SU1487824A3

SU1487824A3 - Средство для определения гликозидазы

Info

Publication number: SU1487824A3
Application number: SU853878797A
Authority: SU
Inventors: Kristian Klyajn; Khans-Georg Batts; Manfred Sernetts; Yurgen Khofmann
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1984-03-29
Filing date: 1985-03-28
Publication date: 1989-06-15
Also published as: SU1574173A3; ZA852333B; JPH0579064B2; EP0156347A3; KR870000699B1; KR850006427A; ES541589A0; DD235648A5; CA1257253A; DE3583954D1; AU550958B2; AU4037585A; DD246120A5; FI851248A0; HU198734B; FI81359B; JPH027589B2; DK140385D0; EP0156347B1; ATE66929T1

Description

Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повышение чувствительности средства. Водный раствор натриево-фосфатного буфера, содержащего соединение в форме таутомеров, смешивают с водным раствором гликозидазы. Импульсно-флуорометри’т ческим способом можно определить, активность бета-галактозидазы не только. для интрацеллюлярной бета-галактозидазы, но и для связанной антителами. 3 табл.

Изобретение относится к области медицины, в частности к средству для обнаружения глюкозидаз.

Целью изобретения является повышение чувствительности средства.

Цель достигается тем, что средство в качестве активного вещества содержит соединение в виде таутомеров общих формул

карбоксиалкил в алкильной группе,

группа С₄-С ^алкокси, нитрогруппа, группа сульфокислоты или группа формулы СО^-С^Н^О-С^Н^-О-С^Н^ или , С0Ы(С₁Н₅)₁; водород, хлор,

бром или С,-С^-алкил; К.^, К₄~ водород, хлор, бром, С|-С₅-алкил, группа карбокси, С .,-С карбоксиалкил, в алкильной группе, группа С ₄-С₅-алкокси или СО-морфолиногруппа.

Υ - азот или группа N->0, при еле- . думцем соотношении компонентов, мас.Х:

Соединение формул

I и II

Водный буфер с

_РН 6-9

Предлагаемое средство тем смешивания активного

водным буфером в указанном соотношении.

В табл. 1 представлены активные

соединения,,

Пример 1. 950 мкл водного

раствора натриево-фосфатного буфера

0,001-1.

Остальное получают пувещества с

50 .,,,1487824

1

1487824

2

с рН 7, содержащего 0,001 вес.£ или 0,1 вес.Х, указанного в табл. 2 активного вещества смешивают с 50 мкл водного раствора указанной в табл. 2 гликозидазы (0,1 ед/мп) и при 35°С фотометрическим и флуорометрическим методом определяют активность средства за счет измерения изменения экстинкции в минуту (д экс/мин). При этом ход процесса характеризуется окраской в красный (согласно изобретению) или в желтый (согласно прототипу) цвет, которая становится вся интенсивнее. Фотометрическое определение осуществляют путем измерения при 578 нм, а флуорометрическое путем подачи света с длиной волны 420 нм и измерения при 580 нм. В случае сравнительного опыта, в котором используют средство, содержащее в качестве активного вещества соответствующий п-нитрофенилгликозид, измерения осуществляют при 405 нм. Результаты опытов сведены в табл. 2.

Сравнение данных табл. 2 свидетельствует о том, что предлагаемое средство обеспечивает более высокую степень обнаружения гликозидаз., чем известное.Пример 2. Повторяют пример 1 с той разницей, что используют средства, содержащие 1 вес.% указанного в табл. 3 активного вещества.

При этом определение изменения экстинкции в минуту осуществляют только фотометрией. Результаты опыта сведены в табл. 3.

Сравнение данных табл. 3 свидетельствует о том, что и при содержании активного вещества, равном 1 вес.%, предлагаемое средство обес-

печивает более высокую степень обна
ружения	гликозидаз, чем известное.
Π Ρ	и м е р 3. Повторяют опыт 1
примера	1 с той разницей, что в ка-
честве	буфера используют
1	натриево-фосфатный буфер с рН 6,0
11	натриево-фосфатный буфер с рН 9,0
111	калиево-фосфатный буфер с рН 6,0
IV	калиево-фосфатный буфер срН 7,0
V	калиево-фосфатный буфер

с рН 9,0

VI оксиэтилпиперазинэтансульфокислый буфер с рН 6,0

VII оксиэтилпиперазинэтансуль^! фокислый буфер с рН 7,0

VIII оксиэ тилпипер азинэтансул ьфокислый буфер с рН 9,0

IX калиево-карбонатный буфер с рН 6,0

X калиево-карбонатный буфер с рН 7,0

XI калиево-карбонатный буфер с рН 9,0

Содержание активного вещества в средстве 0,1 вес.%. Результаты опыта представлены ниже.

Опыт д экс/мин

I 0,062

Сравнение (повторение

опыта с использованием

п— ни тр офенил- β- Ό- галактозида в качестве

активного вещества

средства)	0,007
11	0,056
Сравнение	0,004
1 1 1	0,052
Сравнение	0,006
IV	0,068
Сравнение	0,012
V	0,052
Сравнение	0,007
VI	0,051
Сравнение	0,005
VII	0,069
Сравнение	0,012
VIII	0,053
Сравнение	0,008
IX	0,048
Сравнение	0,005
X	0,068
Ср авнение	0,012
XI	0,050
Сравнение	0,005
Сравнение	данных опыта 1 примера

в табл, 2 и указанных свидетельствует о том, что и при использовании других буферов цель изобретения достигается.

Π р и м е р 4. Измерение галактозидаз.ы по прототипу. В 0,1 М буфера фосфата натрия - рН 7,0 - растворяется титриппекс магния (2 ммоль/л), сульфат марганца (1 ммоль/л) , 0 -мер· каптоэтанол (0,6 ммоль/л), а также хл орфенил- кр ясный- /у-р-галактозид (0,4 ммоль/л). За время 1=0 мин в

3

1437824

4

нем растворяется р -ϋ-галактозидаза (3 мг/л). Соответствующий цвет определяется при 570 нм путем абсорбционного измерения.

Измерение галактозидаэы по изобретению. В 0,1 М буфера фосфата натрия - рН 7,0 - растворяется титриплекс магния (2 ммоль/л), сульфат марганца (1 ммоль/л) /ь -меркаптоэта^нол (0,6 ммоль/л), а также резоруфин-^-галактозид (0,4 ммоль/л). За время 6=0 млн в нем растворяется р-1Гталактозидаза (3 мг/л). Соответствующий цвет определяется при 570 нм путем абсорбционного измерения.

Полученные величины абсорбции (экстинкция при 570 нм) для измерений в зависимости от времени представлены ниже:

С, мин	прототип	изобретение
5	0,05	0,11
10	0,11	0,21
20	0,19	0,40
30	0,29	0,59
40	0,39	0,79
50	0,49	0,99
60	0,57	1,16

Сравнение относительных абсорбций показывает, что средство согласно изобретению является значительно более чувствительным, чем по'прототипу.

П р и м е р 5. Резоруфин-/3, ϋ-галактопиранозил в качестве фпуорогенного вещества.

Целесообразность использования резоруфингалактозида в качестве вещества для реакционно-кинетических и диагностических целей показана на примерах дисперсивного измерения активности иммобилизированной ./5-галактоэидазы в биореакторе посредством проточной импульсной флуорометрии и измерения интрацеллюлярной активности р-галактозидаэы посредством импульсной цитофлуорометрии.

Дисперсивное измерение активности иммобилизированной р-галактозидаэы в биореакторе с синхронным флуорометрическим и импульсно-флуорометрическим измерением продукта.

В биореакторе (объем V) типа С5ТК (СопТхппоиз вЬьггеД Гайк геас~ рог) р-галактозидаза ковалентно связана на пористых частицах-носителях (например, сефароза 4В). В реактор непрерывно подводится раствор вещества (галактозид или резоруфингалактозид). Для интегрального измерения

общей степени превращения (СрУ) также непрерывно отбирается раствор (объемный поток У) и в проточной кювете флуорометра флуорометрически измеряется концентрация Ср продукта. Синхронно с этим для дисперсивного измерения распределения степени превращения в отдельных частицах геляносителя суспензия частиц геля также непрерывно отводится из реактора в импульсно-флуорометрический измерительный зонд. Здесь в измерительном капилляре при прохождении отдельных частиц геля через луч лазера измеряются импульсы рассеянного света и флуоресцентные импульсы и путем многопараметрического анализа уровня импульсов устанавливается распределение популяций частиц. Импульсы рассеянного света пропорциональны объему частиц геля. Уровень импульсов флуоресценции соответствует количеству флуоресцирующего продукта, который образован при равновесии потока на частицу благодаря /з-галактозидазе, иммобилизированной в Нем.

Таким образом, способ определяет не только общую степень превращения реактора, а также распределение активности в фазе-носителе. Исследование определяет реакционно-кинетичест кую чувствительность потока транспорта и реакцию в гетерогенно-каталитической системе, а также КПД в биотехнологических реакторах.

Измерение интрацеллюлярной активности р-галактозидазы с помощью импульсной цитофлуорометрии для дискриминации клеток на основе различного оформления энзимов или для диагностической чувствительности значительных дефектов энзимов.

Клетки различного происхождения на живом организме характеризуется на основе различий в оформлении энзимов и проницаемости мембраны. Поэтому импульсно-флуорометрическое измерение интрацеллюлярного энзиматического превращения флуорогенных субстанций служит для медицинского диагностирования в качестве цветового метода, связывающего энзимную специфичность с микрофлуорометрической чувствительностью.

Суспензия клеток (клеточная структура, проба крови, материал биопсии)

инкубируется для определения интра5

1487824

6

целлюлярной активности р-галактозидазы с помощью флуорогенного субстрата - резоруфингалактозидазы (концентрации моль/л, плотность

клеток Ю^э мл). Нефлуоресциругаций субстрат поглощается клеткой и освобождается интрацеллюлярно путем энзиматического расширения флуоресцирующего продукта - реэоруфина. В им- ю пульсном цитофлуорометре ('принцип измерения, как показано выше) также синхронно с измерением рассеянного света измеряется в зависимости от времени доля интрацеллюлярного об- 15 разования реэоруфина и его распределение в популяции клеток. Для смешанных популяций клеток различного энзимного оформления с помощью этого дисперсивного метода определяют раз- 20 деление по классам активности субпо-, пуляций, что невозможно сделать с помощью обычных фотометрических измерений превращения. Электронное дискриминированне импульсов флуорес- 25 ценции с помощью подключенного к импульсному флурометру сортирователя клеток делает возможным также разделение и получение отдельных клеток детекторного свойства из смешанных 30 популяций.

Определение активности β-галактозидазы этим импульсно-флуорометрическим способом возможно не только для интрацеллюлярной β-галактозидазы, но и для связанной антителами р-галактоаидазы в 1пипицоаз8ау5. При этом клетки с поверхностными антигенами или частицы со связанными антигенами (латексы, бактерии, пыльца) определяются благодаря связи антител, которые энзимно маркированы /ϊ-галактозидазой. Связь на частицу и ее распределение в популяции снова измеряется импульсно-флуорометрически. Способ сочетает высокую селективность иммунологической связи антигены антитела с чувствительностью флуорогенной реакции энзимов. Кроме того, ₅θ с помощью показанных систем (флуоресцентный микроскоп) может быть определена флуорометрическая величина измерения структуры,

_п ' 55

Особые преимущества галактозида реэоруфина и других флуорогенных субстратов на основе производных реэоруфина для обоих способов..

Флуорометрия с фпуорогенными веществами является во много раз более чувствительной по сравнению с абсорбционной фотометрией с помощью хромогенных веществ (фактор 10~³). Поэтому введение флуорогенных веществ позволяет осуществлять измерения в диапазонах концентраций (10~⁶—

10‘® ммоль/л), которые лежат много ниже концентраций, необходимых для хромогенных веществ (10~⁴ моль/л). Сигнал флуоресценции из микроскопически малых объектов (ячейки 10'^,г10“³л, энзимные гелевые частицы 1О'^!?10л) получаются в виде измерительных кювет с пределом измерений около 10'^г* моль. Флуоресценция в диапазоне низких концентраций прямо пропорциональна массе возбужденного флуорохрома,- Поэтому флуорометрия и импульсная флуорометрия позволяют осуществлять фотометрическое измерение суспензий (дисперсий) в противоположность абсорбционной фотометрии, которая по закону Ламберта-Берша требует гомогенных растворов.

Эмиссия реэоруфина в красном при возбуждении в зеленом открывает для флуорометрических измерений энзимов новый спектральный диапазон, который до сих пор не был открыт с помощью других флуорогенных веществ. Для сравнения МепСЬу1ит-Ье11ьГеги!-субстраты требуют ультрафиолетового возбуждения для синей флуоресценции, а флуоресцеин-субстраты - голубого возбуждения в зеленой флуоресценции. Возбуждение в зеленом имеет преимущество, что, с одной стороны, с обычными источниками света имеются в распоряжении высокие монохроматические интенсивности (например, Н-лампы,

546 нм), а с другой стороны, можно избежать возбуждения неспецифической флуоресценции при более коротких длинах волн, так как первичная флуоресценция клеточных протеинов в ультрафиолете и голубом.

Основное преимущество для реакционно-кинетических измерений имеет прямое гидролитическое расщепление галактозида реэоруфина для флуоресцирующего продукта - реэоруфина как энзиматическая одностадийная реакция в сравнении с прежними дизамещенными флуорогенными субстратами на основе флуоресцеина, ндпример, флуоресцеин1487824

8

диазат. Здесь в ходе дву ступенчатой реакции получается лишь промежуточный продукт - флуоресцеин-моноацетат.

Для галактозида резоруфина и субстрат, и продукт имеют достаточную растворимость для энзимо-кинетических измерений в клетках и частицах, тогда как в сравнении с этим известные хромогенные и флуорогеиные вещества при гистохимических реакциях в гистологии отличались нерастворимостью продукта. И, наконец, спектральные свойства (зеленое возбуждение; красная флуоресценция) производных резоруфина допускают комбинированное использование с другими флуорохромами (например, ПТС) и флуорогенными веществами, флуоресценция которых имеет место при более коротких длинах волн, для синхронного учета двух независимых флуоресцентных сигналов из одной клетки или частицы.

Claims

Формула изобретения Средство для определения гликозидазы, содержащее активное соединение

и водный буфер с значением рН 6-9, отличающееся тем, что, с целью повышения чувствительности средства, оно содержит в качестве активного соединения соединение в форме таутомеров общих формул I и 1Г

водород, хлор С,-С£-алкил, карбоксильная груп-30 па, С^-С_£-карбоксиалкил в алкильной группе, группа С₄-Су-алкокси, нитрогруппа, группа сульфокислоты или труп- 25 па формулы

-со₂-с₂н ₄-о-с₂н₄-о-с*н₅или ;

водород, хлор, бром или С _л- С ₅~ ал кил; до

водород, хлор, бром,

С^Су-алкил, группа карбокси, С у-С^карбоксиалкил, в· алкильной группе, группа С ₄-С ₉~; алкокси или СО-морфолиногруппа;

Υ - азот или группа N "* О, при следующем соотношении компонентов, мас,%:

Соединение

формул Т и 11 0,001-1

Водный буфер с

рН 6-9 Остальное

Таблица I

Активное вещество ^К1 »1 «3 »♦ *< · νι Гликозид (УФ, видимая область,кали ево-фосфатный буфер с рН 7,5) 1 2 1 I Ш 1 1 1_ 4 5 6 7 . 8 9 10 I н н н н н н к А . (р-О галактопнраноэнд) 460 11 н н н н н н N В (д—1> · гл юко з и д) 455 III н н н н н -С0₄СН, и д 464 IV -со,сн, н н и н н н д . 461 V -со.сн, н -оси, и н н N д 458 VI н н н -оси, н -СО. СИ, N д 466 VII -со, СИ, н н н С1 ¹ н н д 452 VIII н С1 н н н -со_гсн, • N д 456

9

1487824

10

Продолжение табл.1

* ¹ 1 3 ! -ГТ ί/Ι ; 7 я ³ 1 10 . •X н . н _ Н-СО-нОо'н 'и [ . я д 473 X н я- С0-нО<) 1 н 1 я н я д 453 XI и н Ή я я -СО₁НН(С_<Н_£), я д 485 XII н н я я я я Н-0 д 450 XIII н н я я я со«сн, я в (βί—1> галактопираноэид) 457, XIV н н я я я со,-с,н.-о-с.н,-ос,н. м А 451 XV я я я · я я • я я Г (мальтогелтиоп аид) 454 XVI -со,сн, н -ОСИ, н я Вг я А 459 XVII н Вс ОСЯ, я -со,сн. А 474 XVIII -ио, н к и я я я А 462 XIX н 8 я я я -но_г я А 467 XX -50, И И я я к и я . А 471 XXI н И я я я -80,Я я А 469 XXII н и -со,я я я сн, я А 463 XXIII СИ. и - δ - со,и я я я А 448 XXIV -со.с,н_м с,н„ я я сн, я я А 472 XXV н сн, н я ~со,с,н„ я А 475 XXVI ’ н н’ -со.с.н,, я я оси, я А 449 XXVII -оси, и я -со,сл « Я я я А 445 XXVIII ~со,н н С1 Вг я сн, я А , 447 XXIX и Вг С1 я -со, я я А 446 XXX -с,н„ и -ос,н„ СН, я -со,н„ к А 476 XXXI -ос,н„ и сн. -ОС, я „Я -с_гн„ я А 478 XXXII -СО, (И, и я т я сх я А 455 XXXIII С1 я с,н„ я -со_асн, я А 462 XXXIV в я н я я я я д (д-0 галактоэид) 468 XXXV н я я я я я я Е (р-Э глюкопиранозид) 470 XXXVI и я я я я ^н я Ж (οΙ-Оманнопирадозид) 472 —-¹—- —· - '------

Таблица 2

Опыт Активное вещество в средстве Гликозид аз а Δ экс/мин * Фотометрия Флуометрия 1 IV р-р-галактози- а) 0,068 а) 0,024 даза б), 0,071 б) 0,027 Сравнение а) 0,012 а) 0,001 б) 0,013 б) 0,002 2 XI11 ^-ц-галактози-; а) 0,035 а) 0,020 даза б) 0,039 б) 0,024 Сравнение а) 0,004 а) 0,001 б) 0,005 б) 0,002 3 И р-Ц-глюкози- а) 0,047 а) 0,030 даз а б) 0,050 б) 0,032 Сравнение _и_ а) 0,007 а) 0,0005 б) 0,008 б) 0,0006 XV с1 - амилаза а) 0,028 а) 0,15 б) 0,030 б) 0,017 4 Сравнение — ^п— а) 0,003 а) 0,0005 б) 0,004 б) 0,0005

*а) содержание активного вещества, равное 0,001 вес.%; б) содержание активного вещества, равное 0,1<вес.%

1487824

Таблица 3 Активное вещество в средстве Ί Гликозидаза &экс/мин

1 /ϊ-ЕНгалактозидаза 0,042 Сравнение _ 1Г_ 0,021 1 1 β-0-ГЛЮКОЗИ- 0,063 Сравнение даза _н_ 0,0 12 11 1 β-ϋ-галакто- 0,072 IV зидаза То же 0,068 V — ^п— 0,068 VI _||_ 0,047 VII 0,062 VIII 0,074 IX — ^п— 0,072 X 0,068 XI 0,048 XII — 0,050 XIII о/-1>-галакто- 0,055 Сравнение зидаза _ ч_ .0,009 XIV β-Ί)~ галак то - 0,067 XV зидаза οί-амилаз а 0,042 Сравнение _Н_ 0,008 XVI ' ρ-Ό-галакто- 0,067 XVII зидаза То'же 0,070 XVIII _н_ 0,048 XIX 0,047 XX 0,051 XXI — 0,049 XXII — И-. 0,062 XXIII . 0,0.63 XXIV 0,072 XXV — ^гг— 0,073 XXVI 0,063 XXVII 0,067 XXVIII 0,061 XXIX _ п_ 0,058 XXX _^тт— 0,047 XXXI 0,045 XXXII _ н__ 0,045 XXXIII — ^п— 0,048 XXXIV 0,041 XXXV β-В-глюкози- 0,058 XXXVI даз а -ГНманнози- 0,049 Сравнение даза _м ^н— 0,009