JPH05262716A

JPH05262716A - 被酸化性呈色試薬

Info

Publication number: JPH05262716A
Application number: JP8190091A
Authority: JP
Inventors: Toshiyuki Hashizume; 爪利至橋; Mutsuhiro Date; 達睦廣伊
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1991-03-20
Filing date: 1991-03-20
Publication date: 1993-10-12

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は、アミノ基にヒドロキシスルホアルキ
ル基を導入したことを特徴とするp-フルオロアニリン誘
導体又はその塩、及び該化合物を発色成分として用いる
酸化性物質並びにペルオキシダーゼ様物質の定量方法で
ある。【効果】本発明は、従来同様の目的で用いられていた化
合物が有する問題点、即ち生成する色素の緩衝液中での
呈色安定性が悪いことや、血清や尿等の生体試料中に共
存する成分の影響により、生じた色素の呈色安定性が低
下する（退色する）こと等の問題点を全て解決した新規
なp-フルオロアニリン誘導体又はその塩と、これを発色
成分として用いる酸化性物質並びにペルオキシダーゼ様
物質の定量方法を提供するものであり、斯業に貢献する
ところ大なる発明である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なp-フルオロアニ
リン誘導体又はその塩、及びこれを発色成分として用い
る酸化性物質又はペルオキシダーゼ様物質の定量方法に
関する。

【０００２】

【発明の背景】生体成分、例えば血液や尿などの体液成
分を測定することは、その変動が疾病と大きく関連して
いるため、疾患の診断、病態の解明、治療経過の判定を
行う上で、必須なものとなっている。例えば、血液中の
コレステロール、トリグリセライド、グルコース、尿
酸、リン脂質、胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ等を初
め、非常に多種類の微量成分の測定法が開発されてお
り、疾病の診断上役立っていることは周知の通りであ
る。

【０００３】現在、血清成分の測定法としては、それが
酵素以外のものである場合には、目的成分に特異的に作
用する酵素を用い、また、目的成分が酵素の場合には、
その基質となるべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行
い、これによる生成物を測定して目的成分量を求める、
所謂”酵素法”が一般に広く普及している。なかでも、
過酸化水素生成酵素、例えばオキシダーゼを働かせて目
的成分に相当する過酸化水素を生成させ、これをペルオ
キシダーゼ、及び発色成分である被酸化性呈色試薬を用
いて発色系に導き、その呈色を比色定量することにより
目的成分量を求める方法が、被酸化性呈色試薬の開発と
相まって増加しつつある。例えば、コレステロール-コ
レステロールオキシダーゼ、トリグリセライド-リポプ
ロテインリパーゼ-グリセロールオキシダーゼ、尿酸-ウ
リカーゼ等の組み合わせで発生する過酸化水素を、ペル
オキシダーゼ(POD)、被酸化性呈色試薬を用いて発色系
に導き、その呈色の吸光度を測定することにより目的成
分量を求める方法がそれである。この方法に於いて用い
られる発色成分である被酸化性呈色試薬の代表的なもの
としては、4-アミノアンチピリン又はその誘導体とフェ
ノール系化合物又はN,N-ジ置換アニリン系化合物とを組
み合わせた被酸化性呈色試薬、3-メチルベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾン(MBTH)とアニリン系化合物との組み合わ
せ試薬、2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6
-スルホン酸)(ABTS)、トリフェニルメタン系ロイコ色
素、ベンジジン誘導体、o-トリジン誘導体、トリアリル
イミダゾール誘導体、o-フェニレンジアミン等が挙げら
れる。

【０００４】しかしながら、これらの被酸化性呈色試薬
に於いては、種々の問題点、例えば、生成する色素が血
清成分の影響により退色する、吸収極大が短波長域にあ
るため測定試料中の有色成分、例えば血清や尿中のヘモ
クロビンやビリルビン等の影響を受け易く測定値の信頼
性に乏しい、分子吸光係数が小さいために測定感度が低
く限られた測定対象物にしか利用できない等の問題点が
あり、必ずしも満足できるものではなかった。

【０００５】このような問題点を解決すべく、アニリン
誘導体にフルオロ基を導入したp-フルオロアニリン誘導
体が開発されている（特開昭60-243050号公報等）。し
かしながら、これら既知のp-フルオロアニリン系化合物
を用いた呈色試薬に於いても、種々の問題点、例えば、
生成する色素の分子吸光係数は大きく測定感度は高いも
のの生成する色素自身の呈色安定性があまり良くない、
生成する色素が血清成分の影響により退色する等の問題
点があり、必ずしも満足できるものではなかった。

【０００６】

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、血清成分による退色が少なく、測定感度が
高く且つ吸収極大が長波長側にあってしかも呈色安定性
の良好な色素を生成する被酸化性呈色試薬のカップリン
グ成分として有用なp-フルオロアニリン誘導体又はその
塩、及び該化合物を発色成分として用いる酸化性物質及
びペルオキシダーゼ様物質の精度の高い測定法を提供す
ることにある。

【０００７】

【発明の構成】本発明は、化１

【化１】［式中、Ｒ1及びＲ2は夫々独立して水素原子、
アルケニル基又は置換基を有していても良いアルキル基
を表し（但し、Ｒ1及びＲ2の何れか一方は炭素数２〜５
のヒドロキシスルホアルキル基である。）、Ｒ3はアル
キル基又はアルコキシ基を表わし、Ｒ4及びＲ5は夫々独
立して水素原子、アルコキシ基、アルケニル基、水酸
基、ハロゲン原子、スルホ基、カルボキシル基、ニトロ
基、置換基を有していてもよいアリール基又は置換基を
有していてもよいアルキル基を表わす。また、Ｒ3とＲ4
は互いに結合して芳香環を形成していてもよく、Ｒ1と
Ｒ4又はＲ2とＲ5の何れか一方は互いに結合してアルキ
レン橋を形成していてもよい。］で示されるp-フルオロ
アニリン誘導体又はその塩及び該化合物を発色成分の一
部として用いる酸化性物質の定量方法、並びに該化合物
を発色成分として用いるペルオキシダーゼ様物質の定量
方法である。

【０００８】本発明者らは、所謂”酵素法”に於いて広
く用いられている種々の被酸化性呈色試薬が有する上記
した如き問題点を解決すべく鋭意研究の途上、ヒドロキ
シスルホアルキル基をアミノ基に導入したp-フルオロア
ニリン系化合物又はその塩を4-アミノアンチピリン等と
組み合わせたものを被酸化性呈色試薬として用いた場合
には、ヒドロキシスルホアルキル基がアミノ基に導入さ
れていないp-フルオロアニリン系化合物を使用した場合
に比較して、生じる色素の呈色安定性が高くしかも血清
成分による退色が極めて少ないことを見出し本発明を完
成するに至った。

【０００９】化１で示される本発明のp-フルオロアニリ
ン誘導体及びその塩に於いて、Ｒ1及びＲ2としては、夫
々独立して水素原子、例えばエテニル基（ビニル基），
1-プロペニル基，2-プロペニル基（アリル基），イソプ
ロペニル基，2-ブテニル基等の炭素数２〜４の低級アル
ケニル基又は例えばメチル基、エチル基，プロピル基，
ブチル基，アミル基等の炭素数１〜５の置換基を有して
いてもよいアルキル基（直鎖状、分枝状の何れにても
可）が挙げられ、アルキル基の置換基としては、例えば
沃素原子，塩素原子，臭素原子，弗素原子等のハロゲン
原子、水酸基、例えばメトキシ基、エトキシ基，プロポ
キシ基，ブトキシ基，アミルオキシ基等の炭素数１〜５
のアルコキシ基（直鎖状、分枝状の何れにても可）、ス
ルホ基、カルボキシル基、アミノ基、例えばアセトアミ
ド基，プロピオンアミド基等の置換アミド基、例えばア
セチル基，プロピオニル基，ブチリル基等のアシル基、
例えばアセチルオキシ基，エチルカルボニルオキシ基等
のアシルオキシ基等が挙げられる。また、これら置換基
はアルキル基に複数種、複数個導入されていてもよく、
更にこれら置換基のうち、スルホ基、カルボキシル基等
は塩（例えば、リチウム，ナトリウム，カリウム等のア
ルカリ金属との塩、アンモニウム塩等）を形成していて
もよいし、アミノ基は鉱酸塩（例えば塩酸塩、硫酸塩
等）や有機酸塩（例えば酢酸塩、プロピオン酸塩等）を
形成していてもよい。但し、Ｒ1及びＲ2の何れか一方
は、例えば1-ヒドロキシ-2-スルホエチル基，2-ヒドロ
キシ-3-スルホプロピル基，3-ヒドロキシ-4-スルホブチ
ル基，4-ヒドロキシ-5-スルホペンチル基等の炭素数２
〜５のヒドロキシスルホアルキル基である。Ｒ3として
は、例えばメチル基、エチル基，プロピル基，ブチル
基，アミル基等の炭素数１〜５のアルキル基（直鎖状、
分枝状の何れにても可）又は例えばメトキシ基、エトキ
シ基，プロポキシ基，ブトキシ基，アミルオキシ基等の
炭素数１〜５のアルコキシ基（直鎖状、分枝状の何れに
ても可）が挙げられる。また、Ｒ4及びＲ5としては、夫
々独立して水素原子、例えばメトキシ基、エトキシ基，
プロポキシ基，ブトキシ基，アミルオキシ基等の炭素数
１〜５のアルコキシ基（直鎖状、分枝状の何れにても
可）、例えばエテニル基（ビニル基），1-プロペニル
基，2-プロペニル基（アリル基），イソプロペニル基，
2-ブテニル基等の炭素数２〜４の低級アルケニル基、水
酸基、例えば沃素原子，塩素原子，臭素原子，弗素原子
等のハロゲン原子、スルホ基、カルボキシル基、ニトロ
基、例えばフェニル基，ナフチル基，トリル基，フルオ
ロフェニル基，クロロフェニル基、ブロモフェニル基，
ヨードフェニル基，メトキシフェニル基、ヒドロキシフ
ェニル基等の置換若しくは無置換のアリール基又は例え
ばメチル基、エチル基，プロピル基，ブチル基，アミル
基等の炭素数１〜５の置換基を有していてもよいアルキ
ル基（直鎖状、分枝状の何れにても可）が挙げられ、該
アルキル基の置換基としては、例えば沃素原子，塩素原
子，臭素原子，弗素原子等のハロゲン原子、水酸基、フ
ェニル基等が挙げられる。また、これら置換基のうち、
スルホ基、カルボキシル基等は塩（例えば、リチウム，
ナトリウム，カリウム等のアルカリ金属との塩、アンモ
ニウム塩等）を形成していてもよい。尚、Ｒ3とＲ4は互
いに結合して芳香環を形成していてもよく、Ｒ1とＲ4又
はＲ2とＲ5の何れか一方は互いに結合してアルキレン橋
を形成していてもよい。本発明のp-フルオロアニリン
誘導体は例えば塩酸、硫酸等の鉱酸や例えば酢酸、プロ
ピオン酸等の有機酸と塩を形成していてもよいし、ま
た、例えば、リチウム，ナトリウム，カリウム等のアル
カリ金属との塩或はアンモニウム塩等となっていてもよ
い。

【００１０】化１で示される本発明のp-フルオロアニリ
ン誘導体は例えば以下のようにして容易に合成し得る。
尚、以下の合成法は、Ｒ2が水素原子以外の場合につい
てのものである。即ち、化２

【化２】（式中、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は前記に同じ。）で示される
化合物（以下、化合物(2)と略記する。）を例えばメタ
ノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類に
溶解し、パラジウムカーボン、パラジウムブラック等の
接触還元用触媒を化合物(2)１モルに対して0.1〜100モ
ル、好ましくは0.5〜10モル加えた後、水素ガスを０〜5
0℃で導入して、所謂接触還元処理を行って、先ず化３

【化３】（式中、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は前記に同じ。）で示される
化合物（以下、化合物(3)と略記する。）を得る。

【００１１】次いで、化合物(3)と、化合物(3)１モルに
対して１〜３モル、好ましくは１〜２モルの化４

【化４】（式中、Ｘはハロゲン原子を表わし、Ｒ2は前記に同
じ。）で示される化合物（以下化合物(4)と略記す
る。）とを、例えばメタノール，エタノール，イソプロ
パノール等のアルコール類、例えば1,4-ジオキサン，テ
トラヒドロフラン(THF)等の環状エーテル類等の溶媒或
はこれらに水を混じたものに溶解し、これに例えば水酸
化ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化カルシウム等の
苛性アルカリ、例えば炭酸ナトリウム，炭酸カリウム，
炭酸カルシウム等の炭酸アルカリを化合物(3)１当量に
対して１〜３当量、好ましくは１〜２当量添加し（添加
する際には水溶液としたものを用いてもよい。）、０〜
200℃、好ましくは10〜120℃で１〜150時間、好ましく
は１〜10時間反応させた後、常法により精製して、化５

【化５】（式中、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は前記に同じ。）で示さ
れる化合物（以下化合物(5)と略記する。）を得る。

【００１２】次いで、化合物(5)に、化合物(5)１モルに
対して１〜３モル、好ましくは１〜２モルの化６

【化６】（式中、Ｘ及びＲ1は前記に同じ。）で示される化合物
を、化合物(3)と化合物(4)とを反応させたのと同様の条
件で反応させた後、常法により精製を行えば、目的の本
発明のp-フルオロアニリン誘導体が得られる。

【００１３】尚、上記還元工程は、例えば鉄-塩酸，鉄-
硫酸，錫-塩酸，亜鉛-塩酸等金属-酸の組み合わせによ
る還元法、例えば塩化第一鉄，塩化第一錫等金属塩類に
よる還元法、硫化ナトリウム，硫化アンモニウム，水硫
化ナトリウム，ハイドロサルファイトナトリウム等硫黄
化合物による還元法、ヒドラジン還元法等、他の自体公
知の還元法に適宜置き換え得ることは言うまでもない。
また、化合物(3)から化合物(5)を製造するに際し、化合
物(4)が常温で気体である場合等に於いて、反応を閉管
中で行う等は任意である。更に、化合物(4)の代りに例
えばジメチル硫酸，ジエチル硫酸等のジアルキル硫酸も
使用し得ることは勿論である。

【００１４】また、本発明のp-フルオロアニリン誘導体
は以下の方法によっても容易に合成し得る。即ち、例え
ば化７

【化７】（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は前記に同じ。）
で示される化合物（以下、化合物(7)と略記する。）
と、化合物(7)１モルに対して、１〜３モル、好ましく
は１〜２モルの例えばN-フルオロピリジニウム塩（例え
ばN-フルオロ-2,4,6-トリメチルピリジニウムトリフ
レート，N-フルオロピリジニウムトリフレート，N-フ
ルオロ-3,5-ジクロロピリジニウムトリフレート等）
等の弗素化剤とを、例えばメタノール、エタノール、プ
ロパノール等のアルコール類、例えばベンゼン，トルエ
ン等の芳香族炭化水素類、例えばジエチルエーテル，ジ
イソプロピルエーテル，THF，1,4-ジオキサン等のエー
テル類、例えばクロロホルム，ジクロロメタン，1,2-ジ
クロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ジメチルホルム
アミド等の溶媒（何れも乾燥したものが望ましい。）
中、０〜150℃、好ましくは10〜100℃で、１〜72時間、
好ましくは１〜３時間反応させた後、常法により精製す
ることにより、目的の本発明のp-フルオロアニリン誘導
体が得られる。

【００１５】尚、化１のＲ2が水素原子である化合物を
合成する場合には、上記した合成法に於ける各反応工程
のうち、必要な工程のみを行えばよいことは言うまでも
ない。

【００１６】本発明のp-フルオロアニリン誘導体の製造
に用いられる化合物(2)は、市販品がある場合にはそれ
をそのまま用いれば良いし、市販品がない場合には、J.
Chem.Soc.,1963,5554頁等に記載の方法に準じて、相当
するp-フルオロベンゼン誘導体をニトロ化して得たもの
を用いればよい。

【００１７】本発明のp-フルオロアニリン誘導体の製造
に用いられる化合物(7)は、市販品がある場合にはそれ
をそのまま用いれば良いし、市販品がない場合には、相
当するベンゼン誘導体を常法に従いニトロ化、還元して
アニリン誘導体としたものを用いれば良い。

【００１８】本発明のp-フルオロアニリン誘導体又はそ
の塩は、水或は界面活性剤の溶存する緩衝液中で極めて
安定であるが、これと4-アミノアンチピリン又はその誘
導体、フェニレンジアミン、ＭＢＴＨ等の発色主剤とを
組み合わせたものを、酸化剤により酸化（例えばペルオ
キシダーゼの存在下過酸化水素により酸化）すると呈色
安定性に優れた色素を定量的に形成する。しかも、この
色素は、アミノ基にヒドロキシスルホアルキル基が導入
されていない従来のp-フルオロアニリン誘導体を用いて
同様の方法により生成させた色素に比べて、呈色の安定
性が良好であり、しかも血清や尿等の生体体液を試料と
した場合に於ける該体液中の共存成分の影響に基づく退
色も殆どないと言う優れた性質を有している。従って、
本発明のp-フルオロアニリン誘導体又はその塩は、酸化
性物質の定量やペルオキシダーゼ様物質の定量に於ける
発色試薬のカップリング成分として有効に用い得るが、
とりわけ酵素反応により生成した過酸化水素をペルオキ
シダーゼの存在下発色系に導き、その呈色を比色定量す
ることにより行う、例えば血清、血漿、尿等の生体試料
中の微量成分の定量に於ける発色試薬のカップリング成
分として有効に使用し得る。

【００１９】即ち、本発明の酸化性物質の定量方法は、
基質、又は酵素反応により生成した物質に酸化酵素を作
用させ生成する過酸化水素を定量することにより行う生
体試料中の微量成分、即ち基質又は酵素活性の測定方法
として特に効果的に使用し得る。

【００２０】本発明の方法により測定可能な生体試料中
の微量成分としては、例えばコレステロール、グルコー
ス、グリセリン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿
酸、リン脂質、胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グア
ナーゼ、コリンエステラーゼ等が挙げられるが、これら
に限定されるものではなく、酵素反応により生成する過
酸化水素を定量することにより測定が可能な生体成分は
全て定量が可能である。本発明の測定法は、発色試薬
（被酸化性呈色試薬）として、例えば4-アミノアンチピ
リン又はその誘導体，フェニレンジアミン、ＭＢＴＨ等
の発色主剤と本発明のp-フルオロアニリン誘導体又はそ
の塩とを組み合わせたものを用いる以外は自体公知の酵
素法（過酸化水素生成酵素を用いる）による測定法に準
じてこれを行えば足りる。

【００２１】発色試薬としての使用濃度としては、特に
限定されないが、発色主剤が通常50〜2000μmol/l、好
ましくは500〜1000μmol/lの濃度範囲で、本発明のp-フ
ルオロアニリン誘導体又はその塩は通常50〜10000μmol
/l、好ましくは500〜1000μmol/lの濃度範囲で、適宜組
み合わせて用いられる。

【００２２】本発明の方法による生体成分の定量に於い
て、過酸化水素を生成させる酵素として用いられる酸化
酵素（オキシダーゼ）及びその他の目的で用いられる酵
素類並びに酵素反応に関与する基質及びその他の物質の
種類及び使用量は、被酸化性呈色試薬を用いる自体公知
の生体成分の定量方法に準じて夫々測定対象となる物質
に応じて適宜選択すればよい。また、本発明による過酸
化水素の定量に於いて用いられるペルオキシダーゼ又は
ペルオキシダーゼ様物質としては、その起源、由来に特
に限定はなく、植物、動物、微生物から得られるペルオ
キシダーゼ又はペルオキシダーゼ様物質が、１種若しく
は要すれば２種以上組み合わせて用いられる。また、そ
の使用量は目的に応じて適宜定められ、特に限定されな
い。

【００２３】本発明の方法による生体成分の定量は、通
常pＨ4.0〜10.0、好ましくはpＨ6.0〜8.0で実施され
る。用いられる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸
塩、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、グッド(Good)の緩衝剤等の通常この分野で
用いられる緩衝剤が挙げられるが、特に限定されない。

【００２４】本発明のp-フルオロアニリン誘導体又はそ
の塩は、発色主剤と組み合わせて過酸化水素，過沃素酸
等の酸化性物質の定量に有効に用い得るが、また、これ
と発色主剤及び過酸化水素とを組み合わせることにより
ペルオキシダーゼ様物質の定量を行うことも可能であ
る。ペルオキシダーゼ様物質としては、ペルオキシダー
ゼそのものの他、ヘモグロビンその他のヘム化合物が挙
げられる。

【００２５】即ち、本発明のp-フルオロアニリン誘導体
又はその塩は、例えばペルオキシダーゼを標識化合物に
用いた酵素免疫測定法や血清中のヘモグロビンを過酸化
水素若しくは過硼素酸Naの様な酸化性物質を用いて測定
する場合等にも有効に使用し得る。

【００２６】尚、本発明はドライケミストリーへも応用
が可能である。以下に実施例、比較例及び参考例を挙
げ、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに
より何ら限定されるものではない。

【００２７】

【実施例】

実施例１．N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピ
ル)-4-フルオロ-m-トルイジン Na塩［本発明化合物
(1)］の合成 2-フルオロ-5-ニトロトルエン（アルドリッチ社製）15g
をメタノール１ｌに溶解した後、パラジウムカーボン10
gを添加し、水素ガスを10時間導入した。沈澱物を除去
した後濃縮乾固し4-フルオロ-m-トルイジンを得た。次
いでこれと沃化エチル16gとを、エタノール100mlと2N N
aOH水溶液60mlとの混合液に溶解した後、２時間還流下
に反応させた。反応終了後、エタノールを留去し、酢酸
エチルを用いて残渣から抽出、濃縮を行い、粗N-エチル
-4-フルオロ-m-トルイジン14gを得た。次いで、これと3
-クロロ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸15gとを水：
イソプロパノール（1:1）200mlに溶解し、2N NaOH 48ml
を加えて、３時間還流下に反応させた。反応終了後、イ
ソプロパノールの留去、酢酸エチルを用いての残渣から
抽出、濃縮を行い、目的物の粗体16gを得た。これを更
に水から再結晶してN-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スル
ホプルピル)-4-フルオロ-m-トルイジン Na塩５gを得
た。ＩＲ(KBr) cm^-1：2900〜2980、1600、1500、1200。ｍｐ：205〜215℃。元素分析値(Ｃ₁₂Ｈ₁₈ＦＮＮaＯ₄Ｓ）計算値(%)：Ｃ 46.00、Ｈ 5.47、Ｎ 4.47、実測値(%)：Ｃ 45.73、Ｈ 5.49、Ｎ 4.25。

【００２８】実施例２．N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-
スルホプロピル)-4-フルオロ-3ーメトキシアニリン Na
塩（本発明化合物[2]）の合成 N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メト
キシアニリン Na塩（同仁化学研究所(株)製）3.7gをエ
タノール20mlに溶解したものに、N-フルオロ-2,4,6-ト
リメチルピリジニウムトリフレート３g（小野田セメ
ント(株)製）を添加し、室温下に20時間攪拌反応させ
た。反応終了後、反応液を濃縮し、残渣を逆層オクタデ
シルシリカゲルカラムクロマトグラフィにより精製し
て、目的のN-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピ
ル)-4-フルオロ-3ーメトキシアニリン Na塩の無色結晶
0.2gを得た。ＩＲ(KBr) cm^-1：3400、3050〜2800、1200、1050。ｍｐ：200〜205℃。元素分析値(Ｃ₁₂ Ｈ₁₈ＦＮＮa０₅Ｓ）計算値(%)：Ｃ 43.76、Ｈ 5.20、Ｎ 4.25、実測値(%)：Ｃ 43.52、Ｈ 5.34、Ｎ 4.02。

【００２９】参考例１．本発明化合物の諸性質の測定 (1)分子吸光係数、吸収極大（λmax）及び呈色安定性の
測定（発色溶液）50mM ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスル
ホン酸）(PIPES)−水酸化ナトリウム緩衝液(pH7,0)に、
本発明化合物を0.5mM、4-アミノアンチピリンを0.5mM及
びペルオキシダーゼを１U/mlとなるように溶解したもの
を発色溶液とした。（操作法）所定の本発明化合物を用いて調製した発色溶
液３mlに、１mMの過酸化水素水10μlを添加し良く混合
した後、37℃で５分間加温した。この反応液の吸収曲線
を測定し、そのλmax及びλmaxに於ける吸光度Ｅsを求
めた。尚、吸収曲線及びλmaxを求める際の対照として
は、各々の発色溶液３mlに精製水20μｌを添加し良く混
合した後、37℃で５分間加温したものを用いた。また、
分子吸光係数は、各発色溶液を用いて得られたＥsと、
各発色溶液の代りに4-アミノアンチピリンとフェノール
を夫々50mMずつ及びペルオキシダーゼを１U/ml含む50mM
PIPES−水酸化ナトリウム緩衝液(pH7,0)を用いて、上
記の操作法により得られる505nmに於ける吸光度ＥOHと
を用いて、次式により求めた。分子吸光係数＝(Ｅs÷ＥOH)×５×10³ 呈色安定性については、吸光度Ｅsを測定した後37℃に1
0分間放置した反応液の吸光度Ｅs'を測定し、これらの
値を次式に代入して呈色安定率を求め、呈色安定率が１
％未満である場合をＡ、呈色安定率が１％以上２％未満
である場合をＢ、呈色安定率が２％以上である場合をＣ
として表示した。呈色安定率（％）＝(Ｅs−Ｅs')÷Ｅs×100 結果を表１に示す。 (2)血清成分の影響の測定 (1)で調製した発色溶液３mlに、正常プール人血清20μl
を添加混合し、次いで１mMの過酸化水素水10μlを添加
混合したものを37℃で５分間反応させて、この反応液の
λmaxに於ける吸光度Ｅefを測定した。また、正常プー
ル人血清の代りに精製水を用いて、前記と同じ発色溶液
を用いて同様の操作を行い、吸光度Ｅstdを得た。これ
らの値を次式に代入して、血清成分の影響を調べる指標
となるａ値を求めた。ａ＝(Ｅef÷Ｅstd)×100 尚、血清成分の影響は、ａ値を基に以下のように表わし
た。 −：ａ値が３未満。＋：ａ値が３以上６未満。＋＋：ａ値が６以上。結果を表１に併せて示す。尚、表１中の本発明化合物３
は、沃化エチルの代りにN-クロロエチル-アセトアミド
（アルドリッチ社製）を用いた以外は、実施例１と同じ
試薬を用い、実施例１と同様の操作法により合成したも
のである。また、比較のために、表１及び表２に既知の
p-フルオロアニリン誘導体について同様にして諸性質を
測定した結果を併せて示した。

【表１】

【表２】表１及び表２の結果から明らかな如く、本発明の化合物
は、分子吸光係数及び極大吸収波長は既知のp-フルオロ
アニリン誘導体から生じる色素のそれと同等であるが、
生成した色素の呈色安定性は既知のp-フルオロアニリン
誘導体のそれに比較して明らかに向上しており、且つ既
知のp-フルオロアニリン誘導体に於いて問題となってい
た血清等の生体体液を試料とした場合に体液中の共存成
分の影響により生ずる色素の退色現象が殆ど認められな
いことが判る。

【００３０】実施例３．過酸化水素の定量（測定試液）50mM PIPES−水酸化ナトリウム緩衝液(pH
7,0)に以下の試薬を所定濃度溶解したものを測定試液と
した。 4-アミノアンチピリン 0.5mM 本発明化合物[1] 0.5mM ペルオキシダーゼ４U/ml （試料）市販の過酸化水素水を蒸留水で適宜希釈して、
1.0，2.0，3.0，4.0及び5.0mM溶液としたものを試料と
した。（操作法）測定試液３mlに試料20μlを加えよく混合
し、37℃で５分間加温後、555nmの吸光度（Ｅs）を測定
した。また、試料の代りにイオン交換水を用いて同様の
操作を行い盲検値（ＥBl)を測定した。（結果）測定結果を図１に示す。図１から明らかな如
く、横軸の各過酸化水素濃度に対して得られた吸光度
（Ｅs−ＥBl）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
検量線は良好な直線性を示し、本発明の方法により過酸
化水素を定量的に測定し得ることが判る。

【００３１】実施例４．血清成分による呈色安定性への
影響の検討（測定試液及び試料）実施例３と同じもの使用した。（操作法）測定試液３mlに正常ヒト血清又はイオン交換
水50μlを加えよく混合し、更に試料20μlを加えよく混
合し、37℃で５分間加温後、595nmの吸光度（Ｅs）を
測定した。また、試料の代りにイオン交換水を用いて同
様の操作を行い盲検値（ＥBl）を測定した。（結果）測定結果を表３に示す。

【表３】表３から明らかな如く、本発明のp-フルオロアニリン誘
導体と4-アミノアンチピリンとから生成する色素は血清
成分による影響を殆ど受けないことが判る。

【００３２】実施例５．尿酸の定量（測定試液）50mM PIPES−水酸化ナトリウム緩衝液(pH
7,0)に以下の試薬を所定濃度溶解したものを測定試液と
した。 4-アミノアンチピリン 0.5mM 本発明化合物[1] 0.5mM ペルオキシダーゼ４U/ml ウリカーゼ 0.05U/ml （試料）10mg/dlの尿酸を含有する標準液及びヒト血清
５検体を試料とした。（操作法）測定試液３mlに試料20μlを加えよく混合
し、37℃で５分間加温後、555nmの吸光度（Ｅs）を測定
した。また、試料の代りにイオン交換水を用いて同様の
操作を行い盲検値（ＥBl)を測定した。次式に従いヒト
血清中の尿酸濃度を算出した。尿酸(mg/dl)＝(ヒト血清のＥs−ＥBl)÷(標準液のＥs−
ＥBl)×10 （結果）結果を表４に示す。

【００３３】参考例２．尿酸の定量実施例５と同じ試料を用い、尿酸測定用の市販キット
（尿酸Ｃ−テストワコー、和光純薬工業(株)製）を使用
して、尿酸濃度を測定した。結果を表４に併せて示す。

【表４】表４から明らかな如く、本発明のフルオロアニリン誘導
体を発色成分として用いた実施例５の測定法により得ら
れた尿酸の測定値は、市販キットを用いた従来法のそれ
と良い相関を示している。

【００３４】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、従来同様の
目的で用いられていた化合物が有する問題点、即ち生成
する色素の緩衝液中での呈色安定性が悪いことや、血清
や尿等の生体試料中に共存する成分の影響により、生じ
た色素の呈色安定性が低下する（退色する）こと等の問
題点を全て解決した新規なp-フルオロアニリン誘導体又
はその塩と、これを発色成分として用いる酸化性物質並
びにペルオキシダーゼ様物質の定量方法を提供するもの
であり、斯業に貢献するところ大なる発明である。

【００３５】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例３に於いて得られた検量線を表
わし、横軸の各過酸化水素濃度(mM)について得られた55
5nmの吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだも
のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/72 Ａ 7055−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】化１【化１】［式中、Ｒ1及びＲ2は夫々独立して水素原子、アルケニ
ル基又は置換基を有していても良いアルキル基を表し
（但し、Ｒ1及びＲ2の何れか一方は炭素数２〜５のヒド
ロキシスルホアルキル基である。）、Ｒ3はアルキル基
又はアルコキシ基を表わし、Ｒ4及びＲ5は夫々独立して
水素原子、アルコキシ基、アルケニル基、水酸基、ハロ
ゲン原子、スルホ基、カルボキシル基、ニトロ基、置換
基を有していてもよいアリール基又は置換基を有してい
てもよいアルキル基を表わす。また、Ｒ3とＲ4は互いに
結合して芳香環を形成していてもよく、Ｒ1とＲ4又はＲ
2とＲ5の何れか一方は互いに結合してアルキレン橋を形
成していてもよい。］で示されるp-フルオロアニリン誘
導体又はその塩。
【請求項２】発色主剤及び請求項１に記載のp-フルオロ
アニリン誘導体又はその塩を発色成分として用いること
を特徴とする酸化性物質の定量方法。
【請求項３】発色主剤が4-アミノアンチピリンである、
請求項２に記載の定量方法。
【請求項４】酸化性物質が過酸化水素である、請求項２
又は３に記載の定量方法。
【請求項５】ペルオキシダーゼの存在下、発色成分を酸
化発色させてその呈色を比色定量する、請求項４に記載
の定量方法。
【請求項６】過酸化水素が、酵素反応により生成する過
酸化水素である、請求項４又は５に記載の定量方法。
【請求項７】過酸化水素が、生体試料中の微量成分の定
量に於いて酵素反応により生成する過酸化水素である、
請求項６に記載の定量方法。
【請求項８】生体試料中の微量成分の定量が、基質又は
酵素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成
する過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の
基質又は酵素活性の定量である、請求項７に記載の定量
方法。
【請求項９】発色主剤及び請求項１に記載のp-フルオロ
アニリン誘導体又はその塩を発色成分として用いること
を特徴とするペルオキシダーゼ様物質の定量方法。
【請求項１０】発色主剤が4-アミノアンチピリンであ
る、請求項９に記載の定量方法。
【請求項１１】ペルオキシダーゼ様物質がペルオキシダ
ーゼである、請求項９又は１０に記載の定量方法。
【請求項１２】ペルオキシダーゼ様物質がヘモグロビン
又はその他のヘム化合物である、請求項９又は１０に記
載の定量方法。