漬法またはスプレー法等により塗布する方法や、プラズマ照射、グロー放電、コロナ放電、紫外線照射（例えば、エキシマ光照射）等の方法等が挙げられ、これらの方法を単独又は組み合わせてもよい。
測定用チップ１２は以上のように構成される。次に血糖計１０の装置本体１６について説明する。図４に示すように、血糖計１０は、外観を構成する筐体４０を有する。筐体４０は、ユーザが把持操作し易い大きさでその内部に血糖計１０の制御部４２を収容する箱体部４４と、箱体部４４の一辺（先端側）から先端方向に突出し内部に光学系の測定部１４を収容する筒状の測光ブロック４６とを含む。また、箱体部４４の上面には、電源ボタン４８、操作ボタン５０、ディスプレイ５２が設けられ、測光ブロック４６の上面にはイジェク卜レバー５４が設けられている。
電源ボタン４８は、ユーザの操作下に、血糖計１０の起動と起動停止を切り換える。操作ボタン５０は、起動状態となった血糖計１０において、ユーザの操作に基づき、血糖値の測定や表示を行う、測定結果（過去の測定結果を含む）の表示を切り換える等の操作部として機能する。ディスプレイ５２は、液晶や有機ＥＬ等により構成され、測定結果の表示やエラー表示等のように測定操作においてユーザに提供する情報を表示する。
イジェク卜レバー５４は、先端および基端方向に移動可能に設けられ、測光ブロック４６内に設けられる図示しないイジェク卜ピンのロックを解除して、イジェク卜ピンを先端方向に進出可能とする。
一方、装置本体１６の測光ブロック４６は、ユーザの指等に先端を押し当てるために、箱体部４４から先端方向に長く延出している。図５に示すように、この測光ブロック４６には、挿入孔５８を有するチップ装着部６０と、血中のグルコース（血糖）を光学的に検出する測定部１４とが設けられる。
チップ装着部６０は、高い硬質性（剛性）を有する材料（例えば、ステンレス）により、外方向に突出するフランジ部６０ａを先端側に備え、軸方向に所定長さを有する筒状に形成される。このチップ装着部６０は、樹脂材料で構成された測光ブロック４６の先端面と軸心部（中心部）にわたって位置決め固定される。測光ブロック４６の内面には、図７Ａに示すように、チップ装着部６０を強固に固定する固定壁４６ａが突出形成されている。
チップ装着部６０を構成する材料としては、例えば、ステンレスやチタン等の金属、アルマイト皮膜処理をしたアルミニウム、液晶ポリマー、ガラスやマイカ等のフィラーを添加したプラスティック、ニッケルめっき等で表面を硬化皮膜したプラスティック、カーボンファイバー、ファインセラミック等、硬質で安易に寸法が変化せず、また繰り返し測定用チップの抜き差しをしても摩耗しにくく、且つ寸法精度良く加工可能な材料が挙げられる。この中でも金属材料を適用すれば、チップ装着部６０の製造（射出成形やプレス成形等）時に、高い寸法精度且つ容易に挿入孔５８を成形することができる。なお、装置本体１６は、測光ブロック４６自体を硬質な材料（例えば、金属材料）により構成することで、チップ装着部６０を一体成形していてもよい。
チップ装着部６０の軸心部には、このチップ装着部６０の壁部６２に囲われることにより挿入孔５８が設けられる。挿入孔５８は、上下方向に長く、左右幅方向に短い断面長方形状に形成されている。挿入孔５８は、チップ装着部６０が測光ブロック４６に固着された状態で、その先端面から奥部（基端方向）に向かって所定深さを有する。
チップ装着部６０の先端側には、挿入孔５８に連なると共に、外部に連通する挿入開口部５８ａが形成される。この挿入開口部５８ａの上下方向の寸法は、測定用チップ１２の短辺２４の寸法（上下方向の長さ）に一致している。また、挿入開口部５８ａの左右幅方向の寸法、すなわち挿入孔５８の側面を構成する一対の壁部６２の間隔は、図７Ａに示すように、測定用チップ１２の積層方向の厚み（図７Ａ中のＴａｌｌ）と実質的に同じである。
チップ装着部６０は、挿入孔５８（測定用孔部５９）が延在する途中位置に、測光ブロック４６の固定壁４６ａと協働して一対の素子収容空間６４を形成している。一対の素子収容空間６４は、測定部１４の一部であり、挿入孔５８を挟んで互いに対向位置に設けられ、チップ装着部６０により形成された各導光部６６を介して測定用孔部５９に連通している。
測定部１４は、一方の素子収容空間６４に発光素子６８を収容することで発光部７０を構成し、他方の素子収容空間６４に受光素子７２を収容することで受光部７４を構成している。チップ装着部６０の導光部６６は、適宜な直径を有する円形状の穴に形成されることで、所謂アパーチャの役割を果たしている。
発光部７０の発光素子６８は、第１の波長を有する測定光を測定用チップ１２に照射する第１発光素子６８ａと、第１の波長とは異なる第２の波長を有する測定光を測定用チップ１２に照射する第２発光素子６８ｂとを含む（図５中では図示を省略する）。第１発光素子６８ａと第２発光素子６８ｂは、素子収容空間６４の導光部６６を臨む位置に並設されている。
発光素子６８（第１及び第２発光素子６８ａ、６８ｂ）は、発光ダイオード（ＬＥＤ）で構成され得る。第１の波長は、血糖量に応じた試薬２６の呈色濃度を検出するための波長であり、例えば、６００ｎｍを超えて６８０ｎｍ以下である。第２の波長は、血液中の赤血球濃度を検出するための波長であり、例えば、５１０ｎｍ〜５４０ｎｍである。箱体部４４内の制御部４２は、駆動電流を供給して、第１及び第２発光素子６８ａ、６８ｂをそれぞれ所定タイミングで発光させる。この場合、呈色濃度から得られる血糖値を赤血球濃度から得られるヘマトクリット値を用いて補正し、血糖値を求める。なお、さらに他の測定波長で測定することで、血球に起因するノイズを補正してもよい。
受光部７４は、素子収容空間６４の導光部６６を臨む位置に１つの受光素子７２を配置して構成される。この受光部７４は、測定用チップ１２からの透過光を受光するものであり、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）で構成され得る。
また、挿入孔５８の底部（基端面）には、イジェクトレバー５４に連結されたイジェクトピン５６（イジェクト部）が設けられている。イジェクトピン５６は、測光ブロック４６の軸方向に沿って延びる棒部５６ａと、棒部５６ａの先端部で径方向外側に大径な受部５６ｂとを備える。受部５６ｂには、挿入孔５８に挿入された測定用チップ１２の基端辺２４ｂが接触する。また、挿入孔５８の底部とイジェクトピン５６の受部５６ｂの間には、イジェクトピン５６を非接触に囲うコイルバネ７６が設けられている。コイルバネ７６は、イジェクトピン５６の受部５６ｂを弾性的に支持する。
測定用チップ１２の挿入が完了すると、図７Ｂに示すように、測定用チップ１２の測定対象部２８が導光部６６に重なる位置に配置される。
イジェクトピン５６は、ユーザによる測定用チップ１２の挿入に伴い受部５６ｂが押されることで基端方向に変位し、筐体４０内に設けられた図示しないロック機構によりロック（固定）される。コイルバネ７６は、受部５６ｂの変位に従って弾性的に収縮する。そして、ユーザのイジェクトレバー５４の操作により、イジェクトピン５６が多少移動するとロック機構のロックが解除され、コイルバネ７６の弾性復元力により先端方向にスライドする。これにより、測定用チップ１２がイジェクトピン５６に押し出されて、挿入孔５８から取り出される。
図４に戻り、装置本体１６の制御部４２は、例えば、図示しない演算部、記憶部、入出力部を有する制御回路によって構成される。この制御部４２は、周知のコンピュータを適用することが可能である。制御部４２は、例えば、ユーザの操作ボタン５０の操作下に、測定部１４を駆動制御して血中のグルコースを検出及び算出し、ディスプレイ５２に算出した血糖値を表示する。
例えば、測定用チップ１２に対し測定光を透過させて分析対象物（例えば、グルコース）を測定する血糖計１０において、制御部４２は、以下の式（Ａ）で示すＢｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ則に基づいて測定結果を算出する。
Figure 0006893215
上記式（Ａ）において、ｌ０は血液サンプルに入射する前の光の強度、ｌ１は血液サンプルから出射した後の光の強度、αは吸光係数、Ｌは測定光が通過する距離（セル長）である。
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、下記実施例において、特記しない限り、操作は室温（２５℃）で行われた。また、特記しない限り、「％」および「部」は、それぞれ、「質量％」および「質量部」を意味する。
実施例１：テトラゾリウム化合物１の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物１）を合成した。
Figure 0006893215
１．ヒドラゾン化合物１の合成
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム(Disodium 4-Formylbenzene-1,3-disulfonate)（東京化成工業株式会社製） ８．５９ｇ及び（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）ヒドラジン((4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-hydrazine)（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ社製） ４．０ｇをＲＯ水３００ｍＬに溶解させた。これに、酢酸１．６ｍＬを加えウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱・攪拌終了後、溶媒を除去した。得られた残渣をアルコール洗浄した後、沈殿を濾別した。得られた沈殿を乾燥させることにより、ヒドラゾン化合物１を得た。
２．ホルマザン化合物１の合成
上記１．のヒドラゾン化合物１ １．３９ｇを、ＲＯ水２５ｍＬとメタノール（和光純薬工業株式会社製）２５ｍＬとの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物１溶液を調製した。２−メトキシ−４−ニトロアニリン(2-methoxy-4-nitroaniline)（東京化成工業株式会社製） ０．４３７ｇをＲＯ水３．４４ｍＬとアセトニトリル１０ｍＬとの混合液に溶解した。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を、−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物１溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ６００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物１を含む溶液（ホルマザン化合物１溶液）を調製した。このホルマザン化合物１溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させることにより、ホルマザン化合物１を得た。
３．ホルマザン化合物１の精製およびテトラゾリウム化合物１の合成
上記２．のホルマザン化合物１をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物１溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物１溶液を精製した。脱塩処理後、採取したフラクションの溶媒を除去し、得られた固形成分に、メタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃で）遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物１の回収
上記３．の反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテルを加えて、テトラゾリウム化合物１を沈殿させた。この沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物１を得た（９０ｍｇ、収率：５．０質量％）。
実施例２：テトラゾリウム化合物２の合成
以下の方法に従って、下記構造を有する化合物（テトラゾリウム化合物２）を合成した。
Figure 0006893215
１．ヒドラゾン化合物２の合成
４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム(Disodium 4-Formylbenzene-1,3-disulfonate)（東京化成工業株式会社製） ８．５９ｇ及び（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）ヒドラジン((4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-hydrazine)（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ社製） ４．０ｇを、逆浸透水（ＲＯ水）３００ｍＬに溶解させた。これに、酢酸１．６ｍＬを加えウォーターバスにて６０℃で２時間、加熱・攪拌した。加熱・攪拌終了後、溶媒を除去した。得られた残渣をエタノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。この沈殿を乾燥させることにより、ヒドラゾン化合物２を得た。
２．ホルマザン化合物２の合成
上記１．で得られたヒドラゾン化合物２ １．３９ｇを、ＲＯ水２５ｍＬとメタノール２５ｍＬとの混合液に溶解して、ヒドラゾン化合物２溶液を調製した。２−エトキシ−４−ニトロアニリン(2-Ethoxy-4-nitroaniline)（五二化学工業株式会社製） ０．４５５ｇをＲＯ水３．４４ｍＬとアセトニトリル１０ｍＬとの混合液に溶解した。この溶液を０℃に保持しつつ、９．６Ｎ ＨＣｌ ５６０μＬを加え、亜硝酸ナトリウム溶液を滴下し、ジアゾ化を行った。このジアゾ化溶液を、−２０℃に保持し、ヒドラゾン化合物２溶液に滴下した。滴下終了後、１０Ｎ ＮａＯＨ ６００μＬを滴下し、２時間室温（２５℃）で攪拌して、ホルマザン化合物２を含む溶液（ホルマザン化合物２溶液）を調製した。このホルマザン化合物２溶液を９．６Ｎ ＨＣｌにてｐＨを中性に調整し、溶媒を除去した。得られた残渣をイソプロパノールで洗浄した後、沈殿を濾別した。得られた沈殿を乾燥させることにより、ホルマザン化合物２を得た。
３．ホルマザン化合物２の精製およびテトラゾリウム化合物２の合成
上記２．のホルマザン化合物２をＲＯ水１０ｍＬに溶解して、ホルマザン化合物２溶液を調製した。ディスポーザブルカラム（大きさ：２０ｃｍ×５ｃｍ）に、カラムクロマトグラフィー用充填剤（ナカライテスク株式会社製、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ４０Ｃ１８−ＰＲＥＰ）を充填し、カラム分取システム（日本ビュッヒ社製、商品名：セパコア）にセットした。このカラムシステムを用いて、ホルマザン化合物２溶液を精製した。脱塩処理後、採取した赤色フラクションをエバポレーターで溶媒を除去し、得られた固形成分に、メタノール１５ｍＬ、９．６Ｎ ＨＣｌ ２５０μＬ、１５％亜硝酸エチル（ＣＨ３ＣＨ２ＮＯ２）−エタノール溶液５ｍＬを加えて、７２時間、室温（２５℃で）遮光にて攪拌した。
４．テトラゾリウム化合物２の回収
上記３．の反応溶液５ｍＬに対し、ジエチルエーテル５０ｍＬを加えることにより、テトラゾリウム化合物２を沈殿させた。これを遠心分離し、上澄みを除去後、さらにジエチルエーテルで洗浄した。この沈殿をドラフト内で乾燥させ、テトラゾリウム化合物２を得た（１２０ｍｇ、６．５質量％）。
実施例１〜２、比較例１〜５
上記実施例１〜２のテトラゾリウム化合物１〜２および下記構造の比較化合物１〜５（それぞれ、比較例１〜５）について、下記方法に従って、水溶性、感度、キレート速度、極大吸収波長（λｍａｘ）、および安定性を評価し、結果を下記表１に示す。
Figure 0006893215
Figure 0006893215
（水溶性の評価）
各化合物を、水溶液中の化合物の濃度が２００ｍＭとなるような量で、ＲＯ水 １００μＬ、０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬに加えた。５分間撹拌した後、沈殿物を目視で確認した。２００ｍＭの水溶液にて沈殿物がない場合には溶解性を○とした。２００ｍＭの水溶液にても沈殿物が認められる場合には、溶解性を「×」とした。
（キレート速度および極大吸収波長（λｍａｘ）の評価）
各化合物のホルマザンの終濃度が５０〜２００ｍＭとなるように、１０ｍＭ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）を加えて、試料を調製した。このとき、いずれの試料も赤褐色に発色した。
上記試料１００μＬに、１Ｍ ニッケルイオンを含むニッケル水溶液を１０μＬ加え、素早く攪拌しながら、色調変化を観察した。ニッケル水溶液を添加してから発色を目視にて確認するまでの時間を計り、上記時間が１分以内である場合にはキレート速度を「○」とし、上記時間が１分を超えた場合にはキレート速度を「×」として評価した。なお、比較例２および４では、ニッケルイオンを添加後の試料の色調が、長波長側へと色調変化しなかったため、キレート形成しなかったと判断し、表１において「−」と表示した。
また、各化合物のホルマザン水溶液とニッケル水溶液の混合溶液について、スペクトルを、分光光度計（測定セル長：１０ｍｍ）にて測定した（ｎ＝１）。各スペクトルに基づいて、各化合物のホルマザンでの極大吸収波長（λｍａｘ）（ｎｍ）を求めた。それぞれの結果は、表１に示される。一例として、テトラゾリウム化合物１から得られたスペクトルを図１に示す。図１から、化合物１から生成したホルマザンとニッケルイオンとのキレート化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）は６５０ｎｍであることが分かる。
（感度の評価）
各化合物 ０．０２ｍｍｏｌに、ＲＯ水 ７５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを添加、溶解して、試料を調製した。対照として、２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ−３−（４−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−［４−（２−ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＷＳＴ−４） １１．６ｍｇに、ＲＯ水 ８５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを添加、溶解して、対照試料を調製した。
別途、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ−ＦＡＤ）（東洋紡株式会社製、品番：ＧＬＤ−３５１）７ｍｇに、ＲＯ水 １００μＬを加え、溶解させて、ＧＤＨ溶液を調製した。また、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート（ｍ−ＰＭＳ）（株式会社同仁化学研究所製）
３．５ｍｇに、ＲＯ水 ２００μＬを加えて溶解させて、ｓ−ＰＭＳ溶液を調製した。塩化ニッケル １２９ｍｇにＲＯ水１ｍＬ加え溶解させ、ニッケル溶液を調製した。
各試料に、それぞれ、上記にて調製したＧＤＨ溶液 １０μＬ、ｍ−ＰＭＳ溶液 ５μＬ、ニッケル溶液 １０μＬを加えて、反応溶液を作製した。また、対照試料に、上記にて調製したＧＤＨ溶液 １０μＬ及びｍ−ＰＭＳ溶液 ５μＬを加えて、対照反応溶液を作製した。
上記にて調製した反応溶液 ４０μＬに、それぞれ、５０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ及び２００ｍｇ／ｄＬ濃度のグルコース溶液１０μＬ加えて発色させ、スペクトルを分光光度計（測定セル長：５０μｍ）にて測定した（ｎ＝１）。各スペクトルにおいて、上記にて求めた各化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）での吸光度を測定し、発色溶液中のグルコース濃度及び吸光度をそれぞれ横軸及び縦軸として、プロットし、傾き（傾きｓａｍｐｌｅ）を求める。
上記にて調製した対照反応溶液 ４０μＬに、それぞれ、５０ｍｇ／ｄＬ及び２００ｍｇ／ｄＬ濃度のグルコース溶液 １０μＬ加えて発色させ、スペクトルを分光光度計（測定セル長：５０μｍ）にて測定した（ｎ＝１）。各スペクトルにおいて、６５０ｎｍでの吸光度を測定し、グルコース濃度及び吸光度をそれぞれ横軸及び縦軸として、プロットし、傾き（傾きＷＳＴ−４）を求める。
上記にて求められた傾きｓａｍｐｌｅを傾きＷＳＴ−４で除した値（傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４）が２倍以上である場合には感度を「○」とし、上記傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４の比が２倍未満である場合にはキレート速度「×」として評価した。一例として、テトラゾリウム化合物１及びＷＳＴ−４のプロット図を図２に示す。図２は、テトラゾリウム化合物１及びＷＳＴ−４に関するグルコース濃度と生成ホルマザンの吸光度との関係を示すグラフである。図２から、化合物１及びＷＳＴ−４の傾きはそれぞれ０．００６２及び０．００２６であることから、傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４の比は約２．４（感度が○）であることが分かる。また、図示していないが、実施例２の傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４の比は２．４（感度が○）であり、比較例１の傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４の比は１．６（感度が×）であり、比較例３の傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４の比は２．５（感度が○）であった。また、比較例２および４は、キレート形成しなかったため、ホルマザンの極大吸収波長が６００ｎｍ超へシフトしなかった。このため、比較例２および４は、感度の評価を実施しなかった。（表１において感度結果を「−」と表示した。）なお、傾きは各化合物の発色強度の指標となる。このため、傾きｓａｍｐｌｅを傾きＷＳＴ−４で除した値（傾きｓａｍｐｌｅ／傾きＷＳＴ−４）が１倍を超えることは、公知の発色試薬であるＷＳＴ−４に比して長波長側での発色が高いことを意味する。
（安定性の評価）
各化合物 ０．０２ｍｍｏｌに、ＲＯ水 ７５μＬ及び０．５Ｍ ＭＯＰＳ溶液（ｐＨ７．２）１００μＬを添加、溶解して、試料を調製した。
この試料に、上記（感度の評価）と同様にして調製したＧＤＨ溶液 １０μＬ、ｍ−ＰＭＳ溶液 ５μＬ、ニッケル溶液 １０μＬを加えて、測定溶液を作製した。
測定溶液作製時（０時間）、ならびに作製してから１時間、２時間及び６時間後に、上記にて調製した測定溶液のスペクトルを分光光度計（測定セル長：５０μｍ）にて測定した（ｎ＝１）。各スペクトルにおいて、上記にて求めた各化合物の極大吸収波長（λｍａｘ）での吸光度を測定した。測定溶液作製時（０時間）、ならびに作製してから１時間、２時間及び６時間後での吸光度を、それぞれ、Ａｂｓ０ｈ、Ａｂｓ１ｈ、Ａｂｓ２ｈ及びＡｂｓ６ｈとする。各測定時間での吸光度から測定溶液作製時（０時間）での吸光度を差し引いた値を測定時間で除した値［それぞれ、（Ａｂｓ１ｈ−Ａｂｓ０ｈ）／１、（Ａｂｓ２ｈ−Ａｂｓ０ｈ）／２及び（Ａｂｓ６ｈ−Ａｂｓ０ｈ）／６］が０．０５未満である場合には安定性を「○」とし、上記値が０．０５を超え０．１５以下である場合には安定性を「△」とし、上記値が０．１５を超える場合には安定性を「×」として評価した。一例として、テトラゾリウム化合物１の安定性評価結果を図３に示す。図３から、化合物１の［（Ａｂｓ６ｈ−Ａｂｓ０ｈ）／６］は約０．０３であることから、安定性が良好なことが分かる。また、図示していないが、実施例２の化合物の［（Ａｂｓ６ｈ−Ａｂｓ０ｈ）／６］は約０．０２であり、安定性が良好なことが分かる。一方、本発明の実施例に対して、比較例１、３の化合物の［（Ａｂｓ６ｈ−Ａｂｓ０ｈ）／６］のそれぞれの値は、０．０５、０．２０であった。比較例２、４は、キレート形成しなかったため、６００ｎｍ超の極大吸収波長を有するホルマザンまたは当該ホルマザンとニッケルイオンとのキレート化合物を得ることはできなかった。ゆえに、比較例２、４の化合物の安定性を評価しなかった。
Figure 0006893215
表１に示されるように、本発明のテトラゾリウム塩は、良好な水溶性を示す。上記結果から、本発明のテトラゾリウム塩から生成するホルマザンおよび当該ホルマザンと遷移金属イオンとのキレート化合物もまた、本発明のテトラゾリウム塩と同様、良好な水溶性を示すことが推測される。
また、上記表１の結果から、実施例のテトラゾリウム塩を用いることによって、良好な感度で速やかに血糖値を測定できることがわかる。また、実施例のテトラゾリウム塩によれば、測定後にある程度の時間が経過した後であっても、測定直後の値と同様の結果が得られ、安定性に優れることが分かる。
さらに、実施例のテトラゾリウム塩から生じるホルマザンとニッケルイオンとのキレート化合物は６５０ｎｍ以上の極大吸収波長（λｍａｘ）を示す。ゆえに、全血サンプルに対しても、血糖値等の生体成分濃度を高感度で正確に測定できると考察される。
本出願は、２０１６年９月１４日に出願された日本特許出願第２０１６−１７９９０８号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として引用されている。

Claims (10)

  1. 下記式（１）：
    Figure 0006893215
     ただし、Ｒ１は、メチル基またはエチル基を表わし；
    Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、メトキシ基またはエトキシ基を表わし；および
    Ｘは、水素原子またはアルカリ金属を表わす、
    で示される、２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩。
  2. 前記式（１）において、３位のフェニル基が、アルコキシ基（−ＯＲ１）が２位におよびニトロ基（−ＮＯ２）が４位に存在するフェニル基である、請求項１に記載のテトラゾリウム塩。
  3. 前記式（１）において、５位のフェニル基が、スルホ基（−ＳＯ３ −）が２，４位または３，５位に存在するフェニル基である、請求項１または２に記載のテトラゾリウム塩。
  4. 下記群：
    Figure 0006893215
     ただし、Ｘは、アルカリ金属を表わす、
    からなる群より選択される構造を有する、２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩。
  5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩を含む生体成分濃度測定用試薬。
  6. さらに遷移金属化合物を含む、請求項５に記載の生体成分濃度測定用試薬。
  7. 前記遷移金属化合物がニッケル化合物である、請求項６に記載の生体成分濃度測定用試薬。
  8. 血液または体液中の、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または尿酸の濃度の測定のために使用される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の生体成分濃度測定用試薬。
  9. 生体試料に、請求項１〜４のいずれか１項に記載の２−置換チアゾリル−３−置換フェニル−５−スルホ化フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、酸化還元酵素および遷移金属化合物を添加して、発色量を測定し、当該発色量に基づいて前記生体試料中の生体成分の濃度を定量することを有する、生体成分濃度の測定方法。
  10. 前記生体試料中の生体成分が、血液または体液中の、グルコース、コレステロール、中性脂肪、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または尿酸である、請求項９に記載の方法。
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