JPS6075470A - 水溶性テトラゾリウム化合物及びこれを用いる定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な水浴性テトラゾ１１ウム化合物及びこ
れを用いる定量方法に関する。

詳記すれば、テトラゾール環に置換するフェニル基の１
つにポリエチレングリコール残ｉｋ与え、該テトラゾリ
ウム化合物を水溶性にすると共に、その還元成績体であ
るホルマザンが水に易溶である水溶性テトラゾリウム化
合物、及びこれを用いる定量方法に関する。

テトラゾリウム化合物は、還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、又は還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド燐酸（ＮＡＤＰＨ）の水素
受容体として機能するとか、スーパーオキサイドイオン
やアスコルビン酸によって還元され、夫々の結果として
定量的に生成するホルマザンの量に比例する発色の程度
を、吸光々度測定法で測定することによって、Ｎ　Ａ　
Ｄ　ＨｌＮＡＤＰＨ又はスーパーオキサイドイオン、ア
メコル１゛ン酸などの還元性物質の量を測定することが
できる。従って周知の通り、脱水素酵素の活性度の測定
、それによる基質の定量、更にスーパーオキサイドイオ
ンを生成する酸化酵素の作用対象である基質の定量、即
ち生体々液成分とか食品中の添加物などの定量に極めて
有用である。

これらの原理を、乳酸脱水素酵素（Ｌ　Ｄ　Ｈ）の活性
度の測定の場合に例をとって示せば、であり、これらの
反応は定量的且つ特異的に進行するから、生成するホル
マザンの色濃度を定量することによって、Ｌ　Ｄ　Ｈの
活性度を測定することができる。また脱水素酵素を使用
した生体々液成分の測定を、コレステロールの測定につ
いて示せば、 ルフェート であり、同様にコレステロールの量を測定することがで
きる。次にスーパーオキサイドイオンの測定によって、
コレステロール全定量するｔｊＭ合について説明すれば
、 コレステロール　コレステノン （ト） テトラゾリウム塩　ホルマザン であり、同様にしてコレステロール全定量することがで
きる。この式に於て：Ｘはハロゲンを示す。

かかる方法の為に、従来提供されているテトラゾ１１ワ
ム化合物としては、２−（４−ヨヮ化フェニル）−３−
（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウム塩（ＩＮＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾ
１１ルー２　）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾ
１１ワム塩（ＭＴＴ）、２゜２’、　５　、５’−テト
ラキス（４−二！・ロフェニル）−３，３’　−（３，
３’−ジメトキシ−４，４′−ジフェニレン）　−２Ｈ
、２’Ｈ−ジテトラゾ１１ワム塩（Ｎ０２−ＴＢ）、２
．２’−ｐ−ジフェニレン−３，３’　、　５．５’　
−テトラフェニル−２Ｈ，２’Ｈ−ジテトラゾリウム塩
（Ｎｅｏ　−Ｔ　Ｂ　）などがあるが、何れも水に難溶
であり、又それらから生成するホルマザンも夫々更に難
溶である。従ってその使用に際しては、有機溶剤を併用
するのであるが、測定上も環境的にも好ましくなく、更
に敢て低濃度の水溶液として使用する場合でも、ホルマ
ザンが析出沈澱して測定精度を著しく損ねると共に、測
定機器を汚染し、自動分析機の使用を制限、テトラゾリ
ワム化合物による測定が望ましい場合でも、漸次細の方
法への移行が強いられているのが実状である。

これに対し、テトラゾリウム化合物及びホルマザンを水
溶性にする試みは既に散見される。テトラゾール環に置
換するフェニル基に、直接スルホン酸基とかカルボン酸
基を、又四級アンモニウム塩を含む側鎖を導入する試み
がそれであり、日特公昭５６−３８１５４、日特開昭５
６−６１３６６日特開昭５６−６１３６７、日本薬学会
１０２年会講演要旨集３４１頁４に２−４等に示されて
いる。

しかしこれら水可溶化の目的でフェニル基に直接導入さ
れた酸基の為に、実際の測定で不可欠な酵素機能が発揮
される至適ｐＨ域内トこ於ては、これら提案のテトラゾ
リワム化合物は、水素會受溶してホルマザンを生成しな
いので、臨床検査等の実用には供し難く、又四級アンモ
ニウム塩導入化トラゾ１１ウム化合物及びその還元成績
体であるホルマザンが水に易溶であること、■酸化還元
電位が低く、至適ｐＨ域に於て電子伝達剤の存在下ＮＡ
ＤＨ若しくはＮＡＤＰＨによって、又はスーパーオキサ
イドイオンによって、発色するホルマザ゛ン全生成する
テトラゾリワム化合物であること、及び■分析機器の薬
液等の経路を染色汚染せず、生成ホルマザンも同様であ
るテトラゾ１１ワム化合物であることを、全て満足する
よう、鋭意研究の結果、下記一般式 （１尤１は少なくとも１つはニトロ基、ニトロ基でない
ものは水素、Ｒ２Ｉ″ｉ水素、低級アルキル基、低級ア
ルコキシ基又はハロゲン、Ｒ３は水素又はＯＲ’、Ｉ化
４はスルボン酸基若しくはその塩又は（及び）゛カルボ
ン酸基若しくはその塩の１個以」二を置換してもち、且
つ水酸基を置換してもつ又はもたない、炭素数１〜４個
の脂肪族炭化水素（直鎖又は側鎖をもつもの）を表わし
、Ｒ３に含まれるスルホン酸基（若しくはその塩）又は
カルボン酸基（若しくばその塩）Ｆｉ、全体で２個以上
であって、その内の１個はテトラゾール環と分子内塩を
成している。）で示される、水浴性テトラゾリウム化合
物を創製し、該水浴性テトラゾリウム化合物がそのよう
な要求■〜■を全て満足する化合物であること、及びそ
のような２，３．５−　トＩＩフェニルー２Ｈ−テトラ
ゾリウム化合物のフェニル基に連結基を介して水溶性基
を適宜与えられたテトラゾリウム化合物は、従来のテト
ラゾリウム化合物による水性溶液発色を画期的に改善す
るものであることを明らかにし、先に、特許出願してい
る。（特願昭５７−２１７４２７） 先の出願に於けるテトラゾリウム化合物は、フェニル基
に連結基を介して水溶性基が導入されてシするので、従
来の可溶化されたテトラゾリウム塩のもつ問題点を全て
解決した著しく効果的且つ有用疫ものではあるが、難を
云えば、その導入された水浴性基がスルホン酸基のよう
７．１′酸基であるため、これ等酸基に起因して、Ｎ　
Ａ　Ｄ　Ｈ又はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ。

若シくはスーパーオキザイドイオンによって生成するホ
ルマザンの検量線の極低濃度部分に於てランバルト・ベ
ヤ−の法則に従・わない部分が存することが時として見
受けられる点である。（第１図参照） 今回本発明者等は、そのようなおそれの全くない水浴性
基として、ポリエチレングリコール残基を着想、選定し
鋭意研究の結果、そのようなポ１１エチレングリコール
残基全テトラゾリワム化合物に導入させることにより、
先の出願に於ける水溶性テトラゾリウム化合物のもつ顕
著な効果を全てよン 有し、なお且つ、検量線の直線性に優れた結果が得られ
る新規水浴性テトラゾリウム化合物を提供する本発明全
完成するに到った。

本発明化合物は、一般式 ％式％ Ｒ７ハ水素、ニトロ、シアン、ハロゲン又ハル、且つそ
のアルキルは水酸基全置換してもっていてもよい〕）ヲ
、Ｒ３はポリエチレン残基全、Ｘはハロゲンを表わす）
で示される新規水溶性化合物である。

本発明化合物は自体公知の方法を駆使して製造できる。

即ち例えば、ｐ−ニトロフェニルヒドラジンと、ｐ−ヒ
ドロキシベンズアルデヒドとポ１１エチレングリコール
モノクロロエチルエーテルとｔ反応させて得られるｐ−
ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エクンジイル）ベ
ンズアルデヒドとを反応させて相当するｐ−二トロフェ
ニルヒドラジン化合物とし、次いでＮ、Ｎ−ジエチル−
ｐ−フ１８− ェニレンジアミンをジアゾ化したｍ液を反応させ、得ら
れたホルマザンを酸化して２−（ｐ−ニトロフェニル）
−３−（ｐ−（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミ刀フェニル１−５
−１：ｐ−（ヒドロキシ−ポリ（オキシ−ＩＩ２−エタ
ンジイル））フェニルツー２Ｈ−テトラゾリウム塩（（
４）　）なる本発明化合物を得る。

又例えば、２−ベンゾチアゾリルヒドラジントルーヒド
ロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ベンズ
アルデヒドとを反応させて相当する２一ペンゾチアゾ１
１ルヒドラゾン化合物とし、次いでアントラニル酸ヲジ
アゾ化した溶液全反応させ、得られたホルマザンを酸化
して２−（２−ベンゾｆ　７　ソＩｔ　ル）　−３（Ｉ
Ｏ−カルホキジフェニル）−５−Ｃｐ　−（ヒドロキシ
・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル））フェニル’
Ｊ　−２Ｈ−テトラツリウム塩（０→）なる本発明化合
物を得る。

同様にして得られる化合物の例全例挙すると次のとおり
である。

（１）２．３−ビス（ｐ−ニトロフェニル）−５−Ｃｐ
−（ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル
））フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（２）　２−
（ｐ−二トロフェニル）−３−フェニル−５−［：ｐ−
（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−■、２−上２−ジイル）
）フェニル）−２Ｈ−テトラツリウム塩 （３）　２−　（ｐ−ニトロフェニル）−３−（ｐ−（
Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノ）フェ
ニル−５−［ｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル））フェニル）−２Ｈ−テトラゾ＋１ウ
ム塩 （５）　２−　（１）−ニトロフェニル）−３−（ｐ−
フルオロフェニル）−５−（ｐ（ヒドロキシ・ホＩＩ（
オキシ−１，２−エタンジイル））フェニル〕−２Ｈ−
テトラヅリウム塩 （６）　２−　（ｐ−二トロフェニル）−３−（ｐ−シ
アノフェニル）−５−［ｐ（ヒドロキシ・ポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル））フェニルツー２Ｈ−テトラ
ゾリワム塩 （７）　２−　（２−チアゾリル）−３−フェニル−５
−［：ｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エタ
ンジイル））フェニルツー２Ｈ−テトラゾリウム塩 （８）　２−（４−メチル−２−チアゾリル）−３−フ
ェニル−５−ＣＩ）−（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１
，２−エタンジイル））フェニルツー２Ｈ−テトラゾリ
ワム塩 （９）　２−　（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）
−３−フェニル−５−Ｃｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキ
シ−１，エタンｌンジイル））フェニルツー２Ｈ−テ］
・ラゾリワム塩 （１１２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−フェニル−
５−（ｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エタ
ンジイル））フェニル）−２Ｈ−テトラゾ＋１ウム塩 ｅｌｌ）２−（５−ニトロ−２−チアゾ１ｊル）−３−
フェニル−５−Ｃｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１
，２−エタンジイル））フェニル〕−２Ｈ−テトラゾ１
１ウム塩 ａ諺２−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル−３−（
ｐ−二トロフェニル）−５−［：ｐ−（ヒドロキシ・ポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル））フェニルツー２
Ｈ−テトラゾリウム塩 α３２−（２−チアゾリル）　−３−（ｐ−二トロフェ
ニル）−５−［：ｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１
，２−エタンジイル））フェニルツー２Ｈ−テトラゾリ
ワム塩 α４２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（ｐ−ニトロ
フェニル）−５−Ｃｐ−（ヒドロキシ・ホ１１（オキシ
−１，２−エタンジイル））フェニルツー２Ｈ−テトラ
ゾリワム塩 ＣＩＱ２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（ｅ％−ヒ
ドロキシフェニル）−５−Ｃｐ−（ヒドロキシ・ポリ（
オキシ−１，２−エタンジイル））フェニルツー２Ｈ−
テトラゾリウム塩 ＜１ｌ１９２−（２−ヘ７ゾチアヅ１１ル）−３−（ｒ
ｏ＋　−カルボキシ−ｐ　−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミン
）フェニル）−５−（ｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル））フェニル：］　−］２Ｈ−
テトラゾ１１ウム 塩れら本発明化合物が前記■〜■の３つの目標に適う化
学式−Ｆの特徴は、一般式のＲ１がニトロフェニルキル
、更にＲ４、Ｒ５で芳香環全形成して素又はカルボキシ
ル基、Ｒ７ｕ水素、二ｌ・口、シア異ｌｘる低級アルキ
ル、且つそのアルキルを置換してもっていてもよい〕）
であること、特にＲ３に水溶性基であるポリエチレング
リコール残基−０（　ＣＨ，ＣＨ２０−＋ｎＨ又は÷Ｏ
　Ｃ　Ｈ２Ｃ　Ｈ２＋ｎＯ　Ｉ−ｉがあってフェニル基
に置換されているところにある。

なお、Ｒ’　、　Ｒ’　、　Ｒ８．　Ｒ９の低級アルキ
ルチル、エチル、プロピル、ブチル等であり、ホリエチ
１／ングリコール残基の繰り返し単位ｎの数に関しては
、水溶性の点から平均分子量約４００乃至１０００に相
当するｎ中８〜２３のもの特にｎキ１３のものが好まし
い。

本発明化合物ｔよ、酵素反応系に共存させて用いる場合
、前述の通り、本発明化合物自体の特徴的性質から特に
有意義であり、こｆｌ．全酵素反応系に共存させて、還
元体である水溶性ホルマザンを得、その呈色を測定する
臨床化学分析の代表的定量方法である、水性溶液中還元
性物質を測定する方法を、従来のテトラゾリウム化合物
と比較し乍ら、ＮＡＤＨの測定の場合全実験例１で示す
。

実験例１ （１）比較するテトラゾリウム化合物 （４）本発明化合物の１つであるＰ−１５Ｃ以下、化合
物囚という） （Ｂ）従来のものの１つであるＩＮＴ Ｃ）従来提案の水浴性テトラゾリウム化合物の１つであ
る２，５−ジ（４−スルホフェニル）−３−フェニル−
２Ｈ−テトラゾリワムーカリウム（２）同じ＜２−（４
−ニトロフェニル）−３＝（４−ヨウ化フェニル）−５
−（２−スルホフェニル）　−２　Ｈ−テトラゾ１）ウ
ムクロリド（日特公昭５６ー３８１５４実施例参照） （２）　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈの測定 ）　ＩＩ　１−ンＸ−１００を０．４チ含有する０．１
Ｍ　）１１ス燐酸緩衝液（ｐＨ６．ｏ〜ｐ　Ｈ　９．０
に調整）１００ｍｌずつに前記４種のテトラゾリウム化
合吻合２．５ｍＭ及び電子伝達剤の１−メトキシフェナ
ジンメトサルフエ−　）　（　ＭｅＯ　−　ＰＭＳ　）
　１　０ｍ９、２＋ Ｎｌ（　ＮｉＣｌｚ　）　１　ｍＭｋ添加、それらＦＩ
Ｈ４．ＯｍｌずつにＮＡ　Ｄ　Ｈ　１．６　ｍＭｇ液０
．１ｍｌｆ加え、３７℃で２分間加温、直後に吸光度を
測定する。

（３）操作中の状況と結果 表　１ ｍ解性　○　良く溶解している。

Ｘ　溶解性不良、不溶物又は析出 物がある。

発　色　○　均質液で良好に発色。

八　発色するが不溶物がある。

×　発色しない これより明らかな通り、水浴性基をもたない（Ｂ）は、
中性付近でＮＡＤＨの水素受容体となり得るが、実用的
には価１直が低く、水浴性基がフェニル基に直接置換し
ている（Ｃ）及び（Ｄ）は、中性近辺では発色がなく、
加えて（ＤＩは／Ｉｌ：溶性である。これに対して本発
明化合物の１つである化合物（口）は、それ自身も、生
成ホルマザンも十分に水に易浴性であり、中性近辺で好
都合にＮＡＤＨの水素受容体となり、ホルマザンの呈色
も良好である。

実験例１のように、Ｎ１　イオンを併用することは、呈
色波長を約１１０ηｍ長波長側ヘシフトする効果全与え
る。Ｃｕ　イオン（その併用は、呈色を約１００ハｍ長
波長側ヘシフトする。）のようなその他の金属イオンも
、Ｎｉ　イオンと同様、呈色波長を約１００〜１３０７
＋ｍ長波長側ヘシフトする効果を与える。

周知の通り体液中の微量成分や酵素の活性度を針元々度
法によって測定する場合に該体液試料中ｌこ存するビリ
ルビン等の着色物質の存在が、波長５００ｎ７ＩＬ近傍
の吸収スペクトルに少なからぬ影響を与えて、測定直に
誤差が生ずるので、ホルマザンの発色が５０　Ｑ　ｎｍ
近辺にある場合、金属イＡンの共存によって呈色の波長
が長波長側ヘシフトすることは、極めて好ましいことで
ある。次に金属イオンの使用効果を示す。

実験例２ １−１１　トンＸ　−１００を０．４％含有する０、１
　Ｍ　）１１ス燐酸緩衝液（ｐＨ８，５）　１００ｍ１
ｈコ、本発明の化合物（Ａ）１．（１ｍＭとＭｅＯ−Ｐ
　Ｍ　Ｓ’　１．２．　ｐＭ　、金属イオン１ｍＭ’ｒ
溶解、その溶’７ｇ、　５．０　ｍｌ　ｆとる。

一方、金属イオンを含有しない同緩衝液を用い、同様処
方のもの全作りその５．０ｍ１ｉとる。両液にＮＡＤＨ
５ｍＭ　溶液５０　μｉずつＹ加え、３７℃で１０分間
加温した後その吸光１ｉｋ測定する。結果は下記の通り
。

表　２ 検量線（第２図） また本発明化合物によるキレート化合物の呈色のｐ　Ｈ
依存の様子を、ＮＡＤＨ測定を例にとって示す。

実験例３ トリトンＸ　−１０ｎの０．４係を含有する０、ＩＭＦ
リス燐酸緩衝液（ｐＨ全６．０．６．５．７．０．７．
５．８．０．８．５．９．０に調整）１００ｍｌに、本
発明の化合物（Ａ）　１．０ｍＭ、Ｎｉ　１　ｍ　Ｍ、
及びＭｅＯ−ＰＭ８１２μＭ−で各々添加、それら溶液
５．０ｍ／３ずつをとって、各々にＮＡＤＨの５ｒｎＭ
溶液５０μＭずつを加え、３７℃で゛１０分間加温して
から波長６４０　ｎｍの吸光度を測定する。その結果を
プロットすれば第３図を得る。即ち発色の至適ｐＨは広
く、中性付近に於て十分であり、本発明方法は、目的と
する測定分野の酵素活性至適ｐＨと十分一致する。

このようにテトラゾール環に置換するフェニル基に、本
発明の水溶性基を与えることにより、従来のテトラゾリ
ウムによる水性溶液発色を画期的に改善した本発明は、
斯業に稗益する処絶大である。

このように、本発明化合物から得られる還元体である水
溶性ホルマザンは、Ｎｉ　イオンのような種々の金属イ
オンと有色のキレート化合物を生成するので、より長波
長側にシフトしたそのような呈色を測定することにより
定量的に臨床化学分析をすることができる。この場合は
、本発明化合物を、酵素反応系にそのような金属イオン
と共に共存させて、該テトラゾリウム化合物から得られ
る還元体である水溶性ホルマザンを、該金属と有色のキ
レート化合物に変換、その呈色を測定すればよい。

さらに、本発明化合物から得られる還元体である水溶性
ホルマザン忠は、Ｃｕ　＋　Ｚｎ　＋　Ｎｌ　＋物を、
そ′ｉ″Ｌヲ還元する反応、系におき、得られる水溶性
ホルマザンを以て、該反応系に溶存する金属イオンと有
色のキレート化合物を作らせ、その呈色を測定すること
により該金属を定量的に比色定量することもできる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、これら
実施例は本発明を限定するものではない。

実施例　１ （１）ホリエチレンク１１コール　クロロエチルエーテ
ル ポリエチレングリコール６００　３０６０．！９とピ１
１ジン　２０９ｆ混合、加温して溶解し、塩化チオニル
　９１０ｇ’に５５〜６０℃に加温しながら滴下した後
、更に７０〜７５℃で２時間反応させる。

次に苛性ソーダ水溶液で中和した後、クロロホルムで抽
出し、クロロホルムを減圧留去することにより、ポリエ
チレングリコール　モノクロロエチルエーテル（黄色透
明油分）　２５２０ｇが得られた。

（２）ｐ−ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エタン
ジイル）ペンズアルテ゛ヒド ローヒドロキシベンズアルデヒド　１８３９ｉメタノー
ル　１１に溶解、ナト１１ウムメチラートを２８係溶解
したメタノール液　４３５　、！ｉ’　ｋ添加混合した
後、メタノールを減圧留去する。この濃縮残留物をジメ
チルスルフォギシド　ｌｌに加温溶１Ｍ１還流しながら
ポリエチレングリコール　モノクロロエチルエーテル　
２，３００ｇ−１滴下、更に３時１間還流１１反応させ
た後、苛性ソーダ水浴液を加え溶解し、クロロホルムで
抽出、クロロポルムを減圧留去することにより、赤色透
明油分１、９７　Ｑ　、！ｉ’　ｋ得、次に、この油分
を、カラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ”　Ｃ
−２００、酢酸ニトロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エ
タンジイル）ベンズアルデヒド（橙色透明油分）１，０
９０．！ｉ”、ｒ得た。

（３）　ｐ−ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エタ
ンジイル）ベンズアルデヒド−ｐ−二ｊ・ロフェニルヒ
ドラゾン ｐ−ニトロフェニルヒドラジン　６１．９とｐ　−ヒド
ロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ベンズ
アルデヒド　２８２ｇ？ｒメクノール　３ｏＯｍｌに溶
解、還流下３時間反応させた後、メタノール全減圧留去
することにより、赤色透明油分３４５ｇを得、次に、こ
の油分を、カラムクロマトグラフィー　（Ｗａｋｏｇｅ
ｌ■Ｃ−２００，酢酸エチル：メタノール（９：　ｌ　
））により精製し、ｐ−にドロキシ・ポリ（オキシ−１
，２−エタンジイル）ベンズアルデヒド−ｐ〜ニトロフ
ェニルヒドラゾン　２８０４を得た。

（４）２−（１）−ニトロフェニル）　−：（−（ｐ　
−（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミン）フェニル）−５−Ｃｐ−
←モ＝≠→硫酸Ｎ、Ｎ−ジエチルーｐ−フェニレンジア
ミン２．６９　ｆ濃硫酸１．１ｇ、水６　ｍｌに溶解し
た溶液に、亜硝酸ナト１１ウム　０．７，６．９を水３
　ｍｌに溶解して５℃以下に冷却した溶液を、５℃以下
に冷却下攪拌しながら加えて、ジアゾニウム塩溶液を得
る。このようにして得られたジアゾニウム塩溶液を、ｐ
−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）
ベンズアルデヒド−ｐ−ニトロフェニルヒドラゾン　８
．４９　を苛性ソータ２．０ｇと共に水５．０ｍ／！に
溶解した溶液に、５℃以下に冷却下攪拌しながら滴下す
る。滴下後、５℃以下で更に３０分間反応させた後、水
３００ｍ１．アセトン１００ｍ１．酢酸エチル３００ｍ
Ａ１加え反応液全溶解、分液し、てホルマザン体を含む
酢酸エチル層金得る。なお、酢酸エチノ暫・層には、黒
紫色油分のホルマザン体５ｇが含まれる。

この酢酸エチル液に氷酢酸５　ｍｌ　ｆ添加後、室温下
撹拌しながら次亜塩素酸第三級ブチル　２．７　ｍｌを
加え、更に２時間反応させた後、水及びアセトンを加え
、分液した水層を減圧濃縮することにより、赤褐色油分
３．２　ｇ’を得、この赤褐色油分を、カラムクロマト
グラフィー（逆相シリカゲルクロマトグラフィー、メタ
ノール：酢酸：水（８ｏ：２　：　１８　））により精
製し、２−（ｐ−ニトロフェニル）−３−（ｐ−（Ｎ、
Ｎ−ジエチルアミノ）フェニル）−５−［：Ｉ］−（ヒ
ドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル））フ
ェニル〕−２Ｈ−テトラゾ１１ウム　クロライド　１．
５ｇｉ得た。含量９６　チ 実施例　２ （１）ｐ−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタン
ジイル）ベンズアルデヒド−２−ベンゾチアゾ（１ルヒ
ドラゾン ２−ヒドラジノベンゾチアゾール（２−ベンゾチアゾリ
ルヒドラジン）　２４ｇとｐ−ヒドロキシ・ポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）ベンズアルデヒド　１０２
９’ｚメタノール３００　ｍｌに溶解、還流下３時間反
応させた後、メタノールを減圧留去し、残留物をクロロ
ボルムに溶解、引き続き、塩酸水溶液でクロロホルム液
を洗浄した後、クロロホルムを減圧留去して、褐色透明
油分１０６（９を得、次に、この油分を、カラムクロマ
トグラフ４−（Ｗａｋｏｇｅｌ■Ｃ−２００，酢酸エチ
ル：メタノール（９：　１　））により精製し、ｐ−ヒ
ドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ベン
ズアルデヒド−２−ベンゾチアゾリルヒドラゾン９０．
９を得た。

（２）２−（２−ベンゾチアゾ、リル）　３　５ｄ−カ
ルホーｔ−シ’フェニル）−５−［１）　−（ヒドロキ
シ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル））フェニル
）　−２Ｈ−テトラゾリウム　クロライド（ｐ−１５） アントラニル酸　８．２　、！ｉ’　ｋ製塩［Ｗ１５ｍ
ｌ、水１２０ｍ１ｋｆｆｌ解した溶液に、亜硝酸ナト１
１ワム４．１ｇケ水４０ｍ１に溶解して５℃以下に冷却
した溶液を、５℃以下に冷却下攪拌しながら加え、更に
１０℃で１０分間、反応させ、ジアゾニウム塩溶液を得
る。

このようにして得られたジアゾニウム塩溶液全ｐ−ヒド
ロキシ・ポ１１　（オキシ−１，２−エタンジイル）ベ
ンズアルデヒド−２−ベンゾチアゾリルヒドラゾン　５
１９全アセトン３００ｍ１！、水２００ｍ１に溶解した
溶液に、５℃以下に冷却下ｐ　Ｈ１３に保ちながら、５
係苛性ソーダ液と同時に滴下する。更に５℃以下で３時
間反応後氷酢酸１２ｍ１全加えた水１１を注入し反応液
全溶解、酢酸エチル１．２１３　ｋ加え分液した酢酸エ
チル層全減圧濃縮して、ホルマザン体（黒色油分）１６
．！９’に得る。このホルマザン体全酢酸エチル４００
ｍ１．氷酢酸１０ｍ１に溶解した溶液に、次亜塩素酸第
三級ブチル　５．２ｇを酢酸エチル１００ｍ／にｆｆＪ
Ｍシた溶液を、５℃以下に冷却下攪拌しながら滴下、更
に２．５時間反応させる。反応後、酢酸エチル、アセト
ン、水を反応液に加え溶解、分液した水層を減圧濃縮す
ることにより、赤褐色油分（一部褐色結晶を含む）５．
６．、ｌ−得、この油分を、カラムクロマＩ・グラフィ
ー（逆相シリカゲルクロマトグラフィー、メタノール：
酢酸：水（８０：　２　：　ｌ　８　）　）により精製
し、２−（２−ベンゾチアゾリル）−３（ｏ’−カルボ
キシフェニル）−５−Ｃｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル））フェニル］−２Ｈ−テト
ラゾリワム　りロライド（赤褐色油分（一部褐色結晶を
含む））２．５９を得た。含量９８チ。

実施例　３〜１７ 実施例１又は２と同様にして得ら力、た本発明化合物の
物性及び該テトラゾリウム化合物の還元成　ｍ 鎖体であるホルマザンの極大゛吸収波長（λ　）ａＸ を、表３〜５に示す。

３７− 對又下＆白 −４０− 実施例　１８ＬＤＨ活性の測定 反　応 定　量 乳酸ナトリウム０．１Ｍ、ＮＡＤ　］］ＯｍＭ、Ｐ−１
５１ｍＭ、Ｎ１ｃｂ μＭを、０４チのトリトン　Ｘ−１００を溶解させたト
リス緩衝液（ｐｎｓ、ｓ）に溶解して調製した発色試液
］、　ｍｌをとり、３７℃に於て、血清５（Ｊｔｔｌを
加え、同温度で２０分間インキュベー１・後、ドデシル
硫酸すトリウム（ＳＤＳ）１０ｍＭを０４チのトリトン
　Ｘ−１００を溶解させたトリス緩衝液（ｐ　Ｈ８，５
）に溶解して調製した停止液２−を加え、波長６４０ｎ
ｍで比色する。検量線（第４図）。

実施例　１９　グルコースの測定 酵素反応 β−Ｄ−グルコース＋ＮＡＤ　−＋Ｄ−グルコノーδ−
ラクトン＋Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ２グルコースデヒドロゲナー
ゼ 定　量 グルコースデヒドロゲナーゼ　ＩＯｕ／ｍ１１ＮＡＤ　
１０ｍＭ、Ｐ−１５］ｍＭ、Ｎ１ｃｌ、。

５　ｍＭ、ＭｅＯ−ＰＭＳ　１　２　μ　Ｍ　を　、ト
　リ　ト　ンＸ−１，００を０４％含有するｌ）　Ｈ７
，ＯのＯ，Ｉ　Ｍ　＋−リス緩衝液に溶解して調製した
発色試液５　ｍｌに、グルコース溶液１０μｌを加え、
３７℃、３０分間インキュベートシ、６４０ｎｍの吸光
度（ＯＤ）を測定した。試薬ブランク対照。検量線（第
５図）。

実施例　２０　血清総コレステロールの定量血清１０μ
ｌをとり、これ［Ｐ−１０，０，５ｍＭ／ｄｉ！　。

フェノール０．０５％、パーオキシダーゼ３００′ｌＪ
／　ｄｅ　１グルタチオン（還元型）　２０　ｍｇ／ｄ
ｅ、　＝＋　Ｖステロールエステルヒドロラーゼ３０「
／ｄｌ、コレステロールオキシダーゼ１５　ＴＪ／ｄｌ
！、ｌ−リドンＸ−１０００，１％の濃度になるように
０１Ｍトリス緩衝液（＋）Ｈ８，０）に溶解して調製し
た発色試液３ｍ７！を加えて３７℃の恒温槽中１０分間
加温したのち、血清の代りにイオン交換水を用いて同一
操作を行なった試薬盲検を対照として波長５５０ｎｍに
於ける吸光度を測定する。検量線（第６１￥１）実施例
　２１　銅の定量 原　理 Ｐ　−］　−Ｐ　−４のテトラゾリウム化合物の還元成
績体であるホルマザン体は、ｃ　ｕ＋ｌイオンと反応し
、組成比がモル比で１：１の錯体を形成することをｆｆ
１ｆｆｉしたので、このことを利用して、ｃｕ＋イオン
又はＣｕ　イオンを定量することができる。

至適ｐＨは約９以上例えば９〜１２近辺である。

水溶性テトラゾリウム塩（丁ｚ） Ｒ，−Ｎ−Ｎ　−Ｒ２ １Ｉ＋ ０（ＣＨ２ＣＨ２０）。Ｈ ｎ＝１３．２ 籾イ奪（」 ４３− 表６ 定　量 ５０ｍ（！容メスフラスコに、１．９ＸＩＱ　Ｍテトラ
ゾリウム塩４　ｍｌ　（最終濃度１５２μＭ）をとり、
０、０５　Ｍホウ酸塩緩衝溶液５　ｍｌ　（５ｍ　Ｍ　
）を加え５ｍＭ）を濁加してホルマザン体を生成させた
のち、Ｃｕ２＋イオンを含む試料溶液を加える。

５０ｍ１一定容としたのち、３０分放置して発色させる
。試薬ブランクを対照として６７６　ｎ　ｍ　（Ｐ−３
）に於ける吸光度を測定する。

検量線を第７図に示す。重量線は、０〜０６５ｐｐｍ　
の範囲で、原点を通る直線と７：ｒ：った。

この結果を、広く知られているバンクプロイン法（０，
５〜３　ｐｐｍ、Ｅ＝１２，０００　）と比較すると、
不法は高感度で精度よく、低濃度の銅を定量できる利点
を有している。

共存イオンの影響 ０、３３　ｐｐｍのＣｕ２４　イオンに対して１０　ｐ
ｐｍの３＋ Ｆｅ　イオン、Ｎｉ２＋イオン、Ｃｄ２４イオン、Ｚｎ
　イオン、Ｍｎ２＋　イオン、Ｉ　ＯＯｐｐｍのＣａ２
＋２＋ イオン、Ｍｇ２＋イオンの共存は定量を妨害しない。

血清銅の定量 血清４０ｍ１に、４Ｎ−塩酸２．５　ｍｌを加え、８０
〜９５℃で５分間加熱したのち、５０％トリクロロ酢酸
４．０　ｍｅを加え、遠心分離（２００Ｏｒ、ｐ９ｍ。

で約１５分間）し、上清を分取し、５０ｍｅ一定容とし
たものを試料として、前記定量法に従い、定量した。バ
ンクプロイン法と併せて、結果を表７に示す。

表７　血清銅の定量 銅剣定値（ｐｐｍ） バンクプロ ０　不法　イン法 ］　０．４４．　０．４０゜ ２　０．４３．　０．４３４ ３　０．４６３０．４５５ 表４の結果から、不法とバックプロイン法とは良く一致
していることが判る。

実施例　２２　亜鉛の定量 原　理 ｐ−１０、−１５、−１，８のテトラゾリウム化合物の
還元生成物であるホルマザン体は、Ｚｎ２＋イオンと反
応し、組成比がモル比で、Ｚｎ　１に対し２の錯体を形
成することを見出したので、このことを利用して、Ｚｎ
　イオンを定量することができる。

水溶性テトラゾリウム塩（Ｔｚ） Ｒ，−Ｎ−Ｎ＋−Ｒ２ １ＩＩ ０（ＣＨ，、ＣＨ２０）。Ｈ ｎ＝１３．２ 定　量 ２５ｍ１容メスフラスコに、２Ｘ１０−’Ｍテトラゾリ
ウム塩３　ｍｌ　（最終濃度２４μＭ）をとり、００５
Ｍホウ酸塩緩衝溶液５ｍ／（］ＯｆＴｆＭ）を加えて、
ｐＨを９とする。５Ｘ］ＯＭアスコルビン酸２５４７− ｍｌ　（０，５ｍ　Ｍ　）を添加し、ホルマザンを生成
させたのち、２．　溶液を加えて、錯体を生成させる。

蒸留水で一定容としたのち、３０分間放置し、試薬ブラ
ンクを対照として、６７６ｎｍの吸光度を測定する。

検量線は、０〜０．６５　ｐＩ）ｍの範囲で、原点を通
る直線となった。０．５２　ｐｐｍに於ける５回の繰り
返し測定の相対標準偏差は１２％０モル吸光係数は５．
　ＯＸ　１０’、と高感度で精度よくＺ。　イオンを定
量することができる。

ジンコン法との比較 ｚ２＋の定量法として実用化されている方法に比較した
。表９゜士に吐丑； 歳　？ 表？から判るように、拳法は、ジンコン法と比較して、
感度、精度ともに優れており、壕だ、測定条件も容易で
あり、ｐ　Ｈ領域が広いことから、使用しやすい利点が
ある。

実施例　２３　ニッケルの定量 原　理 Ｐ−１ｏ　、−１ｓ　、−１７、−１８のテトラゾリウ
ム化合物の還元生成物であるホルマザン体は、Ｎ１２＋
イオンと反応し、組成比がモル比で、Ｎ＋１に対し１又
は２の錯体を形成することを児頭しだので、このことを
利用して、Ｎ！２＋イオンを定量することができる。

水溶性テトラゾリウム塩（Ｔｚ） Ｒ，−Ｎ−Ｎ”−Ｒ２ １１ ０（ＣＨ２ＣＨ，、し）。Ｈ ｎ＝１３．２ 表１０ 定　量 実施例２２と同様にして、Ｎ１２＋イオンを定量するこ
とができる肩線（第８図）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、先の発明に於ける水溶性テトラシリ’７　ム
塩ノ−ツテアル２−（４−ニトロフェニル）−３，５−
ビス（３−スルホプロポキン）−２Ｈ−テトラゾリウム
ナトリウム（Ｐ　Ｎ　Ｔ　）を用いた場合（ａ）と本発
明に於ける水溶性テトラゾリウム塩の一つであるＰ−１
５を用いた場合（１））の検量線の比較を示し、（ａ）
が低濃度部分に於て彎曲せずに直線であった場合を特に
破線で示しである。 第２図は、Ｉ）１．５（化合物（Ａ））を用いてＮＡＤ
Ｈを測定する場合の、検量線を示したものであり、第３
図は、Ｎ１２＋イオン共存のもと、各種ｐ　ＨでＮＡＤ
Ｈを測定した場合の、生成ホルマザンの可視部の極大吸
収をプロットして示したものである。 第４図はＬＤＨの、第５図はグルコースの、第６図はコ
レステロールの、検量線を示したものである。 第７図はＣｕ＋□イオンの検量線を示したものである。 第８図は、ｚｎ　、Ｎｉ　、Ｃｕ　、Ｃｏの検量線を示
１−だもので、各金属イオンのλｍａｘと丘は下表の通
りである。 表１１　極太吸収波長（λｍａｘ）とモル吸光係数（０
特許出願人　和光純薬工業株式会社 第４図 １！５　図 グルコース（巧／ｄＡ） コレス干ロー／し　（爛９／ｄλ） 第７図 Ｃｕ（ｐｐｍ） 金属イオン（μＭ） 昭和５ｑ年　２月　Ｚと日 特許庁長官　殿　・・ 事件の表示 １０口ら？１碑費爵＄　ｔ　ｓ　２ｔｔ−ｑ　ｑ層２、
発明の名称 補正をする者 事件どの関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連１１６先特許課（東京）　置　０３−２７０−１１５
７１υ１ ５、　補正の対象 明細書の５２頁。 ６、補正の内容 （１）明細書５２頁４行目以下に記載の表１１と表の説
明を削除する。 （２）明細書５２頁１行目から３行目にかけて記載の「
第８図は、・・・下表の通りである。」を「第８図は、
Ｚｎ　、　Ｎｉ　＋　Ｃｕ　ｔ　ｃｏの検量線を示した
ものである。」と補正する。 別紙の通り。 以上 第８図は、Ｚｎ、　Ｎｉ、　Ｃｕ、　Ｃｏの検量線を示
したものである。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 　２− 昭和５９年／２月２♂日 丁召オロ繋内−斗寺許靜８＋ｇ２＋９ｑ号２、　発明の
名称 Ａ＜シｉしＹ犬／り払イヒ、イ計Ａ夕し尖１入゛これ４
月」Ｖ・るｊと１計う５法３、　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許課（東京）　置０３−２７０４５７１名称
　和光純渠工業株式会社 代表者　−力　−生　のく神ン ４　補正４令の日付　（ぐ賢くかでとこ、ｌ　→ ５２− ５、　補正により減少する発明の数　２６、　補正の対
象 明細書の特許請求の範囲の欄、発明の詳細な説明の欄、
及び図面の簡単な説明の欄。 ７、　補正の内容 （１）　特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （２）明細書１０頁４行目から同頁９行目にかけて記載
の「詳記すれば、・・・・・・定量方法に関する。」を
次のように補正する。 ［詳記すれば、テトラゾール環に置換するフェニル基の
１つにポリエチレングリコール残基を与えることにより
、該テトラゾリウム化合物を水溶性にすると共に、その
還元成績体であるホルマザンをも水に易溶とする新規な
水溶性テトラゾリウム化合物、及びこれを用いる定量方
法に関する。」（３）明細書１２頁１６行目に記載の「
この式に於て：Ｘはｊを「この式に於てＸは」と補正す
る。 （４）明細書１２頁１８行目から１３頁８に行・目；に
かけて記載のｒ２−（４−ヨウ化フェニル）−３−（４
−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリ
ウム塩・・・・・・２．２’−ｐ−ジフェニレン−３，
３’、５．５’−テトラフェニル−２Ｈ。 ２／Ｈ−ジテトラゾリウム塩（Ｎｅｏ　−ＴＢ　）　Ｊ
を「３−（ｐ−ヨウ化フェニル）−２−（ｐ−ニトロフ
ェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（Ｉ
ＮＴ）、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−
２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ΔｆＴ
Ｔ）、３　、３’−（３、３’−ジメトキシ−４，４′
−ジフェニレン）−ビス［２−（ｐ−二トロフェニル）
−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩：］　（Ｎｏ
２−ＴＢ　）、３．３’−（４，４’−ジフェニレン）
−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩
）　（Ｎｅｏ　−ＴＢ　）Ｊと補正する。 （５）明細書１４頁１０行目に記載の「水素を受溶」を
「水素を受容」と補正する。 （６）明細書１８頁３行目から同頁５行目にかけて記載
の「更にＲ４、Ｒ１１は 、Ｒで芳香環を形成してもよい）を、Ｒ２は（７）明細
書１８頁１０行目に記載の「Ｒ８はポリエチレン残基を
、」を「Ｒ３はポリエチレングリコール残基を、」と補
正する。 （８）明細書１８頁１１行目から同頁１２行［Ｉにかけ
て記載の「新規水溶性化合物である。」を「新規水溶性
テトラゾリウム化合物である。」と補正する。 （９）明細書１８頁１９行目から同頁２００行目カケて
記載の「ｐ−ニトロフェニルヒドラジン化合物とし、」
を「ｐ−ニトロフェニルヒドラゾノ化合物とし、」と補
正する。 ００）明細書１９頁１２行目から同頁１６６行目かけて
記載のｒ２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（ｏ−カ
ルボキシフェニル）−５−［：ｐ−（ヒドロキシ・ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル））フェニル）　−２
１−Ｔ−テトラゾリウム塩（（１５））なる」をｒ２−
（２−ベンゾチアゾリル）−３−（０−カルボキシフェ
ニル）−５−［ｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，
２−エタンジイル）Ｆフェニル：）−２Ｈ−テトラゾリ
ウム塩（ポリエチレングリコール残基の平均分子量が６
００の化合物）（（１５））なる」と補正する。 ■）明細書２０頁１１行目から同頁１４４行目かＣすて
記載の［（５）２−（ｐ−ニトロフェニル）−３−（ｐ
−フルオロフェニル）−５−（ｐ（ヒドロキシ・ポリ（
オキシ−１，２−エタンジイル））フェニル）　−２Ｉ
（−テトラゾリウム塩」ヲ［（５）２−（ｐ−ニトロフ
ェニル）−３−（ｐ−フルオロフェニル）−５−Ｃｐ−
（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）
）フェニル〕−２１１−テトラゾリウム塩」と補正する
。 （１２）明細書２０頁１５行目から同頁１８８行目かけ
て記載のｒ（６）２−（ｐ−ニトロフェニル）−３−（
ｐ−シアノフェニル）−５−（ｐ（ヒドロキシ・ポリ（
オキシ−１，２−エタンジイル））フェニル］　−２Ｈ
−テトラゾリウム塩」を「２−（ｐ−ニトロフェニル）
−３−（ｐ−シアノフェ　５− 二ル）−５−［ｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，
２−エタンジイル））フェニル］　−２１−１−テトラ
ゾリウム塩」と補正する。 ０３）明細書２２頁１１行目から同頁１４４行目か（す
てａ己載の［（１６）２−（２−ペンゾチアソ°リル）
−３−（ｏ−ヒドロキシフェニル）−５−ｒ：ｐ−（ヒ
ドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル））フ
ェニル：］　−２１１−テトラゾリウム塩」をｒ２−（
２−ベンゾチアゾリル）−３−（ｏ−カルボキシフェニ
ル）−５−（ｐ−１ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル））フェニル）　−２Ｈ−テトラゾリウ
ム塩（ポリエチレングリコール残基の平均分子量４００
の化合物）」と補正する。 チアゾリル）−３−（ｏ−カルボキシフェニル）−５−
［ｐ−（ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１゜２−エタンジ
イル）トフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ポリエチ
レングリコール残基の平均分子量が１，０００の化合物
）」を挿入する。 （１５）明細書２３頁９行目に記載の［〔Ｒ８，Ｒ９は
同−又」をｒ　［Ｒ”、Ｒ９は同−又は」と補正する。 （１６）明細書２４頁６行目から同頁８打目にかけて記
載の「水性溶液中還元性物質・・・・・実験例１で示す
。」を「水性溶液中還元性物質を測定する方法を、従来
のテトラゾリウム化合物と比較し乍ら実験例により示す
。」と補正する。 （１７）明細書２４頁１１行目から同頁１２２行目かけ
て記載のＩＰ−１５Ｃ以下、化合物（Ａ）という）」を
「Ｐ−１５（化合物（Ａ）戸と補正する。 （１８）明細書２４頁１５行目から同頁１６６行目カケ
て記載の「２，５−ジ（４−スルホフェニル）−３−フ
ェニル−２Ｎ−テトラゾリウム＝カリウム」を「２，５
−ジ（ｐ−スルホフェニル）−３−フェニル−２ｌ−１
−テトラゾリウム＝カリウム」と補正する。 （１９）明細書２４頁１７行目から同頁１９９行目か（
すて記載のｒ２−（４−二トロフェニル）−３−（４−
ヨウ化フェニル）−５−（２−スルホフェニル）　−２
Ｉ−Ｔ−テトラゾリウムクロリド」をｒ２−（ｐ−ニト
ロフェニル）−３−（ｐ−ヨウ化フェニル）−５−（ｏ
−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド」
ど補正する。 （２０）明細書２５頁５行目に記載の「各２．５　ｍＭ
　Ｊを［各２．５ｍｍｏ／−Ｊと補正する。 （２１）明細占２５頁７行目に記載のｒ　Ｎｉ”　（Ｎ
ｉＣｌ２）１ｍＭ」を削除する。 （２２）明細書２５頁８行目から同頁９行目にかけて記
載の「３７℃で２分間加温、直後に吸光度を測定する。 」を［３７℃で２分間加温後、溶解性と発色の状況を観
察した。」と補正する。 （２３）明細書２５頁ｌＯ行目に記載の「（３）操作中
の状況と結果」を「（３）結果」と補正する。 （２４）明細書２６頁１２行目に記載の「化合物い）は
、」を「化合物（Ａ）（Ｐ−１５）は、」と補正する。 （２５）　明細書２６頁１６行目から２７頁２行目にか
けて記載の「実験例】のように、・・・・・・効果を与
える。」を削除する。 （２６）明細書２７頁１４行目から同頁１７７行目かけ
て記載の「本発明の化合物（ｌ＼）・・・・・・同緩衝
液を用い、」を［本発明の化合物（Ａ　）　（Ｐ−１５
）］、　Ｏｍ　ｍｏｔとＭｅＯ−ＰＭＳ１２μｍｏｔ、
　Ｎｉ２”　イ、ｔ　７１ｍｍｏｔを溶解、その溶液５
．０　ｍｌをとる。一方、ＮＩ２＋イオンを含有しない
同緩衝液を用い、」と補正する。 （２７）　明細書２７頁２０行目から２８頁１行目にか
けて記載の「結果は下記の通り。」を「結果は表２の通
り、呈色波長を約１１０　ｎｍ長波長側・＼シフトする
効果を与える。Ｃｕ２＋イオン（その併用は、呈色を約
１００　ｎｍ長波長側ヘシフトする。）のようなその他
の金属イオンも、Ｎｉ２＋イオンと同様、呈色波長を約
１００〜１３０　ｎｍ長波長側・＼シフトする効果を与
える。」と補正する。 （２８）明細書２８頁８行目に記載の「検量線（第２図
）」を［次に実験例２の測定法（ＮＩ２＋イオンを含む
）において、ＮＡＤＨの１．２，３，４、及び５　ｍＭ
溶液を５０μｔずつ加え、同様の操作によって検量線を
得る。（第２図）」と補正する。 （２９）明細書２８頁９行目に記載の「また本発明化合
物」を「また次に本発明化合物」と補正する。 （３０）明細書２８頁１６行目から同頁１７７行目かけ
て記載の「化合物（Ａ）・・・・・・１２μＭを各々添
加、」を「化合物（Ａ）　（Ｐ−１５）　１．０　ｍｍ
ｏＺ＋Ｎ　ｉ　”　１　ｍ　ｍｏ　／＝及びＭｅＯ−Ｐ
ＭＳ　１２　μｍｏｔを各々添加、」と補正する。 （３１）明細書２８頁１８行目に記載のｒ　ＮＡＤＩ−
Ｔの５　ｍＭ溶液５０μＭＪをｒ　ＮＡＤＨの５ｍＭ溶
液５０μｔ」と補正する。 （３ツ　明細書２９頁９行目から同頁１８８行目かけて
記載の「このように、・・・・・・その呈色を測定すれ
ばよい。」を［又、このように、本発明化合物から得ら
れる還元体である水溶性ホルマザンは、ｈキレート化合
物を生成するので、体液中の微量成分や酵素の活性度を
測定する場合に、本発明化合物を酵素反応系に共存させ
、還元成績体である水溶性ホルマザンを生成させる系に
於て、金属イオンを予め、又は該ホルマザンが生成した
後に添加し、該ホルマザンが該金属とキレート化合物に
変換して示す呈色を測定することによって有利に目的を
達することが出来る。」と補正する。 （３３）明細書３０頁１行目から同頁２行目にかけて記
載の「金属イオンと定量的に・・・・・・見出し、」を
「金属イオンとも定量的にキレート化合物を生成するの
で、」と補正する。 ０４）明細書３０頁１１行目に記載の「ポリエチレング
リコール　クロロエチルエーテル」ヲ「ポリエチレング
リコール　モノクロロエチルエーテル」と補正する。 （３ｍ　明細書３５頁１０行目に記載のｒ　（ｐ−１５
）Ｊをｒ（Ｐ−ｘｓ）」と補正する。 （３０明細書３８頁表３の項目の欄に記載の弼　明細書
４０頁表５の項目の欄に記載の「平Ｃ３（至）明細書４
１頁３行目から同頁５行目にかけ顛　明細書４１頁９行
目から同頁１０行目にかけて記載の「０．４％のトリト
ンＸ−１００・・・・・・トリス緩衝液（ｐＨ８，５）
に」を［トリトンＸ−１００をｏ、　４％含有するｐＨ
８，５の０．１　Ｍ　）リス緩衝液に」ｉ己載の　「　
０．４　％　の　ト　リ　ト　ン　ｘ−ｉｏｏ　・・・
　・・・　ト　リ　ス綬衝液（ｐＨ８，５）に」をｒ　
）　！Ｊ　）ンＸ−１００を０、４％含有するｐＨ，８
，５の０．１　Ｍ　）リス緩衝液に」と補正する。 （４カ　明細書４１頁１５行目から同頁１７７行目かけ
て記載の［停止液２　ｍｌを加え、・・・・・・検量線
（第４図）。」を［停止液２ｍｔを加え、試薬盲検を対
照として波長６４０　ｎｍの吸光度を測定した。 次に上記測定法に於て血清５０μｔの代りに種初既知濃
度の標準血清５０μｔを用いて検量線を作成した。（第
４図）」と補正する。 （１３１明細書４２頁９行目から同頁１１１行目かけて
記載の「インキュベートシ、・・・・・・検量線（第５
図）。」を［インキユベートシ、試薬盲検を対照として
、波長６４０　ｎｍの吸光度を測定した。次に上記測定
法に於てグルコース溶液１０μｔの代りに、種々の既知
濃度のグルコース溶液ｌＯμｔを用いて検量線を作成し
た。（第５図）」と補正する。 （４４）　明細書４３頁１行目から同頁３行目にかけて
記載の［血清の代りに・・・・・・検量線（第６図）。 」を「試薬盲検を対照として波長５５０　ｎｍの吸光度
を測定した。次に上記測定法に於て、血清１０μｔの代
りに種々の既知濃度の標準血清ｌ・０μｔを用いて検量
線を作成した。（第６図）」ど補正する。 （４５）明細書４３頁１３行目以降に記載の水溶性テト
ラゾリウム塩（Ｔｚ　）を以下の通り補正する。 ０　（Ｃｒ１２　ＣＩ（２０）　ｎ　１−ｉｎ＝１３．
２　Ｊ （４６）明細書４４頁１３行目から同頁１４４行目かけ
て記載の「テトラゾリウム塩４ｍ７Ｊを［テトラゾリウ
ム塩（Ｐ−３）溶液４ｍ１Ｊと補正する。 （４７）明細書４４頁１５行目に記載のｒ　（５ｍＭ）
Ｊを「（最終濃度５ｍＭ）Ｊと補正する。 （４８）明細書４４頁１７行目から同頁１８８行目かけ
て記載の［アスコルビン酸２．５　ｍｔ（０，２５ｍＭ
　）　Ｊを「アスコルビン酸溶液２．５ｍｔ（最終濃度
０．２５ｍＭ）Ｊと補正する。 （４９）明細書４４頁２０行目に記載のｒ５０ｍｔ一定
容としたのち、」を［全容量を５０ｍ７としたのち、」
と補正する。 （５０）明細書４５頁２行目から同頁３行目にかけて記
載の「吸光度を測定する。＠量線を第７図に示す。」を
「吸光度を測定した。次に上記測定法に於て、ＣＬＩ２
＋イオンを含む試料溶液の代りに、種２＋ 々の既知濃度のＣｕ　イオンを含む溶液を用いて検量線
を作成した。Ｃ第７図）」と補正する。 （５１）明細書４５頁１８行目から同頁１９行目にかけ
て記載の「５０ｍｔ一定容としたものを試料として、」
を「全容量を５０ｍ７としたのち、」と補正する。 （５２）明細書４６頁１４行目に記載の［還元生成物給
「還元成績体」と補正する。 （５３）明細書４７頁１７行目から同頁１８行目にかけ
て記載の［テトラゾリウム塩３ｍｔＪを「テトラゾリウ
ム塩（Ｐ−１０）溶１３ｍｔＪと補正する。 （５４）明細書４７頁１９行目に記載のｒ　（１０ｍＭ
）　Ｊを［（最終濃度１．０ｍＭ）」と補正する。 （５５）明細書４８頁１行目に記載のｒ　（０，５ｍＭ
）　」を「（最終濃度０．５ｍＭ）Ｊと補正する。 （５６）明細書４８頁３行目から同頁５竹目にかけて記
載の「蒸留水で・・・・・・吸光度を測定する。」を［
蒸留水で全容量を２５ｍｔとし、３０分間放置し。 試薬ブランクを対照として、波長６７６　ｎｍの吸光度
を測定した。次に上記測定法に於て、Ｚｎ２＋溶液の代
りに種々の既知濃度のＺｎ２→ンオンを含む溶液を用い
て検量線を作成した。（第８図）」と補正する。 （５７）明細書４８頁１４行目に記載の「ジンコン法と
の定量条件を」を「ジンコン法とを」と補正する。 （５８）明細書４９頁１６行目に記載の「還元生成物」
を「還元成績体」と補正する。 （５９〕明細書５０頁１９行目から同頁２０行目にかけ
て記載の「実施例２２と同様にして、・・・・・・Ｐ−
１０の検量線（第８図）。」を「実施例２２と同様にし
て、Ｐ−１０を用いＮｉ２＋イオンを定量することがで
きる。又、同様に、Ｐ−１０を用いＺｎ２＋イオン、Ｃ
ｕ　イオン、ＣＯイオンヲ定量することができる。この
時のＮｉ　イオン、Ｚｎ２＋イオン、Ｃｕ＋イオン、又
ＣＯ２＋イオンの検量線を第８図に示し、表１１に各金
属イオンの極大吸収波長（λｍａｘ）とモル吸光係数（
ε）を示す。 表　１１ 一□■ と補正する。 （６０）明細書５１頁３行目から同頁５行目にかけて記
載のｒ２−（４−ニトロフェニル）−３，５ル）−３，
５−ビス（ｍ−スルホプロポキシ〕−２Ｈ−テトラゾリ
ウムナトリウム（ＰＮＴ　）　Ｊと補正する。 （６１）明細書５１頁１０行目から同頁１１行目に−１
７−−一＋ かけて記載の［Ｐ−１，ｓ（化合物（Ａ））を用いてＮ
Ａ、ＤＨを測定する場合゛の、」を丁Ｐ、−１５（化合
物（Ａ））を用いてＮＩ２＋イオン共存のもとＮＡＤＩ
（を測定する場合の、」と補正する。 （６２）明細書５１頁１２行目から同頁１５行目にかけ
て記載の「第３図は、Ｎｉ２＋イオン共存のもと、」を
「第３図は、Ｐ−１５（化合物（Ａ））を用いてＮｉ２
＋イオン共存のもと、」と補正する。 （６３）昭和５９年２月２８日付提出の手続補正書によ
り′・補″正、し−だ。明細書５２頁１行目から同頁２
行目にかけて記載の「第８図は、Ｚｎ　、　Ｎｉ　、　
Ｃｕ　。 Ｃｏの検量線を示したものである。ｋ「第８図は、Ｚｎ
２＋イオン、Ｎｉ２＋イオン、Ｃｕ＋イオン、ＣＯ２＋
イオンの検量線を示したものである。」と補正する。 以上 １８− 別　紙 ２、特許請求の範囲 （１）一般式 ％式％ Ｒ５は水素又は低級アルキル、更にＨ４，Ｒ５で芳香は
水素又はカルボキシル基、Ｒ′は水素、ニトロ、又は異
なる低級アルキル、且つそのアルキルは水酸基を置換し
てもっていてもよい〕）を、Ｒはポリエチレングリコー
ル残基を、Ｘはハロゲンヲ表わす。）で示される新規水
溶性テトラゾリウム化合物。 （２）　ポリエチレングリコールの平均分子量が４００
乃至１０００である。特許請求の範囲第１項記載の新規
水溶性テトラゾリウム化合物。 （３）一般式 ％式％ Ｒ′′は水素又は低級アルキル、更にＨ４，Ｈ６で芳香
環を形成してもよい）を　Ｂｅは 〔Ｒ８，Ｒ９は同−又は異なる低級アルキル、且つその
アルキルは水酸基を置換してもっていてもよい〕）ヲＲ
８ハポリエチレングリコール残基を、Ｘはハロゲンを表
わす。）で示される水溶性テトラシリの定量方法。 （４）　還元性物質が還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡ、ＤＨ）またはＭ元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド燐酸（ＮＡＤＰＨ）（５）　
還元性物質がスーパーオキサイドイオンで定量方法。 　３− Ｒ’−Ｎ−Ｎ−Ｒ２ Ｒ６は水素又は低級アルキル、更にＲ’、Ｒ’で芳香環
素又はカルボキシル基　Ｒ７は水素、二）ｏ、シフなる
低級アルキル、且つそのアルキルは水酸基なＮ換しても
っていてもよい〕）を、Ｈａはポリエチレングリコール
残基を、Ｘはハロゲンを表わす。〕で示される水溶性テ
トラゾリウム化合物に金属イ−　４− オンを共存させるか又は、該テトラゾリウム化合を添加
して、該テトラゾリウム化合物から得られる還元成績体
である水溶性ホルマザンを、該金属（８）　’ｒＭ　元
性物質が還元型ニコチンアミドアデニンジツケレオチド
（ＮＡＤＩ（）または還元型ニコチンアミドアダニ／ジ
ヌクレオチド燐酸（ＮＡＤＰＨ）である、特許請求の範
囲第７項記載の還元性物質の定量方法。 （９）　Ｍ元性物質がスーパーオキサイドイオンである
、特許請求の範囲第７項記載の還元性物質の定量方法。 Ｒ’−Ｎ−Ｎ−Ｒ’ 水素又はカルボキシル基　Ｒ７は水素、ニトロ、シ８ アメ、ハロゲン又は−Ｎ′〔Ｒ８，Ｒ”は同−又ｋま＼
Ｒ９ 異なる低級アルキル、且つそのア７レキルレマ水酸基を
置換してもっていてもよい〕）を、Ｒ１は７ｊｚ　ＩＪ
エチレングリコール残基を、Ｘはハロゲンを表わす。）
で示される水溶性テトラゾリウム化合物を、それを還元
する反応系におき、得られる水溶性ホルマザンを以て、
該反応系に溶存する金属イオンと有色のキレート化合物
を作らせ、その呈色を測定することを特徴とする金属の
比色定量法。 （１２）金属イオンがＣｕ＋イオンである、特許請求の
範囲第１１項記載の金属の比色定量法。 （１，３）　金属イオンがＺｎ２＋イオン又はＮｉ２＋
イオンである、特許請求の範囲第１１項記載の金属の比
色定量法。 以上 　７−

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 ％式％ は水素又はカルボキシル基、Ｒ７け水素、ニトロ、又は
   異なる低級アルキル、且つそのアルキルは水酸基を置換
   してもっていてもよい〕）を、Ｒ３けポリエチレングリ
   コール残基を、Ｘはハロゲンを表わす。）で示される新
   規水溶性テトラゾリウム化合物。
2. （２）ポリエチレングリコールの平均分子量が４００乃
   至１０００である、特許請求の範囲第１項記載の新規水
   溶性テトラゾリウム化合物。
3. （３）一般式 ％式％ Ｒ５は水素又は低級アルキル、更にＲ４，Ｒ５で芳香は
   水素又はカルボキシル基、Ｒ７け水素、ニトロ、又は異
   なる低級アルキル、且つそのアルキルは水酸基を置換し
   てもっていてもよい〕）をＲ３はポリエチレングリコー
   ル残基を、Ｘけハロゲンを表わす。）で示される水溶性
   テトラゾリウム化合物を、酵素反応系に共存させて、還
   元体である水溶性ホルマザンを得、その呈色を測定する
   ことを特徴とする臨床化学分析定量方法。
4. （４）酵素反応系が還元性物質を生成する系である特許
   請求の範囲第３項記載の臨床化学分析定量方法。
5. （５）還元性物質が還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
   クレオチド（ＮＡＤＨ）？たけ還元型ニコチンアミドア
   デニンジヌクレオチド燐酸（ＮＡＤＰＨ）である、特許
   請求の範囲第４項記載の臨床化学分析定量方法。
6. （６）還元性物質がスーパーオキサイドイオンである、
   特許請求の範囲第４項記載の臨床化学分析定量方法。
7. （７）一般式 ％式％ は水素又はカルボキシル基　Ｒ７は水素、ニトロ、又は
   異なる低級アルギル、且つそのアルキルは水酸基を置換
   してもっていてもよい〕）を、Ｒ３はポリエチレングリ
   コール残基を、Ｘはハロゲンを表わす。）で示される水
   溶性テトラゾリウム化合物を用いることを特徴とする、
   水性溶液中の還元性物質の定量方法。
8. （８）還元性物質がスーパーオキサイドイオンである、
   特許請求の範囲第７項記載の臨床化学分析定量方法。
9. （９）還元性物質がアスコルビン酸である特許請求の範
   囲第７項記載の定量方法。 （１０一般式 Ｒ５は水素又は低級アルキル、更にＲ’、Ｒ５で芳香６ は水素又はカルボキシル基、Ｒ７は水素、ニトロ、又は
   異なる低級アルキル、且つそのアルキルは水酸基を置換
   してもっていてもよい〕）を、Ｒ３はポリエチレングリ
   コール残基を、Ｘはハロゲンを表わす。）で示される水
   溶性テトラゾリウム化合物を、酵素反応系に金属イオン
   と共に共存させて、該テトラゾリウム化合物から得られ
   る還元体である水溶性ホルマザンを、該金属と有色のキ
   レ−１・化合物に変換、その呈色を測定することを特徴
   とする臨床化学分析定量方法。 ０］）酵素反応系が還元性物質を生成する系である特許
   請求の範囲第１０項記載の臨床化学分析定量方法。 α埠還元性物質が還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
   レオチド（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ）−！たは還元型ニコチンア
   ミドアデニンジヌクレオチド燐酸（ＮＡＤＰＨ）である
   、特許請求の範囲第１１項記載の臨床化学分析定量方法
   。 α］還元性物質がスーパーオキサイドイオンである、特
   許請求の範囲第１１項記載の臨床化学分析定量方法。 ０４一般式 Ｒ−Ｎ−員−Ｒ２ １１１ρ け水素又はカルボキシル基、Ｒ７は水素、二）０、８ は異なる低級アルキル、且つそのアルキルは水酸基を置
   換してもっていてもよい〕）を、Ｒ３はポリエチレング
   リコール残基を、Ｘはハロゲンを表わす。）で示される
   水溶性テトラゾリウム化合物を金属イオンの共存下に用
   いることを特徴とする、水性溶液中の還元性物質の定量
   方法。 ０→還元性物質がスーパーオキサイドイオンである、特
   許請求の範囲第１４項記載の臨床化学分析定量方法。 Ｏ０還元性物質がアスコルビン酸である特許請求の範囲
   第１４項記載の定量方法。 （ｌ′ｆ）一般式 ％式％ Ｒ５は水素又は低級アルキル、更にＲ’、Ｒ５で芳香６ は水素又はカルボキシル基、Ｒ７は水素、ニトロ、又は
   異々る低級アルキル、且つそのアルキルは水酸基を置換
   してもっていてもよい〕）を、Ｒ３けポリエチレングリ
   コール残基を、Ｘけハロゲンを表わす。）で示される水
   溶性テトラゾリウム化合物を、それを還元する反応系に
   おき、得られる水溶性ホルマザンを以て、該反応系に溶
   存する金属イオンと有色のキレート化合物を作らせ、そ
   の呈色を測定することを特徴とする金属の比色定量法。 θ枠金域イオンがＣ１１＋イオンである、特許請求の範
   囲第１７項記載の金属の比色定量法。 （１，４Ｊｌ金属イオンがＺｎ２＋イオン又はＮｉ２＋
   イオンである、特許請求の範囲第１７項記載の金属の比
   色定量法。