CS273162B2 - Diagnostic agent for glicosidases activity determination - Google Patents

Diagnostic agent for glicosidases activity determination Download PDF

Info

Publication number
CS273162B2
CS273162B2 CS206485A CS206485A CS273162B2 CS 273162 B2 CS273162 B2 CS 273162B2 CS 206485 A CS206485 A CS 206485A CS 206485 A CS206485 A CS 206485A CS 273162 B2 CS273162 B2 CS 273162B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
hydrogen
group
glycosides
alkyl
lower alkyl
Prior art date
Application number
CS206485A
Other languages
English (en)
Other versions
CS206485A2 (en
Inventor
Christian Dr Klein
Hans-Georg Dr Batz
Manfred Prof Dr Sernetz
Jurgen Dr Hoffmann
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Priority to CS298888A priority Critical patent/CS273184B2/cs
Publication of CS206485A2 publication Critical patent/CS206485A2/cs
Publication of CS273162B2 publication Critical patent/CS273162B2/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/28—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines
    • C07D265/34—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines condensed with carbocyclic rings
    • C07D265/36—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines condensed with carbocyclic rings condensed with one six-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/28—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines
    • C07D265/34—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines condensed with carbocyclic rings
    • C07D265/38—[b, e]-condensed with two six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Vynález se týká diagnostického prostředku pro stanovení aktivity glykosidáz.
Glykosidázy splňují v lidském a zvířecím organismu mnohonásobné fyziologické funkce. Tak například yd-D-galaktosidáza hraje důležitou rolu při látkové výměně uhlohydrátů, poněvadž jejím působením dochází k. hydrolýze laktózy. Kromě toho představuje /3-D-galaktoaidáza klíčový enzym při odbourávání glykolipidů, mukopolysacheridů a glykoproteinů. Jako dalSí fyziologicky významné glykosidázy je třeba uvést «i-D-galaktoaidázu, có-D- aβ-D-glukosidázu, jakož i «/-D-manaosidázu,
Kromě toho, že mají fyziologický význam, nabývají glykosidázy v posledních letech na významu v oboru diagnostiky a biotechnologií. Tak se například těchto enzymů v rostoucí míře používá jako tzv. indikátorových enzymů při enzymatických imunostanoveních (enzymimmunoassay). Obzvláštní přednost se v této souvislosti dává/?-D-galaktosidáze (víz například Annals of Clinical Biochemistry 16, 221 až 240 /1979/).
Určení aktivity glykoaidáz hraje následkem toho narůstající úlohu jak v klinické chemii, tak v diagnostice. Přitom se zcela obecně postupuje tak, že ae vzorek obsahující glykosidázu smísí s vhodným substrátem. Substrát se působením enzymu rozštěpí, načež se vhodným způsobem stanoví jeden z produktů štěpení. Může se stanovovat buí působením enzymu uvolněný glykon, nebo aglykon. Zpravidla se stanovuje aglykon.
Jako substráty se často hodí přírodní substráty dokazovaných enzymů. Obzvláštní přednost se však dává použití takových glykosidů, ve kterých představuje aglykon spektroskopicky snadno stanovitelný zbytek.
Je známa řada substrátů pro glykosidázy, u kterých je možno po rozštěpení glykosidázou stanovit aglykon spektroskopicky ve viditelné nebo ultrafialové oblasti spektra nebo fluorometricky. ·
Tak jsou jako substráty /S-D-galaktosidázy popsány v Biochem. Z. 333. 209 (1960) fenyl-|j-D-galaktosid a některé jeho další, na aromatickém kruhu substituované, deriváty (například o-nitrofenyl a p-nitrofenyl-^-D-galaktosid. Fenoly uvolněné hydrolýzou ae stanoví fotometricky v ultrafialové oblasti nebo v případě nitrofenolů v krátkovlnné viditelné oblasti vlnových délek spektra. Jako indikátorová reakce se může také připojit oxidační kopulace s aminoantipyrinem (Analytical Biochem. 40. 281 /1971/).
Ero histooheraioké zkoušky se používá naftyl-/?-D-galaktosidu, například použití 1-naftylsloučeniny je popsáno v Histochemii 35. 199 (1973), použití 6-brom-2-naftylderivátu v J. Biol. Chem. 195. 239 (1952) a použití naftol-/)-D-galaktosidu v Histochemii 37. 89 (1973). Pro vizualizaci ae přitom nechávají vzniklé naftoly reagovat a různými diazoniovými solemi na azobarviva.
Určení aktivity enzymu pomocí fluorogenních substrátů je široce rozšířené, poněvadž oproti fotometrickým metodám je citlivost fluorometrických stanovení vyšší o několik desetinných řádů. Y mnohých případech se musí pracovat s íluorogenními substráty, například při stanovování enzymatické aktivity v buňkách pomocí automatických zařízení za účelem rozlišení buněk (cytofluorometrie) a při analýze immobilizovaných enzymů průtokovou mikrofluorometrií. V jiných případeob, například při určování enzymatického značení systémů (enzymatické imunoatanovení), se multiplikační efekt enzymatická katalýzy za použití fluorogenních substrátů značně zesiluje.
Až dosud známé fluorogenní substráty pro /?-D-galaktosidázu a jiné glykosidázy obsahují jako fluorofory deriváty fluoresceinu, indoxylu nebo methylurabelliferonu. Pro kinetickou analýzu složitých systémů vykazují však tyto sloučeniny závažné nevýhody. Disubstituované deriváty fluoresceinu ae při vícestupňové řadě reakcí bydrolyzují, Monosubstltuované fluorescein-glykosidy již samotné fluoreskují, Indoxylové deriváty podléhají po svém enzymatickém rozštěpení řadě chemických reakcí, které rovněž komplikují kinetickou analýzu. Deriváty methylumbelliferonu se musí excitovat ultrafialovým zářením. Přitom může rušit vlastní fluorescence biologických nebo syntetických látek.
Kromě toho je ultrafialová excitace, zejména v případě laserové optiky, nákladná. Většina fluorogenníoh substrátů poskytuje reakění produkty, které vykazují pouze nízkou rozpustnost, takže nejsou vhodné pro kinetickou analýzu aktivity enzymu, kde je právě potřebná dobrá rozpustnost substrátu a produktu.
Nadále proto existuje potřeba substrátů, pomocí kterých by bylo možno jednoduše, rychle a spolehlivě stanovit glykosidázy, přičemž takové substráty by, pokud možno, měly být použitelné jak pro fotometrické, tak pro fluorometrické metody stanovení. Úkolem vynálezu bylo uspokojit shora uvedenou poptávku.
Tento úkol je vyřešen novými glykosidy derivátů resorufinu, které se pomocí glykosidáz štěpí na cukerný zbytek a derivát resorufinu. Posledně uvedené látky jsou sloučeniny s dobrou rozpustností ve vodě, které vykazují dobře měřitelnou absorpci ve viditelné oblasti spektra a lze je kromě toho snadno excitovat pro fluorescenci.
Předmětem předloženého vynálezu je diagnostický prostředek pro stanovení aktivity glykosidáz obsahující jeden nebo více chromogenních a/-.nebo fluorogenníoh substrátů, vhodnou tlumivou látku a popřípadě další obvykle používané pomocné látky, vyznačující se tím, že jako chromogenní a fluorogenní substráty obsahuje glykosidy derivátů resorufinu obecného vzorce la nebo Ib
kde glykosid je glykosidový zbytek monosacharidu,
R1 vodík, každý ze symbolů R2, R^ a R·*, které jsou stejné nebo různé, je vodík, halogen nebo alkylskupina s 1 až 5 atomy uhlíku, každý ze symbolů R^a R^, které jsou stejné nebo různé, je vodík; halogen; kyanoskupina; alkylskupina s 1 až 5 atomy uhlíku; alkoxylskupina s 1 až 5 atomy uhlíku; karboxyskupina; alkoxykarbonyl-, karboxyalkyl- nebo alkoxykarbonylalkylskupina, přičemž v poBledně uvedených třech skupinách obsahují alkylové a alkoxylové zbytky vždy 1 až 5 atomů uhlíku; nebo karboxamidoskupina, popřípadě jednoduše nebo dvojnásobně substituovaná prostřednictvím alkylových, alkoxyalkylových, karboxyalkylových nebo alkoxykarbonylalkylových zbytků, v nichž alkylové a alkoxylové skupiny obsahují vždy 1 až 5 atomů uhlíku, přičemž v případě přítomnosti dvou substituentů mohou být spolu spojeny za vzniku kruhu, který je popřípadě přerušen též kyelíkem, dusíkem nebo sítqu; nebo skupinu obecného vzorce - C00 - (CH2-CH2O)n - R7, •T kde R* je vodík nebo alkylakupina a 1 až 5 atomy uhlíku a n je celé číslo l.až.4.
přičemž navíc R^ je sulfonyl- nebo nitroskupina a
Y Ja dusík nebo skupina ΪΓ—?Q.
Glykosidy derivátů reaorufinu obecného vzorce Ia, popřípadě Ib, jsou nové sloučeniny, Mohou se připravit tak, še se deriváty reaorufinu obecných tautomemích vzorců Ila a lib
(Ha) )
(lib) *
kde R1 až R® a Y mají význam uvedený shora, nechají reagovat s monosacharidem nebo jeho 1-halogenderiváteo, přičemž všechny hydroxyskupiny jsou vždy subtituovány ochrannými skupinami, obvyklými v chemii uhlohydrátů, za vzniku per-O-substltuovaných glykosidů, ze kterých se záskají glykosidy derivátů reaorufinu obecného vzorce I o sobč známým způsobem odštěpením ochranných skupin.
Reakce sloučenin obecného vzorce II s per-O-substituovanými 1-halogensacharidy se přednostně provádí v přítomnosti látek vázajících kyseliny, jako je hydroxid nebo uhličitan alkalického kovu ve vodném acetonu nebo (za podmínek mezlfázového přestupu) ve směsi voda/benzen nebo voda/chloroform.
Kromě toho se může tento postup provádět tak, že se nejprve deriváty reaorufinu obecného vzorce II převedou prostřednictvím hydroxidu nebo alkoxidu alkalického kovu na alkalické soli nebo prostřednictvím popřípadě substituovaného aminu na amoniové soli a soli se nechají reagovat s per-O-substituovanými 1-halogensacharidy v dipolámím aprotickém rozpouštědle jako acetonu, dimethylsulfoxidu, dichlormethanu,
CS. 273162 B2 tetrahydrofuranu nebo dimethylformamidu.
Při syntéze per-O-subeltuovaných glykosidů z derivátů resorufinu obecného vzorce II a per-O-substituovaných l-halogensacharidů se dále osvědčily přísady jednotlivých solí stříbra nebo směsí solí stříbra (oxidu stříbrného , uhličitanu stříbrného, uhličitanu stříbrného na Celitu, triflátu stříbrného, salicylátu stříbrného) a/nebo jednotlivých solí rtuti nebo směsí solí rtuti (bromidu rtuínatého, kyanidu rtuínatého, octanu rtuínatého, oxidu rtufnatého), popřípadě za použití aušidel, jako chloridu vápenatého, molekulárního síta nebo Drieritu, v rozpouštědlech, jako methylenchloridu, chloroformu, benzenu, toluenu nebo dioxanu. Při syntéze glykosidů vázaných voó-poloze se účelně postupuje tak, že se sloučenina obecného vzorce II roztaví se sacharidem, jehož hydroxyskupiny jeou substituovány ochrannými skupinami, a výhodou acetylskupinami, v přítomnosti lewleovy kyseliny, například chloridu ciničitého, chloridu hlinitého a přednostně chloridu zinečnatóho (srovnej Chem. Ber. 66, 378 až 383 /1933/ a Methods in Carbohydr. Chem. 2, 345 až 347 /1967/). Teplota sé přitom volí v rozmezí od 80 do 150 °C, přednostně v rozmezí od 110 do 130 °C.
Takto získané per-O-substituované glykosidy derivátů resorufinu obecného vzorce II jsou rovněž nové sloučeniny.
Odštěpování ochranných ekupin z per-O-substituovaných glykosidů za vzniku glykosidů obecného vzorce I se provádí metodami, které jsou běžné v chemii uhlohydrátů (viz například Advanoes Carbohydrate Chem. 12. 157 (1975)), v případě acylových skupin například pomooí methoxidu sodného nebo methoxidu bamatého nebo pomocí amoniaku v methanolu,
7
Pod pojmem halogen se v definici R až R* rozumí fluor, chlor, brom a jod, přednostně chlor a brom.
Alkylskupina v definici R^ až R^ obsahuje přednostně 1 až 3 atomy uhlíku, přičemž zvláštní přednost se dává methylskupinám.
Alkoxyskupina v definici R^ a R^ obsahuje s výhodou 1 až 3 atomy uhlíku, přičemž největší přednost se dává methoxyskupinám,
Alkoxylové nebo alkylové zbytky alkoxykarbonylskupin, karboxyalkylskupin a alkoxykarbonylalkylskupin v definici substituentů R^ až R^ obsahují rovněž a výhodou 1 až 3 atomy uhlíku, přičemž obzvláštní přednost se dává methoxyskupinám nebo methylenovému zbytku.
Jako ochranná skupina, která je obvyklá v ohemil uhlohydrátů, se hodí především acetyl-, benzoyl-, benzyl- nebo trlmethylsilylskupina.
Alkyl-, alkoxyalkyl-, karboxyalkyl- a alkoxykarbonylalkylskupiny přicházející v úvahu jako substituenty karboxamidoskupiny, obsahují s výhodou 1 až 3 atomy uhlíku.
Jako glykosidický zbytek, který je připojen k derivátům resorufinu obecného vzorce II za vzniku glykosidů obecného.vzorce I, se hodí jakýkoliv monosacharid, který lze odpovídající glykosldázou opět odštěpit od základní kostry resorufinu. Jako příklady glykosidů, které lze použít podle vynálezu, je možno uvést ^-D-galaktopyranosid, oá-D-galaktopyranosid, β> -D-glukopyranosid, 06-D-glukopyranosld a -D-mannopyranosid. Použití glykosidů derivátů resorufinu obecného vzorce I jako substrátů pro glykosidázy vede k výrazně citlivějším zkušebním systémům ve srovnání s až dosud známými systémy. Nové substráty se mohou používat pro stanovení aktivity glykosidáz s výhodou jak v biochemickém a biotechnologickém, tak i v klinioko-ohemiokém oboru. Jsou citlivější, v důsledku čehož poskytují četné výhody:
a) Mohou se měřit nižší aktivity enzymu.
b) Jako vzorků se může používat menších množství látek.
c) Určení aktivity proběhne za značné kratší dobu.
d) Použití malého vzorku a příznivá vlnová délka měření snižují kromě toho náchylnost jiných složek vzorku pro rušení metody.
e) Může se měřit přeměna v nosných matricích s immobilizovaným enzymem.
Ukázalo se, Že substráty podle vynálezu se hodí pro určování aktivity glykosidáz libovolného původu. Diagnostické prostředky podle vynálezu obsahující substráty obecného vzorce X reagují mnohem citlivěji než až dosud známé zkušební prostředky.
Glykoaidy derivátů resorufinu obecného vzorce I se rovněž hodí pro imunologická stanovení, při kterých se glykosidáz používá jako indikátorových enzymů, jejichž aktivitu po provedení imunologické reakce je třeba určit. Tyto imunologické metody stanovení za použití enzymatických indikátorových reakcí bývají označovány odborným termínem enzymiwmunoassay (dále a shora česky enzymatická imunostaňovení). Tyto metody slouží pro určování koncentrace proteinů, polysacharidů, hormonů, léčiv e jiných nízkomolekulárních látek přítomných v konoentraci v rozmezí od IO“5 do 10 A mol/1. Podle požadavků na separaci fází se rozlišuje mezi homogenním a heterogenním provedením zkoušky. Další rozdělení zkoušek je podle toho, zda probíhají na konkurenčním nebo nekonkurenčním principu.
Všechny zkušební principy však pracují s konjugáty enzym-antigen nebo enzym-protilátka. Enzymatická indikátorová reakce je všem enzymatickým imunostanovením společná. Pro tyto účely jsou vhodnými indikátorovými enzymy například glykosidázy, zejména fa -D-galaktosidáza. Stanovení glykosidáz při těchto enzymatických imunostanoveních se provádí obvyklým způsobem tak, že se přidá vhodný substrát, který se enzymaticky rozštěpí a pak běžným způsobem fotometricky nebo fluorometricky změří.
Zlepšení zkušebních systémů pro glykosidázy vede v důsledku toho rovněž k podstatným výhodám dosahovaným při těchto enzymatických imunostanoveních:'
1. Vyšší citlivost umožňuje i zde dosáhnout dalšího snížení hranice dokazatelnosti, dále umožňuje zkrátit reakční dobu a zmenšit množství vzorku a tím rovněž dosáh-* nout menšího rušení metody jinými součástmi vzorku.
2. Příznivější vlnová délka snižuje při určitých provedeních reakce náchylnost k rušení metody nerozpustnými složkami, například zákaly.
Diagnostický prostředek obsahuje vedle jednoho nebo více substrátů obecného vzorce I vhodný tlumioí systém a popřípadě další přísady obvykle používané v takových diagnostických prostředcích, jako jsou například smáčedla, stabilizátory atd. Diagnostický prostředek může mít formu roztoku, lyofilizátu, práškové směsi, reagenční tablety nebo zkušebního proužku, ve kterém jsou látky naneseny v savém nosiči.
Diagnostický prostředek podle vynálezu ve formě roztoku obsahuje přednostně všechny reakční složky potřebné pro zkoušku. Jako rozpouštědlo přichází v úvahu voda nebo směsi vody s organickými rozpouštědly rozpustnými ve vodě, jako je například methanol, ethanol, aceton nebo dimethylformamid. Z důvodu skladovatelnosti může být výhodné rozdělit reakční složky potřebné pro provedení zkoušky do dvou nebo víoe roztoků, které se spolu smísí teprve při vlastním prováděni zkoušky.
Pro výrobu diagnostického prostředku ve formě lyofilizátu o celkové hmotnosti vždy 5 až 20 mg, přednostně asi 10 mg, se vysuší roztok, který vedle všech reakčních složek potřebných pro provedení zkoušky obsahuje též obvyklé nosiče, například polyvinylpyrrolidon, a popřípadě další nosiče, jako je mannit, sorbit nebo xylit.
Diagnostický prostředek ve formě práškovité směsi nebo reagenční tablety se může připravit tak, že se složky potřebné pro provedení zkoušky smísí s obvyklými galeniokými přísadami a směs se granuluje. Přísadami tohoto typu jsou například alkoholické cukry, jako mannit, sorbit nebo xylit nebo Jiné rozpustné inertní sloučeniny, jako polyethylenglykoly nebo polyvinylpyrrolidon. Práškovité směsi nebo reagenční tablety vykazují obvykle konečnou hmotnost asi 30 až asi 200 mg, přednostně 50 až 80 mg.
£ři výrobě diagnostického prostředku ve formě zkušebního proužku se savý nosič, přednostně filtrační papír, celulóza nebo rouno ze syntetických vláken, napustí roztokem požadovaných, pro výrobu zkušebních proužků obvykle používaných reakčníoh složek ve snadno těkavém rozpouštědle, jako například vodě, methanolu, ethanolu nebo acetonu, Napouštění se může provádět Jednostupňově, často je však účelné provádět napouštění ve více stupních, přičemž se používá roztoků , které obsahují vždy část složek diagnostického prostředku. Tak se například může v prvním stupni provádět napouštění pomocí vodného roztoku obsahujícího tlumič a jiné ve vodě rozpustné přísady a pak se ve druhém stupni napouští roztokem obsahujícím glykosidázový substrát. Hotových zkušebních papírků se může používat Jako takových nebo se mohou známým způsobem vlepit do držátek nebo se mohou s výhodou vlepit mezi plastickou hmotu a jemnou síťovinu, jak je to popsáno v DE patentu č. 2 118 455.
Následující příklady dále znázorňují prostředky podle vynálezu. Příklady rozsah vynálezu v žádném směru neomezují.
Příklad 1
Stanovení aktivity β -D-galaktosidázy a) příprava použitých roztoků
Roztok tlumiče: HEPES 100 mmol/1 chlorid sodný 154 mmol/1
I-aspartát hořečnatý 2 mmol/1
BSA 10.g/1
Tneen 20 0,5 g/1 hodnota pH (nastavená hydroxidem sodným 7,3 (37 °C)
Reagenční roztok 1:1
Ve shora popsaném roztoku tlumiče se rozpustí 0,8 mmol/1 fi> -D-galaktopyranosidu resorufinu.
Rs.agenční roztok 2:
Ve shora popsaném roztoku tlumiče se rozpustí 3,5 mmol/1 -D-galaktopyranosidu resorufin-9-karboxylové kyseliny.
Reagenční roztok 3:
Ve shora popsaném roztoku tlumiče se rozpustí 1,0 mmol/1 -D-galaktopyranosidu methylesteru resorufin-9-karboxylové kyseliny.
Roztok enzymu:
Obchodně dostupná /!> -D-galaktosidáza vyrobená za použití Esoheriohia coli se rozpustí vs shora popsaném roztoku tlumiče. Aktivita tohoto roztoku js asi 0,08 U/ml (vztaženo na údaje výrobce).
b) Provádění měření
Měření se provádí fotometricky při 579 nm.
950 fjil reagenčního roztoku se v 1 cm kyvetě při 37 °C smísí s 5O,ulroztoku enzymu.
Měřítkem reakce je nárůst extlnkce vztažený na Sašovou'jednotku (mEXT/min). Tato hodnota se vypočítá z naměřené extlnkce vydělením reakční dobou.
Získaná data jsou uvedená v následující tabulce:
ReagenČní roztok Číslo
Reakce (mExt/rain)
Příklad 2
Důkaz /S-galaktosidázy pomocí indikátorového filmu
Směs ml vodného roztoku obsahujícího 0,5 M fosforečnanů draselného a 0,05 M chloridu hořečnatého, pH 7,3,
0,13 g alginátu sodného, g 50 % disperze polyvinylpropionátu 10 g silikagelu, ml vody,
0,4 g Tritonu X-10Ó a mg resorufin-/3-D-galaktopyranosÍdu rozpuštěného v 5 ml methanolu se spolu smísí na homogenní hmotu. Tato hmota se nanese na 0,1 mm tlustou polykarbonátovou fólii (Pokalon, Fa. Lonza) při šířce nanášecí štěrbiny 0,2 mm. Povlak se vysuší při 50 °C, načež se fólie rozstříhá na kousky o rozměrech 6x6 mm, které se pomocí lepící pásky nalepí na 400 pan tlustou polystyrénovou fólii.
Takto získané zkušební proužky se na krátkou dobu ponoří do zkoušeného roztoku obsahujícího β-D-galaktosidázu. Po čekací době dvou minut při teplotě místnosti se na proužku vytvoří červené reakční zbarvení, jehož intenzita je závislá na koncentraci /i-D-galaktosidázy ve zkoušeném vzorku. S pomocí zkušebních roztoků s předem určenou známou koncentrací β - D-galaktosidázy je možno získat barevnou stupnici, pomocí které je možno určovat neznámý obsah β-D-galaktosidázy ve zkušebních vzorcích.
Shora popsané zkušební proužky je možno rovněž použít pro kinetická stanovení aktivity β -D-galaktosidázy ve vzorku pomocí reflexní fotometrie. I v tomto případě se může pomocí vzorků se známou aktivitou /£-D-galaktosidázy sestrojit kalibrační křivka, s jejíž pomocí je lze určovat neznámé hodnoty aktivity β-D-galaktosidázy ve zkušebních vzorcích.
Příklad 3
Stanovení aktivity volné a konjugované β-D-galaktosidázy a) Výroba použitých roztoků
Roztok tlumiče: HEPES 100 mmol/1 chlorid sodný L-asparát hořečnatý BSA
Tween-20
154 mmol/1 2 mmol/1 g/1
0,5 g/1
Hodnota pH (nastavená hydroxidem sodným) 7.3 (37 °C)
Reaganční roztok:
Va shora popsaném roztoku tlumiče sa rozpustí 0,8 mol/1 resorufin-^-D-galaktopyranosidu.
Roztok enzymu:
Obchodně dostupné /?-D-galaktosidáza vyrobená za použití Esoheriohia ooli se rozpustí va shora popsaném roztoku tlumiče. Aktivita vzniklého roztoku je asi 0,08 U/ml (vztaženo na údaje výrobce).
Roztok konjugátu enzymu:
Použije se preparátu obsahujícího konjugát /?-D-galaktosidázy a protilátky. Způsob výroby takového konjugátu je známý e je popsán například v Biochem. Biophys. Acta 612. 40 až 49 /1980/. Preparát se zředí roztokem tlumiče na takovou koncentraci, aby měl přibližně srovnatelnou aktivitu se shora popsaným roztokem enzymu.
b) Provádění měřeni:
Měření se provádí fotometricky při 578 nm. 950 μΙ reagenčního roztoku ee vždy v 1 om kyvetě smísí s 50 )il roztoku enzymu nebo 50 μιΐ roztoku konjugátu enzymu při teplotě 37 °C. Měřítkem reakce je nárůst extinkce za časovou jednotku a udává se v jednotkách mExt/min.
Při reakci s volnou ft -D-galaktosidázou se zjistí hodnota 85 mExt/min a při reakci s konjugátem /3-D-galsktosidáza - protilátka se zjistí hodnota 92 mExt/min.
Obě naměřené hodnoty ukazují, že jak v případě volné, tak v případě konjugované A-D-galaktosidázy vzniká velmi dobře měřitelný rozdíl v extinkci,
Z toho vyplývá, že popsané sloučeniny se hodí jako substráty stejně dobře jak pro volné glykosidázy, tak pro konjugáty glykosidáz. Nových substrátů je proto možno používat nejen jako diagnostických prostředků pro stanovení volných glykosidáz, nýbrž i, což je velmi výhodné, pro imunologické metody stanovení, při kterých se glykosidáz používá jako indikátorových enzymů.

Claims (3)

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    1. Diagnostický prostředek pro stanovení aktivity glykosidáz obsahující jeden nebo více ohromogenníoh a/nebo fluorogenníoh substrátů, vhodnou tlumivou látku a popřípadě další obvykla pomocné látky, vyznačující se tím, že jako chromogenní a fluorogenní substráty obsahuje glykosidy derivátů resorufinu obecného vzorce Ta nabo Ib (Ia) /
    A °S 273162 B2 (Xb) kde glykosid je glykosidový zbytek monosaobaridu
    R·*· je vodík, každý ze symbolů R^, R^ a R^, které jsou stejné nebo různé, vodík, halogen nebo alkylskupina s 1 až 5 atomy uhlíku, každý ze symbolů R^ a R^, které jsou stejné nebo různé, je vodíky halogen, kyanoskupina, alkylskupina s 1 až 5 atomy uhlíku, alkoxyskupina s 1 až 5 atomy uhlíku; karboxyskupina, alkoxykarbonyl-, karboxyalkyl- nebo alkoxykarbonylaiky1skupina, přičemž v posledně uvedených třech skupinách alkylové a alkoxylové zbytky vždy 1 až 5 atomů uhlíku, nebo karboxamidoskupina, popřípadě jednoduše nebo dvojnásobně substituovaná prostřednictvím alkylových, alkoxyalkylových, karboxyalkylových nabo alkoxykarbonylalkylových zbytků, v nichž alkylové a alkoxylové skupiny obsahují vždy 1 až 5 atomů uhlíku, přičemž v případě přítomnosti dvou substituentů, mohou být spolu spojeny za vzniku kruhu, který je popřípadě přerušen též kyslíkem, dusíkem nebo sírou, nebo skupinu obecného vzorce
    - COO - (CH2-CH20)n - R7 kde R7 je vodík nebo alkylskupina s 1 až 5 atomy uhlíku a n je celé číslo 1 až 4, přičemž navío R^ je sulfonyl- nebo nitroskupina a Y je dusík nebo skupina Ν'—>0.
  2. 2. Diagnostický prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že derivát resorufinu obsahuje jako glykosidový zbytek β> -D-galaktopyranosidový, -D-galaktopyranosidový, fi, -D-glukopyranosidový, 06-D-glukopyranosidový nebo có -D-mannopyranosidový zbytek.
  3. 3. Diagnostický prostředek podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jako přídavná pomocná činidla obsahuje smáčedla, galenické přísady nebo/a nosiče pro vytvoření kostry.
CS206485A 1984-03-29 1985-03-22 Diagnostic agent for glicosidases activity determination CS273162B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS298888A CS273184B2 (en) 1984-03-29 1988-05-03 Method of resorufin's derivative glycoside production

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19843411574 DE3411574A1 (de) 1984-03-29 1984-03-29 Glycoside von resorufin-derivaten, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der aktivitaet von glycosidasen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS206485A2 CS206485A2 (en) 1990-07-12
CS273162B2 true CS273162B2 (en) 1991-03-12

Family

ID=6231957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS206485A CS273162B2 (en) 1984-03-29 1985-03-22 Diagnostic agent for glicosidases activity determination

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0156347B1 (cs)
JP (2) JPS60218397A (cs)
KR (1) KR870000699B1 (cs)
AT (1) ATE66929T1 (cs)
AU (1) AU550958B2 (cs)
CA (1) CA1257253A (cs)
CS (1) CS273162B2 (cs)
DD (2) DD235648A5 (cs)
DE (2) DE3411574A1 (cs)
DK (1) DK140385A (cs)
ES (1) ES8603192A1 (cs)
FI (1) FI81359C (cs)
HU (1) HU198734B (cs)
SU (2) SU1487824A3 (cs)
ZA (1) ZA852333B (cs)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3412939A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-17 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Substrate fuer hydrolasen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3534927A1 (de) * 1985-10-01 1987-04-02 Boehringer Mannheim Gmbh Phosphate von resorufin-derivaten, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der aktivitaet von phosphatasen
DE3629175A1 (de) * 1986-08-28 1988-03-17 Behringwerke Ag Chromogene verbindungen, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung
US4810636A (en) * 1986-12-09 1989-03-07 Miles Inc. Chromogenic acridinone enzyme substrates
DE3644401A1 (de) * 1986-12-24 1988-07-07 Boehringer Mannheim Gmbh Neue hydrolase-substrate
EP0494704A3 (en) 1987-04-10 1992-09-02 The Flinders University Of South Australia Method and composition for the determination of calcium ions in fluids
DE3732871A1 (de) * 1987-09-30 1989-04-20 Behringwerke Ag Chromogene substrate
US4932871A (en) * 1987-11-20 1990-06-12 Miles Inc. Rapid method for preparing chromogenic alpha-amylase substrate compounds at high preparative yields
DE3743908A1 (de) * 1987-12-23 1989-07-06 Boehringer Mannheim Gmbh Neue oligoglucoside
JPH01211595A (ja) * 1988-02-18 1989-08-24 Kikkoman Corp 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、その製法及びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬への利用
US5151348A (en) * 1988-12-23 1992-09-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Enzyme-linked immunoassay for measurement of cyclosporin a levels in whole blood samples
US5104980A (en) * 1989-06-12 1992-04-14 Miles Inc. Chromogenic dibenzoxazepinone and dibenzothiazepinone enzyme substrates
KR100710561B1 (ko) * 2000-07-12 2007-04-24 에스케이 주식회사 유류 제품 은닉 표지 물질 및 이를 검출하는 방법
WO2002100843A1 (fr) * 2001-06-13 2002-12-19 Jianqing Lu Composes phenoxazines, preparations les contenant et leurs utilisations medicinales
FR2854893B1 (fr) * 2003-05-13 2006-07-07 Biomerieux Sa Nouveaux substrats enzymatiques derives de phenoxazinone et leur utilisation comme revelateur dans la detection de microorganismes a activite peptidase
FR2875242B1 (fr) * 2004-09-10 2006-11-17 Biomerieux Sa Nouveaux substrats enzymatiques derives de phenoxazinone et leur utilisation comme revelateur dans la detection de microorganismes a activite peptidase
WO2016110378A1 (en) 2015-01-09 2016-07-14 Unilever Plc Laundry treatment composition comprising a dye
EP3932995A1 (en) 2020-07-04 2022-01-05 Emulseo SAS Novel fluorescent substrates and uses thereof in microfluidics

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3378463A (en) * 1965-06-22 1968-04-16 Army Usa Method of measuring enzyme activity
US3391104A (en) * 1966-11-14 1968-07-02 Eastman Kodak Co Light stabilized, poly-alpha-olefin plastic composition
US3950322A (en) * 1973-08-27 1976-04-13 Research Corporation Fluorogenic substrate glycosides
DE2752501A1 (de) * 1977-11-24 1979-05-31 Kurt Prof Dr Wallenfels Mit indikatorgruppen substituierte alpha-d-maltodextrine, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur bestimmung von glukosidasen und amylasen
US4406832A (en) * 1981-09-03 1983-09-27 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
NZ206795A (en) * 1983-01-21 1987-08-31 Merck Frosst Canada Inc Phenothiazines, analogues and pharmaceutical compositions

Also Published As

Publication number Publication date
DK140385A (da) 1985-09-30
FI851248L (fi) 1985-09-30
HUT38104A (en) 1986-04-28
CA1257253A (en) 1989-07-11
CS206485A2 (en) 1990-07-12
ES541589A0 (es) 1985-12-16
KR850006427A (ko) 1985-10-05
DE3411574A1 (de) 1985-10-10
DE3583954D1 (de) 1991-10-10
EP0156347A3 (en) 1988-01-13
DD246120A5 (de) 1987-05-27
FI851248A0 (fi) 1985-03-28
HU198734B (en) 1989-11-28
JPH027589B2 (cs) 1990-02-19
ATE66929T1 (de) 1991-09-15
DD235648A5 (de) 1986-05-14
FI81359C (fi) 1990-10-10
FI81359B (fi) 1990-06-29
EP0156347A2 (de) 1985-10-02
JPS60218397A (ja) 1985-11-01
DK140385D0 (da) 1985-03-28
ZA852333B (en) 1985-12-24
SU1487824A3 (ru) 1989-06-15
AU4037585A (en) 1985-10-03
EP0156347B1 (de) 1991-09-04
AU550958B2 (en) 1986-04-10
ES8603192A1 (es) 1985-12-16
JPH0579064B2 (cs) 1993-11-01
JPH02160771A (ja) 1990-06-20
SU1574173A3 (ru) 1990-06-23
KR870000699B1 (ko) 1987-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS273162B2 (en) Diagnostic agent for glicosidases activity determination
EP0231125B1 (en) Hydrolyzable fluorescent substrates and analytical determinations using same
EP0270946B1 (en) Chromogenic acridinone enzyme substrates
US4668622A (en) Phenolsulphonphthaleinyl-β-D-galactosides and diagnostic agents containing them
US4952495A (en) Hydrolyzable compounds which release electron transfer agents and analytical use of same
Cheeseman et al. Assays for the identification and quantification of sialic acids: challenges, opportunities and future perspectives
US5292669A (en) Agents for the detection of substrates with hydrolase activity
US4754025A (en) Glucosamine derivatives and reagent for assaying N-acetyl-β-D-glucosaminidase using the same as substrate
JP3994461B2 (ja) ヒドロキシアルキルピリジン誘導体
JPS58994A (ja) 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼ活性測定法
US5202233A (en) Process for the detection of substances with hydrolase activity
WO2000055167A1 (fr) Derives de 2-pyridinethiol et reactifs permettant la mesure de l'activite de la nag contenant ceux-ci
NO175308B (no) Kromogen enzymsubstratforbindelse, anvendelse av forbindelsen samt forsöksinnretning for bestemmelse av et bestemt enzym i en flytende pröve
US6534637B2 (en) Synthesis of chlorophenol red glucuronic acid
US5260428A (en) Agent for the detection of substances with hydrolase activity
US5792619A (en) Assay using oxidative chromogenic reagent
JPH0730107B2 (ja) 加水分解酵素活性を有する物質の検出方法及び二環式化合物
JPH0687798B2 (ja) 体液中のカルシウム測定方法
JPH07112440B2 (ja) α−アミラ−ゼアイソザイムの分別測定法
JP3266967B2 (ja) 新規なオリゴサッカライド誘導体及びその製法、並びにこれを基質として用いるα−アミラーゼ活性測定法
CS273184B2 (en) Method of resorufin's derivative glycoside production
CS268700B2 (en) Means for beta-d-galacosidase determination
JPH09289899A (ja) α−アミラーゼ活性測定用基質、測定試薬及び測定方法
JPH05262716A (ja) 被酸化性呈色試薬