JPH027589B2 - - Google Patents

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JPH027589B2
JPH027589B2 JP60064003A JP6400385A JPH027589B2 JP H027589 B2 JPH027589 B2 JP H027589B2 JP 60064003 A JP60064003 A JP 60064003A JP 6400385 A JP6400385 A JP 6400385A JP H027589 B2 JPH027589 B2 JP H027589B2
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JP
Japan
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lower alkyl
resorufin
alkyl group
hydrogen atom
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JP60064003A
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Kurain Kurisuchan
Batsutsu Hansuugeoruku
Zerunetsu Manfureeto
Hoofuman Yurugen
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Publication of JPH027589B2 publication Critical patent/JPH027589B2/ja
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    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
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    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
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    • C07D265/34—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines condensed with carbocyclic rings
    • C07D265/36—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines condensed with carbocyclic rings condensed with one six-membered ring
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 グリコシダーゼは人間及び動物組織中で多くの
生理学的なはたらきをする。すなわち例えばβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼは炭水化物代謝において、
乳糖の加水分解を行なうので、重要な役割をす
る。更にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼは糖脂質、ム
コ多糖類及び糖蛋白質の分解の際の鍵酵素であ
る。その他の生理学的に重要なグリコシダーゼと
しては次のものが挙げられる：α−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、α−Ｄ−及びβ−Ｄ−グルコシダーゼ
並びにα−Ｄ−マンノシダーゼ。
グリコシダーゼはその生理的な重要な働らきの
他に近年は診断的並びに生物工学的範囲で重要に
なつて来た。すなわち例えばこれらの酵素は増々
酵素免疫分析のための指示−酵素として使用され
る。この関係ではβ−Ｄ−ガラクトシダーゼが特
に有利である〔例えばアナルス オブ クリニカ
ル ビオケミストリイ Annals of Clinical
Biochemistry第16巻、第221〜第240頁（1979年）
参照〕。
従つてグリコシダーゼの活性の測定は、臨床化
学において、並びに診断学において増々重要であ
る。そのために極めて一般的にはグリコシダーゼ
含有の試料に適当な基質を混合する。基質は酵素
により分解される。分解生成物の１種を適当な方
法で検出する。酵素の作用により遊離したグリコ
ン又はアグリコンを測定することができる。普通
は後者が測定される。
基質としては屡々検出すべき酵素の天然基質が
適する。しかしながらそれにおけるアグリコンが
分光的に容易に検出可能な基であるグリコシドを
特に有利に使用する。
従来の技術 グリコシダーゼによる分解後に、アグリコンを
分光的に可視又は同様に紫外線−範囲で、並びに
螢光分析的に測定することができる一連のグリコ
シダーゼ−基質が公知である。
すなわち、ビオケム（Biochem.Z.）第333巻、
209頁（1960年）に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
の基質として、フエニル−β−Ｄ−ガラクトシド
並びに若干のその他の芳香族環に置換した誘導体
（例えばＯ−ニトロフエニル−及びｐ−ニトロフ
エニル−β−Ｄ−ガラクトシド）が記載されてい
る。加水分解により遊離されるフエノールは測定
的に紫外線範囲で、もしくはニトロフエノールを
短波の可視波長範囲で測定する。指示反応として
酸化縮合をアミノアンチピリンで接触させること
もできる〔アナリテイカル ビオケム
（Analytical Biochem.）第40巻、第281頁（1971
年）〕。
組織化学的検査にナフチル−β−Ｄ−ガラクト
シドを使用する、すなわち例えばヒストケミイ
（Histochemie）第35巻、第199頁（1973年）では
１−ナフチル−化合物、ジエイ．ビオル．ケム．
（J.Biol.Chem.）第195巻、第239頁（1952年）で
は６−ブロム−２−ナフチル−誘導体又はヒスト
ケミイ（Histochemie）第37巻、第89頁（1973
年）ではナフトール−β−Ｄ−ガラクトシドであ
る。可視化のためにその際生成するナフトールを
種々のジアゾニウム塩と反応させてアゾ−色素に
する。
発螢光基質での酵素活性測定は、測光的方法に
比して螢光計測定の感度が屡々数10％程増加して
いるので普及している。多くの場合に、例えば細
胞分化のために自動装置を用いて細胞中の酵素活
性を検査する際に（細胞螢光法）、並びに流過微
螢光法での非可動酵素の分析の際に発螢光基質で
処理すべきである。その他の場合には、例えば試
験系の酵素的標識付けを定める際に（酵素免疫分
析）、発螢光基質の使用により酵素触媒の相乗効
果が著しく強化される。
従来公知のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ及びその
他のグリコシダーゼのための発螢光基質は発螢光
団としてフルオレセイン、インドキシル又はメチ
ルウンベリフエロンの誘導体を有する。しかしな
がら複合体の動的分析のためにこれらの化合物は
重大な欠点を有する。フルオレセインの二置換誘
導体は多段階の反応経過で加水分解される。一置
換フルオレセイン−グリコシドはすでに自ら螢光
を発する。インドキシル−誘導体はその酵素的分
解度、同様に動的分析を複雑にする一連の化学的
変換物の基になる。メチルウンベリフエロンの誘
導体は、紫外線で励起させなければならない。こ
の際生物学的又は合成の物質の固有螢光が妨害し
得る。更に紫外線−励起は、特にレーザー光学に
おいて、経費がかかる。殆んどの発螢光基質は、
極めてわずかな溶解性を示す反応生成物になり、
従つて酵素活性の動的分析には（それには基質及
び生成物の全く良好な溶解性が必要である）適さ
ない。
発明が解決しようとする問題点 従つて更に、基質を用いて種々のグリコシダー
ゼを簡単で、速やかなかつ確実な方法で測定する
ことができかつできれば測光的にも並びに螢光分
析的な測定方法でも使用出来る基質への必要性が
生じてきた。本発明の課題はこの要求を満足させ
ることにある。
問題点を解決する手段 この課題は、グリコシダーゼにより糖成分及び
レゾルフイン−誘導体に分離することができる新
規のレゾルフイン−誘導体のグリコシドにより解
明される。後者は良好に水溶性の化合物であり、
これは可視範囲で良好な測定可能な吸収を示し、
かつ更に容易に励起して螢光を発する。
従つて本発明の目的は、一般式ａもしくは
ｂ： 〔式中R1は水素原子を表わし、R2、R3及びR5は
同じか又は異なつていて良く、水素原子、ハロゲ
ン原子又は低級アルキル基を表わし、R4及びR6
は同じか又は異なつていて良く、水素原子、ハロ
ゲン原子、シアノ基、低級アルキル基、低級アル
コキシ基、カルボキシ基、低級アルコキシカルボ
ニル基、カルボキシ低級アルキル基、低級アルコ
キシカルボニル−低級アルキル基又は場合により
一置換又は二置換のカルボキサミド基又は基： −COO−（CH2CH2O）ｎ−R7 （基式中R7は水素原子又は低級アルキル基を表
わし、かつｎは１〜４の整数を表わす）を表わ
し、この際R6は付加的にスルホニル基又はニト
ロ基であつて良く、かつＹは窒素原子又は基：Ｎ
→Ｏを表わし、グリコシドはモノ−又はオリゴ−
サツカリド基である〕のレゾルフイン−誘導体の
グリコシドである。
一般式のレゾルフイン−誘導体のグリコシド
は新規の化合物である。これは炭水化物化学から
自体公知の方法により製造することができる。
殊に自体公知の方法で互変異性の一般式ａ及
びｂ： 〔式中R1〜R6及びＹは前記のものである〕のレ
ゾルフイン−誘導体を、単糖類又は少糖類又はそ
の１−ハロゲノ−誘導体（この際そのつど全ての
ヒドロキシ基は炭水化物化学で常用の保護基で置
換されている）と反応させて、過−Ｏ−置換のグ
リコシドにし、これから自体公知の方法で保護基
を離脱することにより一般式のレゾルフイン−
誘導体のグリコシドを得る。
式の化合物と過−Ｏ−置換の１−ハロゲノ−
糖類との反応は殊に酸受容体、例えばアルカリ金
属水酸化物又はアルカリ金属炭酸塩の存在で、水
性アセトン中又は（相移行条件下で）水／ベンゾ
ール−混合物又は水／クロロホルム−混合物中で
行なう。
更にこの方法は、一般式のレゾルフイン−誘
導体を先ずアルカリ金属水酸化物又はアルカリ金
属アルコラートを用いてアルカリ金属塩に変える
かもしくは場合により置換したアミンを用いてア
ンモニウム塩に変え、かつこれを次いで双極性の
中性溶剤、例えばアセトン、ジメチルスルホキシ
ド、ジクロルメタン、テトラヒドロフラン又はジ
メチルホルムアミド中で過−Ｏ−置換の１−ハロ
ゲノ−糖類と反応させることにより実施すること
ができる。
更に、一般式のレゾルフイン−誘導体及び過
−Ｏ−置換の１−ハロゲノ−糖類からの過−Ｏ−
置換のグリコシドの合成の際に、単一の銀塩又は
銀塩の混合物（酸化銀、炭酸銀、セライト
（Celite）上の炭酸銀、シルバ−トリフレート
（−triflat）、サリチル酸銀）及び／又は単一の水
銀塩又は水銀塩の混合物（臭化水銀、シアン化水
銀、酢酸水銀、酸化水銀）の添加が、場合により
乾燥剤、例えば塩化カルシウム、分子ふるい又は
無水硫酸カルシウムの使用下で、溶剤、例えば塩
化メチレン、クロロホルム、ベンゾール、トルオ
ール又はジオキサン中で、適切であることが判明
した。α−結合のグリコシドの合成には有利に一
般式の化合物を、そのヒドロキシ基が保護基
で、特に有利にアセチル基で置換されている糖類
と、ルユイス酸、例えば四塩化錫、塩化アルミニ
ウム、殊に塩化亜鉛の存在で熔融させる〔ケミ．
ベル．（Chem.Ber.）第66巻第378〜383頁〔1933
年〕及びメソーズ イン カルボヒドル．ケム．
（Methods in Carbohydr.Chem.）第２巻、第２
巻、第345〜347頁〔1967年〕参照〕。この際温度
は80℃〜150℃、有利に110℃〜130℃で選択され
る。
こうして得られる一般式のレゾルフイン−誘
導体の過−Ｏ−置換のグリコシドは同様に新規の
化合物である。
過−Ｏ−置換のグリコシドの保護基を分離して
一般式のグリコシドにすることは炭水化物化学
において慣例の方法により〔例えばアドバンセス
カルボヒドレート ケム（Advances
Carbohydrate Chem.）第12巻、第157頁（1975
年）参照）、例えばアシル−保護基の場合にはナ
トリウムメチラート又はバリウムメチラート又は
メタノール中のアンモニアを用いて実施する。
R1〜R7の定義におけるハロゲンとは、弗素、
塩素、臭素及び沃素、殊に塩素及び臭素である。
R1〜R6の定義における“低級アルキル基”は
炭素原子１〜５個、殊に１〜３個有し、この際メ
チル基が特に有利である。
R4及びR6の定義における“低級アルコキシ基”
は炭素原子１〜５個、殊に１〜３個有し、この際
メトキシ基が特に有利である。
置換基R4及びR6の定義におけるる低級アルコ
キシカルボニル−、カルボキシ−低級アルキル−
並びに低級アルコキシカルボニル−低級アルキル
−基の“低級アルコキシ−”もしくは“低級アル
キル−”基は同様に炭素原子１〜５個、殊に１〜
３個有し、この際メトキシ−基もしくはメチレン
−基が特に有利である。
“炭水化物化学で常用の保護基”として、特に
アセチル−、ベンゾイル−、ベンジル−又はトリ
メチルシリル−基が適する。
カルボキサミド基の置換基として、アルキル
−、アルコキシアルキル−、カルボキシアルキル
−及びアルコキシカルボニルアルキル基がこれに
該当し、この際アルキル基はそのつど炭素原子１
〜５個、殊に１〜３個有する。二置換のカルボキ
サミド官能基においては、両置換基が閉環して、
ヘテロ原子、例えば酸素原子、窒素原子及び硫黄
原子で遮断されて良い環を形成し得る。
一般式のレゾルフイン−誘導体で一般式の
グリコシドに結合しているグリコシド基として
は、相応するグリコシダーゼにより再びレゾルフ
イン−基礎構造から分離される全ての単糖類及び
少糖類が適する。本発明によるグリコシドの例と
しては次のものが挙げられる：β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド、α−Ｄ−ガラクトピラノシド、β−
Ｄ−グルコピラノシド、α−Ｄ−グルコピラノシ
ド並びにα−Ｄ−マンノピラノシド。
グリコシド基としては、サツカリド鎖を分離す
る酵素により単一もしくは少−糖類の段階にまで
分解されるオリゴ−糖鎖も適し、その単−もしく
は少−糖類はその側に相応するグリコシドと共
に、直接レゾルフイン−基礎構造から分離するこ
とができる。かかるオリゴ−糖鎖としては特に単
糖−単位２〜10、特に２〜７から構成されている
鎖である。
互変異性の一般式′ａ及び′ｂ： 〔式中R1′〜R6′は置換基R1〜R6と同じものであ
り、この際R1′〜R6′は全てが同時に水素原子を表
わすことは出来ず、かつＹは前記のものである〕
の化合物は新規化合物である。
これは本発明による一般式のレゾルフイン−
誘導体のグリコシドの製造のための中間生成物と
して特に適する。
一般式′の化合物は、公知のレゾルフイン
（式中R1〜R6がそのつど水素原子を表わす一般式
の化合物）の製造に適している方法と同様にし
て製造される。
一般式′の化合物は有利な方法で、一般式
： 〔式中R1′〜R3′は前記のものである〕のニトロソ
レゾルシン−誘導体を、一般式： 〔式中R4′〜R6′は前記のものである〕のレゾルシ
ン−誘導体とパイロルース鉱及び硫酸の存在で低
温で反応させることにより製造する。その際先
ず、式中ＹがＮ→Ｏ−基である一般式′の化合
物が生成する。この物質はアンモニアの存在で亜
鉛末を用いて容易に式中Ｙが窒素原子を表わす一
般式′の化合物に変換することができる。
一般式の化合物と一般式の化合物との反応
は通例は−10℃〜50℃、殊に０℃〜30℃の温度で
実施する。一般式及び一般式の物質を約０℃
で混合し、かつ反応混合物を引続き室温に加熱す
る場合に、反応は特に穏やかに経過する。パイロ
ルース鉱の濃度は有利に0.5〜５、殊に１〜２モ
ル／でなければならない。硫酸濃度は0.5〜５、
殊に１〜３モル／でなければならない。
式中ＹがＮ→Ｏ−基である一般式′の化合物
の、式中Ｙが窒素原子を表わす一般式′の化合
物への還元は殊にアンモニア性溶液中で亜鉛末を
用いて実施する（ニエツキ等著、（Nietzki）、ベ
ル．ドイチユ．ケム．ゲス．（Ber.Dtsch.Chem.
Ges.）第22巻、第3020頁〔1889年〕参照）。溶剤
として有利に水−アルコール−混合物、殊にメタ
ノール０〜４部と共に水１部よりなる混合物を使
用する。還元すべき物質１モルにつき亜鉛末１〜
20、殊に１〜５モルを少量ずつ加える。この際反
応溶液の温度は−10℃〜＋35℃、殊に＋５℃〜＋
10℃で保つ。温度範囲を正確に保持することは明
白な反応経過に不可欠なことであると判明した。
冷却なしでは発熱反応が起り、分離し難い副生成
物が生じる。
選択された穏和な条件下で、一般式及び一般
式の物質の間の反応は明白に、かつ良好な収率
で経過する。選択された合成方法は変えることが
できる。これは特に非対称に置換したレゾルフイ
ン−もしくは同様にレゾアズリン−誘導体の製造
に関して数多くの合成可能性をもたらす。
式中R4′又は／及びR6′が低級アルコキシカルボ
ニル基、場合により一置換又は二置換のカルボキ
サミド基、又は基−COO−（CH2CH2O）ｎ−R7
を表わす式′のレゾルフイン−誘導体は有利に
一般式： 〔式中R1、R2、R3及びR5は前記のものであり、
R4″及びR6″はカルボキシ基を表わし、かつR7″は
水素原子又は低級アルキル基を表わす〕のトリア
シル化ジヒドロレゾルフインを介して製造され
る。
カルボン酸−官能は文献で公知の方法により、
例えば塩化オキサリル／DMF又は塩化チオニ
ル／DMFを用いて酸塩化物に変換し、これから
任意のアルコール及びアミンとの反応により相応
の置換したカルボン酸エステル−もしくはカルボ
キサミド−誘導体が得られる。
こうして得た一般式のアセチル化誘導体を苛
性アルカリ溶液、有利に苛性ソーダ溶液又は苛性
カリ溶液0.1〜5Mで、又はアンモニア水１〜15M
及び酸化剤、有利にヘキサシアノ鉄（）酸カリ
ウムで、水溶性の有機溶剤、例えば１，４−ジオ
キサン又はメタノールの添加下に処理することに
より相応する一般式のレゾルフイン−誘導体が
得られる。
アルコール成分としては原則的に全ての可能な
アルコールが適する。特にジエチレングリコール
−モノエチル−エーテル、トリエチレングリコー
ル−モノエチル−エーテル又は簡単なアルコー
ル、例えばメタノール又はエタノールが有利であ
る。アミン−成分は同様に全ての可能なアミンか
ら選択されて良い。特に極性基を有するアミン、
例えばモルホリン、メトキシエチルアミン又はグ
リシンアミド又はアンモニア、一級又は二級低級
アルキルアミンが有利である。更に、常法で保護
されたカルボキシル−官能を有するアミノカルボ
ン酸、例えばグリシン−第三ブチル−エステル、
グリシンベンジルエステル又はN〓−BOC−リジ
ンメチルエステルを使用することができる。こう
して保護基の分離後、脂肪族カルボン酸−官能を
有するレゾルフインもしくはレゾルフイン−グ
リコシドが得られる。
一般式のアセチル化ジヒドロレゾルフイン
は、相応するレゾルフイン又はレゾアズリンか
ら、強還元剤、例えば塩化錫（）又は酢酸クロ
ム（）との反応により、又は電気化学的還元及
び引続いてのアセチル化により得られる。還元の
ためにレゾルフイン又はレゾアズリンを５〜35％
の水性塩酸中塩化錫（）２〜10当量、有利に２
〜６当量と共に10分間〜１時間加熱する。冷却す
るとジヒドロ化合物が析出する。アセチル化は常
法で無水酢酸で行なう。一般式の化合物は一容
器方法で還元的アセチル化により有利に製造され
る。相応するレゾルフイン又はレゾアズリンは塩
化錫（）２〜６当量と共に５分間〜５時間、有
利に10分間〜３時間無水酢酸中還流下に加熱する
か、又は室温（RT）において４〜16時間撹拌す
る。
一般式のレゾルフイン−誘導体のグリコシド
の合成の際には、非−螢光化合物が生成し、これ
から相応するグリコシダーゼを用いて酵素的分解
により再び螢光のレゾルフイン−誘導体が遊離す
る。本発明による発螢光団のレゾルフイン−誘導
体は従来公知のその他の発色団もしくは発螢光団
の基のグリコシドに比較して極めて有利な特性を
示す。一置換誘導体としてこれは酵素的加水分解
の動力学を示し、これは極めて簡単にミハエリス
−メンテン−式により記載され得る。レゾルフイ
ン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドには例えばミハ
エリス−定数KM＝0.38ミリモル／があてはま
る。天然の基質乳糖によりこの加水分解の阻害は
競争であり、従つて一定の検査にはレゾルフイン
−誘導体のグリコシドの天然グリコシド、例えば
β−Ｄ−ガラクトシダーゼの場合には乳糖の添加
による特別な変換が限定されかつ可逆的に変化さ
れ得る。
本発明によるレゾルフイン−誘導体のグリコシ
ドは水溶液中で＋４℃で実添に無限に安定であ
る。レゾルフイン−基礎構造のグリコシドの溶解
性はすでに殆んどの動力学的目的に十分間に合
う。カルボン酸エステル、極性基もしくはスルホ
ン酸基を有するカルボン酸−誘導体は相応するグ
リコシドの溶解性をなお実際に改良させる。
本発明による生成物の励起及び放射は可視スペ
クトル範囲で十分な量子収量である。レゾルフイ
ンの最高螢光強度はPH−値7.0以上で達し、より
低いPH−値については少しずつ降下する。レゾル
フインのグリコシドは水溶液中で殆んど帯黄色で
ある（約470nｍでλnax）。酵素反応の後に生成物
は赤色を示し（約570nｍでλnax）、従つて物質は
光度測定及び非−器械的な視覚的方法に同様に卓
越的に適している。
本発明のもう１つの目的は新規の一般式のレ
ゾルフイン−誘導体のグリコシドを相応するグリ
コシダーゼ、例えばα−Ｄ−及びβ−Ｄ−カラク
トシダーゼ、α−Ｄ−及びβ−Ｄ−グリコシダー
ゼ並びにα−Ｄ−マンノシダーゼの活性の測定の
ために使用することである。
式中グリコシド−基がオリゴー糖−鎖である一
般式のレゾルフイン−誘導体は、糖鎖を分離す
る酵素、例えばα−アミラーゼの検知にも特に適
する。この際オリゴー糖鎖は検知すべき酵素によ
り特有の方法で殊に単糖類の段階にまで分離さ
れ、その際必要の場合にはその他の補助酵素を使
用することができる。次いでこれは相応するグリ
コシダーゼにより前記の方法でレゾルフイン−基
礎構造及び単糖類に分解される。
更に、新規の一般式のレゾルフイン−誘導体
のグリコシドを含有するグリコシダーゼ活性測定
のための診断剤が特許請求される。グリコシダー
ゼのための基質として一般式のレゾルフイン−
誘導体のグリコシドの使用は明らかに従来公知で
あるそれよりも精密な試験方式である。新規の基
質はグリコシダーゼの活性測定のために有利に生
物化学的、生物工学的並びに臨床−化学的領域で
使用され得る。これはより精密である。それから
多くの利点が生じる： (a) より少ない酵素−活性を測定することができ
る。
(b) より少ない量の試料を使用することができ
る。
(c) 活性の測定は著しくより短時間で行なうこと
ができる。
(d) 少ない試料装入及び有利な測定波長は更にそ
の他の試料成分による方法の妨害感受性を減少
させる。
(e) 担体母体中の変換を非可動酵素で測定するこ
とができる。
特許請求した基質は各素性のグリコシダーゼの
活性を測定するのに適していることが示された。
本発明による一般式の基質を有する診断剤は従
来公知の試験剤よりも明らかに精密に反応する。
一般式のレゾルフイン−誘導体のグリコシド
は免疫学的測定法にも適し、その際グリコシダー
ゼは指示−酵素として使用され、その活性は免疫
学的反応の実施により確められねばならない。か
かる酵素指示反応での免疫学的測定方法は、当業
者には酵素免疫分析として知られている。この方
法は蛋白質、多糖類、ホルモン、医薬品及びその
他の低分子物質の濃度を10-5〜10-12モル／の
範囲で測定するために用いる。相分離処理の必要
に応じて均質及び不均質試験操作の区別をする。
もう１つの分類は競争及び非競争試験原理におい
て行ない得る。
しかしながら全ての試験原理は酵素−抗原−も
しくは酵素−抗体−複合体で操作する。酵素指示
反応は全ての酵素免疫分析に共通である。かかる
目的に適当な指示酵素は例えばグリコシダーゼ、
特にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである。かかる酵
素免疫分析におけるグリコシダーゼの測定は通
例、適当な基質を添加し、酵素的に分解し、かつ
常法で測光的に又は同様に螢光測定することによ
り行なわれる。
従つてグリコシダーゼ−試験系の改善はかかる
酵素免疫分析における著しい利点にもつながる： １ より高い精密性はこの場合も更に検出限界の
低下、より短かい反応時間及びより少ない試料
装入及びそれによりその他の試料成分によるよ
り少ない妨害を可能にする。
２ より有利な測定波長は一定の反応実施におい
て不溶性の成分による、例えば懸濁による方法
の妨害感受性を減少させる。
診断剤は本発明による一般式の基質１糖又は
それ以上の他に、適当な緩衝液系並びに場合によ
りその他の適当なかかる診断剤に常用の添加物、
例えば湿潤剤、安定剤等を含有する。診断剤は溶
液の形で、凍結乾燥物として、粉末混合物とし
て、試薬錠剤又は吸収可能な支持体上に付着され
て存在して良い。
溶液の形の本発明による診断剤は殊に試験に必
要な全ての試薬を含有する。溶剤としては水又は
水溶性の有機溶剤、例えばメタノール、エタノー
ル、アセトン又はジメチルホルムアミドと水の混
合物がこれに該当する。安定性の理由から、試験
に必要な試薬を２種又はそれ以上の溶液に分配す
ることが有利であり、これらの溶液は実際の検査
の際にはじめて混合される。
そのつど約５〜20mg、殊に約10mgの総重量で凍
結乾燥物の形の診断剤を製造するために、試験に
必要な全試薬の他に常用の賦形剤、例えばポリビ
ニルピロリドン、及び場合によりその他の充料、
例えばマンニツト、ソルビツト又はキシリツトを
含有する溶液を乾燥する。
粉末混合物又は試薬錠剤の形の診断剤は、試験
成分を常用のガレヌス添加物と混合し、顆粒化す
ることによつて製造することができる。この種類
の添加物は例えば糖アルコール、例えばマンニツ
ト、ソルビツト又はキシリツト又はその他の溶性
の不活性化合物、例えばポリエチレングリコール
又はポリビニルピロリドンである。粉末混合物又
は試薬錠剤は一般に最終重量約30mg〜200mg、殊
に50mg〜80mgである。
試験テープの形の診断剤の製造には、吸収可能
な支持体、殊に濾紙、繊維素又は合成繊維フリー
スを、易揮発性の溶剤、例えば水、メタノール、
エタノール又はアセトン中の、試験テープの製造
に常用の必要な試薬の溶液で、含浸させる。これ
は１含浸工程で行なわれてよい。しかしながら
屡々、含浸を数工程で実施することが有利であ
り、この際そのつど診断剤成分の一部分を含有す
る溶液を使用する。すなわち例えば第１工程では
緩衝液及びその他の水溶性の添加物を含有する水
溶液を含浸し、次いで第２工程でグリコシダーゼ
−基質を含有する溶液で含浸することができる。
完成試験紙はそのものとして使用する又は自体公
知の方法で柄状物に接着させるか、又は殊に西ド
イツ国特許第2118455号明細書に依るプラスチツ
ク及び目のつんだ網状物の間に接着させることが
できる。
本発明による化合物の合成のために実施するこ
とができる数多くの種々の方法の若干、並びに実
例としてグリコシダーゼ活性測定のための新規の
レゾルフイン−誘導体のグリコシドの使用を次の
実施例につき示す。しかしながらそれらは本発明
の目的の限定を意味するものではない。
実施例 例 １ レゾルフイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド (a) レゾルフインの製造 レゾルフインを、良好な純度で市販で得られ
るその酸化生成物レゾアズリンから、ニエツキ
（Nietzki）等の記載に依り〔ベリヒト・デ
ル・ドイチエン・ケミカル ゲゼルシヤフト
（Ber.Dtch.Chem.Ges.）第22巻（1889年）第
3020〜3038頁〕製造する。このためにレゾアズ
リン〔フルカ（Fluka）、ブツハス（Buchs）、
スイス（Schweiz）〕10ｇ（43ミリモル）をビ
ーカー中で25％のアンモニア溶液50ml、37％の
亜硫酸水素ナトリウム−溶液25ml及び水50mlと
共に30分間沸騰水浴上で加熱する。再びアンモ
ニア溶液20ml、亜硫酸水素塩−溶液７ml及び水
20mlを添加し、更に30分間加熱する。変換は青
色から赤色への変色で、又は薄層−クロマトグ
ラフイーを介して観察することができる。反応
が完全に終了した後に、32％の塩溶液10mlを加
え、PH５にする。反応溶液を１日冷蔵庫中に放
置する。その後に褐色の沈殿を吸引濾過し、氷
冷の塩酸溶液でPH４にし、洗浄し、110℃で乾
燥する。収量7.8ｇ（36.7ミリモル；理論値の
85％）。
(b) レゾルフイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
へのレゾルフインのグリコシル化 テトラアセテートの中間段階を介してフエノ
ール性ヒドロキシル基へのグリコシル化は次の
方法により成功した。微粉末のレゾルフイン
2.13ｇ（10ミリモル）、アセトブロモ−α−Ｄ
−ガラクトース〔シグマ（Sigma）ミユンヘ
ン〕4.12ｇ（10ミリモル）、酸化銀（）〔フル
カ（Fluka）、ブツハス（Buchs）、スイス〕
1.16ｇ（５ミリモル）、硫酸カルシウム
（CaSO4・1/2H2O；無水硫酸カルシウム）５
ｇ、粒状沃素若干量及びキノリン50μを塩化
メチレン50ml中で室温で40分間撹拌する。この
際レゾルフインの40％がレゾルフイン−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド−テトラ−アセテートに
変換する。反応の調整は再び薄層−クロマトグ
ラフイーに依り実施されてよい。固体成分を襞
付き濾過器及び遠心分離を介して分離した後に
塩化メチレンを回転蒸発器中で除去する。レゾ
ルフイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−テト
ラ−アセテートは褐黄色のシロツプ状物として
残留する。収量約２ｇ（理論値の35％）。
レゾルフイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
−テトラ−アセテート２ｇをそれ以上の精製な
しに無水メタノール80ml中に取り込む。ナトリ
ウム0.5ｇを小片ずつ、氷浴中で無水メタノー
ル20ml中に溶解する。氷浴中で撹拌下でメトキ
シド溶液６〜８mlを30分間以内に１mlずつレゾ
ルフイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−テト
ラ−アセテート−溶液に加え、かつ脱アセチル
化を薄層クロマトグラフイーを介して観察す
る。生成した橙色のレゾルフイン−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドを吸引濾過し、かつ氷冷のメ
タノール少量で洗浄する。収量約１ｇ粗物質
（理論値の70％）。メタノールから再結晶させ、
次いで乾燥（60℃以上にならない）して純粋な
生成物0.2ｇが得られる。
反応経過の調整のための全薄層−クロマトグ
ラフイー検査は珪酸ゲル60（メルクMerck社、
ダルムスタツト）系及び展開剤塩化メチレン／
メタノール（９／１）を用いて行なうことがで
きる。この系のために次のRf−値があてはま
る： レゾルフイン 0.4 レゾアズリン 0.35 レゾルフイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−
テトラ−アセテート 0.9 レゾルフイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
0.1 例 ２ レゾルフイン−β−Ｄ−グリコシド レゾルフイン（例1aに依り製造した）2.13ｇ
（10ミリモル）、アセトブロモ−α−Ｄ−グルコー
ス4.11ｇ（10ミリモル）及びヘキサデシルトリメ
チルアンモニウムブロミド3.64ｇ（10ミリモル）
を1N苛性ソーダ溶液11.5ml及びクロロホルム50
mlの混合物中で４時間還流加熱した。その後蒸発
乾固させ、酢酸エステルで浸出する。酢酸エステ
ル溶液を新たに蒸発乾固する。エタノール20mlで
取り込む。この溶液から生成するテトラアセチル
レゾルフイン−β−Ｄ−グリコシドを活性炭の添
加下にメタノールから再結晶させる。
脱アセチル化のために、メタノール10mlで取り
込む。室温で２時間撹拌後、析出した生成物を吸
引濾過し、乾燥する。収量：50mg 1H−NMR（〔Ｄ〕6−DMSO）：δ＝3.15−3.80
（ｍ、6H）；4.5−6.5（広巾、4H）；5.12（ｄ、Ｊ
＝6.9Hz、1H）；6.29（ｄ、Ｊ＝2.0Hz、1H）；
6.80（dd、Ｊ＝9.6及び2.0Hz、1H）；7.12（dd、
Ｊ＝8.5及び2.0Hz、1H）；7.16（ｄ、Ｊ＝2.0Hz、
1H）；7.55（ｄ、Ｊ＝9.6Hz、1H）；7.80（ｄ、Ｊ
＝8.5Hz、1H）． 例 ３ レゾルフイン−１−カルボン酸メチルエステル ニトロソレゾルシン50ｇ、３，５−ジヒドロキ
シ安息香酸メチルエステル53.3ｇ及びパイロルー
ス鉱28.0ｇをメタノール500ml中に溶かす、もし
くは懸濁させる。氷冷下で５〜10℃で濃硫酸34.4
mlを滴加する。氷浴の除去後、更に２時間撹拌す
る。その後に冷却下でアンモニア水溶液200mlを
加える。生成する沈殿をガラス繊維濾過器を介し
て濾別する。濾液に５〜10℃で亜鉛末10ｇを少量
ずつ加える。還元が完了するまで（薄層クロマト
グラフイー（DC）−調整、展開剤として酢酸エス
テル／メタノール４：１、反応時間約1.5時間）
の間室温で撹拌する。回転蒸発器上で浴温25℃で
容量の1/3に濃縮する。冷却下で濃塩酸で変色す
るまで酸性化することにより、所望の生成物が生
成する。希塩酸で洗浄し、塩化カルシウム上で真
空中乾燥した後にレゾルフイン−１−カルボン酸
メチルエステルが得られる。収量：30.9ｇ（理論
値の36％）。
1H−NMR：（〔Ｄ〕6−DMSO）：δ＝3.98（ｓ、
3H）；6.47（ｄ、Ｊ＝2.2Hz、1H）；6.85−6.95
（ｍ、2H）；7.09（ｄ、Ｊ＝2.2Hz、1H）；7.60
（ｄ、Ｊ＝9.6Hz、1H）． 螢光：吸収：λnax＝570nｍ 発光：λnax＝588nｍ 同様の方法で、 (a) ３，５−ジヒドロキシ安息香酸及びニトロソ
レゾルシンから、レゾアズリン−１−カルボン
酸を介して、 レゾルフイン−１−カルボン酸 UV／VIS（0.1M燐酸カリウム−緩衝液、PH
7.5）：λnax＝569nｍ、 (b) ４−Ｏ−メチル−没食子酸メチルエステル及
びニトロソレゾルシンから、４−メトキシ−レ
ゾアズリン−１−カルボン酸メチルエステルを
介して、 ４−メトキシ−レゾルフイン−１−カルボン
酸メチルエステル UV／VIS（0.1M燐酸カリウム−緩衝液、PH
7.5）：λnax＝592nｍ (c) ３，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステ
ル及び４−クロル−６−ニトロソレゾルシンか
ら、８−クロル−レゾアズリン−１−カルボン
酸メチルエステルを介して、 ８−クロル−レゾルフイン−１−カルボン酸
メチルエステル (d) ４−Ｏ−メチル没食子酸メチルエステル及び
４−ブロム−６−ニトロソレゾルシンから、８
−ブロム−４−メトキシ−レゾアズリン−１−
カルボン酸メチルエステルを介して、 ８−ブロム−４−メトキシ−レゾルフイン−
１−カルボン酸メチルエステル (e) ５−ニトロレゾルシン及びニトロソレゾルシ
ンから１−ニトロ−レゾアズリンを介して、 １−ニトロ−レゾルフイン (f) レゾルシン−５−スルホン酸及びニトロソレ
ゾルシンから、レゾアズリン−１−スルホン酸
を介して、 レゾルフイン−１−スルホン酸 が得られる。
例 ４ レゾアズリン−４−カルボン酸 ニトロソレゾルシン1.60ｇ（10.5ミリモル）、
２，６−ジヒドロキシ安息香酸1.55ｇ（10.0ミリ
モル）及びパイロルース鉱0.86ｇ（10ミリモル）
をメタノール20ml中に取り込み、０℃に冷却す
る。これに濃硫酸1.06mlを滴加する。更に２時間
冷却なしに撹拌する。沈殿する赤色生成物を濾別
し、メタノールで洗浄し、乾燥する。収量：2.3
ｇ（理論値の85％） UV／VIS（0.1M燐酸カリウム緩衝液PH7.5）：
λnax＝614nｍ（ε＝48cm2モル-1） 酸性後λnax＝522nｍ（ε＝32cm2モル-1） 例 ５ レゾルフイン−４−カルボン酸 レゾアズリン−４−カルボン酸（例４に依り製
造）2.3ｇを水20ml及び25％のアンモニア５ml中
に溶かす。青色溶液に氷冷下で亜鉛末５ｇを加え
る。その後に氷冷を除き、従つて溶液は徐々に室
温に温くなる。還元は青色から暗紫色への変色で
容易に知るか、もしくは薄層−クロマトグラフイ
ー（展開剤：メタノール／酢酸エステル１：１）
に依り観察される。過剰の亜鉛末は濾別する。反
応溶液を氷酢酸５ml及び濃塩酸で酸性化する。沈
殿する生成物を濾別し、希塩酸で洗浄し、真空中
塩化カルシウム上で乾燥する。収量：1.8ｇ（理
論値の82％）。
UV／VIS：（0.1M燐酸カリウム緩衝液PH7.5）：
λnax＝579.4nｍ（ε＝48.6cm2モル-1）； 酸性後：λnax＝485.9nｍ（ε＝34.7cm2モル-1） 螢光：吸収：λnax＝579nｍ 発光：λnax＝593nｍ 例 ６ １−メチルレゾルフイン−４−カルボン酸 ２，６−ジヒドロキシ−４−メチル安息香酸
840mg、ニトロソレゾルフイン760mg、パイロルー
ス鉱430mg及び硫酸0.53mlを例４と同様に反応さ
せて１−メチルレゾアズリン−４−カルボン酸に
する。収量：0.8ｇ こうして得た１−メチルレゾアズリン−４−カ
ルボン酸を例５と同様に還元して１−メチルレゾ
ルフイン−４−カルボン酸にする。収量：0.4ｇ UV／VIS（0.1M燐酸カリウム緩衝液PH7.5）：
λnax＝571nｍ 例 ７ レゾルフイン−４−カルボン酸−モルホリド (1) Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルジヒドロレゾルフ
イン−４−カルボン酸 変法(a) レゾルフイン−４−カルボン酸５ｇ（19.4ミ
リモル）又はレゾアズリン−４−カルボン酸
5.3ｇ（19.4ミリモル）を10％の塩酸100ml中で
0.5時間塩化錫（）７ｇ（38ミリモル）と共
に還流加熱する。この際溶液は緑色に変色す
る。冷却し、生成するジヒドロレゾルフイン−
４−カルボン酸を窒素下で濾別し、真空中五酸
化燐上を乾燥する。こうして得た粗生成物を30
分間無水酢酸30ml及び酢酸ナトリウム20mgと共
に還流加熱する。反応混合物を氷水200mlに入
れ、14時間撹拌する。沈殿をエタノール／水か
ら再結晶させる。所望の化合物4.8ｇ（65％）
が得られる。
融点：197〜199℃ DC（珪酸ゲル、展開剤クロロホルム／メタノ
ール／氷酢酸９：１：0.1） Rf＝0.33 変法(b) レゾルフイン−４−カルボン酸5.1ｇ（20ミ
リモル）を無水酢酸20ml中で塩化錫（）11ｇ
（60ミリモル）と共に１時間80℃で撹拌する。
氷水230mlに加え、１時間撹拌し、濾過し、変
法(a)の様に後処理する。
収量：5.4ｇ（71％） (2) Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルジヒドロレゾルフ
イン−４−カルボン酸クロリド Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルジヒドロレゾルフ
イン−４−カルボン酸3.85ｇ（10ミリモル）に
塩化オキザリル5.4ml（60ミリモル）を混合し、
−10℃に冷却する。これにジメチルホルムアミ
ド１滴を加え、反応混合物を撹拌下で室温に温
める。この際遊離物がガス発生下に溶解し、ガ
ス発生の終了後、更に0.5時間撹拌し、蒸発さ
せ、無水塩化メチレン20mlで各３回取り込み、
蒸発乾固する。こうして粗生成物４ｇが得ら
れ、これ以上精製することなく、更に処理す
る。
DC（珪酸ゲル、展開剤クロロホルム／メタノ
ール／氷酢酸９：１：0.1） Rf＝0.42； 無色のフレーク状物、これは数時間後に赤色
に変わる。
(3) Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルジヒドロレゾルフ
イン−４−カルボン酸−モルホリド 粗製の酸塩化物11.3ｇ（31.4ミリモル）を無
水塩化メチレン150ml中に溶かす。これにトリ
エチルアミン8.7ml（63ミリモル）及び引続き
モルホリン3.3ml（37.7ミリモル）を滴加する。
更に２時間撹拌し、溶液を１％のクエン酸、炭
酸水素ナトリウム溶液及び水で洗浄し、有機相
を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発する。
残渣をエタノールから結晶化させる。収量：
8.1ｇ（63％）、融点：133〜135℃（分解） (4) レゾルフイン−４−カルボン酸−モルホリド トリアセチルジヒドロレゾルフイン−４−カ
ルボン酸−モルホリド3.7ｇ（９ミリモル）を
メタノール250ml及び水250mlで取り込む。これ
に1n苛性ソーダ溶液36ml及びヘキサシアノ鉄
酸（）カリウム6.0ｇ（18ミリモル）を加え、
14時間室温で撹拌する。塩酸でPH３に酸性化後
蒸発乾固させ、アセトンで浸出する。色料−溶
液を珪酸ゲル500mlを介して展開剤としてアセ
トンを用いて濾過する。色料含有の溶離液を蒸
発した後に生成物2.3ｇ（80％）を得る。
UV／VIS（0.1M燐酸カリウム緩衝液PH7.5）：
λnax＝575nｍ、ε＝55000cm2モル-1） DC（展開剤、２以下参照） Rf＝0.52 1H−NMR（〔Ｄ〕6−DMSO）：δ＝3.3−3.8
（ｍ、8H）；6.50（ｄ、Ｊ＝２Hz、1H）；6.64
（ｄ、Ｊ＝１Hz、1H）；6.76（dd、Ｊ＝10及び
２Hz、1H）；7.44及び7.51（それぞれｄ、Ｊ＝
10Hz、2H）． 例 ８ テトラアセチルレゾルフイン−１−カルボン酸
メチルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
及びテトラアセチルレゾルフイン−９−カルボ
ン酸メチルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド レゾルフイン−１−カルボン酸メチルエステル
（例３に依り製造）6.8ｇ、酸化銀（）5.75ｇ炭
酸銀6.75ｇ、分子ふるい４Å15ｇ及びα−ブロム
−テトラアセチルガラクトース10ｇを無水クロロ
ホルム250mlと共に４時間室温で撹拌する。更に
α−ブロム−テトラアセチル−ガラクトース５ｇ
を添加した後に一夜更に撹拌する。反応混合物を
ガラス繊維濾過器を介して濾過し、蒸発濃縮す
る。油状粗生成物を珪酸ゲル２上で溶離剤とし
てクロロホルム／酢酸エステル２：１でクロマト
グラフイーにかける。Rf＝0.28を有する黄色の溶
離分2.5ｇが得られる（HPTLC珪酸ゲル、同一の
溶離剤）。メタノールとの撹拌によりテトラアセ
チルレゾルフイン−９−カルボン酸メチルエステ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが橙色の結晶形
で得られる。
収量1.5ｇ 1H−NMR（〔Ｄ〕6−DMSO）：δ＝1.95、2.03、
2.04及び2.14（jes、12H）；3.88（ｓ、3H）；4.11
（ｄ、Ｊ＝７Hz、2H）；4.51（ｔ、Ｊ＝７Hz、
2H）；5.24（ｍ、2H）；5.36（ｍ、1H）；5.69（ｍ、
1H）；6.31（ｄ、Ｊ＝２Hz、1H）；6.97（ｄ、Ｊ
＝２Hz、1H）；7.04（dd、Ｊ＝8.8及び2.4Hz、
1H）；7.14（ｄ、Ｊ＝2.4Hz、1H）；7.78（dd、Ｊ
＝8.8Hz、1H）． その後、Rf＝0.24を有する同様に黄色の溶離分
が得られる。メタノールから、テトラアセチルレ
ゾルフイン−１−カルボン酸メチルエステル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシドが黄橙色結晶で晶出す
る。
収量：1.2ｇ 1H−NMR（〔Ｄ〕6−DMSO）：δ＝1.95、2.02、
2.04及び2.14（各ｓ、12H）；3.90（ｓ、3H）；
4.09（ｍ、2H）；4.51（ｍ、1H）；5.24（ｄ、Ｊ＝
７Hz、1H）；5.25（ｍ、1H）；5.36（ｍ、1H）；
5.71（ｍ、1H）；6.50（ｄ、Ｊ＝２Hz、1H）；
6.83（dd、Ｊ＝10及び２Hz、1H）；7.20及び7.24
（各ｄ、Ｊ＝２Hz、2H）；7.47（ｄ、Ｊ＝10Hz、
1H）． 純粋な生成物の間でなお混合溶離分が得られ、
それからメタノールからの再結晶により、両異性
体化合物の混合物の結晶2.5ｇが得られる。
同様の方法で、α−ブロム−テトラアセチルガ
ラクトース及び (a) ４−メトキシ−レゾルフイン−１−カルボン
酸メチルエステルから、テトラアセチル−４−
メトキシ−レゾルフイン−１−カルボン酸メチ
ルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び
テトラアセチル−６−メトキシ−レゾルフイン
−９−カルボン酸メチルエステル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド (b) ８−クロル−レゾルフイン−１−カルボン酸
メチルエステルから、テトラアセチル−８−ク
ロル−レゾルフイン−１−カルボン酸メチルエ
ステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及びテト
ラアセチル−２−クロル−レゾルフイン−９−
カルボン酸メチルエステル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシドが得られる。
例 ９ テトラアセチルレゾルフイン−４−カルボン酸
モルホリド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び
テトラアセチルレゾルフイン−６−カルボン酸
−モルホリド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド レゾルフイン−４−カルボン酸モルホリド3.26
ｇ（10ミリモル）を例８と同様にしてガラクトシ
ド化する。粗生成物を珪酸ゲル１上で溶離剤と
して酢酸エステル／アセトン３：１でクロマトグ
ラフイーにかける。こうしてテトラアセチル−レ
ゾルフイン−６−カルボン酸モルホリド−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド0.9ｇ DC（珪酸ゲル、溶離剤例７参照） Rf＝0.71 及びテトラアセチルレゾルフイン−４−カルボ
ン酸モルホリド−ｐ−Ｄ−ガラクトピラノシド
0.4ｇ DC（珪酸ゲル、同一の溶離剤） Rf＝0.76 並びに両異性体よりなる混合溶離分1.2ｇが得
られる。
例 10 レゾルフイン−１−カルボン酸メチルエステル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド テトラアセチルレゾルフイン−９−カルボン酸
メチルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
1.2ｇを例２と同様にしナトリウムメチラート／
メタノールで脱アセチル化する。収量：0.8ｇ UV／VIS（0.1M燐酸カリウム緩衝液PH7.5）：
λnax＝464nｍ（ε＝21.8cm2、モル-1） β−ガラクトシダーゼでの分離後、レゾルフイ
ン−１−カルボン酸メチルエステルの陰イオンが
得られる。λnax＝572nｍ（ε＝65.4cm2モル-1） 1H−NMR（〔Ｄ〕6−DMSO）：3.20−3.80（ｍ、
6H）；3.91（ｓ、3H）；5.09（ｄ、Ｊ＝7.5Hz、
1H）；6.30（ｄ、Ｊ＝2.1Hz、1H）；6.81（dd、Ｊ
＝9.8及び2.1Hz、1H）；7.30（ｍ、2H）；7.51
（ｄ、Ｊ＝9.8Hz、1H）；OH−陽子極めて巾広
い約5. 同様の方法で相応するテトラアセテートの脱ア
セチル化により次のものが得られる。
(a) レゾルフイン−１−カルボン酸メチルエステ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド 1H−NMR（〔Ｄ〕6−DMSO）：δ＝3.4−3.7
（ｍ、6H）；5.09（ｄ、Ｊ＝7.5Hz、1H）；6.34
（ｄ、Ｊ＝２Hz、1H）；6.97（ｄ、Ｊ＝２Hz、
1H）；7.08−7.17（ｍ、2H）；7.75（ｄ、Ｊ＝
10Hz、1H）；OH極めて広巾、約5ppm. (b) ４−メトキシ−レゾルフイン−１−カルボン
酸メチルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド (c) ６−メトキシ−レゾルフイン−９−カルボン
酸メチルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド (d) ８−クロル−レゾルフイン−１−カルボン酸
メチルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド (e) ２−クロル−レゾルフイン−９−カルボン酸
メチルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド。
(f) レゾルフイン−６−カルボン酸モルホリド−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド Rf（酢酸エステル／イソプロパノール／水
９：４：２）＝0.3β−ガラクトシダーゼでの分
離後 UV／VIS（0.1M燐酸カリウム緩衝液PH7.5）：
λnax＝574.6nｍ 螢光発光：λnax＝593nｍ (g) レゾルフイン−４−カルボン酸モルホリド−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド Rf（酢酸エステル／イソプロパノール／水
９：４：２）＝0.3β−ガラクトシダーゼでの分
離後、 UV／VIS（0.17燐酸カリウム緩衝液PH7.5）：
λnax＝574.6nｍ 螢光発光：λnax＝593nｍ 例 11 レゾルフイン−９−カルボン酸−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド−トリエチル−アンモニウム塩 レゾルフイン−９−カルボン酸メチルエステル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド266mgを水50ml及
び１，４−ジオキサン20ml中に取り込む。これに
0.1N苛性ソーダ溶液５mlを0.5mlずつ添加し、こ
の際溶液のPH−値が12.5以上に上らないようにす
る。反応混合物をDEAE−セフアデツクス
（Sephadex）、炭酸塩−形６mlに装入し、水180ml
で洗浄する。
その後、生成物を0.1Mトリエチルアンモニウ
ムカルボネート緩衝液PH7.5で溶離する。溶離物
を真空中蒸発濃縮させる。その後エタノールで数
回蒸発させる。
収量：レゾルフイン−９−カルボン酸−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド−トリエチルアンモニウム
塩110mg UV／VIS（0.1M燐酸カリウム緩衝液PH7.5）：
λnax＝465nｍ β−ガラクトシダーゼでの分離後：λnax＝570nｍ 例 12 レゾアズリン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド レゾアズリン−ナトリウム塩12.6ｇを1N苛性
ソーダ溶液65ml及び水80ml中に溶かす。これにク
ロロホルム150ml中のアセトブロム−α−Ｄ−ガ
ラクトース20.6ｇ及びヘキサデシルトリメチルア
ンモニウムブロミド18.2ｇを加える。混合物を３
時間還流加熱する。その後蒸発乾固させ、酢酸エ
ステルで浸出する。酢酸エステル溶液を再び濃縮
し、珪酸ゲル500ｇ上でクロマトグラフイーにか
ける（溶離剤：塩化メチレン／酢酸エステル３：
１）。Rf＝0.5（HPTLC珪酸ゲル、同一の溶離剤）
を有するテトラアセチルレゾアズリン−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド2.13ｇが得られる。
脱アセチル化には、テトラアセチル−誘導体
2.13ｇをナトリウムメチラート0.1ｇと共に無水
メタノール100ml中で１時間室温で撹拌する。沈
殿する生成物を吸引濾過し、塩化カルシウム上で
真空中乾燥する。
収量：1.0ｇ Rf＝0.62（HPTLC珪酸ゲル、酢酸エステル／イ
ソプロパノール／水９：４：２） 1H−NMR（〔Ｄ〕6−DMSO）：δ＝3.30−3.90
（ｍ、6H）；4.54（広ｄ、Ｊ＝4.4Hz、1H）；4.67
（広ｔ、Ｊ＝4.4Hz、1H）；5.07（ｄ、Ｊ＝７Hz、
1H）；5.2（広ｄ、Ｊ＝4.4Hz、1H）；6.15（ｄ、
Ｊ＝２Hz、1H）；6.63（dd、Ｊ＝9.6及び２Hz、
1H）；7.10（dd、Ｊ＝９及び２Hz、1H）；7.2
（ｍ、2H）；7.96（ｄ、Ｊ＝9.6Hz、1H）；8.07
（ｄ、Ｊ＝９Hz、1H）． 例 13 ８−クロル−レゾアズリン−４−カルボン酸 ４−クロル−レゾルシン4.3ｇ（30ミリモル）
をエタノール20ml中に溶かす。水酸化カリウム
2.4ｇの添加後５℃に冷却する。冷却下亜硝酸イ
ソペンチル2.81mlを滴加する。その後室温で一夜
撹拌する。沈殿を濾別し、水中に溶解し、酸性化
する。黄色沈殿を新たに濾過し、40℃で真空中乾
燥する。収量：４−クロル−６−ニトロソレゾル
シン2.5ｇ（48％） Rf：0.28（HPTLC、珪酸ゲル、溶離剤：メタノ
ール／酢酸エステル１：３）。
４−クロル−６−ニトロソレゾルシン1.83ｇ、
２，６−ジヒドロキシ安息香酸1.55ｇ、パイロル
ース鉱0.86ｇ及び硫酸1.06mlをメタノール20ml中
に装入し、２時間０℃で並びに14時間室温で撹拌
する。赤色沈殿が得られ、これを濾別し、乾燥さ
せる。
収量：８−クロル−レゾアズリン−４−カルボン
酸2.45ｇ（80％） UV／VIS（0.1M燐酸カリウム緩衝液PH7.5）：
λnax＝621.5nｍ 同様の方法で、 (a) ２−メチル−レゾルシンから２−メチル−６
−ニトロソレゾルシンを介して ６−メチル−レゾアズリン−４−カルボン
酸、 (b) ４−メチル−レゾルシンから、４−メチル−
６−ニトロソレゾルシンを介して、 ８−メチル−レゾアズリン−４−カルボン酸 (c) ４−ブロム−レゾルシンから、４−ブロム−
６−ニトロソレゾルシンを介して、 ８−ブロム−レゾアズリン−４−カルボン酸 が得られる。
例 14 ８−クロル−レゾルフイン−４−カルボン酸 ８−クロル−レゾアズリン−４−カルボン酸
（例10に依り製造）２ｇを水20ml及び25％のアン
モニア５ml中に溶かす。氷冷下で亜鉛末を赤−紫
色へ完全に変色するまで添加する。過剰の亜鉛を
濾別する。酸性化後、沈殿する生成物を濾別し、
真空中40℃で塩化カリウム上で乾燥する。収量：
８−クロル−レゾルフイン−４−カルボン酸1.5
ｇ（79％）。
UV／VIS（0.1M燐酸カリウム緩衝液PH7.5）：
λnax＝585.5nｍ 同様の方法で、 (a) ６−メチル−レゾアズリン−４−カルボン酸
から、６−メチル−レゾルフイン−４−カルボ
ン酸 (b) ８−メチル−レゾアズリン−４−カルボン酸
から、８−メチル−レゾルフイン−４−カルボ
ン酸 (c) ８−ブロム−レゾアズリン−４−カルボン酸
から、８−ブロム−レゾルフイン−４−カルボ
ン酸 が得られる。
例 15 レゾルフイン−９−カルボン酸メチルエステル
−α−Ｄ−ガラクトピラノシド ペンタアセチルガラクトース3.9ｇに無水の塩
化亜鉛0.1ｇを加え、125℃に加熱する。20分間10
mmHgで撹拌する。溶融物にレゾルフイン−１−
カルボン酸メチルエステル１ｇを加える。混合物
を１時間41℃で撹拌し、その後例７に記載した方
法で珪酸ゲル上でクロロホルム／酢酸エステル
２：１でクロマトグラフイーにかける。
収量：テトラアセチル−レゾルフイン−９−カル
ボン酸−メチルエステル−α−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド（黄色油状物）25mg Rf＝0.22（HPTLC、珪酸ゲル、同一の溶離剤） レゾルフイン−９−カルボン酸メチルエステル
−α−Ｄ−ガラクトピラノシドへの脱アセチル化
は例10と同様にして実施する。
例 16 レゾルフイン−９−カルボン酸−（３，６−ジ
オキサオクチル）−エステル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド テトラアセチルレゾルフイン−９−カルボン酸
メチルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
0.6ｇにジエチレングリコールモノエチルエーテ
ル50ml及びサジ先量の水素化ナトリウムを加え、
15分間室温で撹拌する。その後アセトン100mlを
加える。生成する沈殿を濾別し、乾燥する。
収量：レゾルフイン−９−カルボン酸−（３，６
−ジオキサオクチル）−エステル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド56mg Rf＝0.54（珪酸ゲルHPTLC、溶離剤：酢酸エス
テル／イソプロパノール９：４） 例 17 レゾルフイン−マルトヘプタノシド アミラーゼ（E.C.2.4.1.19）、例えばバチルス
マセランス（Bacillus macerans）よりなるアミ
ラーゼは加水分解作用及び環化作用の他にグリコ
シル−転移特性を有し、これは少糖類及び少糖類
−誘導体の合成のために利用することができる
（メソーズ イン カルボヒドレート ケミスト
リー（Methods in Carbohydrate Chmistry）第
巻、第347頁）。
バチルスマセランスDSM24（凍結乾燥物；
0.46U／正味mg；正味の蛋白質含量28.5％）680mg レゾルフイン−グルコシド 500mg α−シクロデキストリン 3.5ｇ 及び セレンセン（Soerensen）燐酸塩緩衝液
（pSH6.2、0.01M） 70ml を混合する。装入物を24時間37℃で培養する。次
いで後精製のためにα−及び生じたβ−シクロデ
キストリンを先ずテトラクロルエチレン封鎖化合
物を介して分離する。網状化デキストラン〔セフ
アデツクス（Sephadex）LH20〕のクロマトグ
ラフイーによりアミラーゼ試験で高活性のレゾル
フイニルマルトヘプタノシドの凍結乾燥物50mgが
得られる。
例 18 β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定 (a) 使用する溶液の調製 緩衝溶液：HEPES 100ミリモル／ 塩化ナトリウム 154ミリモル／ Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム
２ミリモル／ BSA 10ｇ／ トウイーン（Tween）−20 0.5ｇ／ PH−値（苛性ソーダ溶液で調整）
7.3（37℃） 試薬溶液１： 前記の緩衝溶液中にレゾルフイン−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド0.8ミリモル／を溶かす。
試薬溶液２： 前記の緩衝溶液にレゾルフイン−９−カルボ
ン酸−β−Ｄ−ガラクトピラノシド3.5ミリモ
ル／を溶かす。
試薬溶液３： 前記の緩衝液中にレゾルフイン−９−カルボ
ン酸メチルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド1.0ミリモル／を溶かす。
酵素溶液 大腸菌（Escherichia coli）よりなる市販の
β−Ｄ−ガラクトシダーゼを前記の緩衝溶液中
に溶かす。この溶液の活性は約0.08U／ml（製
造者−データに対して）である。
測定の実施 測定は測光で579nｍで行なう。
試薬950μを１cmキユベツト中で37℃で酵
素溶液50μと混合する。反応に対する尺度と
して時間単位毎の消光上昇を〔mExt／分〕で
確かめる。反応時間での除去により測定した消
光から計算する。
次の表に実測した測定値を挙げる： 試験番号 反応〔mExt／分〕 １ 85 ２ 46 ３ 76 例 19 指示−薄膜に依るβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの
検出 均質の組成物のために次のものを施こす： 0.5M燐酸カリウム及び0.05M塩化マグネシウム
を有する水溶液、 PH7.3 ５ml アルギン酸ナトリウム 0.13ｇ ポリビニルプロピオネートの50％の分散物 ８ｇ 珪酸ゲル 10ｇ 水 12ml トリトン（Triton）Ｘ−100 0.4ｇ レゾルフイン−β−Ｄ−ガラクトピラノミド50mg をメタノール５ml中に溶かす。
この組成物を0.1mmの厚さのポリカルボネート
シート（ポカロンPokalon.ロンザ社Fa.Lonza）
上に0.2mmのスリツト巾で塗布する。被覆を50℃
で乾燥させ、その後に６枚に６mmで切断する。こ
れを接着テープで400μｍの厚さのポリスチロー
ルシートにはりつける。
こうして得た試験テープを短時間、試験すべ
き、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ含有の溶液中に浸
漬する。室温で２分間の待時間後に、赤色の反応
色が発現し、その強度は試験溶液中のβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼの濃度に依る。一定の既知の含量
のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを有する試験溶液に
依り、色尺度が得られ、これに基づき試料中のβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼの未知の含量が確しかめ
られる。
前記の試験テープは、試料中に存在するβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼの活性を運動的に反射測光で
測定することに使用することもできる。これにも
常法で既知のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−活性を
有する試料に基づき較正曲線をつくり、それに依
り試料の未知のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−活性
を確かめることができる。
例 20 遊離の及び複合のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの
活性測定 (a) 使用する溶液の製造 緩衝溶液：HEPES 100ミリモル／ 塩化ナトリウム 154ミリモル／ Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム
２ミリモル／ BSA 10ｇ／ トウイーン−20 0.5ｇ／ PH−値（苛性ソーダ溶液で調整）
7.3（37℃） 試薬溶液： 前記の緩衝溶液中にレゾルフイン−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド0.8ミリモル／を溶かす。
酵素溶液： 市販の大腸菌（Escherichia coli）よりなる
β−Ｄ−ガラクトシダーゼを緩衝液中に溶か
す。この溶液の活性は約0.08U／ml（製造者−
データに対して）である。
酵素−複合体−溶液： β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗体−製剤を使
用する。かかる酵素−抗体−複合体の製造は公
知である。これは例えばビオケム・ビオフイ
ス・アクタ（Biochem.Biophys.Acta）第612
巻、第40〜49頁（1980年）に記載されている。
製剤は緩衝液中で、前記の酵素溶液と大凡比較
可能な活性が生じるように、希釈される。
測定の実施 測定は測光的に578nｍで行なわれる。試薬
溶液950μはそのつど１cmキユベツト中で37
℃で酵素溶液50μと、もしくは酵素−複合体
−溶液50μと混合する。反応のための尺度と
して時間単位毎の消光上昇が〔mExt／分〕で
確かめられる。
遊離のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼでの反応に
は85mExt／分が、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
−抗体−複合体での反応には92mExt／分が測
定される。
両測定値は、遊離のβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼでも、並びに複合のβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼでも極めて良好に測定可能な消光差異が判明
されることを示す。
そのことから、前記の化合物は基質として遊
離のグリコシダーゼにも並びにグリコシダーゼ
−複合体にも同様の方法で適していることが明
らかである。従つて新規の基質は診断剤として
ばかりでなく遊離のグリコシダーゼの測定のた
めにも使用することができる。これは有利な方
法で免疫学的測定方法でも使用可能であり、そ
の場合グリコシダーゼは指示−酵素として使用
される。
例 21 α−アミラーゼ−活性の測定 クエン酸塩緩衝液PH６中に溶解したレゾルフイ
ン−マルトヘプタノシドに濾紙を浸す。こうして
得た試薬紙を順々にα−アミラーゼ含有の試料
で、並びにα−及びβ−グリコシダーゼで処理す
る。数分間後、明らかに目に見える赤色を検出す
ることができ、試料中でその強度又はα−アミラ
ーゼ−濃度は比例する。
既知のα−アミラーゼ−濃度を有する試料に依
り較正曲線が確認され、それに基づき試料の未知
のα−アミラーゼ−含量を測定することができ
る。
前記の実施例では次の略語が使用された： HEPES ２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−
１−ピペラジニル〕−エタン−スルホン酸 BSA 牛血清（Rinderserun）−アルブミン、（牛
血清（bovineserum）−アルブミン） トウイーン20 ポリオキシエチレン（20）ソルビ
タンモノラウレート

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式ａもしくはｂ： ［式中R1は水素原子を表わし、R2、R3及びR5は
    同じか又は異なつていて良く、水素原子、ハロゲ
    ン原子又は低級アルキル基を表わし、R4及びR6
    は同じか又は異なつていて良く、水素原子、ハロ
    ゲン原子、シアノ基、低級アルキル基、低級アル
    コキシ基、カルボキシ基、低級アルコキシカルボ
    ニル基、カルボキシ低級アルキル基、低級アルコ
    キシカルボニル−低級アルキル基又は場合により
    一置換の又は二置換のカルボキサミド基又は基： −COO−（CH2CH2O）ｎ−R7 （式中R7は水素原子又は低級アルキル−基を表
    わし、かつｎは１〜４の整数を表わす）を表わ
    し、この際R6は付加的にスルホニル基又はニト
    ロ基を表わして良く、かつＹは窒素原子又は基：
    Ｎ→Ｏを表わし、グリコシド基はモノ−又はオリ
    ゴ−サツカリド基である］のレゾソルフイン−誘
    導体のグリコシド。 ２ グリコシド−基がβ−Ｄ−ガラクトピラノシ
    ド基、α−Ｄ−ガラクトピラノシド基、β−Ｄ−
    グルコピラノシド基、α−Ｄ−グルコピラノシド
    基又はα−Ｄ−マノンピラノシド基を表わす特許
    請求の範囲第１項記載の化合物。 ３ グリコシド−基が単糖類−単位２〜10個有す
    る少糖類を表わす特許請求の範囲第１項記載の化
    合物。 ４ 一般式ａもしくはｂ： ［式中R1は水素原子を表わし、R2、R3及びR5は
    同じか又は異なつていて良く、水素原子、ハロゲ
    ン原子又は低級アルキル基を表わし、R4及びR6
    は同じか又は異なつていて良く、水素原子、ハロ
    ゲン原子、シアノ基、低級アルキル基、低級アル
    コキシ基、カルボキシ基、低級アルコキシカルボ
    ニル基、カルボキシ低級アルキル基、低級アルコ
    キシカルボニル−低級アルキル基又は場合により
    一置換の又は二置換のカルボキサミド基又は基： −COO−（CH2CH2O）ｎ−R7 （式中R7は水素原子又は低級アルキル−基を表
    わし、かつｎは１〜４の整数を表わす）を表わ
    し、この際R6は付加的にスルホニル基又はニト
    ロ基を表わして良く、かつＹは窒素原子又は基：
    Ｎ→Ｏを表わし、グリコシド基はモノ−又はオリ
    ゴ−サツカリド基である］のレゾソルフイン−誘
    導体のグリコシドを製造するに当り、自体公知の
    方法で、互変異性の一般式ａ及びｂ： ［式中R1〜R6及びＹは前記のものである］の化
    合物を単糖類又は少糖類又はそれの１−ハロゲノ
    −誘導体（この際それぞれ全てのヒドロキシ基は
    炭水化物化学で常用の保護基で置換されている）
    と反応させて過−Ｏ−置換したグリコシドにし、
    それから自体公知の方法で保護基を分離すること
    を特徴とするレゾルフイン−誘導体のグリコシド
    の製法。 ５ １種又はそれ以上の呈色又は／及び発螢光基
    質、適合の緩衝物質、並びに場合によりその他の
    常用の助剤を含有するグリコシダーゼ検出のため
    の診断剤において、呈色及び発螢光基質として一
    般式ａもしくはｂ： ［式中R1は水素原子を表わし、R2、R3及びR5は
    同じか又は異なつていて良く、水素原子、ハロゲ
    ン原子又は低級アルキル基を表わし、R4及びR6
    は同じか又は異なつていて良く、水素原子、ハロ
    ゲン原子、シアノ基、低級アルキル基、低級アル
    コキシ基、カルボキシ基、低級アルコキシカルボ
    ニル基、カルボキシ低級アルキル基、低級アルコ
    キシカルボニル−低級アルキル基又は場合により
    一置換の又は二置換のカルボキサミド基又は基： −COO−（CH2CH2O）ｎ−R7 （式中R7は水素原子又は低級アルキル−基を表
    わし、かつｎは１〜４の整数を表わす）を表わ
    し、この際R6は付加的にスルホニル基又はニト
    ロ基を表わして良く、かつＹは窒素原子又は基：
    Ｎ→Ｏを表わし、グリコシド基はモノ−又はオリ
    ゴ−サツカリド基である］のレゾソルフイン−誘
    導体のグリコシドを使用することを特徴とするグ
    リコシダーゼ検出のための診断剤。 ６ １種又は数種の呈色又は／及び発螢光基質、
    適当な緩衝物質、場合によりその他の常用の助
    剤、適当なグリコシダーゼ並びに場合によりその
    他の補助酵素を含有する特許請求の範囲第５項記
    載の糖鎖分解酵素の検出のための診断剤。 ７ 添加助剤として、湿潤剤、ガレヌス添加剤又
    は／及び支持体形成物を使用する特許請求の範囲
    第５項又は第６項記載の診断剤。
JP60064003A 1984-03-29 1985-03-29 レゾルフイン誘導体のグリコシド、その製法及びこれを含有するグリコシダーゼ検出のための診断剤 Granted JPS60218397A (ja)

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