CN109438326A - 一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒 - Google Patents

一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒，该荧光探针为2‑[2‑4‑乙酰氧基‑苯基)‑乙烯基]‑3‑乙基‑1,1‑二甲基‑1H‑苯并[e]吲哚，本发明基于羧酸酯酶可与乙酰氧基发生水解反应，将乙酰氧基作为特异性响应基团，半花菁类染料作为荧光团，半花菁类染料荧光团自身具有良好的荧光性质，具有较长的发射波长，设计了一种半花菁类荧光探针，本设计的试剂盒与羧酸酯酶反应后溶液呈现粉红色并且发出强烈的荧光，灵敏度高，该显色反应仅在羧酸酯酶存在的条件下发生，其他常见的活性氧、氨基酸、酶类物种不产生干扰。

Description

一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法与专用检测 试剂盒
技术领域
本发明涉及化学分析、生物分析技术领域，特别是指一种用于检测羧酸酯 酶的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒。
背景技术
羧酸酯酶(carboxylesterase,CaE)是α/β折叠水解酶家族中的一种酶，能够 催化氨基甲酰酯、硫酯、羧酸酯和酰胺等多种内源性和外源性化合物的水解。 CaE作为人体分布的一种重要的水解代谢酶，其在维持人体脂质代谢平衡、药 物及毒物的代谢清除中发挥不可忽视的作用。然而，CaE的异常变化又与多种 疾病的发生密切相关，例如，高血脂、脂肪肝、癌症等疾病。因此，建立一种 准确、快速、简便、特异性且能在活细胞和组织上实时原位检测的方法对相关 疾病的诊断和治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法与 专用检测试剂盒。
本发明的技术方案是这样实现的：一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针，该 荧光探针为2-[2-4-乙酰氧基-苯基)-乙烯基]-3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚， 其结构式如式Ⅰ所示：
本发明提出一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：在70℃～90℃条件下，将式Ⅲ所示1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚与 碘乙烷混匀进行取代反应，反应6～20小时，得到式Ⅱ所示化合物，
步骤二：在催化剂存在的条件下，于40℃～70℃，将式Ⅱ所述的3-乙基-1,1,2- 三甲基-1H-苯并[e]吲哚与4-乙酰氧基苯甲醛混匀进行缩合反应，反应4～10小 时，得到式Ⅰ所示化合物，
优选的，所述催化剂为有机碱和无机碱中的至少一种；所述有机碱为三乙 胺和吡啶中的至少一种；所述无机碱为碳酸钾、醋酸钠、碳酸钠和碳酸氢钠中 的至少一种。
优选的，式Ⅱ所述的3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚、4-乙酰氧基苯甲 醛和催化剂的投料摩尔比为1：0.5～4：0.5～4。
优选的，式Ⅱ所述的3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚、4-乙酰氧基苯甲 醛和催化剂的投料摩尔比为1:1-4:1-4。
进一步优选，式Ⅱ所述的3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚、4-乙酰氧基 苯甲醛和催化剂的投料摩尔比为1:1:1或1:4:4。
优选的，步骤一所述取代反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为N,N-二 甲基甲酰胺、三乙胺、乙醇和乙腈中的至少一种。
步骤二所述缩合反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为乙酸酐、乙醇和 乙腈中的至少一种。
本发明还提出一种专用检测试剂盒，包含式Ⅰ所示化合物和溶剂，
式Ⅰ所示化合物的浓度为1mM，
溶剂为乙醇或二甲基亚砜。
优选的，还包括缓冲液，
所述缓冲液为pH值为6.0～8.0的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种；所述磷酸盐的浓度为0.01～0.5M。
本发明提供的羧酸酯酶检测试剂盒在测定羧酸酯酶含量中的应用，尤其是 在检测在生物系统中细胞内产生羧酸酯酶含量中的应用，均属于本发明的保护 范围。
测定羧酸酯酶含量的方法，包括如下步骤：
1)制作标准曲线：
a)以520nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品的溶 液在发射波长为575nm处的荧光强度，记为F；并测定试剂空白在发射波长为 575nm处的荧光强度，记为F0，以羧酸酯酶的浓度C为横坐标，荧光强度变化 值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线；
其中，ΔF＝F-F0；所述一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品的溶液由所述羧 酸酯酶检测试剂盒中的试剂储备液1、试剂储备液2和羧酸酯酶的标准储备溶液 混匀而得；
2)检测待测样品中羧酸酯酶的含量：
将所述步骤1)所述羧酸酯酶标准品替换为待测样品，按照所述步骤1)所 述方法检测所述待测样品在发射波长为575nm处的荧光强度，记为F’，将所述 F’代入所述步骤1)所得标准曲线，进而得到所述待测样品中羧酸酯酶的含量。
上述检测方法中，所述一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品的溶液中，所述 羧酸酯酶的浓度依次为0，0.001，0.002，0.004，0.005，0.006，0.008和0.01U/mL。
所述一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品的溶液的体积均为1mL。
所述羧酸酯酶的标准储备溶液中，溶剂为水；所述羧酸酯酶的标准储备溶 液中羧酸酯酶的浓度为1mM。
所述羧酸酯酶检测试剂盒中的试剂储备液1和所述试剂储备液2的体积比 为1mL：10μL。
本发明提供的羧酸酯酶检测试剂盒，具有以下特点：
1)包含2-[2-4-乙酰氧基-苯基)-乙烯基]-3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚的试剂盒呈黄色，且具有淡黄色荧光；而与羧酸酯酶反应后则可显示粉红色并 且发出强烈的红色荧光。
2)反应速度快，20分钟内即可显色。
3)灵敏度高，羧酸酯酶浓度在≥0.005U/mL时即可用肉眼观察到明显的微 粉红色产生。
4)该显色反应仅在羧酸酯酶存在的条件下发生，其他常见的无机盐、活性 氮、活性氧、氨基酸、维生素、生物巯基物种不产生干扰。
5)具有长荧光发射波长(575nm)，可用荧光光谱法检测，测定限可达1.2 ×10-4U/mL，可用于生理条件下细胞产生羧酸酯酶含量的检测。
本发明基于羧酸酯酶可与乙酰氧基发生水解反应，将乙酰氧基作为特异性 响应基团，半花菁染料作为荧光团，半花菁染料荧光团自身具有良好的荧光性 质：较高的稳定性、较大的Storks位移和较强的荧光发射，设计了一种靶向溶 酶体的荧光探针。实验发现，该探针本身的荧光强度非常弱，加入羧酸酯酶后， 基于分子内电荷转移机理，探针被打开，溶液荧光显著增强并且颜色由几乎无 色变成粉红色，表明该方法可用于羧酸酯酶的检测。为了验证该方法的实用性， 并将其运用于生物体中羧酸酯酶的定量测定，应用该原理，制备了羧酸酯酶检 测试剂盒。本设计的试剂盒与羧酸酯酶反应后溶液呈现粉红色并且发出强烈的 荧光，灵敏度高，该显色反应仅在羧酸酯酶存在的条件下发生，其他常见的活 性氧、氨基酸、酶类物种不产生干扰。
本发明具有操作简便，成本低，快速高效灵敏等优点，易于推广和应用。 该试剂盒是一种性能优良、使用方便的羧酸酯酶检测设备，会成为现代生物学、 生理学和医学等相关领域提供有力的研究工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明制备式Ⅰ所示化合物的化学反应方程式。
图2为羧酸酯酶检测试剂盒与不同浓度的羧酸酯酶反应的荧光光谱。
图3为羧酸酯酶检测试剂盒用于各种干扰物种反应的荧光发射光谱。
图4为羧酸酯酶检测试剂盒检测羧酸酯酶的吸光度变化和荧光强度变化。
图5为羧酸酯酶检测试剂盒检测细胞中的羧酸酯酶。
图6为羧酸酯酶检测试剂盒定位检测溶酶体中羧酸酯酶。
图7为式Ⅰ的氢谱图(400MHz,DMSO-d6,298K)。
图8为式Ⅰ的碳谱图(100MHz,DMSO-d6,298K)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和 生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、制备式Ⅰ所示2-[2-4-乙酰氧基-苯基)-乙烯基]-3-乙基-1,1-二甲 基-1H-苯并[e]吲哚。按照图1所示的化学反应流程图进行制备，操作步骤如下： 将4-硝基-1,8-萘二甲酸酐(80mg,0.38mmol)溶解于乙醇(10mL)中，加入 碘乙烷(60μL,0.75mmol)于反应液中，并在80℃反应6小时。反应完毕，经 冷却后，减压浓缩溶剂得粗产品，用二氯甲烷/甲醇(12：1，v/v)作洗脱液， 柱层析提纯粗产品得到产物Ⅱ29.6mg。
将产物式Ⅱ(29.6mg,0.12mmol)与4-乙酰氧基苯甲醛(40mg,0.24mmol)溶 于乙酸酐(10mL)中，加入催化剂无水醋酸钠(20mg,0.24mmol)，在50℃反应 8小时。反应完毕，经冷却后，减压浓缩溶剂得粗产品，用二氯甲烷/甲醇(20： 1，v/v)作洗脱液，柱层析提纯粗产品得到产物20mg。
该产物的结构表征数据结果如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.57(d,J＝16.4Hz,1H),8.44(d,J＝8.4Hz, 1H),8.37(d,J＝8.4Hz,2H),8.31(d,J＝8.8Hz,1H),8.23(d,J＝8.8Hz,1H),8.17 (d,J＝8.4Hz,1H),7.82(t,J＝7.6Hz,1H),7.76(d,J＝3.2Hz,1H),7.72(d,J＝5.2 Hz,1H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),4.91(d,J＝7.2Hz,2H),2.33(s,3H),2.05(s,6H), 1.54(t,J＝7.2Hz,3H)；
13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ182.1,168.9,154.1,151.6,138.9,138.1, 133.3,132.2,132.1,131.2,130.1,128.5,127.4,126.8,123.2,122.8,113.3,112.2,
79.3,54.0,42.8,25.4,21.0,14.1。
由上结合图7，图8可知，该产物结构正确，为式Ⅰ所示的2-[2-4-乙酰氧基 -苯基)-乙烯基]-3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚。
实施例2：式Ⅰ所示化合物与不同浓度羧酸酯酶反应的光谱性质
称取3.84mg试剂1，配成10mL二甲基亚砜溶液作为母液(1mM)。
将10μL的上述母液滴加到10mM磷酸盐缓冲溶液中，然后加入不同浓度 的羧酸酯酶溶液，再用10mM的磷酸盐缓冲溶液定容到1mL。37℃下反应20 min后，测量其紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以520 nm去激发；激发和发射的狭缝宽度为10nm；电压700V。
图2为试剂1与0-0.01U/mL羧酸酯酶反应的荧光光谱。
图2结果表明，本发明中的试剂1具有以下特点：
1)探针在溶液中呈无色并且无荧光，但随着羧酸酯酶的加入，该探针在约 405nm处产生吸收，并在575nm处产生红色荧光；
2)紫外可见吸收的强度和荧光强度随羧酸酯酶浓度的增加而增加；
3)使用10μM的试剂1时，荧光增强与羧酸酯酶的浓度在0-0.01U/mL范 围内呈线性关系。
实施例3：式Ⅰ所示化合物与其他物种反应情况
在缓冲液中分别加入各种物质：1Blank,ROS(2-5):50μM·OH,50μM HOCl, 50μMH2O2,50μM H2S2；(6)50μMN-acetyl-cysteine；(7)1mM vitamin C；(8)3 mM glutathione；(9)1mM cysteine；(10)1mM leucine；(11)1mM alanine；(12)1 mM serine；(13)1mMarginine；(14)1mM asparagine；(15)1mM aspartic acid；(16) 25U/L leucineaminopeptidase；1μg/mL(17)DT-diaphorase；(18)80ng/mL hyaluronidase；(19)5nMthrombin；(20)5nM matrix metalloproteinase 2；(21)100 μM human serum albumin；(22)1U/mL CEs。在37℃下反应20min后，测量其荧 光发射光谱。荧光发射光谱测定时以520nm去激发；激发和发射的狭缝宽度为 10nm；电压700V。
在1mL混合了上述各种物质的溶液中加入10μL的试剂1母液(1mM)。
图3为试剂1(10μM)与各种其他物质混合时得到的荧光发射光谱。
实验结果表明，只有羧酸酯酶可引起试剂1产生明显的光信号响应，证明 该试剂对羧酸酯酶具有高度的选择性，而其他物种的存在不干扰羧酸酯酶的测 定。
实施例4：用羧酸酯酶试剂盒定量测定生理状态下细胞产生的羧酸酯酶的浓 度
1)细胞培养：
A549和HepG2细胞生长于玻璃底培养皿(Corning Inc.)中，培养基采用含 10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM (Dulbecco's modified eaglemedia)液体培养基，环境温度37℃，二氧化碳浓度 控制在5％。
2)工作曲线的制作
取1U羧酸酯酶，溶于1mL二次水中，配成1U/mL羧酸酯酶的标准储备 溶液；另外，在样品瓶中，依次加入10μL试剂储备液2，并使羧酸酯酶的最终 浓度依次为0，0.001，0.002，0.004，0.005，0.006，0.008和0.01U/mL，摇匀， 在37℃摇床反应20min，取反应液于1厘米石英比色皿中，以520nm作激发波 长，测定575nm处的荧光强度，得到一系列标准溶液的荧光强度F，同时测定 相应试剂空白溶液的荧光强度F0。以羧酸酯酶的浓度C(U/mL)为横坐标，荧 光强度变化值ΔF(ΔF＝F-F0)为纵坐标，绘制工作曲线，得出相应的线性回归 方程为ΔF＝18572.6×C(U/mL)+7.8(r＝0.996)。
试剂储备液2为试剂1(式Ⅰ所示化合物)的二甲基亚砜溶液，该试剂的最 终浓度为10μM；
3)细胞中羧酸酯酶含量的测定
向经过不同处理的细胞中加入试剂储备液2，测定520-650nm处的荧光强 度。各组细胞的处理方式：a组：贴壁的细胞用含胎牛血清的DMEM培养基洗 涤三次，然后加入10μM探针37℃孵育30分钟；b组：贴壁的细胞用含胎牛血 清的DMEM培养基洗涤三次，然后加入10μM探针37℃孵育30分钟；c组： 先加入10μM 4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐37℃孵育30分钟，用PBS洗涤三次， 加入10μM探针37℃孵育30分钟；d组：加入50μM 4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐37℃孵育30分钟，用PBS洗涤三次，加入10μM探针37℃孵育30分钟。 孵育完成后，细胞用PBS(pH 7.4)洗涤三次后进行成像实验，如图5。
4)试剂盒定位检测细胞中羧酸酯酶含量
细胞的处理如下：A组：贴壁的细胞用含胎牛血清的DMEM培养基洗涤三 次，然后加入10μM探针37℃孵育30分钟；B组：贴壁的细胞用含胎牛血清 的DMEM培养基洗涤三次，然后加入50nM DND-99 37℃孵育30分钟。孵育 完成后，细胞用PBS(pH 7.4)洗涤三次后进行成像实验，如图6。
图5为试剂盒检测经不同处理的细胞，细胞内羧酸酯酶的含量变化；由图5 可知4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐可抑制羧酸酯酶的产生，相较于其他细胞，肝 癌细胞可产生大量的羧酸酯酶。图6为试剂盒定位检测溶酶体中羧酸酯酶；由 图6可知，本课题组设计的试剂盒可定位检测细胞溶酶体中羧酸酯酶含量的变 化。
最后应说明的是：上述实施例仅举出以试剂1为荧光试剂，反应体系中含1 和磷酸盐缓冲液的浓度分别为10μM、10mM，反应20min的情况。其余荧光 试剂浓度和反应时间的结果不一一列出，然而其并非用于限定本发明。任何本 领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当可以作出各种 修改与变更。

Claims (9)

1.一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针，其特征在于，该荧光探针为2-[2-4-乙酰氧基-苯基)-乙烯基]-3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚，其结构式如式Ⅰ所示：
2.如权利要求1所述的一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：在70℃～90℃条件下，将式Ⅲ所示1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚与碘乙烷混匀进行取代反应，反应6～20小时，得到式Ⅱ所示化合物，
步骤二：在催化剂存在的条件下，于40℃～70℃，将式Ⅱ所述的3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚与4-乙酰氧基苯甲醛混匀进行缩合反应，反应4～10小时，得到式Ⅰ所示化合物，
3.如权利要求2所述的一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，
所述催化剂为有机碱和无机碱中的至少一种；所述有机碱为三乙胺和吡啶中的至少一种；所述无机碱为碳酸钾、醋酸钠、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种。
4.如权利要求2所述的一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，
式Ⅱ所述的3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚、4-乙酰氧基苯甲醛和催化剂的投料摩尔比为1：0.5～4：0.5～4。
5.如权利要求4所述的一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，
式Ⅱ所述的3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚、4-乙酰氧基苯甲醛和催化剂的投料摩尔比为1:1-4:1-4。
6.如权利要求2所述的一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，
步骤一所述取代反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、三乙胺、乙醇和乙腈中的至少一种。
步骤二所述缩合反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为乙酸酐、乙醇和乙腈中的至少一种。
7.一种专用检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中式Ⅰ所示化合物和溶剂，
式Ⅰ所示化合物的浓度为1mM，
溶剂为乙醇或二甲基亚砜。
8.如权利要求7所述的一种专用检测试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液，
所述缓冲液为pH值为6.0～8.0的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种；所述磷酸盐的浓度为0.01～0.5M。
9.权利要求1中式Ⅰ所示化合物或权利要求7所述试剂盒在检测羧酸酯酶含量中的应用。
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