JPH09289899A

JPH09289899A - α−アミラーゼ活性測定用基質、測定試薬及び測定方法

Info

Publication number: JPH09289899A
Application number: JP6236697A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Hisae; 信雄久江; Tomohiro Saito; 知弘斉藤
Original assignee: SHINOTESUTO KK; Shino Test Corp
Current assignee: SHINOTESUTO KK; Shino Test Corp
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 1997-11-11

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】共役酵素を使用せずにα−アミラーゼ活性を測
定することができ、長期間正確な測定値が得られるα−
アミラーゼ活性測定用の基質、測定試薬及び測定方法の
提供。【解決手段】一般式（Ｉ）（式中、Ｒ₁ 、Ｒ₂ はそれぞれ水素原子あるいは、非置
換又は置換の低級アルキル基、低級アルコキシル基又は
フェニル基であり、Ｒ₁ とＲ₂ は互いに架橋していても
よく、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、同一若しくは異なって、水素原
子、水酸基、低級アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子
又はニトロ基であり、ｎは０又は１である、但し、Ｒ₁
とＲ₂ は同時に水素であることはない）で表される化合
物よりなる共役酵素を必要としないα−アミラーゼ活性
測定用の基質。また、前記化合物を基質として含有し、
かつ共役酵素を含有しないα−アミラーゼ活性測定試
薬。更に、前記化合物を基質として用い、共役酵素を介
在させずに測定を行うα−アミラーゼ活性測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、還元末端並びに非
還元末端において誘導体化されたマルトオリゴ糖化合物
よりなる共役酵素を必要としないα−アミラーゼ活性測
定用の基質、前記マルトオリゴ糖誘導体化合物を基質と
して含有し、かつ共役酵素を含有しないα−アミラーゼ
活性測定試薬及び前記マルトオリゴ糖誘導体化合物を共
役酵素を介在させずにα−アミラーゼと反応させること
よりなる試料中のα−アミラーゼ活性測定方法に関する
ものである。本発明は、臨床検査分野及び食品分野など
において特に重要であるα−アミラーゼの活性測定に適
するものである。本発明のα−アミラーゼ活性測定用の
基質は、α−アミラーゼの基質として共役酵素を介在さ
せずにα−アミラーゼ活性の測定が可能となり、かつ転
移反応を生じさせることなく正確なα−アミラーゼ活性
の測定を可能とするものである。

【０００２】

【従来の技術】α−アミラーゼ［Ｅ．Ｃ．３．２．１．
１］は、澱粉又はグリコーゲン等の糖質中のグルコース
単位間のα−１，４グリコシド結合を加水分解するエン
ド型配糖体加水分解酵素である。このα−アミラーゼ
は、人体中では主として膵臓及び唾液腺で産生され、急
性膵炎又は流行性耳下腺炎発症時に血清、血漿又は尿等
中の活性値が上昇することから、その活性の測定が疾患
の診断の場で広く行われている。

【０００３】従来より、α−アミラーゼ活性測定方法と
しては、α−アミラーゼに澱粉を基質として反応させ
て、残存する澱粉の量をヨード澱粉反応により測定する
アミロクラスティック（Ａｍｙｌｏｃｌａｓｔｉｃ）
法、α−アミラーゼによって分解生成される糖の還元能
を測定するサッカロジェニック（Ｓａｃｃｈａｒｏｇｅ
ｎｉｃ）法又はα−アミラーゼに色素を結合させた澱粉
を基質として反応させて、これにより遊離する色素結合
オリゴ糖の量を測定するクロモジェニック（Ｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｉｃ）法等が知られているが、これらの測定方
法はいずれも操作が煩雑であって、測定の再現性が悪い
などの問題点を有していた。

【０００４】また、近年、マルトオリゴ糖の還元末端に
置換されたフェニル基などを結合させた４−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−マルトヘキサオシド又は４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド等のマルトオリゴ糖誘
導体を基質として用い、これが試料中のα−アミラーゼ
によって分解されることにより生成してくる４−ニトロ
フェニル−α−Ｄ−マルトテトラオシド、４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−マルトシド又は４−ニトロフェニル−α−
Ｄ−グルコシド等を、共役酵素としてのα−グルコシダ
ーゼ又はα−グルコシダーゼ並びにβ−グルコシダーゼ
で更に分解し、これにより生成した４−ニトロフェノー
ル等の遊離の置換されたフェノールの量を、吸光度を測
定することにより定量して、試料中のα−アミラーゼ活
性を測定する方法が開発された（特開昭５３−１１０９
２号公報、特開昭５４−５１８９２号公報）。しかしな
がら、これらの測定方法は、測定試薬に含まれるα−グ
ルコシダーゼ等の共役酵素により基質が分解され、測定
試薬の保存中又は測定中に試薬ブランク値が上昇して、
測定試薬の性能が劣化するという問題点を有していた。

【０００５】この問題点を解決するためにマルトオリゴ
糖の非還元末端をアルキル基、フェニル基又はこれらの
誘導体で修飾し、還元末端に置換されたフェニル基等を
結合させた、４，６−Ｏ−エチリデン−４−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド、４，６−Ｏ−ベン
ジリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタ
オシド又は４，６−Ｏ−イソプロピリデン−２−クロロ
−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトペンタオシド等
のマルトオリゴ糖誘導体を基質として用い、α−グルコ
シダーゼ又はα−グルコシダーゼ並びにβ−グルコシダ
ーゼを共役酵素として使用して、共役酵素による基質の
分解を抑制する測定方法が考え出され（特開昭６０−５
４３９５号公報、特開昭６０−８７２９７号公報）、更
にこれに共役酵素としてα−グルコシダーゼ又はα−グ
ルコシダーゼ並びにβ−グルコシダーゼと共にグルコア
ミラーゼを用いることにより、分解速度が遅かった４−
ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトテトラオシド等のテト
ラオシド誘導体を迅速に分解して、置換されたフェノー
ルを遊離させる測定方法が考え出された（特開昭６１−
６３２９９号公報）。

【０００６】しかしながら、これらの測定方法は、α−
グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラ
ーゼ等の共役酵素を必要とするため、測定反応がα−アミラーゼによる反応と各共役酵素
による反応の２段階又は３段階の反応よりなり、直接α
−アミラーゼ活性を測定することが出来ない、２段階又は３段階の反応により測定するため、測定
反応が定常状態となって測定可能となるまでに１〜３分
間の時間がかかる（ラグフェーズを有する）、共役酵素中に不純物として含まれている微量のα−
アミラーゼが基質を徐々に分解し、試薬ブランクを上昇
させる、共役酵素を添加するため測定のコストが高いものに
なる、等の問題点を有していた。

【０００７】共役酵素を使用しないα−アミラーゼ活性
測定方法として、マルトトリオース又はマルトースの還
元末端に、置換された４−ニトロフェニル基又は置換さ
れたナフチル基を結合させた、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（以下、Ｇ３ＣＮ
Ｐと略記することがある）又は４−クロロ−２−ニトロ
−１−ナフチル−α−Ｄ−マルトトリオシド等のマルト
トリオース誘導体又はマルトース誘導体を基質として用
い、これが試料中のα−アミラーゼによって分解される
ことにより生成してくる遊離の置換された４−ニトロフ
ェノール又は遊離の置換されたナフタレンの量を測定す
ることにより、試料中のα−アミラーゼ活性を測定する
方法が考え出された（特開昭６３−１８３５９５号公
報）。この２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
マルトトリオシドの構造を下に示した。

【０００８】

【化４】

【０００９】しかしながら、この測定方法については、
Ｇ３ＣＮＰを基質とした場合のα−アミラーゼとの反応
機構を検討した結果、基質とα−アミラーゼの反応によ
り本来生成される２−クロロ−４−ニトロフェノール及
びマルトトリオース以外に、マルトース、マルトテトラ
オース、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マ
ルトシド及び２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ
−マルトヘキサオシドが生成し、元の基質より大きなマ
ルトオリゴ糖及びマルトオリゴ糖誘導体の生成が確認さ
れた。（菅沼ら「第20回日本臨床化学会冬期セミナープ
ログラム・抄録集」，３５頁，１９９４年）この報告によると、α−アミラーゼ−マルトトリオース
複合体（活性中間体）の一部は更に１分子の基質と反応
して２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルト
ヘキサオシドを生成し（転移反応）、これがα−アミラ
ーゼにより再び反応を受け分解されてマルトース、マル
トテトラオース及び２−クロロ−４−ニトロフェニル−
α−Ｄ−マルトシドが生成すると考えられるとされてい
る。

【００１０】この報告に記載された反応を下に示した
が、前記のようにこの測定方法では、１分子の基質にα−アミラーゼが複数回反応してし
まう可能性があり（ダブルアタック）、α−アミラーゼ
の１回の反応を正確に捕えることができない、転移反応により生じた元の基質より大きなマルトオ
リゴ糖又はマルトオリゴ糖誘導体が再びα−アミラーゼ
により分解され、生成した２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−マルトシド等のマルトース誘導体又はグ
ルコース誘導体は、シグナルとして検出することができ
ないので、やはりα−アミラーゼによる反応を正確に検
出することができない、との問題点が存在した。

【００１１】

【化５】

【００１２】また、マルトトリオース又はマルトースの
還元末端に置換されたインドフェニル基を結合させた、
２’，２，６−トリクロロ−インドフェニル−α−Ｄ−
マルトトリオシド等を基質として用い、共役酵素を使用
することなしに試料中のα−アミラーゼ活性を測定する
方法が報告され、更にマルトトリオース又はマルトース
の非還元末端をアルキル基、フェニル基又はこれらの誘
導体で修飾し、還元末端に置換されたインドフェニル基
を結合させた化合物としてイソプロピリデン−２’，
２，６−トリクロロ−インドフェニル−α−Ｄ−マルト
トリオシドが開示された。（特表平５−５０７０９４号
公報）。しかし、この基質は構造が複雑であり、その合
成には４段階のステップが必要であって煩雑である。

【００１３】そして、マルトテトラオース、マルトトリ
オース又はマルトースの非還元末端をβ−ガラクトピラ
ノシル基で修飾し、還元末端に結合が切断されたときに
測定可能な物質となる基を結合させた２−クロロ−４−
ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−α−Ｄ−マルトシド等を基質として用い、共役酵素を
使用することなしに試料中のα−アミラーゼ活性を測定
する方法が報告されているが十分ではない（特開平６−
３１５３９９号公報）。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、従来の
α−アミラーゼ活性測定用の基質、α−アミラーゼ活性
測定試薬及びα−アミラーゼ活性測定方法において、アミロクラスティック法、サッカロジェニック法及
びクロモジェニック法等は、操作が煩雑であって測定の
再現性が悪いものであり、置換されたフェニル基等を還元末端に結合させたマ
ルトオリゴ糖誘導体を基質とし、共役酵素を必要とする
測定方法は、保存中又は測定中に共役酵素により基質が
分解され、試薬ブランクが上昇して測定試薬の性能が劣
化するものであり、非還元末端をアルキル基等で修
飾しかつ還元末端に置換されたフェニル基等を結合させ
たマルトオリゴ糖誘導体を基質として、共役酵素を必要
とする測定方法は、直接α−アミラーゼの活性を測定す
ることができず、測定反応が定常状態になり測定可能と
なるまでに時間がかかり（ラグフェーズを有し）、共役
酵素中に不純物として含まれる微量のα−アミラーゼに
より測定値が正の誤差を受け、そして共役酵素の原料費
により測定のコストが高いというものであり、従来の、マルトテトラオース誘導体、マルトトリオ
ース誘導体又はマルトース誘導体を基質とし、共役酵素
を使用しない測定方法は、転移反応により生成した元の
基質より大きなマルトオリゴ糖又はマルトオリゴ糖誘導
体が再びα−アミラーゼにより反応を受けて分解される
ことより、α−アミラーゼによる反応を正確に検出する
ことができなかったり、基質の合成が煩雑なものであっ
た。

【００１５】本発明者らは、これらの従来のα−アミラ
ーゼ活性測定方法等が有する課題を解決すべく鋭意検討
を行った結果、還元末端及び非還元末端が特定の官能基
により誘導体化されたマルトオリゴ糖化合物をα−アミ
ラーゼの活性測定の基質として用いることにより、前記
の課題が解決できることを見出し、α−アミラーゼと
の親和性に優れているため共役酵素を使用せずにα−ア
ミラーゼ活性を測定することができ、基質の分解が抑
えられることにより長期間正確な測定値を得ることがで
き、ラグフェーズを有さず、共役酵素中の不純物に
よる正誤差がなく、低コストで測定を行うことがで
き、元の基質より大きなマルトオリゴ糖又はマルトオ
リゴ糖誘導体を生成する転移反応を完全に防げることに
より測定値が正確であり、基質の合成が容易であり、
かつ測定操作が簡便で再現性のよい、α−アミラーゼ
活性測定用の基質、α−アミラーゼ活性測定試薬及びα
−アミラーゼ活性測定方法を完成するに至った。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は以下の発明を提
供する。

【００１７】（１）一般式（Ｉ）

【化６】（式中、Ｒ₁ は水素原子あるいは、置換されていないか
若しくは置換されている、低級アルキル基、低級アルコ
キシル基又はフェニル基であり、Ｒ₂ は水素原子あるい
は、置換されていないか若しくは置換されている、低級
アルキル基、低級アルコキシル基又はフェニル基であ
り、Ｒ₁ とＲ₂ は互いに架橋していてもよく、Ｒ₃ 及び
Ｒ₄ は、同一若しくは異なって、水素原子、水酸基、低
級アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子又はニトロ基で
あり、ｎは０又は１である、但し、Ｒ₁ とＲ₂ は同時に
水素原子であることはない）で表される化合物よりな
る、共役酵素を必要としないα−アミラーゼ活性測定用
の基質。

【００１８】（２）一般式（Ｉ）

【化７】（式中、Ｒ₁ は水素原子あるいは、置換されていないか
若しくは置換されている、低級アルキル基、低級アルコ
キシル基又はフェニル基であり、Ｒ₂ は水素原子あるい
は、置換されていないか若しくは置換されている、低級
アルキル基、低級アルコキシル基又はフェニル基であ
り、Ｒ₁ とＲ₂ は互いに架橋していてもよく、Ｒ₃ 及び
Ｒ₄ は、同一若しくは異なって、水素原子、水酸基、低
級アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子又はニトロ基で
あり、ｎは０又は１である、但し、Ｒ₁ とＲ₂ は同時に
水素原子であることはない）で表される化合物を基質と
して含有し、かつ共役酵素を含有しないα−アミラーゼ
活性測定試薬。

【００１９】（３）（ａ）一般式（Ｉ）

【化８】（式中、Ｒ₁ は水素原子あるいは、置換されていないか
若しくは置換されている、低級アルキル基、低級アルコ
キシル基又はフェニル基であり、Ｒ₂ は水素原子あるい
は、置換されていないか若しくは置換されている、低級
アルキル基、低級アルコキシル基又はフェニル基であ
り、Ｒ₁ とＲ₂ は互いに架橋していてもよく、Ｒ₃ 及び
Ｒ₄ は、同一若しくは異なって、水素原子、水酸基、低
級アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子又はニトロ基で
あり、ｎは０又は１である、但し、Ｒ₁ とＲ₂ は同時に
水素原子であることはない）で表される化合物を基質と
してα−アミラーゼを含有すると推測される試料と混合
し、前記の試料中に含有されるα−アミラーゼを前記の
化合物と反応させ、共役酵素を介在させずに前記の化合
物の還元末端側の置換されたフェニル基を遊離させ、
（ｂ）この遊離した置換されたフェノールの量を測定
することよりなる試料中のα−アミラーゼ活性測定方
法。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明における共役酵素を必要と
しないα−アミラーゼ活性測定用の基質は、マルトシド
又はマルトトリオシドであり、一般式（Ｉ）（式中、Ｒ
₁ は水素原子あるいは、置換されていないか若しくは置
換されている、低級アルキル基、低級アルコキシル基又
はフェニル基であり、Ｒ₂ は水素原子あるいは、置換さ
れていないか若しくは置換されている、低級アルキル
基、低級アルコキシル基又はフェニル基であり、Ｒ₁ と
Ｒ₂ は互いに架橋していてもよく、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、同
一若しくは異なって、水素原子、水酸基、低級アルキル
基、アミノ基、ハロゲン原子又はニトロ基であり、ｎは
０又は１である、但し、Ｒ₁ とＲ₂ は同時に水素原子で
あることはない）で表される化合物よりなる。

【００２１】前記の一般式（Ｉ）で表される化合物より
なるα−アミラーゼ活性測定用の基質において、低級ア
ルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プ
ロピル基及びイソプロピル基等を挙げることができる。
低級アルコキシル基としては、メトキシ基、エトキシ
基、プロポキシ基及びイソプロポキシ基等を挙げること
ができる。また、Ｒ₁ とＲ₂ が架橋した置換基として
は、メチリデン基、エチリデン基、プロピリデン基、イ
ソプロピリデン基、ベンジリデン基、ジメトキシメチリ
デン基及びジエトキシメチリデン基等を挙げることがで
きる。

【００２２】一般式（Ｉ）で表される化合物よりなるα
−アミラーゼ活性測定用の基質のうち、当該マルトオリ
ゴ糖の還元末端に２−クロロ−４−ニトロフェニル基を
有する基質としては、４，６−Ｏ−メチリデン−２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ド、４，６−Ｏ−エチリデン−２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、４，６−Ｏ−イ
ソプロピリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニル−α
−Ｄ−マルトトリオシド、４，６−Ｏ−ベンジリデン−
２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリ
オシド、４，６−Ｏ−ジメトキシメチリデン−２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、
４，６−Ｏ−ジエトキシメチリデン−２−クロロ−４−
ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、４，６−
Ｏ−エチリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニル−α
−Ｄ−マルトシド及び４，６−Ｏ−ジメトキシメチリデ
ン−２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルト
シド等を挙げることができる。

【００２３】また、一般式（Ｉ）で表される化合物より
なるα−アミラーゼ活性測定用の基質のうち、当該マル
トオリゴ糖の還元末端に４−ニトロフェニル基を有する
基質としては、４，６−Ｏ−メチリデン−４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、４，６−Ｏ−エチ
リデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ド、４，６−Ｏ−イソプロピリデン−４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−マルトトリオシド、４，６−Ｏ−ベンジリ
デン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ド、４，６−Ｏ−ジメトキシメチリデン−４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、４，６−Ｏ−ジエ
トキシメチリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マル
トトリオシド、４，６−Ｏ−エチリデン−４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−マルトシド及び４，６−Ｏ−ジメトキ
シメチリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトシ
ド等を挙げることができる。

【００２４】本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物よ
りなるα−アミラーゼ活性測定用の基質は、既知の方法
で製造することができる。例えば、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（Ｇ３ＣＮ
Ｐ）又は４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ドなどのマルトトリオシド又はマルトシド等を出発原料
とし、これを非プロトン性極性溶媒中でアルデヒド、ア
セトン、又はより好ましくはアセタールと反応させるこ
とによって合成することができる。

【００２５】前記非プロトン性極性溶媒としては、Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略記するこ
とがある）、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと
略記することがある）又はホルムアミド等が挙げられる
が、最も好適な溶媒はＤＭＦである。また、アルデヒド
又はアセタール自身を溶媒として用いることも可能であ
る。

【００２６】前記アルデヒドとしては、ホルムアルデヒ
ド、アセトアルデヒド又はベンズアルデヒド等が挙げら
れる。

【００２７】また、前記アセタールとしては、ジアルコ
キシメタン、ジアルコキシエタン、ジアルコキシプロパ
ン、ジアルコキシトルエン、テトラメトキシメタン又は
テトラエトキシメタン等が挙げられ、このアルコキシル
基としては、メトキシ基又はエトキシ基が好適である。
また、アセタールの代わりとして、α，α−ジブロモト
ルエン等を用いることもできる。

【００２８】前記反応の反応温度は、用いる非プロトン
性極性溶媒及びアルデヒド、アセタール若しくはアセト
ンによって異なるが、−２０℃から溶媒の沸点までの範
囲であることが望ましく、特に好適な範囲は−１０℃か
ら５０℃である。

【００２９】また、合成時に常圧若しくは減圧下で加熱
還流を行ったり、又は副生成物として生じる水若しくは
アルコール類を蒸発除去したり、若しくはモレキュラー
シーブス等の吸着剤で吸着除去を行うことで、合成生成
物の収率を上げることができる。

【００３０】更に、本発明の基質合成時に反応溶液中
に、触媒として適量の硫酸、塩化水素、ｐ−トルエンス
ルホン酸、塩化亜鉛、又は陽イオン交換樹脂を添加する
ことで、より容易に合成反応を行うことができる。

【００３１】本発明におけるα−アミラーゼ活性測定試
薬は、一般式（Ｉ）で表される化合物を基質として含有
し、かつ共役酵素を含有しないα−アミラーゼ活性測定
試薬である。この基質として含有する一般式（Ｉ）で表
される化合物としては、前記の一般式（Ｉ）で表される
化合物よりなるα−アミラーゼ活性測定用の基質を挙げ
ることができる。

【００３２】本発明において、一般式（Ｉ）で表される
化合物をα−アミラーゼ活性測定用の基質として用い
て、α−アミラーゼの活性測定を行うに際しては、α−
アミラーゼ活性測定試薬中の本基質濃度は、０．０５〜
１００ｍＭの範囲にあることが好ましく、特に好ましく
は０．１〜５０ｍＭの範囲である。

【００３３】本発明におけるα−アミラーゼ活性測定試
薬は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物よりなるα−ア
ミラーゼ活性測定用の基質と共に、緩衝剤又はα−アミ
ラーゼの活性化剤等を含有させることができるが、α−
グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ及びグルコアミラ
ーゼ等の共役酵素はその必要がないのでこの測定試薬中
には含有しない。

【００３４】また、本発明のα−アミラーゼ活性測定試
薬は１試薬のものでもよいが、必要に応じて２試薬以上
に試薬成分を分けて構成してもよい。

【００３５】緩衝剤としては、ｐＨ５からｐＨ９の範囲
に緩衝能がある緩衝剤が使用できる。この緩衝剤として
は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ又はＨＥＰＥＳ等のグッドの緩
衝剤を用いることが好ましい。

【００３６】α−アミラーゼの活性化剤とは、α−アミ
ラーゼの活性化の効果を有する化合物であり、例えば、
カルシウムイオン又は塩化物イオンを含む化合物を挙げ
ることができ、より具体的には、酢酸カルシウムや塩化
ナトリウム等を挙げることができる。

【００３７】また、本発明のα−アミラーゼ活性測定試
薬には、界面活性剤又は防腐剤等を含有させてもよい。

【００３８】更に、本発明のα−アミラーゼ活性測定試
薬中に、アルカリ金属のアジ化物又はチオシアン酸塩を
含有させることにより、これらの成分をα−アミラーゼ
の活性化剤として使用することができる。具体的にはア
ジ化リチウム、アジ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリ
ウム又はチオシアン酸カリウム等を挙げることができ
る。

【００３９】本発明におけるα−アミラーゼ活性測定方
法は、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物を基質とし
てα−アミラーゼを含有すると推測される試料と混合
し、前記の試料中に含有されるα−アミラーゼを前記の
化合物と反応させ、共役酵素を介在させずに前記の化合
物の還元末端側の置換されたフェニル基を遊離させ、
（ｂ）この遊離した置換されたフェノールの量を測定す
ることよりなる試料中のα−アミラーゼ活性測定方法で
ある。

【００４０】この基質として用いる一般式（Ｉ）で表さ
れる化合物としては、前記の一般式（Ｉ）で表される化
合物よりなるα−アミラーゼ活性測定用の基質を挙げる
ことができる。

【００４１】本発明のα−アミラーゼ活性測定方法は、
α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコア
ミラーゼ等の共役酵素を全く必要としないという点で特
徴的である。

【００４２】本発明のα−アミラーゼ活性測定方法にお
いて、前記一般式（Ｉ）で表される化合物よりなる基質
をα−アミラーゼを含有すると推測される試料と混合す
ると、この試料中に含有されるα−アミラーゼによって
基質の糖とアグリコン（置換されたフェノール）の間の
グリコシド結合が直接加水分解され、非還元末端修飾マ
ルトース又は非還元末端修飾マルトトリオースと２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル基又は４−ニトロフェニル基
等の置換されたフェニル基に分離し、遊離する。ここで
遊離した２−クロロ−４−ニトロフェノール又は４−ニ
トロフェノール等の置換されたフェノールは、４００ｎ
ｍ付近において吸収を示すので、これを分光光度計を用
いて吸光度を測定すること等により、遊離した置換され
たフェノールの量を求め、これより試料中のα−アミラ
ーゼ活性の算出を行うことができる。

【００４３】本発明によるα−アミラーゼ活性測定方法
は、α−アミラーゼの反応停止後に吸光度を測定するエ
ンドポイント法及び単位時間当たりの吸光度変化を測定
するレート法のいずれにおいても実施することができる
が、試料中の共存物質の影響を受け難い等の理由により
レート法による実施がより好ましい。

【００４４】本発明において測定対象となるα−アミラ
ーゼは、主に血液、血清、血漿若しくは尿等中に存在す
る唾液腺由来のα−アミラーゼ、膵臓由来のα−アミラ
ーゼ又はこれら両方のα−アミラーゼ等である。また、
本発明においてα−アミラーゼ活性の測定を行う試料
は、α−アミラーゼを含有すると推測される試料であれ
ば特に限定されるものではない。

【００４５】そして、本発明によりα−アミラーゼ活性
を測定することによって、試料中のカルシウムイオン又
は塩化物イオン等を測定することもできる。

【００４６】遊離した置換されたフェノールの吸光度の
測定を行う波長としては、遊離した２−クロロ−４−ニ
トロフェノール又は４−ニトロフェノール等の置換され
たフェノールが吸収を持つ波長の範囲内のものであれば
よく、具体的には３４０ｎｍから４５０ｎｍであり、更
に好ましくは３８０ｎｍから４２０ｎｍの範囲である。
また、遊離した置換されたフェノールが吸収を持たない
波長を副波長として用い、二波長分析により吸光度の測
定を行うこともできる。

【００４７】本発明におけるα−アミラーゼ活性測定方
法をより具体的に例示すると、あらかじめ室温又は２０
℃〜４０℃に加温、好ましくは３７℃に加温した、一般
式（Ｉ）で表される化合物よりなるα−アミラーゼ活性
測定用の基質を含有するα−アミラーゼ活性測定試薬
に、α−アミラーゼを含有すると推測される試料を添加
して、温度一定の条件下において、試料添加後３０秒か
ら３０分の間、好ましくは３分から５分の間の４００ｎ
ｍにおける吸光度変化を測定し、１分間当たりの２−ク
ロロ−４−ニトロフェノール又は４−ニトロフェノール
等の置換されたフェノールの生成量（遊離量）から試料
中のα−アミラーゼ活性を算出する。

【００４８】また、基質を含有しないα−アミラーゼ活
性測定試薬にα−アミラーゼを含有すると推測される試
料を添加して、その後この測定反応液に一般式（Ｉ）で
表される化合物よりなる基質を含有するα−アミラーゼ
活性測定試薬を添加して、前記の測定方法と同様の操作
により測定を行い、１分間当たりの置換されたフェノー
ルの生成量（遊離量）から試料中のα−アミラーゼ活性
を算出してもよい。

【００４９】本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物を
基質として用いるα−アミラーゼ活性測定方法において
は、測定反応液中の本基質濃度は、０．０５〜１００ｍ
Ｍの範囲にあることが好ましく、特に好ましくは０．１
〜５０ｍＭの範囲である。

【００５０】また、本発明のα−アミラーゼ活性測定方
法においては、前記のα−アミラーゼ活性測定試薬と同
様に、測定反応液中に緩衝剤、α−アミラーゼの活性化
剤、界面活性剤又は防腐剤等を共存させてもよい。

【００５１】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に詳
述するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定さ
れるものではない。

【００５２】〔実施例１〕（４，６−Ｏ−エチリデン−２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（ＥｔＧ３ＣＮＰ）
の合成）本発明のα−アミラーゼ活性測定用の基質である、４，
６−Ｏ−エチリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニル
−α−Ｄ−マルトトリオシド（以下、ＥｔＧ３ＣＮＰと
略記することがある）の合成を行った。

【００５３】まず、５０ｍＬのフラスコに、２−クロロ
−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（Ｇ
３ＣＮＰ）１．００ｇ（１．５２ｍｍｏｌ）とｐ−トル
エンスルホン酸０．１ｇを入れ、更にＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬを加えて、攪拌して内
容物を溶解し均一な溶液とした。これに、アセトアルデ
ヒドジメチルアセタール４８４μＬ（４．５７ｍｍｏ
ｌ）を滴下し、３５℃で反応を行った。２１時間後、反
応溶液を氷冷した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）約１００ｍＬに滴下して反応を停止させた。滴下後
の緩衝液のｐＨが７であることを確認後、４０℃で濃縮
乾固し黄色の残さを得た。この残さにメタノールを加え
懸濁液とした後、これをろ過し、ろ液を濃縮乾固して
１．４６ｇの黄色の濃縮残さを得た。

【００５４】これを７０％アセトニトリル水溶液１０ｍ
Ｌに溶解後、ＨＰＬＣ（カラム：ＡｓａｈｉｐａｋＮ
Ｈ２Ｐ、昭和電工社製）にかけ、溶離液には７０％アセ
トニトリル水溶液を用いて分取を行った。その結果、
４，６−Ｏ−エチリデン−２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−マルトトリオシド〔分子量６８６．０
２〕の淡黄色の結晶２２０ｍｇを分離して得ることがで
きた。

【００５５】この４，６−Ｏ−エチリデン−２−クロロ
−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドの構
造を下に示した。

【００５６】

【化９】

【００５７】分析結果高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）カラム： Asahipak NH2P-50 4.6mmI.D.×250mm （昭和電工社製）溶離液：アセトニトリル：水＝７：３（V／V）流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ検出波長：３００ｎｍ溶出時間：６．６分ピーク純度：９９．９％

【００５８】薄層クロマトグラフィ担体： Merck Art. 5554 Kieselgel 60 F₂₅₄ （メルク社製）展開溶媒：ブタノール：ピリジン：水＝９０：５：５（V／V）Ｒf ：０．６０

【００５９】¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ₂Ｏ
中）：ｐｐｍ（分裂型：相対プロトン数） 1.34 （ｄ：３Ｈ） 3.45〜4.89（ｍ：19Ｈ） 5.42 （ｄ：１Ｈ） 5.43 （ｄ：１Ｈ） 5.96 （ｄ：１Ｈ） 7.46 （ｄ：１Ｈ） 8.22 （dd：１Ｈ） 8.40 （ｄ：１Ｈ）１．３４ｐｐｍのプロトン３個分のダブレットなピーク
はエチリデン基の末端のメチル基のものである。

【００６０】質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）［Ｍ］⁺ ＝６８６．０〔分子量（理論値）は６８６．０２〕

【００６１】赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1） 3333，2929，1586，1521，1484，1394，1347，1272，12
47，1146，1106，1083，1056，1023， 997， 933， 87
6， 839， 761， 745， 705， 678， 668， 596， 57
1， 519， 490

【００６２】〔実施例２〕（４，６−Ｏ−ジメトキシメチリデン−２−クロロ−４
−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（ＤＭＧ
３ＣＮＰ）の合成）本発明のα−アミラーゼ活性測定用の基質である、４，
６−Ｏ−ジメトキシメチリデン−２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（以下、ＤＭＧ
３ＣＮＰと略記することがある）の合成を行った。

【００６３】まず、Ｇ３ＣＮＰ１．０ｇ（１．５２ｍｍ
ｏｌ）とＤＭＦ１０ｍＬ、テトラメトキシメタン０．５
ｍＬ及びｐ−トルエンスルホン酸０．１ｇとを加えて溶
解し、均一な溶液にした。これを３５℃で２３時間撹拌
して反応させた後、氷冷した１００ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ６．５）１００ｍＬ中に反応液を少しずつ
加えて中和し、反応を停止させた。上澄み液をフラスコ
に集めて濃縮乾固し、淡黄色の残さを得た。これにメタ
ノール３０ｍＬを加えて溶解させた後、ろ過し、ろ液を
濃縮乾固させて１．５９ｇの淡黄色の残さを得た。

【００６４】これに７０％アセトニトリル水溶液８ｍＬ
を加えて溶解し、ＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐ−５０２
Ｆ分取用ＨＰＬＣカラム（昭和電工社製）にかけ、７０
％アセトニトリル水溶液を溶離液として精製した。４，
６−Ｏ−ジメトキシメチリデン−２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドのピークのフラ
クションを集めて濃縮乾固し、少量のメタノールに溶解
させた後、冷却下ジエチルエーテルを加えて結晶を晶出
させ、ろ過し、乾燥させて、ＤＭＧ３ＣＮＰの白色の結
晶１７４ｍｇを得ることができた。

【００６５】この４，６−Ｏ−ジメトキシメチリデン−
２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリ
オシドの構造を下に示した。

【００６６】

【化１０】

【００６７】分析結果高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）カラム： Asahipak NH2P-50 4.6mmI.D.×250mm （昭和電工社製）溶離液：アセトニトリル：水＝７：３（V／V）流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ検出波長：３００ｎｍ溶出時間：６．０分ピーク純度：９９．４％

【００６８】薄層クロマトグラフィ担体： Merck Art. 5554 Kieselgel 60 F₂₅₄ （メルク社製）展開溶媒：ジクロロメタン：メタノール＝４：１（V／V）Ｒf ：０．４４

【００６９】¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ₂Ｏ
中）：ｐｐｍ（分裂型：相対プロトン数） 3.33 （ｓ：３Ｈ） 3.35 （ｓ：３Ｈ） 3.67〜4.33（ｍ：18Ｈ） 5.35 （ｄ：１Ｈ） 5.38 （ｄ：１Ｈ） 5.91 （ｄ：１Ｈ） 7.41 （ｄ：１Ｈ） 8.09 （dd：１Ｈ） 8.14 （ｄ：１Ｈ）３．３３ｐｐｍ及び３．３５ｐｐｍのプロトン３個分×
２本のシングレットな各ピークはジメトキシメチリデン
基の末端のメトキシ基のものである。

【００７０】赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1） 3436，2924，1633，1587，1521，1485，1349，1273，10
84，1049， 931， 763， 580 〔実施例３〕（４，６−Ｏ−イソプロピリデン−２−クロロ−４−ニ
トロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（ＩＰＧ３Ｃ
ＮＰ）の合成）本発明のα−アミラーゼ活性測定用の基質である、４，
６−Ｏ−イソプロピリデン−２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（以下、ＩＰＧ３Ｃ
ＮＰと略記することがある）の合成を行った。

【００７１】まず、１００ｍＬのフラスコに、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド
（Ｇ３ＣＮＰ）１．００ｇ（１．５２ｍｍｏｌ）とｐ−
トルエンスルホン酸１５ｍｇを入れ、更にＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍＬを加えて、攪拌し
て内容物を溶解し均一な溶液とした。これに、アセトン
ジメチルアセタール９２７μＬ（７．５８ｍｍｏｌ）を
滴下し、２５℃で反応を行った。６時間後、反応溶液を
氷冷した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）約１０
０ｍＬに滴下して反応を停止させた。滴下後の緩衝液の
ｐＨが７であることを確認後、４０℃で濃縮乾固し黄色
の残さを得た。これにメタノールを加え懸濁液とした
後、これをろ過し、ろ液を濃縮乾固して黄色の濃縮残さ
を得た。

【００７２】これを７０％アセトニトリル水溶液１０ｍ
Ｌに溶解後、ＨＰＬＣ（カラム：ＡｓａｈｉｐａｋＮ
Ｈ２Ｐ、昭和電工社製）にかけ、溶離液には７０％アセ
トニトリル水溶液を用いて分取を行った。その結果、
４，６−Ｏ−イソプロピリデン−２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド〔分子量７０
０〕の黄色の粉体４１４ｍｇを分離して得ることができ
た。

【００７３】この４，６−Ｏ−イソプロピリデン−２−
クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ドの構造を下に示した。

【００７４】

【化１１】

【００７５】分析結果高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）カラム： Asahipak NH2P-50 4.6mmI.D.×250mm （昭和電工社製）溶離液：アセトニトリル：水＝７：３（V／V）流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ検出波長：３００ｎｍ溶出時間：６．１７分ピーク純度：９９．０％

【００７６】薄層クロマトグラフィ担体： Merck Art. 5554. Kieselgel 60 F₂₅₄ （メルク社製）展開溶媒：ジクロロメタン：メタノール＝４：１（V／V）Ｒf ：０．２９

【００７７】¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ₃Ｏ
Ｄ−ＣＤＣｌ₃中）：ｐｐｍ（分裂型：相対プロトン
数） 1.41，1.50（ｓ：各３Ｈ） 3.30〜4.22 (ｍ：18Ｈ） 5.07 （ｄ：１Ｈ） 5.18 （ｄ：１Ｈ） 5.74 （ｄ：１Ｈ） 7.35 （ｄ：１Ｈ） 8.16 （dd：１Ｈ） 8.31 （ｄ：１Ｈ）１．４１および１．５０ｐｐｍのプロトン３個分×２本
のシングレットな両ピークはイソプロピリデン基の末端
メチル基のものである。

【００７８】質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）［Ｍ］⁺ ＝７００〔分子量（理論値）は７００．０５〕

【００７９】〔実施例４〕（４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（ＢｎＧ３ＣＮ
Ｐ）の合成）本発明のα−アミラーゼ活性測定用の基質である、４，
６−Ｏ−ベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−マルトトリオシド（以下、ＢｎＧ３ＣＮＰ
と略記することがある）の合成を行った。

【００８０】まず、１００ｍＬのフラスコに、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド
（Ｇ３ＣＮＰ）１．００ｇ（１．５２ｍｍｏｌ）とｐ−
トルエンスルホン酸５０ｍｇを入れ、更にＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬを加えて、攪拌し
て内容物を溶解し均一な溶液とした。これに、ベンズア
ルデヒドジメチルアセタール１１３６μＬ（７．６１ｍ
ｍｏｌ）を滴下し、２５℃で反応を行った。２２時間
後、反応溶液にダウエックス１ＷＸ−８（水酸基型、
１００−２００メッシュ）を適量加え、約５分撹拌後、
樹脂をろ去し、ろ液を４０℃で濃縮乾固し微黄色の残さ
を得た。

【００８１】これを７０％アセトニトリル水溶液１０ｍ
Ｌに溶解後、ＨＰＬＣ（カラム：ＡｓａｈｉｐａｋＮ
Ｈ２Ｐ、昭和電工社製）にかけ、溶離液には７０％アセ
トニトリル水溶液を用いて分取を行った。その結果、
４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド〔分子量７４８〕の
白色の粉体７４３ｍｇを分離して得ることができた。

【００８２】この４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドの
構造を下に示した。

【００８３】

【化１２】

【００８４】分析結果高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）カラム： Asahipak NH2P-50 4.6mmI.D.×250mm （昭和電工社製）溶離液：アセトニトリル：水＝７：３（V／V）流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ検出波長：３００ｎｍ溶出時間：５．８３分ピーク純度：１００％

【００８５】薄層クロマトグラフィ担体： Merck Art. 5554. Kieselgel 60 F₂₅₄ （メルク社製）展開溶媒：ジクロロメタン：メタノール＝４：１（V／V）Ｒf ：０．３７

【００８６】¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ₃Ｏ
Ｈ−ＣＨＣｌ₃中）：ｐｐｍ（分裂型：相対プロトン
数） 3.37〜4.27（ｍ：18Ｈ） 5.11 （ｄ：１Ｈ） 5.18 （ｄ：１Ｈ） 5.53 （ｓ：１Ｈ） 5.73 （ｄ：１Ｈ） 7.27〜7.48（ｍ：６Ｈ） 8.15 （dd：１Ｈ） 8.31 （ｄ：１Ｈ）７．２７ｐｐｍ〜７．４８ｐｐｍのプロトン６個分のマ
ルチプレットなピークはベンジリデン基の芳香環のもの
である（４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−クロロ−４−
ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドの２−クロ
ロ−４−ニトロフェノール由来のプロトン１個分のシグ
ナルが含まれている）。

【００８７】質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）［Ｍ］⁺ ＝７４８〔分子量（理論値）は７４８．０９〕

【００８８】〔実施例５〕（４，６−Ｏ−メチリデン−２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（ＭｔＧ３ＣＮＰ）
の合成）本発明のα−アミラーゼ活性測定用の基質である、４，
６−Ｏ−メチリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニル
−α−Ｄ−マルトトリオシド（以下、ＭｔＧ３ＣＮＰと
略記することがある）の合成を行った。

【００８９】まず、５０ｍＬのフラスコに、２−クロロ
−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（Ｇ
３ＣＮＰ）１．００ｇ（１．５２ｍｍｏｌ）とｐ−トル
エンスルホン酸０．１５ｇを入れ、更にＮ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍＬを加えて、攪拌して
内容物を溶解し均一な溶液とした。これに、ジメトキシ
メタン３．３２ｍＬ（３８．０ｍｍｏｌ）を滴下し、３
５℃で反応を行った。８日後、反応溶液にダウエックス
１ＷＸ−８（水酸基型、１００−２００メッシュ）を
適量加え、約５分撹拌後、樹脂をろ去し、ろ液を４０℃
で濃縮乾固し淡黄色の残さを得た。

【００９０】これを７０％アセトニトリル水溶液１０ｍ
Ｌに溶解後、ＨＰＬＣ（カラム：ＡｓａｈｉｐａｋＮ
Ｈ２Ｐ、昭和電工社製）にかけ、溶離液には７０％アセ
トニトリル水溶液を用いて分取を行った。その結果、
４，６−Ｏ−メチリデン−２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−マルトトリオシド〔分子量６７２〕１８
０ｍｇを淡黄色の粉体として分離して得ることができ
た。

【００９１】この４，６−Ｏ−メチリデン−２−クロロ
−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドの構
造を下に示した。

【００９２】

【化１３】

【００９３】分析結果高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）カラム： Asahipak NH2P-50 4.6mmI.D.×250mm （昭和電工社製）溶離液：アセトニトリル：水＝７：３（V／V）流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ検出波長：３００ｎｍ溶出時間：７．４２分ピーク純度：１００％

【００９４】薄層クロマトグラフィ担体： Merck Art. 5554. Kieselgel 60 F₂₅₄ （メルク社製）展開溶媒：ジクロロメタン：メタノール＝２：１（V／V）Ｒf ：０．６９

【００９５】¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ₃Ｏ
Ｄ−ＣＤＣｌ₃中）：ｐｐｍ（分裂型：相対プロトン
数） 3.28〜4.18（ｍ：18Ｈ） 4.66 （ｓ：２Ｈ） 5.06 （ｄ：１Ｈ） 5.18 （ｄ：１Ｈ） 5.74 （ｄ：１Ｈ） 7.40 （ｄ：１Ｈ） 8.15 （dd：１Ｈ） 8.30 （ｄ：１Ｈ）

【００９６】質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）［Ｍ］⁺ ＝６７２〔分子量（理論値）は６７１．９９〕

【００９７】〔実施例６〕（本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬による試料中の
α−アミラーゼ活性の測定）本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬によりヒト血清試
料中のα−アミラーゼ活性の測定を行った。

【００９８】（１）α−アミラーゼ活性測定試薬の調製測定試薬（Ａ）の調製下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に調整して、基質と
して４，６−Ｏ−エチリデン−２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドを含有し、チオシ
アン酸カリウムをα−アミラーゼの活性化剤として含有
するα−アミラーゼ活性測定試薬〔測定試薬（Ａ）〕を
調製した。

【００９９】試薬成分濃度 4,6-O-エチリテ゛ン-2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシト゛（EtG3CNP）５．０ｍＭ酢酸カルシウム５．０ｍＭ塩化ナトリウム５０ｍＭチオシアン酸カリウム３００ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・一水和物（MES）５０ｍＭ

【０１００】測定試薬（Ｂ）の調製下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に調整して、基質と
して４，６−Ｏ−ジメトキシメチリデン−２−クロロ−
４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドを含有
し、チオシアン酸カリウムをα−アミラーゼの活性化剤
として含有するα−アミラーゼ活性測定試薬〔測定試薬
（Ｂ）〕を調製した。

【０１０１】試薬成分濃度 4,6-O-シ゛メトキシメチリテ゛ン-2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシト゛（DMG3CNP）５．０ｍＭ酢酸カルシウム５．０ｍＭ塩化ナトリウム５０ｍＭチオシアン酸カリウム３００ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・一水和物（MES）５０ｍＭ

【０１０２】（２）ヒト血清試料中のα−アミラーゼ活
性の測定ヒト血清試料中のα−アミラーゼ活性の測定は、３７℃
に加温した前記（１）の測定試薬（Ａ）１．５ｍＬに、
α−アミラ−ゼを含有すると推測される試料であるヒト
血清２５μＬを添加し、３７℃で反応させ、試料添加後
３分目から５分目の４０５ｎｍにおける吸光度変化を日
立３２１０型分光光度計で測定して行った。試料中のα
−アミラーゼ活性値〔ＩＵ／Ｌ（国際単位／Ｌ）〕は、
１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡ／ｍｉｎ）から次式
により算出した。

【０１０３】α−アミラーゼ活性値（IU／L）＝｛ΔＡ
／min ×（Ｓ＋Ｖ）×１０⁶｝÷（ε×Ｓ×ｄ）＝ΔＡ
／min ×４５９７

【０１０４】なお、前記式中、Ｓは試料の容量（２５μ
Ｌ）を、Ｖはα−アミラーゼ活性測定試薬の容量（１．
５ｍＬ）を、εは置換されたフェノールのモル吸光係数
（２−クロロ−４−ニトロフェノール：１３．３×１０
³ ）を、ｄは吸収セルの光路長（１ｃｍ）を表す。ま
た、前記と同様にして、前記（１）の測定試薬（Ｂ）に
よりヒト血清試料中のα−アミラーゼ活性の測定を行っ
た。これらの測定結果を表１に示した。

【０１０５】

【表１】

【０１０６】これより、本発明のα−アミラーゼ活性測
定試薬は、ヒト血清試料中のα−アミラーゼ活性の測定
を行えることが確かめられた。

【０１０７】〔実施例７〕（本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬による試料中の
α−アミラーゼ活性の測定）本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬により管理血清試
料中のヒト由来のα−アミラーゼ活性の測定を行った。

【０１０８】（１）α−アミラーゼ活性測定試薬の調製測定試薬（Ｅ）の調製下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に調整して、基質と
して４，６−Ｏ−イソプロピリデン−２−クロロ−４−
ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドを含有し、
チオシアン酸カリウムをα−アミラーゼの活性化剤とし
て含有するα−アミラーゼ活性測定試薬〔測定試薬
（Ｅ）〕を調製した。

【０１０９】試薬成分濃度 4,6-O-イソフ゜ロヒ゜リテ゛ン-2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシト゛（IPG3CNP）５．０ｍＭ酢酸カルシウム５．０ｍＭ塩化ナトリウム５０ｍＭチオシアン酸カリウム３００ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・一水和物（MES）５０ｍＭ

【０１１０】測定試薬（Ｆ）の調製下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に調整して、基質と
して４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドを含有し、チオ
シアン酸カリウムをα−アミラーゼの活性化剤、α−サ
イクロデキストリン及びトライトンＸ−４０５を基質の
可溶化剤として含有するα−アミラーゼ活性測定試薬
〔測定試薬（Ｆ）〕を調製した。

【０１１１】試薬成分濃度 4,6-O-ヘ゛ンシ゛リテ゛ン-2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシト゛（BnG3CNP）３．７ｍＭ酢酸カルシウム３．７ｍＭ塩化ナトリウム４０ｍＭチオシアン酸カリウム２５０ｍＭ α−サイクロデキストリン２０％トライトンＸ−４０５０．０４％２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・一水和物（MES）４０ｍＭ

【０１１２】（２）試料試料としてヒト由来のα−アミラーゼを含む下記の市販
の管理血清（アールト社製）を用いた。管理血清３：アールトコントロールレベルＩＩＢ〔製
造番号：Ｄ５０３〕

【０１１３】（３）管理血清試料中のα−アミラーゼ活
性の測定前記の実施例６の（２）と同様にして、前記（１）の測
定試薬（Ｅ）及び測定試薬（Ｆ）各々により、試料であ
る前記（２）の管理血清３中のα−アミラーゼ活性の測
定を行った。

【０１１４】前記（２）の管理血清３（後に記載した実
施例１０の（１）のの従来法測定試薬１におけるα−
アミラーゼ活性値：２７６ＩＵ／Ｌ）中のα−アミラー
ゼの活性値は、測定試薬（Ｅ）では１２４ＩＵ／Ｌ、測
定試薬（Ｆ）では１８ＩＵ／Ｌであった。

【０１１５】これより、本発明のα−アミラーゼ活性測
定試薬（Ｅ）及び（Ｆ）は、血清試料中のα−アミラー
ゼ活性の測定が可能であることが確かめられた。〔実施例８〕（本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬による試料中の
α−アミラーゼ活性の測定）本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬により管理血清試
料中のヒト由来のα−アミラーゼ活性の測定を行った。

【０１１６】（１）α−アミラーゼ活性測定試薬の調製測定試薬（Ｇ）の調製下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に調整して、基質と
して４，６−Ｏ−メチリデン−２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドを含有し、チオシ
アン酸カリウムをα−アミラーゼの活性化剤として含有
するα−アミラーゼ活性測定試薬〔測定試薬（Ｇ）〕を
調製した。

【０１１７】試薬成分濃度 4,6-O-メチリテ゛ン-2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシト゛（MtG3CNP）５．０ｍＭ酢酸カルシウム５．０ｍＭ塩化ナトリウム５０ｍＭチオシアン酸カリウム３００ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・一水和物（MES）５０ｍＭ

【０１１８】（２）試料試料としてヒト由来のα−アミラーゼを含む下記の市販
の管理血清（アールト社製）を用いた。管理血清４：アールトコントロールレベルＩＩＤ〔製
造番号：Ｌ５０５〕

【０１１９】（３）管理血清試料中のα−アミラーゼ活
性の測定前記の実施例６の（２）と同様にして、前記（１）の測
定試薬（Ｇ）により、試料である前記（２）の管理血清
４中のα−アミラーゼ活性の測定を行った。

【０１２０】前記（２）の管理血清４（後に記載した実
施例１０の（１）のの従来法測定試薬１におけるα−
アミラーゼ活性値：２８０ＩＵ／Ｌ）中のα−アミラー
ゼの活性値は、測定試薬（Ｇ）では１２０ＩＵ／Ｌであ
った。

【０１２１】これより、本発明のα−アミラーゼ活性測
定試薬（Ｇ）は、血清試料中のα−アミラーゼ活性の測
定が可能であることが確かめられた。

【０１２２】これらの結果より、本発明のα−アミラー
ゼ活性測定試薬は、血清試料中のα−アミラーゼ活性の
測定が可能であることが確かめられた。

【０１２３】〔実施例９〕（異なる活性化剤を用いての試料中のα−アミラーゼ活
性の測定）異なるα−アミラーゼの活性化剤を用いて、試料中のα
−アミラーゼ活性の測定を行った。

【０１２４】（１）α−アミラーゼ活性測定試薬の調製測定試薬（Ｃ）の調製下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に調整して、基質と
して４，６−Ｏ−エチリデン−２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドを含有し、チオシ
アン酸カリウムをα−アミラーゼの活性化剤として含有
するα−アミラーゼ活性測定試薬〔測定試薬（Ｃ）〕を
調製した。

【０１２５】試薬成分濃度 4,6-O-エチリテ゛ン-2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシト゛（EtG3CNP）２．０ｍＭ酢酸カルシウム５．０ｍＭ塩化ナトリウム５０ｍＭチオシアン酸カリウム３００ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・一水和物（MES）５０ｍＭ

【０１２６】測定試薬（Ｄ）の調製下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に調整して、基質と
して４，６−Ｏ−エチリデン−２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドを含有し、アジ化
ナトリウムをα−アミラーゼの活性化剤として含有する
α−アミラーゼ活性測定試薬〔測定試薬（Ｄ）〕を調製
した。

【０１２７】試薬成分濃度 4,6-O-エチリテ゛ン-2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシト゛（EtG3CNP）２．０ｍＭ酢酸カルシウム５．０ｍＭ塩化ナトリウム５０ｍＭアジ化ナトリウム１５０ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・一水和物（MES）５０ｍＭ

【０１２８】（２）試料試料として下記の２種類の市販の管理血清（ハイランド
社製）を用いた。管理血清１：オメガＩ〔製造番号凍結乾燥品：V02053、溶解液：V02052〕管理血清２：オメガＩＩ〔製造番号凍結乾燥品：1V1059、溶解液：1V1058〕

【０１２９】（３）管理血清試料中のα−アミラーゼ活
性の測定前記の実施例６の（２）と同様にして、前記（１）の測
定試薬（Ｃ）により、試料である前記（２）の管理血清
１及び管理血清２中のα−アミラーゼ活性の測定を行っ
た。また、前記と同様にして、前記（１）の測定試薬
（Ｄ）により管理血清１及び管理血清２中のα−アミラ
ーゼ活性の測定を行った。これらの測定結果を表２に示
した。

【０１３０】

【表２】

【０１３１】これより、本発明のα−アミラーゼ活性測
定試薬は、種々のα−アミラーゼの活性化剤を用いて
も、試料中のα−アミラーゼ活性の測定を行えることが
確かめられた。

【０１３２】〔実施例１０〕（従来のα−アミラーゼ活性測定方法との相関）本発明のα−アミラーゼ活性測定方法による測定値と、
従来のα−アミラーゼ活性測定方法である４，６−Ｏ−
ベンジリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘ
プタオシド（以下、ＢＧ７ＰＮＰと略記することがあ
る）を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定方法に
よる測定値との相関を確かめた。

【０１３３】（１）α−アミラーゼ活性測定試薬本発明のα−アミラーゼ活性測定方法前記の実施例６の（１）で調製した測定試薬（Ａ）をα
−アミラーゼ活性測定試薬として用いた。

【０１３４】従来のα−アミラーゼ活性測定方法（Ｂ
Ｇ７ＰＮＰ基質法）下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを７．１（２０℃）に調整して、基質と
して４，６−Ｏ−ベンジリデン−４−ニトロフェニル−
α−Ｄ−マルトヘプタオシドを用いる、α−アミラーゼ
活性測定試薬〔従来法測定試薬１〕を調製した。

【０１３５】試薬成分濃度 4,6-O-ヘ゛ンシ゛リテ゛ン-4-ニトロフェニル-α-D-マルトヘフ゜タオシト゛（BG7PNP）１ｍＭ酢酸カルシウム２ｍＭ塩化ナトリウム２０ｍＭ α−サイクロデキストリン１％ α−グルコシダーゼ６０００Ｕ／Ｌグルコアミラーゼ２００００Ｕ／Ｌヒ゜ヘ゜ラシ゛ン -N,N'-ヒ゛ス(2-エタンスルホン酸ナトリウム)（PIPES）１００ｍＭ

【０１３６】（２）試料試料として、９検体のヒト血清試料を用いた。

【０１３７】（３）ヒト血清試料中のα−アミラーゼ活
性の測定本発明のα−アミラーゼ活性測定方法前記の実施例６の（２）と同様にして、測定試薬（Ａ）
により、９検体のヒト血清試料中のα−アミラーゼ活性
の測定を行った。

【０１３８】従来のα−アミラーゼ活性測定方法（Ｂ
Ｇ７ＰＮＰ基質法）９検体のヒト血清試料中のα−アミラーゼ活性の測定
は、３７℃に加温した前記（１）の従来法測定試薬１の
２．０ｍＬに、それぞれのヒト血清試料３５μＬを添加
し、３７℃で反応させ、試料添加後３分目から５分目の
４０５ｎｍにおける吸光度変化を日立３２１０型分光光
度計で測定して行った。試料中のα−アミラーゼ活性値
（ＩＵ／Ｌ）は、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡ／
ｍｉｎ）から次式により算出した。

【０１３９】α−アミラーゼ活性値（IU／L）＝｛ΔＡ
／min ×（Ｓ＋Ｖ）×１０⁶｝÷（ε×Ｓ×ｄ）＝ΔＡ
／min ×３７７６

【０１４０】なお、前記式中、Ｓは試料の容量（３５μ
Ｌ）を、Ｖはα−アミラーゼ活性測定試薬の容量（２．
０ｍＬ）を、εは置換されたフェノールのモル吸光係数
（４−ニトロフェノール：１５．４×１０³ ）を、ｄは
吸収セルの光路長（１ｃｍ）を表す。

【０１４１】これらの測定結果を図１に示した。なお、
この図１において、縦軸（ｙ軸）は本発明のα−アミラ
ーゼ活性測定方法による測定値を、横軸（ｘ軸）は従来
のα−アミラーゼ活性測定方法（ＢＧ７ＰＮＰ基質法）
による測定値を表す。

【０１４２】

【図１】

【０１４３】この図より、本発明のα−アミラーゼ活性
測定方法によるα−アミラーゼ活性の測定と、従来のα
−アミラーゼ活性測定方法（ＢＧ７ＰＮＰ基質法）によ
るα−アミラーゼ活性の測定とでは、相関係数がｒ＝
０．９９３であり、回帰式のｙ切片が−０．３８６と小
さく、大変良好な相関を示すことがわかった。従って、
本発明のα−アミラーゼ活性測定方法によるα−アミラ
ーゼ活性の測定値は、臨床検査及び診断の場において、
問題なく用いることができることが確かめられた。

【０１４４】〔実施例１１〕（本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬の直線上限の確
認） α−アミラーゼ活性が高いヒト血清を１０段階に希釈し
た試料を用いて、本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬
の直線上限の確認を行った。

【０１４５】（１）α−アミラーゼ活性測定試薬前記の実施例６の（１）で調製した測定試薬（Ａ）をα
−アミラーゼ活性測定試薬として用いた。

【０１４６】（２）試料 α−アミラーゼ活性値２７１Ｕ／Ｌのヒト血清試料を、
それぞれ０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４
ｍＬ、０．５ｍＬ、０．６ｍＬ、０．７ｍＬ、０．８ｍ
Ｌ及び０．９ｍＬ分注し、これらに生理食塩水（０．９
％塩化ナトリウム水溶液）をそれぞれ０．９ｍＬ、０．
８ｍＬ、０．７ｍＬ、０．６ｍＬ、０．５ｍＬ、０．４
ｍＬ、０．３ｍＬ、０．２ｍＬ及び０．１ｍＬ加え混合
して、１０段階に希釈されたヒト血清試料を調製した。

【０１４７】（３）ヒト血清試料中のα−アミラーゼ活
性の測定前記の実施例６の（２）と同様にして、測定試薬（Ａ）
により、前記（２）の１０段階に希釈されたヒト血清試
料中のα−アミラーゼ活性の測定を行った。

【０１４８】この測定結果を図２に示した。なお、この
図２において、縦軸（ｙ軸）はα−アミラーゼ活性値
を、横軸（ｘ軸）はヒト血清試料の希釈率を表す。

【０１４９】

【図２】

【０１５０】この図より、本発明のα−アミラーゼ活性
測定試薬によるα−アミラーゼ活性の測定では、検量線
が原点を通る直線であり、２７０ＩＵ／Ｌ以上まで直線
性を有することがわかり、試料中のα−アミラーゼ活性
の測定において十分な性能を持つことが確かめられた。

【０１５１】〔実施例１２〕（本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬の直線上限の確
認） α−アミラーゼ活性が高いヒト血清を７段階に希釈した
試料を用いて、本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬の
直線上限の確認を行った。

【０１５２】（１）α−アミラーゼ活性測定試薬前記の実施例６の（１）で調製した測定試薬（Ｂ）をα
−アミラーゼ活性測定試薬として用いた。

【０１５３】（２）試料 α−アミラーゼ活性値３８８０Ｕ／Ｌのヒト血清試料
を、それぞれ０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、
０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、０．６ｍＬ及び０．７ｍＬ分
注し、これらに生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水
溶液）をそれぞれ０．９ｍＬ、０．８ｍＬ、０．７ｍ
Ｌ、０．６ｍＬ、０．５ｍＬ、０．４ｍＬ及び０．３ｍ
Ｌ加え混合して、７段階に希釈されたヒト血清試料を調
製した。

【０１５４】（３）ヒト血清試料中のα−アミラーゼ活
性の測定前記の実施例６の（２）と同様にして、測定試薬（Ｂ）
により、前記（２）の７段階に希釈されたヒト血清試料
中のα−アミラーゼ活性の測定を行った。

【０１５５】この測定結果を図３に示した。なお、この
図３において、縦軸（ｙ軸）はα−アミラーゼ活性値
を、横軸（ｘ軸）はヒト血清試料の希釈率を表す。

【０１５６】

【図３】

【０１５７】この図より、本発明のα−アミラーゼ活性
測定試薬によるα−アミラーゼ活性の測定では、検量線
が原点を通る直線であり、２２００ＩＵ／Ｌ以上まで直
線性を有することがわかり、試料中のα−アミラーゼ活
性の測定において十分な性能を持つことが確かめられ
た。

【０１５８】〔実施例１３〕（α−アミラーゼ活性測定用基質のα−アミラーゼによ
る分解生成物の測定）高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により、本発明
のα−アミラーゼ活性測定用の基質である４，６−Ｏ−
エチリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ
−マルトトリオシド（ＥｔＧ３ＣＮＰ）及び従来のα−
アミラーゼ活性測定用の基質である２−クロロ−４−ニ
トロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（Ｇ３ＣＮ
Ｐ）のα−アミラーゼによる分解生成物の測定を行っ
た。

【０１５９】（１）α−アミラーゼ活性測定試薬本発明のα−アミラーゼ活性測定用の基質前記の実施例９の（１）で調製した測定試薬（Ｃ）をα
−アミラーゼ活性測定試薬として用いた。

【０１６０】従来のα−アミラーゼ活性測定用の基質下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に調整して、基質と
して２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルト
トリオシド（Ｇ３ＣＮＰ）を含有し、チオシアン酸カリ
ウムをα−アミラーゼの活性化剤として含有するα−ア
ミラーゼ活性測定試薬〔従来法測定試薬２〕を調製し
た。

【０１６１】試薬成分濃度 2-クロロ-4-ニトロフェニル-α-D-マルトトリオシト゛(G3CNP) ２．０ｍＭ酢酸カルシウム５．０ｍＭ塩化ナトリウム５０ｍＭチオシアン酸カリウム３００ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）５０ｍＭ

【０１６２】（２）α−アミラーゼ活性測定用基質のα
−アミラーゼとの反応ＥｔＧ３ＣＮＰのα−アミラーゼとの反応は、測定試薬
（Ｃ）３．０ｍＬにα−アミラーゼを含有するヒト血清
２００μＬを添加し、３７℃で反応させ、α−アミラー
ゼを含有するヒト血清を添加して反応を開始させてか
ら、３０分後、２時間後、４時間後及び６時間後にこの
反応液の３００μＬを採取し、これをＨＰＬＣで分析し
て反応による分解生成物の測定を行った。

【０１６３】（３）ＨＰＬＣによる分解生成物の測定ＨＰＬＣ分析に供する試料として前記（２）で採取した
反応液３００μＬそれぞれを７００μＬのアセトニトリ
ルに添加して、α−アミラーゼを不活性化させα−アミ
ラーゼの反応を停止させた後、この溶液をサンプレップ
ＬＣＲ１３−ＬＧ（ミリポア社製）でろ過し、このろ液
をＨＰＬＣ分析の試料としてマルトオリゴシド及びマル
トオリゴ糖それぞれの分析を行った。

【０１６４】マルトオリゴシドの測定 α−アミラーゼによる分解反応で生じたマルトオリゴシ
ド（２−クロロ−４−ニトロフェニル−マルトオリゴ
糖）の測定は、固定相としてＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐ
−５０（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、昭和電工社
製）を用い、移動相として７０％のアセトニトリル水溶
液を用い、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで８８０−ＰＵ型ポ
ンプ（日本分光社製）及び８７０−ＵＶ型紫外可視分光
検出器（日本分光社製）を使用するＨＰＬＣに、それぞ
れの前記ろ液１０μＬを注入して、検出波長３００ｎｍ
で測定を行った。このＨＰＬＣによる分析のクロマトグ
ラムを図４に示した。

【０１６５】

【図４】

【０１６６】また、比較のため、前記（１）で調製した
従来のα−アミラーゼ活性測定用の基質（Ｇ３ＣＮＰ）
を含有する従来法測定試薬２を用い、前記の測定試薬
（Ｃ）の場合と同様にして、Ｇ３ＣＮＰのα−アミラー
ゼによる分解生成物の測定を行った。この時のＨＰＬＣ
による分析のクロマトグラムを図５に示した。

【０１６７】

【図５】

【０１６８】なお、これらの図において、縦軸は溶出時
間（リテンションタイム）を示し、横軸は３００ｎｍに
おける吸光度を示す。

【０１６９】そして、図４において、溶出時間約６．６
分のピーク（信号）は、４，６−Ｏ−エチリデン−２−
クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ド（ＥｔＧ３ＣＮＰ）由来のものである。

【０１７０】また、図５において、溶出時間約６．８分
のピーク（信号）は２−クロロ−４−ニトロフェニル−
α−Ｄ−グルコシド（以下、Ｇ１ＣＮＰと略記すること
がある）、溶出時間約８．０分のピーク（信号）は２−
クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトシド（以
下、Ｇ２ＣＮＰと略記することがある）、そして溶出時
間約１０．３分のピーク（信号）が２−クロロ−４−ニ
トロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（Ｇ３ＣＮ
Ｐ）由来のものである。

【０１７１】そして、これらの測定結果を、横軸に反応
時間を表し、縦軸に基質残存率又は分解生成物生成率を
表したグラフにまとめ直したのが、図６及び図７であ
る。

【０１７２】本発明のα−アミラーゼ活性測定用の基質
（ＥｔＧ３ＣＮＰ）における結果を図６に示した。

【０１７３】

【図６】

【０１７４】また、従来のα−アミラーゼ活性測定用の
基質（Ｇ３ＣＮＰ）における結果を図７に示した。

【０１７５】

【図７】

【０１７６】マルトオリゴ糖の測定 α−アミラーゼによる分解反応で生じたマルトオリゴ糖
の測定は、固定相としてＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐ−
５０（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、昭和電工社
製）を用い、移動相として７０％のアセトニトリル水溶
液を用い、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで８８０−ＰＵ型ポ
ンプ（日本分光社製）及び５０４Ｒ型示差屈折率検出器
（ジーエルサイエンス社製）を使用するＨＰＬＣに、そ
れぞれの前記ろ液２０μＬを注入して屈折率の測定を行
った。反応開始６時間後の反応液のこのＨＰＬＣによる
分析のクロマトグラムを図８に示した。

【０１７７】

【図８】

【０１７８】また、このマルトオリゴ糖の測定において
も比較のため、前記の測定試薬（Ｃ）の場合と同様にし
て、従来法測定試薬２中のＧ３ＣＮＰのα−アミラーゼ
による分解生成物の測定を行った。この時の反応開始６
時間後の反応液のＨＰＬＣによる分析のクロマトグラム
を図９に示した。

【０１７９】

【図９】

【０１８０】なお、これらの図において、縦軸は溶出時
間（リテンションタイム）を示し、横軸は屈折率変化を
示す。

【０１８１】そして、図８において、溶出時間約１３．
０分のピーク（信号）は、エチリデンマルトトリオース
（以下、ＥｔＧ３と略記することがある）由来のもので
ある。

【０１８２】また、図９において、溶出時間約１３．４
分のピーク（信号）はグルコース（以下、Ｇ１と略記す
ることがある）、溶出時間約１８．８分のピーク（信
号）はマルトース（以下、Ｇ２と略記することがあ
る）、そして溶出時間約２７．５分のピーク（信号）が
マルトトリオース（以下、Ｇ３と略記することがある）
由来のものである。

【０１８３】これらの本実施例における測定結果より、
従来のα−アミラーゼ活性測定用の基質である２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド
（Ｇ３ＣＮＰ）では、α−アミラーゼと反応することに
より、それ以上α−アミラーゼで直接分解できず、シグ
ナルとして検出できないＧ１ＣＮＰ、Ｇ２ＣＮＰ、Ｇ１
及びＧ２のような副生成物を生じ、図５に示したような
α−アミラーゼによる転移反応が生じていることが推測
され、α−アミラーゼの１回の反応を正確に捕えること
ができないことが確かめられた。

【０１８４】これに対して、本発明のα−アミラーゼ活
性測定用の基質である４，６−Ｏ−エチリデン−２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド
（ＥｔＧ３ＣＮＰ）では、α−アミラーゼとの反応によ
り分解を受ける箇所が糖とアグリコンの間の一箇所であ
り、図５に示したようなα−アミラーゼによる転移反応
が生じていないことがわかり、α−アミラーゼの１回の
反応を正確に検出できることが確かめられた。

【０１８５】

【作用】一般式（Ｉ）で表される化合物をα−アミラー
ゼ活性測定用の基質として用いる、本発明のα−アミラ
ーゼ活性測定用の基質、α−アミラーゼ活性測定試薬及
びα−アミラーゼ活性測定方法においては、一般式
（Ｉ）で表される化合物を基質としてα−アミラーゼを
含有すると推測される試料と混合することにより、前記
の試料中に含有されるα−アミラーゼによって前記の化
合物の糖とアグリコン（置換されたフェノール）の間の
グリコシド結合が直接加水分解され、非還元末端修飾マ
ルトース又は非還元末端修飾マルトトリオースと置換さ
れたフェニル基が共役酵素の介在なしに分離し、遊離す
る。これにより遊離した置換されたフェノールの量をそ
の吸光度を測定すること等により求め、これより試料中
のα−アミラーゼ活性を算出することができる。

【０１８６】

【発明の効果】一般式（Ｉ）で表される化合物をα−ア
ミラーゼ活性測定用の基質として用いる、本発明のα−
アミラーゼ活性測定用の基質、α−アミラーゼ活性測定
試薬及びα−アミラーゼ活性測定方法は、α−アミラ
ーゼとの親和性に優れているため共役酵素を使用せずに
α−アミラーゼ活性を測定することができ、共役酵素
を使用せず基質の分解が抑えられるので長期間正確な測
定値を得ることができ、ラグフェーズを有さず、共
役酵素中の不純物による正誤差がなく、低コストで測
定を行うことができ、元の基質より大きなマルトオリ
ゴ糖又はマルトオリゴ糖誘導体を生成する転移反応を完
全に防ぐことにより測定値が正確であり、基質の合成
が容易であり、かつ測定操作が簡便で再現性がよい、
という効果を有するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のα−アミラーゼ活性測定方法による測
定値と、従来のα−アミラーゼ活性測定方法である４，
６−Ｏ−ベンジリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−
マルトヘプタオシド（ＢＧ７ＰＮＰ）を基質として用い
るα−アミラーゼ活性測定方法による測定値との相関を
示したグラフである。

【図２】α−アミラーゼ活性が高いヒト血清を１０段階
に希釈した試料を用いて、本発明のα−アミラーゼ活性
測定試薬（基質：ＥｔＧ３ＣＮＰ）により測定を行った
結果を示したグラフである。

【図３】α−アミラーゼ活性が高いヒト血清を７段階に
希釈した試料を用いて、本発明のα−アミラーゼ活性測
定試薬（基質：ＤＭＧ３ＣＮＰ）により測定を行った結
果を示したグラフである。

【図４】本発明のα−アミラーゼ活性測定用の基質（Ｅ
ｔＧ３ＣＮＰ）にα−アミラーゼを作用させた時の、Ｈ
ＰＬＣによる分析におけるマルトオリゴシドのクロマト
グラムを示した図である。

【図５】従来のα−アミラーゼ活性測定用の基質（Ｇ３
ＣＮＰ）にα−アミラーゼを作用させた時の、ＨＰＬＣ
による分析におけるマルトオリゴシドのクロマトグラム
を示した図である。

【図６】本発明のα−アミラーゼ活性測定用の基質（Ｅ
ｔＧ３ＣＮＰ）にα−アミラーゼを作用させた時の、基
質の残存率及び分解生成物の生成率を示したグラフであ
る。

【図７】従来のα−アミラーゼ活性測定用の基質（Ｇ３
ＣＮＰ）にα−アミラーゼを作用させた時の、基質の残
存率及び分解生成物の生成率を示したグラフである。

【図８】本発明のα−アミラーゼ活性測定用の基質（Ｅ
ｔＧ３ＣＮＰ）にα−アミラーゼを作用させた時の、Ｈ
ＰＬＣによる分析におけるマルトオリゴ糖のクロマトグ
ラムを示した図である。

【図９】従来のα−アミラーゼ活性測定用の基質（Ｇ３
ＣＮＰ）にα−アミラーゼを作用させた時の、ＨＰＬＣ
による分析におけるマルトオリゴ糖のクロマトグラムを
示した図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｉ）【化１】（式中、Ｒ₁ は水素原子あるいは、置換されていないか
若しくは置換されている、低級アルキル基、低級アルコ
キシル基又はフェニル基であり、Ｒ₂ は水素原子あるい
は、置換されていないか若しくは置換されている、低級
アルキル基、低級アルコキシル基又はフェニル基であ
り、Ｒ₁ とＲ₂ は互いに架橋していてもよく、Ｒ₃ 及び
Ｒ₄ は、同一若しくは異なって、水素原子、水酸基、低
級アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子又はニトロ基で
あり、ｎは０又は１である、但し、Ｒ₁ とＲ₂ は同時に
水素原子であることはない）で表される化合物よりな
る、共役酵素を必要としないα−アミラーゼ活性測定用
の基質。
【請求項２】一般式（Ｉ）【化２】（式中、Ｒ₁ は水素原子あるいは、置換されていないか
若しくは置換されている、低級アルキル基、低級アルコ
キシル基又はフェニル基であり、Ｒ₂ は水素原子あるい
は、置換されていないか若しくは置換されている、低級
アルキル基、低級アルコキシル基又はフェニル基であ
り、Ｒ₁ とＲ₂ は互いに架橋していてもよく、Ｒ₃ 及び
Ｒ₄ は、同一若しくは異なって、水素原子、水酸基、低
級アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子又はニトロ基で
あり、ｎは０又は１である、但し、Ｒ₁ とＲ₂ は同時に
水素原子であることはない）で表される化合物を基質と
して含有し、かつ共役酵素を含有しないα−アミラーゼ
活性測定試薬。
【請求項３】（ａ）一般式（Ｉ）【化３】（式中、Ｒ₁ は水素原子あるいは、置換されていないか
若しくは置換されている、低級アルキル基、低級アルコ
キシル基又はフェニル基であり、Ｒ₂ は水素原子あるい
は、置換されていないか若しくは置換されている、低級
アルキル基、低級アルコキシル基又はフェニル基であ
り、Ｒ₁ とＲ₂ は互いに架橋していてもよく、Ｒ₃ 及び
Ｒ₄ は、同一若しくは異なって、水素原子、水酸基、低
級アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子又はニトロ基で
あり、ｎは０又は１である、但し、Ｒ₁ とＲ₂ は同時に
水素原子であることはない）で表される化合物を基質と
してα−アミラーゼを含有すると推測される試料と混合
し、前記の試料中に含有されるα−アミラーゼを前記の
化合物と反応させ、共役酵素を介在させずに前記の化合
物の還元末端側の置換されたフェニル基を遊離させ、
（ｂ）この遊離した置換されたフェノールの量を測定
することよりなる試料中のα−アミラーゼ活性測定方
法。