JPH0368868B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な水溶性テトラゾリウム化合物
及びこれを用いる定量方法に関する。 詳記すれば、テトラゾール環に置換するフエニ
ル基の１つにポリエチレングリコール残基を与え
ることにより、該テトラゾリウム化合物を水溶性
にすると共に、その還元成績体であるホルマザン
をも水に易溶とする新規な水溶性テトラゾリウム
化合物、及びこれを用いる定量方法に関する。 テトラゾリウム化合物は、還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（NADH）、又は還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸
（NADPH）の水素受容体として機能するとか、
スーパーオキサイドイオンやアスコルビン酸によ
つて還元され、夫々の結果として定量的に生成す
るホルマザンの量に比例する発色の程度を、吸
光々度測定法で測定することによつて、NADH、
NADPH又はスーパーオキサイドイオン、アス
コルビン酸などの還元性物質の量を測定すること
ができる。従つて周知の通り、脱水素酵素の活性
度の測定、それによる基質の定量、更にスーパー
オキサイドイオンを生成する酸化酵素の作用対象
である基質の定量、即ち生体々液成分とか食品中
の添加物などの定量に極めて有用である。 これらの原理を、乳酸脱水素酵素（LDH）の
活性度の測定の場合に例をとつて示せば、 であり、これらの反応は定量的且つ特異的に進行
するから、生成するホルマザンの色濃度を定量す
ることによつて、LDHの活性度の測定すること
ができる。また脱水素酵素を使用した生体々液成
分の測定を、コレステロールの測定について示せ
ば、 であり、同様にコレステロールの量を測定するこ
とができる。次にスーパーオキサイドイオンの測
定によつて、コレステロールを定量する場合につ
いて説明すれば、 であり、同様にしてコレステロールを定量するこ
とができる。この式に於てＸはハロゲンを示す。 かかる方法の為に、従来提供されているテトラ
ゾリウム化合物としては、３−（ｐ−ヨウ化フエ
ニル）−２−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニ
ル−2H−テトラゾリウム塩（INT）、３−（４，
５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフ
エニル−2H−テトラゾリウム塩（MTT）、３，
3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ジフエニレ
ン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フ
エニル−2H−テトラゾリウム塩〕（NO₂−TB）、
３，3′−（４，4′−ジフエニレン）−ビス（２，５
−ジフエニル−2H−テトラゾリウム塩）（NeO
−TB）などがあるが、何れも水に難溶であり、
又それらから生成するホルマザンも夫々更に難溶
である。従つてその使用に際しては、有機溶剤を
併用するのであるが、測定上も環境的にも好まし
くなく、更に敢て低濃度の水溶液として使用する
場合でも、ホルマザンが析出沈澱して測定精度を
著しく損ねると共に、測定機器を汚染し、自動分
析機の使用を制限、テトラゾリウム化合物による
測定が望ましい場合でも、漸次他の方法への移行
が強いられているのが実状である。 これに対し、テトラゾリウム化合物及びホルマ
ザンを水溶性にする試みは既に散見される。テト
ラゾール環に置換するフエニル基に、直接スルホ
ン酸基とかカルボン酸基を、又四級アンモニウム
塩を含む側鎖を導入する試みがそれであり、日特
公昭56−38154、日特開昭56−61366、日特開昭56
−61367、日本薬学会102年会講演要旨集341頁
4K2−４等に示されている。 しかしこれら水可溶化の目的でフエニル基に直
接導入された酸基の為に、実際の測定で不可欠な
酵素機能が発揮される至適PH域内に於ては、これ
ら提案のテトラゾリウム化合物は、水素を受容し
てホルマザンを生成しないので、臨床検査等の実
用には供し難く、又四級アンモニウム塩導入化合
物は水溶性不十分である。 本発明者らの一部は、かかる問題を解決する
為、テトラゾリウム化合物及びその還元成績体
であるホルマザンが水に易溶であること、酸化
還元電位が低く、至適PH域に於て電子伝達剤の存
在下NAD若しくはNADPHによつて、又はスー
パーオキサイドイオンによつて、発色するホルマ
ザンを生成するテトラゾリウム化合物であるこ
と、及び分析機器の薬液等の経路を染色汚染せ
ず、生成ホルマザンも同様であるテトラゾリウム
化合物であることを、全て満足するよう、鋭意研
究の結果、下記一般式 （R¹は少なくとも１つはニトロ基、ニトロ基
でないものは水素、R²は水素、低級アルキル基、
低級アルコキシ基又はハロゲン、R³は水素又は
OR⁴，R⁴はスルホン酸基若しくはその塩又は
（及び）カルボン酸基若しくはその塩の１個以上
を置換してもち、且つ水酸基を置換してもつ又は
もたない、炭素数１〜４個の脂肪族炭化水素（直
鎖又は側鎖をもつもの）を表わし、R³に含まれ
るスルホン酸基（若しくはその塩）又はカルボン
酸基（若しくはその塩）は、全体で２個以上であ
つて、その内の１個はテトラゾール環と分子内塩
を成している。）で示される、水溶性テトラゾリ
ウム化合物を創製し、該水溶性テトラゾリウム化
合物がそのような要求〜を全て満足する化合
物であること、及びそのような２，３，５−トリ
フエニル−2H−テトラゾリウム化合物のフエニ
ル基に連結基を介して水溶性基を適宜与えられた
テトラゾリウム化合物は、従来のテトラゾリウム
化合物による水性溶液発色を画期的に改善するも
のであることを明らかにし、先に、特許出願して
いる。（特願昭57−217427） 先の出願に於けるテトラゾリウム化合物は、フ
エニル基に連結基を介して水溶性基が導入されて
いるもので、従来の可溶化されたテトラゾリウム
塩のもつ問題点を全て解決した著しく効果的且つ
有用なものではあるが、難を云えば、その導入さ
れた水溶性期がスルホン酸基のような酸基である
ため、これ等酸基に起因して、NADH又は
NADPH、若しくはスーパーオキサイドイオン
によつて生成するホルマザンの検量線の極低濃度
部分に於てランバルト・ベヤーの法則に従わない
部分が存することが時として見受けられる点であ
る。（第１図参照） 今回本発明者等は、そのようなおそれの全くな
い水溶性基として、ポリエチレングリコール残基
を着想、選定し鋭意研究の結果、そのようなポリ
エチレングリコール残基をテトラゾリウム化合物
に導入させることにより、先の出願に於ける水溶
性テトラゾリウム化合物のもつ顕著な効果を全て
有し、なお且つ、検量線の直線性に於て優れた結
果が得られる新規水溶性テトラゾリウム化合物を
提供する本発明を完成するに到つた。 本発明化合物は、一般式 （式中R¹はニトロフエニル又は

【式】 （R⁴，R⁵は水素又は低級アルキル、更にR⁴，R⁵
で芳香環を形成してもよい）を、R²は

【式】（R⁶は水素、又はカルボキシル 基、R⁷は水素、ニトロ、シアノ、ハロゲン又は

【式】〔R⁸，R⁹は同一又は異なる低級アル キル、且つそのアルキルは水酸基を置換してもつ
ていてもよい〕）を、R³はポリエチレングリコー
ル残基を、Ｘはハロゲンを表わす。）で示される
新規水溶性テトラゾリウム化合物である。 本発明化合物は自体公知の方法を駆使して製造
できる。即ち例えば、ｐ−ニトロフエニルヒドラ
ジンと、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドとポリ
エチレングリコールモノクロロエチルエーテルと
を反応させて得られるｐ−ヒドロキシ・ポリ（オ
キシ−１，２−エタンジイル）ベンズアルデヒド
とを反応させて相当するｐ−ニトロフエニルヒド
ラゾン化合物とし、次いでＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ
−フエニレンジアミンをジアゾ化した溶液を反応
させ、得られたホルマザンを酸化して２−（ｐ−
ニトロフエニル）−３−｛ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチル
アミノ）フエニル｝−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）｝フエニル〕
−2H−テトラゾリウム塩（(4)）なる本発明化合
物を得る。又例えば、２−ベンゾチアゾリルヒド
ラジンとｐ−ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）ベンズアルデヒドとを反応させ
て相当する２−ベンゾチアゾリルヒドラゾン化合
物とし、次いでアントラニル酸をジアゾ化した溶
液を反応させ、得られたホルマザンを酸化して２
−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（ｏ−カルボキ
シフエニル）−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オ
キシ−１，２−エタンジイル）｝フエニル〕−2H
−テトラゾリウム塩（ポリエチレングリコール残
基の平均分子量が600の化合物）（（15））なる本発
明化合物を得る。 同様にして得られる化合物の例を例挙すると次
のとおりである。 (1) ２，３−ビス（ｐ−ニトロフエニル）−５−
〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エ
タンジイル）｝フエニル〕−2H−テトラゾリウ
ム塩 (2) ２−（ｐ−ニトロフエニル）−３−フエニル−
５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２
−エタンジイル）｝フエニル〕−2H−テトラゾ
リウム塩 (3) ２−（ｐ−ニトロフエニル）−３−｛ｐ−（Ｎ−
エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノ｝
フエニル−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オキ
シ−１，２−エタンジイル）｝フエニル〕−2H
−テトラゾリウム塩 (5) ２−（ｐ−ニトロフエニル）−３−（ｐ−フル
オロフエニル）−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）｝フエニル〕
−2H−テトラゾリウム塩 (6) ２−（ｐ−ニトロフエニル）−３−（ｐ−シア
ノフエニル）−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）｝フエニル−
2H−テトラゾリウム塩 (7) ２−（２−チアゾリル）−３−フエニル−５−
〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エ
タンジイル）｝フエニル〕−2H−テトラゾリウ
ム塩 (8) ２−（４−メチル−２−チアゾリル）−３−フ
エニル−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）｝フエニル〕−2H−
テトラゾリウム塩 (9) ２−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−
３−フエニル−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ
（オキシ−１，２−エタンジイル）｝フエニル〕
−2H−テトラゾリウム塩 (10) ２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−フエニル
−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，
２−エタンジイル）｝フエニル〕−2H−テトラ
ゾリウム塩 (11) ２−（５−ニトロ−２−チアゾリル）−３−フ
エニル−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オキシ
−１，２−エタンジイル）｝フエニル〕−2H−
テトラゾリウム塩 (12) ２−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル−
３−（ｐ−ニトロフエニル）−５−〔Ｐ−｛ヒドロ
キシ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）｝
フエニル〕−2H−テトラゾリウム塩 (13) ２−（２−チアゾリル）−３−（Ｐ−ニトロ
フエニル）−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オ
キシ−１，２−エタンジイル）｝フエニル〕−
2H−テトラゾリウム塩 (14) ２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（ｐ−
ニトロフエニル）−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）｝フエニ
ル〕−2H−テトラゾリウム塩 (16) ２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（ｏ−
カルボキシフエニル）−５−〔ｐ−｛ヒドロキ
シ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）｝
フエニル〕−2H−テトラゾリウム塩（ポリエチ
レングリコール残基の平均分子量400の化合物） (17) ２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（ｏ−
カルボキシフエニル）−５−〔ｐ−｛ヒドロキ
シ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）｝
フエニル−2H−テトラゾリウム塩（ポリエチ
レングリコール残基の平均分子量が1000の化合
物） (18) ２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（ｏ−
カルボキシ−ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）
フエニル｝−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オ
キシ−１，２−エタンジイル）｝フエニル〕−
2H−テトラゾリウム塩 これら本発明化合物が前記〜の３つの目標
に適う化学式上の特徴は、一般式のR¹がニトロ
フエニル又は

【式】（R⁴，R⁵は水素又 は低級アルキル、更にR⁴，R⁵で芳香環を形成し
てもよい）であること、R²が

【式】 （R⁶は水素又はカルボキシル基、R⁷は水素、ニト
ロ、シアノ、ハロゲン又は

【式】〔R⁸，R⁹ は同一又は異なる低級アルキル、且つそのアルキ
ルは水酸基を置換してもつていてもよい〕）であ
ること、特にR³に水溶性基であるポリエチレン
グリコール残基−Ｏ−（CH₂CH₂O）−_oＨ又は−（
OCH₂CH₂）−_oOHがあつてフエニル基に置換され
ているところにある。 なお、R⁴，R⁵，R⁸，R⁹の低級アルキルは、メ
チル、エチル、プロピル、ブチル等であり、ポリ
エチレングリコール残基の繰り返し単位ｎの数に
関しては、水溶性の点から平均分子量約400乃至
1000に相当するｎ≒８〜23のもの特にｎ≒13のも
のが好ましい。 本発明化合物は、酵素反応系に共存させて用い
る場合、前述の通り、本発明化合物自体の特徴的
性質から特に有意義であり、これを酵素反応系に
共存させて、還元体である水溶性ホルマザンを
得、その呈色を測定する臨床化学分析の代表的定
量方法である、水性溶液中還元性物質を測定する
方法を、従来のテトラゾリウム化合物と比較し乍
ら実験例により示す。 実験例 １ (1) 比較するテトラゾリウム化合物 (A) 本発明化合物の１つであるＰ−15（化合物(A)） (B) 従来のものの１つであるINT (C) 従来提案の水溶性テトラゾリウム化合物の１
つである２，５−ジ（ｐ−スルホフエニル）−
３−フエニル−2H−テトラゾリウム＝カリウ
ム (D) 同じく２−（ｐ−ニトロフエニル）−３−（ｐ
−ヨウ化フエニル）−５−（ｏ−スルホフエニ
ル）−2H−テトラゾリウムクロリド（日特公昭
56−38154実施例参照） (2) NADHの測定 トリトンＸ−100を0.4％含有する0.1Mトリス
燐酸緩衝液（PH6.0〜PH9.0に調整）100mlずつに
前記４種のテトラゾリウム化合物各2.5mmol及び
電子伝達剤の１−メトキシフエナジンメトサルフ
エート（MeO−PMS）10mg、を添加、それら溶
液4.0mlずつにNADH1.6mM溶液0.1mlを加え、37
℃で２分間加温後、溶解性と発色の状況を観察し
た。 (3) 結果

【表】 これより明らかな通り、水溶性基をもたない(B)
は、中性付近でNADHの水素受容体となり得る
が、実用的には価値が低く、水溶性基がフエニル
基に直接置換している(C)及び(D)は、中性近辺では
発色がなく、加えて(D)は不溶性である。これに対
して本発明化合物の１つである化合物(A)（ｐ−
15）は、それ自身も、生成ホルマザンも十分に水
に易溶性であり、中性近辺で好都合にNADHの
水素受容体となり、ホルマザンの呈色も良好であ
る。 周知の通り体液中の微量成分や酵素の活性度を
分光々度法によつて測定する場合に該体液試料中
に存するビリルビン等の着色物質の存在が、波長
500nm近傍の吸収スペクトルに少なからぬ影響を
与えて、測定値に誤差が生ずるので、ホルマザン
の発色が500nm近辺にある場合、金属イオンの共
存によつて呈色の波長が長波長側へシフトするこ
とは、極めて好ましいことである。次に金属イオ
ンの使用効果を示す。 実施例 ２ トリトンＸ−100を0.4％含有する0.1Mトリス
燐酸緩衝液（PH8.5）100mlに、本発明の化合物(A)
（ｐ−15）1.0mmolとMeO−PMS12μmol，Ni²⁺
イオン1mmolを溶解、その溶液5.0mlをとる。一
方、Ni²⁺イオンを含有しない同緩衝液を用い、
同様処方のものを作りその5.0mlをとる。両液に
NADH5mM溶液50μlずつを加え、37℃で10分間
加温した後その吸光度を測定する。結果は表２の
通り、呈色波長を約110nm長波長側へシフトする
効果を与える。Cu²⁺イオン（その併用は、呈色
を約100nm長波長側へシフトする。）のようなそ
の他の金属イオンも、Ni²⁺イオンと同様、呈色
波長を約100〜130nm長波長側へシフトする効果
を与える。

【表】 次に実験例２の測定法（Ni²⁺イオンを含む）
において、NADHの１，２，３，４、及び5mM
溶液を50μlずつ加え、同様の操作によつて検量線
を得る。（第２図） また次に本発明化合物によるキレート化合物の
呈色のPH依存の様子を、NADH測定を例にとつ
て示す。 実験例 ３ トリトンＸ−100の0.4％を含有する0.1Mトリ
ス燐酸緩衝液（PHを6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，
8.5，9.0に調整）100mlに、本発明の化合物(A)
（Ｐ−15）1.0mmol，Ni²⁺1mmol及びMeO−
PMS12μmolを各々添加、それら溶液5.0mlずつを
とつて、各々にNADHの5mM溶液50μlずつを加
え、37℃で10分間加温してから波長640nmの吸光
度を測定する。その結果をプロツトすれば第３図
を得る。即ち発色の至適PHは広く、中性付近に於
て十分であり、本発明方法は、目的とする測定分
野の酵素活性至適PHと十分一致する。 このようにテトラゾール環に置換するフエニル
基に、本発明の水溶性基を与えることにより、従
来のテトラゾリウムによる水性溶液発色を画期的
に改善した本発明は、斯業に裨益する処絶大であ
る。 又、このように、本発明化合物から得られる還
元体である水溶性ホルマザンは、Ni²⁺イオンの
ような種々の金属イオンと約100nm、又はそれ以
上の長波長側にシフトした極大吸収波長を有する
キレート化合物を生成するので、体液中の微量成
分や酵素の活性度を測定する場合に、本発明化合
物を酵素反応系に共存させ、還元成績体である水
溶性ホルマザンを生成させる系に於て、金属イオ
ンを予め、又は該ホルマザンが生成した後に添加
し、該ホルマザンが該金属とキレート化合物に変
換して示す呈色を測定することによつて有利に目
的を達することが出来る。 さらに、本発明化合物から得られる還元体であ
る水溶性ホルマザンは、Cu⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，
Co²⁺，Cd²⁺のような金属イオンとも定量的にキ
レート化合物を生成するので、本発明化合物を、
それを還元する反応系におき、得られる水溶性ホ
ルマザンを以て、該反応系に溶存する金属イオン
と有色のキレート化合物から作らせ、その呈色を
測定することにより該金属を定量的に比色定量す
ることもできる。 以下に実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、これら実施例は本発明を限定するものではな
い。 実施例 １ (1) ポリエチレングリコール モノクロロエチル
エーテル ポリエチレングリコール600 3060ｇとピリジン
20ｇを混合、加温して溶解し、塩化チオニル
910ｇを55〜60℃に加温しながら滴下した後、更
に70〜75℃で２時間反応させる。 次に苛性ソーダ水溶液で中和した後、クロロホ
ルムで抽出し、クロロホルムを減圧留去すること
により、ポリエチレングリコール モノクロロエ
チルエーテル（黄色透明油分） 2520ｇが得られ
た。 (2) ｐ−ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エ
タンジイル）ベンズアルデヒド ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド 183ｇをメ
タノール １に溶解、ナトリウムメチラートを
28％溶解したメタノール液 435ｇを添加混合し
た後、メタノールを減圧留去する。この濃縮残留
物をジメチルスルフオキシド １に加温溶解、
還流しながらポリエチレングリコール モノクロ
ロエチルエーテル 2300ｇを滴下、更に３時間還
流反応させた後、苛性ソーダ水溶液を加え溶解
し、クロロホルムで抽出、クロロホルムを減圧留
去することにより、赤色透明油分 1970ｇを得、
次に、この油分を、カラムクロマトグラフイー
（Wakogel Ｃ−200、酢酸エチル：メタノー
ル（９：１））により精製し、ｐ−ヒドロキシ・
ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ベンズア
ルデヒド（橙色透明油分）1090ｇを得た。 (3) ｐ−ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，2.エタ
ンジイル）ベンズアルデヒド−ｐ−ニトロフエニ
ルヒドラゾン ｐ−ニトロフエニルヒドラジン 61ｇとｐ−ヒ
ドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）ベンズアルデヒド 282ｇをメタノール 300
mlに溶解、還流下３時間反応させた後、メタノー
ルを減圧留去することにより、赤色透明油分
345ｇを得、次に、この油分を、カラムクロマト
グラフイー（WakogelＲ○Ｃ−200、酢酸エチル：
メタノール（９：１）により精製し、ｐ−ヒドロ
キシ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ベ
ンズアルデヒド−ｐ−ニトロフエニルヒドラゾン
280ｇを得た。 (4) ２−（ｐ−ニトロフエニル）−３−｛ｐ−（Ｎ，
Ｎ−ジエチルアミノ）フエニル｝−５−〔ｐ−｛ヒ
ドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイ
ル）｝フエニル〕−2H−テトラゾリウム クロラ
イド（ｐ−４）硫酸Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−フエ
ニレンジアミン2.6ｇを濃硫酸1.1ｇ、水６mlに溶
解した溶液に、亜硝酸ナトリウム 0.76ｇを水３
mlに溶解して５℃以下に冷却した溶液を、５℃以
下に冷却下撹拌しながら加えて、ジアゾニウム塩
溶液を得る。このようにして得られたジアゾニウ
ム塩溶液を、ｐ−ヒドロキシ・ポリ（オキシ−
１，２−エタンジイル）ベンズアルデヒド−ｐ−
ニトロフエニルヒドラゾン 8.4ｇを苛性ソーダ
2.0ｇと共に水50mlに溶解した溶液に、５℃以
下に冷却下撹拌しながら滴下する。滴下後、５℃
以下で更に30分間反応させた後、水300ml、アセ
トン100ml、酢酸エチル300mlを加え反応液を溶
解、分液してホルマザン体を含む酢酸エチル層を
得る。なお、酢酸エチル層には、黒紫色油分のホ
ルマザン体５ｇが含まれる。 この酢酸エチル液に氷酢酸５mlを添加後、室温
下撹拌しながら次亜塩素酸第三級ブチル 2.7ml
を加え、更に２時間反応させた後、水及びアセト
ンを加え、分液した水層を減圧濃縮することによ
り、赤褐色油分3.2ｇを得、この赤褐色油分を、
カラムクロマトグラフイー（逆相シリカゲルクロ
マトグラフイー、メタノール：酢酸：水（80：
２：18））により精製し、２−（ｐ−ニトロフエニ
ル）−３−｛ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フエ
ニル｝−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オキシ−
１，２−エタンジイル）｝フエニル〕−2H−テト
ラゾリウム クロライド 1.5ｇを得た。含量96
％ 実施例 ２ (1) ｐ−ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エ
タンジイル）ベンズアルデヒド−２−ベンゾチア
ゾルヒドラゾン ２−ヒドラジノベンゾチアゾール（２−ベンゾ
チアゾリルヒドラジン） 24ｇとｐ−ヒドロキ
シ・ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ベン
ズアルデヒド 102ｇをメタノール300mlに溶解、
還流下３時間反応させた後、メタノールを減圧留
去し、残留物をクロロホルムに溶解、引き続き、
塩酸水溶液でクロロホルム液を洗浄した後、クロ
ロホルムを減圧留去して、褐色透明油分106ｇを
得、次に、この油分を、カラムクロマトグラフイ
ー（WakogelＣ−200、酢酸エチル：メタノー
ル（９：１））により精製し、ｐ−ヒドロキシ・
ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ベンズア
ルデヒド−２−ベンゾチアゾリルヒドラゾン 90
ｇを得た。 (2) ２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（ｏ−カ
ルボキシフエニル）−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポ
リ（オキシ−１，２−エタンジイル）｝フエニル〕
−2H−テトラゾリウム クロライド （ｐ−15） アントラニル酸 8.2ｇを濃塩酸15ml、水120ml
を溶解した溶液に、亜硝酸ナトリウム4.1ｇを水
40mlに溶解して５℃以下に冷却した溶液を、５℃
以下に冷却下撹拌しながら加え、更に10℃で10分
間反応させ、ジアゾニウム塩溶液を得る。 このようにして得られたジアゾニウム塩溶液
を、ｐ−ヒドロキシ・ポリ（オキシ−１，２−エ
タンジイル）ベンズアルデヒド−２−ベンゾチア
ゾリルヒドラゾン 51ｇをアセトン300ml、水200
mlに溶解した溶液に、５℃以下に冷却下PH13に保
ちながら、５％苛性ソーダ液と同時に滴下する。
更に５℃以下で３時間反応後氷酢酸12mlを加えた
水１を注入し反応液を溶解、酢酸エチル1.2
を加え分液した酢酸エチル層を減圧濃縮して、ホ
ルマザン体（黒色油分）16ｇを得る。このホルマ
ザン体を酢酸エチル400ml、氷酢酸10mlに溶解し
た溶液に、次亜塩素酸第三級ブチル 5.2ｇを酢
酸エチル100mlに溶解した溶液を、５℃以下に冷
却下撹拌しながら滴下、更に2.5時間反応させる。
反応後、酢酸エチル、アセトン、水を反応液に加
え溶解、分液した水層を減圧濃縮することによ
り、赤褐色油分（一部褐色結晶を含む）5.6ｇを
得、この油分を、カラムクロマトグラフイー（逆
相シリカゲルクロマトグラフイー、メタノール：
酢酸：水（80：２：18））により製精し、２−（２
−ベンゾチアゾリル）−３−（ｏ−カルボキシフエ
ニル）−５−〔ｐ−｛ヒドロキシ・ポリ（オキシ−
１，２−エタンジイル｝フエニル〕−2H−テトラ
ゾリウム クロライド（赤褐色油分（一部褐色結
晶を含む））2.5ｇを得た。含量98％。 実施例 ３〜17 実施例１又は２と同様にして得られた本発明化
合物の物性及び該テトラゾリウム化合物の還元成
績体であるホルマザンの極大吸収波長（λ^nm _nax）
を、表３〜５に示す。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 実施例18 LDH活性の測定 定 量 乳酸ナトリウム0.1M、NAD⁺10mM、Ｐ−15
1mM、Nicl₂5mM、MeO−PMS 12μMを、トリ
トンＸ−100を0.4％含有するPH8.5の0.1Mトリス
緩衝液に溶解して調整した発色試液１mlをとり、
37℃に於て、血清50μlを加え、同温度で20分間イ
ンキユベート後、ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）10mMトリトンＸ−100を0.4％含有する
PH8.5の0.1Mトリス緩衝液に溶解して調整した停
止液２mlを加え、試薬盲検を対照として波長
640nmの吸光度を測定した。次に上記測定法に於
て血清50μlの代りに種々の既知濃度の標準血清
50μlを用いて検量線を作成した。（第４図） 実施例19 グルコースの測定 酵素反応 β−Ｄ−グルコース＋NAD⁺→Ｄ−グルコノー
δ−ラクトン＋NADH₂ ⁺ グルコースデヒドロゲナーゼ 定 量 グルコースデヒドロゲナーゼ 10μ／ml、
NAD⁺10mM、Ｐ−15 1mM、Nicl₂5mM、MeO
−PMS 12μMを、トリトンＸ−100を0.4％含有
するPH7.0の0.1Mトリス緩衝液に溶解して調製し
た発色試液５mlに、グルコース溶液10μlを加え、
37℃、30分間インキユベートし、試薬盲検を対照
として、波長640nmの吸光度を測定した。次に上
記測定法に於てグルコース溶液10μlの代りに、
種々の既知濃度のグルコース溶液10μlを用いて検
量線を作成した。（第５図） 実施例20 血清総コレステロールの定量 血清10μlをとり、これにＰ−１ 0.05mM／dl、
フエノール0.05％、パーオキシダーゼ300U／dl、
グルタチオン（還元型）20mg／dl、コレステロー
ルエステルヒドラーゼ30U／dl、コレステロール
オキシダーゼ15U／dl、トリトンＸ−100 0.1％の
濃度になるように0.1Mトリス緩衝液（PH8.0）に
溶解して調製した発色試液３mlを加えて37℃の恒
温槽中10分間加温したのち、試薬盲検を対照とし
て波長550nmの吸光度を測定した。次に上記測定
法に於て、血清10μlの代りに種々の既知濃度の標
準血清10μlを用いて検量線を作成した。（第６図） 実施例21 銅の定量 原 理 Ｐ−１〜Ｐ−４のテトラゾリウム化合物の還元
成績体であるホルマザン体は、Cu⁺¹イオンと反
応し、組成比がモル比で１：１の錯体を形成する
ことを見出したので、このことを利用して、Cu⁺
イオン又はCu²⁺イオンを定量することができる。
至適PHは約９以上例えば９〜12近辺である。 水溶性テトラゾリウム塩（Tz）

【表】 定 量 50ml容メスフラスコに、1.9×10^-4Mテ
トラゾリウム塩（Ｐ−３）溶液４ml（最終濃度
15.2μM）をとり、0.05Mホウ酸塩緩衝溶液５ml
（最終濃度5mM）を加える。必要あれば、水酸化
ナトリウムでPH11に調整する。５×10^-3Mアスコ
ルビン酸2.5ml（最終濃度0.25mM）を添加してホ
ルマザン体を生成させたのち、Cu²⁺イオンを含
む試料溶液を加える。全容量を50mlとしたのち、
30分放置して発色させる。試薬ブランクを対照と
して676nm（Ｐ−３）に於ける吸光度を測定した。
次に上記測定法に於て、Cu²⁺イオンを含む試料
溶液の代りに、種々の既知濃度のCu²⁺イオンを
含む溶液を用いて検量線を作成した。（第７図）
検量線は、０〜0.65ppmの範囲で、原点を通る直
線となつた。 この結果を、広く知られているバソクプロイン
法（0.5〜3ppm、ε＝12000）と比較すると、本
法は高感度で精度よく、低濃度の銅を定量できる
利点を有している。 共存イオンの影響 0.33ppmのCu²⁺イオンに対して10ppmのFe³⁺イ
オン、Ni²⁺イオン、Cd²⁺イオン、Zn²⁺イオン、
Mn²⁺イオン、100ppmのCa²⁺イオン、Mg²⁺イオ
ンの共存は定量を妨害しない。 血清銅の定量 血清40mlに、4N−塩酸2.5mlを加え、80〜95℃
で５分間加熱したのち、50％トリクロロ酢酸4.0
mlを加え、遠心分離（2000r.p.m.で約15分間）
し、上清を分取し、全容量を50mlとしたのち、前
記定量法に従い、定量した。バソクプロイン法と
併せて、結果を表７に示す。 表 ７ 血清銅の定量 銅測定量（ppm） ｎ 本法 ジソクプロイン法 １ 0.44₅ 0.40₀ ２ 0.43₅ 0.43₄ ３ 0.46₃ 0.45₅ 表４の結果から、本法とジソクロプロイン法と
は良く一致していることが判る。 実施例22 亜鉛の定量 原 理 Ｐ−10，−15，−18のテトラゾリウム化合物の還
元成績体であるホルマザン体は、Zz²⁺イオンと反
応し、組成比がモル比で、Zn²⁺1に対し２の錯体
を形成することを見出したので、このことを利用
して、Zn²⁺イオンを定量することができる。 水溶性テトラゾリウム塩（Tz）

【表】

【表】 25ml容メスフラスコに、２×10^-4Mテトラゾリ
ウム塩（Ｐ−10）溶液３ml（最終濃度24μM）を
とり、0.05Mホウ酸塩緩衝溶液５ml（最終濃度
10mM）を加えて、PHを９とする。５×10^-3Mア
スコルビン酸2.5ml（最終濃度0.5mM）を添加し、
ホルマザンを生成させたのち、Zn²⁺溶液を加え
て、錯体を生成させる。蒸留水で全容量を25mlと
し、30分間放置し、試薬ブランクを対照として、
波長676nmの吸光度を測定した。次に上記測定法
に於て、Zn²⁺溶液の代りに種々の既知濃度の
Zn²⁺イオンを含む溶液を用いて検量線を作成し
た。（第８図） 検量線は、０〜0.65ppmの範囲で、原点を通る
直線となつた。0.52ppmに於ける５回の繰り返し
測定の相対標準偏差は1.2％。モル吸光係数は5.0
×10⁴、と高感度で精度よくZn²⁺イオンを定量す
ることができる。 ジンコン法との比較 Zn²⁺の定量法として実用化されている方法に
ジンコン法（JIS KO102−1971）がある。そこ
で、本法（Ｐ−10）とジンコン法とを比較した。
表９。

【表】

【表】 表９から判るように、本法は、ジンコン法と比
較して、感度、精度ともに優れており、また、測
定条件も容易であり、PH領域が広いことから、使
用しやすい利点がある。 実施例23 ニツケルの定量 原 理 Ｐ−10，−15，−17，−18のテトラゾリウム化合
物の還元成績体であるホルマザン体は、Ni²⁺イ
オンと反応し、組成比がモル比で、Ni²⁺1に対し
１又は２の錯体を形成することを見出したので、
このことを利用して、Ni²⁺イオンを定量するこ
とができる。 水溶性テトラゾリウム塩（Tz）

【表】 定 量 実施例22と同様にして、Ｐ−10を用いNi²⁺イ
オンを定量することができる。又、同様に、Ｐ−
10を用いZn²⁺イオン、Cu⁺イオン、Co²⁺イオンを
定量することができる。この時のNi²⁺イオン、
Zn²⁺イオン、Cu⁺イオン、又Co²⁺イオンの検量線
を第８図に示し、表11に各金属イオンの極大吸収
波長（λmax）とモル吸光係数（ε）を示す。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は、先の発明に於ける水溶性テトラゾリ
ウム塩の一つである２−（ｐ−ニトロフエニル）−
３，５−ビス（ｍ−スルホプロポキシ）−2H−テ
トラゾリウムナトリウム（PNT）を用いた場合
(a)と本発明に於ける水溶性テトラゾリウム塩の一
つであるＰ−15を用いた場合(b)の検量線の比較を
示し、(a)が低濃度部分に於て彎曲せずに直線であ
つた場合を特に破線で示してある。第２図は、Ｐ
−15（化合物(A)）を用いてNi²⁺イオン共存のもと
NADHを測定する場合の、検量線を示したもの
であり、第３図は、Ｐ−15（化合物(A)）を用いて
Ni²⁺イオン共存のもと、各種PHでNADHを測定
した場合の、生成ホルマザンの可視部の極大吸収
をプロツトして示したものである。第４図は
LDHの、第５図はグルコースの、第６図はコレ
ステロールの、検量線を示したものである。第７
図はCu⁺イオンの検量線を示したものである。第
８図は、Zn²⁺イオン、Ni²⁺イオン、Cu⁺イオン、
Co²⁺イオンの検量線を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中R¹はニトロフエニル又は【式】 （R⁴，R⁵は水素又は低級アルキル、更にR⁴，R⁵
   で芳香環を形成してもよい）を、R²は
   【式】（R⁶は水素又はカルボキシル 基、R⁷は水素、ニトロ、シアノ、ハロゲン又は
   【式】〔R⁸，R⁹は同一又は異なる低級アル キル、且つそのアルキルは水酸基を置換してもつ
   ていてもよい〕）を、R³はポリエチレングリコー
   ル残基を、Ｘはハロゲンを表わす。）で示される
   水溶性テトラゾリウム化合物。 ２ ポリエチレングリコールの平均分子量が400
   乃至1000である、特許請求の範囲第１項記載の水
   溶性テトラゾリウム化合物。 ３ 一般式 （式中R¹はニトロフエニル又は【式】 （R⁴，R⁵は水素又は低級アルキル、更にR⁴，R⁵
   で芳香環を形成してもよい）を、R²は
   【式】（R⁶は水素又はカルボキシル 基、R⁷は水素、ニトロ、シアノ、ハロゲン又は
   【式】〔R⁸，R⁹は同一又は異なる低級アル キル、且つそのアルキルは水酸基を置換してもつ
   ていてもよい〕）を、R³はポリエチレングリコー
   ル残基を、Ｘはハロゲンを表わす。）で示される
   水溶性テトラゾリウム化合物を用いることを特徴
   とする還元性物質の定量方法。 ４ 水溶性テトラゾリウム化合物に金属イオンを
   共存させるか又は、該テトラゾリウム化合物から
   ホルマザンを生成させたのちに金属イオンを添加
   して、該テトラゾリウム化合物から得られる還元
   成績体である水溶性ホルマザンを、該金属との有
   色のキレート化合物に変換し、その呈色を測定す
   る特許請求の範囲第３項記載の還元性物質の定量
   方法。 ５ 還元性物質が還元型ニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチド（NADH）または還元型ニコチ
   ンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸
   （NADPH）である、特許請求の範囲第３項又は
   第４項に記載の還元性物質の定量方法。 ６ 還元性物質がスーパーオキサイドイオンであ
   る、特許請求の範囲第３項又は第４項記載の還元
   性物質の定量方法。 ７ 還元性物質がアスコルビン酸である、特許請
   求の範囲第３項又は第４項記載の還元性物質の定
   量方法。 ８ 一般式 （式中R¹はニトロフエニル又は【式】 （R⁴，R⁵は水素又は低級アルキル、更にR⁴，R⁵
   で芳香環を形成してもよい）を、R²は
   【式】（R⁶は水素又はカルボキシル 基、R⁷は水素、ニトロ、シアノ、ハロゲン又は
   【式】〔R⁸，R⁹は同一又は異なる低級アル キル、且つそのアルキルは水酸基を置換してもつ
   ていてもよい〕）を、R³はポリエチレングリコー
   ル残基を、Ｘはハロゲンを表わす。）で示される
   水溶性テトラゾリウム化合物を、それを還元する
   反応系におき、得られる水溶性ホルマザンを以
   て、該反応系に溶存する金属イオンと有色のキレ
   ート化合物を作らせ、その呈色を測定することを
   特徴とする金属の比色定量法。 ９ 金属イオンがCu⁺イオンである、特許請求の
   範囲第８項記載の金属の比色定量方法。 １０ 金属イオンがZn²⁺イオン又はNi²⁺イオン
   である、特許請求の範囲第８項記載の金属の比色
   定量法。