JPH04229196A - α‐アミラーゼアイソザイム活性の分別定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、α‐アミラーゼアイソ
ザイム活性の新規な分別定量法、さらに詳しくいえば、
試料中のα‐アミラーゼアイソザイム活性を、２種のα
‐アミラーゼ活性測定用基質及び共役酵素を用いて分別
定量する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒトα‐アミラーゼにはスイ臓由来のも
の（以下Ｐ型α‐アミラーゼという）とダ液セン由来の
もの（以下Ｓ型α‐アミラーゼという）の少なくとも２
種のアイソザイムが存在することが知られている。とこ
ろで、血清中の総α‐アミラーゼ活性が高値になると、
急性スイ炎の初期あるいは慢性スイ炎の急性化の疑いを
生じるが、この場合はＰ型α‐アミラーゼ活性の上昇が
総α‐アミラーゼ活性の上昇の主因となっている。しか
し、ダ液センや耳下センの疾病、外科手術後、ある種の
肝疾患などではＳ型α‐アミラーゼ活性の上昇が主因と
なって顕著な総α‐アミラーゼ活性の上昇がみられるた
め、しばしば鑑別診断を誤らせる原因となっている。し
たがって、近年両アイソザイムの簡便、正確な分別定量
法が強く要望されている。

【０００３】従来、ヒトα‐アミラーゼアイソザイム活
性の分別定量法としては、２種のアイソザイムを分離し
、電気泳動法、エンザイム・イムノ・アッセイ法（ＥＩ
Ａ法）又はクロマトグラフィー法などにより、個々に定
量する方法、一方のアイソザイムのみを反応させて定量
する方法、２種のアイソザイムのα‐アミラーゼ測定用
基質に対する反応速度比の差を利用する方法などが知ら
れている。

【０００４】しかしながら、２種のアイソザイムを分離
し、個々に定量する方法は、分離のために煩雑な操作を
必要とする上に、処理に長時間を要するという欠点があ
るし、一方のアイソザイムのみを反応させて定量する方
法は、基質以外に、安定性の低いモノクローナル抗体や
インヒビターなどの生体成分を使用しなければならない
という欠点がある。

【０００５】また、２種のアイソザイムのα‐アミラー
ゼ測定用基質に対する反応速度比の差を利用する方法に
おいては、これまで基質として修飾マルトオリゴ糖が用
いられているが、２種のアイソザイムのこのものに対す
る反応速度比すなわち、Ｓ型α‐アミラーゼの反応速度
に対するＰ型α‐アミラーゼの反応速度の比が０．７程
度であり、Ｐ型α‐アミラーゼの反応速度とＳ型α‐ア
ミラーゼの反応速度との間に十分な差を生じないため、
精度が低くなるのを免れないという欠点がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、α‐アミラ
ーゼ活性測定用基質に対するＰ型α‐アミラーゼの反応
速度とＳ型α‐アミラーゼの反応速度の差を利用して、
試料中のα‐アミラーゼアイソザイムの分別定量を行う
際に、簡単な操作で、しかも高い精度で測定しうる方法
を提供することを目的としてなされたものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために、種々研究を重ねた結果、６‐デオキ
シマルトオリゴ糖誘導体に対するヒトα‐アミラーゼの
２種のアイソザイムの反応速度比が著しく異なること、
したがって、これを一方の基質として用いれば精度の高
い分別定量がなされることを見出し、この知見に基づい
て本発明をなすに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、α‐アミラーゼアイ
ソザイムによる反応速度比が異なった２種の基質と、試
料とを、共役酵素の存在下で反応させ、得られたα‐ア
ミラーゼ活性の各測定値より、α‐アミラーゼアイソザ
イム活性を分別定量する方法において、一般式

【化２】 （式中のＲは水素原子又は芳香族発色性基であるか、グ
ルコース以外の単糖類の残基であり、ｎは２〜６の整数
である）で表わされる６‐デオキシマルトオリゴ糖誘導
体を、第二の基質として、２種のα‐アミラーゼアイソ
ザイムのそれに対する反応速度比が第一の基質に対する
反応速度比と異なるα‐アミラーゼ活性測定用基質を用
いることを特徴とするα‐アミラーゼアイソザイム活性
の分別定量法を提供するものである。

【０００９】以下、本発明について詳細に説明する。先
ず、本発明方法においては、２種のα‐アミラーゼ活性
測定用基質を用い、第一の基質として前記一般式（Ｉ）
で表わされる６‐デオキシマルトオリゴ糖誘導体を用い
ることが必要である。この一般式（Ｉ）で表わされる６
‐デオキシマルトオリゴ糖誘導体は、文献未載の新規物
質であって、例えばマルトオリゴ糖誘導体の脱酸素しよ
うとする水酸基を保護したのち、他の水酸基をアセチル
化し、次いで保護基を脱離してそこにハロゲン原子又は
アリールチオ基等を導入したのち、還元、脱アセチル化
することによって製造することができる。

【００１０】次に、第二の基質としては、これまで用い
られているα‐アミラーゼ活性測定用基質であって、第
一の基質と両アイソザイムによる反応速度比が異なった
ものが用いられる。このような物質としては、例えば一
般式

【化３】 （式中のＲ′は水素原子又は芳香族発色性基であるるか
、グルコース以外の単糖類の残基であり、Ｒ１とＲ２は
それぞれ水酸基、ハロゲン原子、アシルオキシ基、アル
キル又はアリールオキシ基、アルキル又はアリールスル
ホニルオキシ基、アルキル又はアリールメルカプト基で
あるか、Ｒ１とＲ２とで置換又は非置換のメチレンジオ
キシ基を形成する基であり、ｍは２〜６の整数である）
で表わされるマルトオリゴ糖誘導体を挙げることができ
る。これらの物質の中で、反応速度比が０．６以上、特
に約１のものが、簡便性、正確性の点で有利である。

【００１１】次に、これらの基質を用いて、試料中のα
‐アミラーゼアイソザイム活性を分別定量する方法を具
体的に説明する。先ず、活性既知のＰ型α‐アミラーゼ
標品及びＳ型α‐アミラーゼ標品を用いて、あらかじめ
第一の基質に対する各反応速度と、第二の基質に対する
各反応速度を求める。この測定方法は、例えば「メソッ
ズ・オブ・エンザイマティック・アナリシス（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ
）第３版」、第ＩＶ巻、第１５７〜１６１ページ（１９
８４年）に記載された方法に従って行われる。

【００１２】次に、α‐アミラーゼ活性を有する試料に
、第一の基質又は第二の基質を加え、常法により共役酵
素の存在下で反応させ、それぞれの吸光度変化量Ａ１、
Ａ２を測定する。

【００１３】第一の基質に対するＰ型α‐アミラーゼの
反応速度をｋ１、Ｓ型α‐アミラーゼの反応速度をｋ２
、第二の基質に対するＰ型α‐アミラーゼの反応速度を
ｋ３、Ｓ型α‐アミラーゼの反応速度をｋ４、試料中の
Ｐ型α‐アミラーゼ活性をａｐ、Ｓ型α‐アミラーゼ活
性をａｓとすると、次の関係が成り立つ。

【数１】

【数２】

【００１４】そして、これらの式から、次の式が得られ
る。

【数３】

【数４】 すなわち、ｋ１，ｋ２，ｋ３及びｋ４をあらかじめ測定
しておけば、数３及び数４を用いることにより、２種の
基質を用いて酵素反応を行って測定した吸光度変化量を
代入するだけで、試料中の２種のアイソザイム活性の分
別定量を簡単に行うことができる。

【００１５】そして、前記したように、第一の基質とし
て用いる前記一般式（Ｉ）の６‐デオキシマルトオリゴ
糖誘導体は、反応速度比（ｋ１／ｋ２）が非常に小さい
ため、ｋ３とｋ４がほぼ等しいとすると、数３及び数４
において分母のｋ１とｋ２の差（絶対値）が大きくなり
、分子のＡ１及びＡ２に含まれる測定誤差の増幅が小と
なる結果、正確度が向上することになる。

【００１６】本発明方法で第一の基質として用いる６‐
デオキシマルトオリゴ糖誘導体はα‐アノマー、β‐ア
ノマーのいずれでもよい。そして、この化合物中の６‐
デオキシマルトオリゴ糖部としては、６４‐デオキシ‐
Ｄ‐マルトテトラオースから６８‐デオキシ‐Ｄ‐マル
トオクタオースまでのものが全て使用できる。これらの
中でも特に６５‐デオキシ‐Ｄ‐マルトペンタオース、
６６‐デオキシ‐Ｄ‐マルトヘキサオース、６７‐デオ
キシ‐Ｄ‐マルトヘプタオースが好適である。なお、上
記化合物におけるデオキシの前に付した記号６４‐、６
５‐、６６‐等はそれぞれマルトオリゴ糖を構成するグ
ルコース単位の還元末端から４番目、５番目、６番目の
グルコースの６位の水酸基が水素原子に置換されている
ことを意味する。

【００１７】また、第二の基質として用いられる前記一
般式（ＩＩ）で表わされるマルトオリゴ糖誘導体も、α
‐アノマー、β‐アノマーのいずれでもよい。そして、
このマルトオリゴ糖部については、例えばＤ‐マルトテ
トラオースから、マルトオクタオースまでのもの全てが
使用できるが、特にマルトペンタオース、マルトヘキサ
オース、マルトヘプタオースが好ましい。前記一般式（
Ｉ）で表わされる６‐デオキシマルトオリゴ糖誘導体の
Ｒ及び一般式（ＩＩ）で表わされるマルトオリゴ糖誘導
体のＲ１は、それぞれ水素原子、芳香族発色性基又はグ
ルコースを除く単糖類の残基、特に芳香族発色性基が好
ましい。

【００１８】この芳香族発色性基としては分光学的に検
出できればどのようなものを用いてもよいが、例えば次
のものが挙げられる。

【化４】 （式中のＲ３〜Ｒ７は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ
基、アルキル基、アリール基、アリル基、アミノ基、ス
ルホン酸基又はカルボキシル基であり、それぞれ同一で
あってもよいし、また異なっていてもよく、またＲ３と
Ｒ４又はＲ４とＲ５が結合して、縮合芳香環を形成して
もよい）

【００１９】

【化５】 （式中のＲ８は水素原子又はアルキル基である）

【００
２０】

【化６】 （式中のＲ９は水素原子又はアルキル基である）

【００
２１】

【化７】 （式中のＲ１０〜Ｒ１７は水素原子、ハロゲン原子、ニ
トロ基、アルキル基、アリール基、アリル基、アミノ基
、スルホン酸基又はカルボキシル基であり、それぞれ同
一であってもよいし、また異なっていてもよく、またＲ
１０とＲ１１又はＲ１２とＲ１３が結合して、縮合芳香
環を形成してもよく、さらにＲ１１とＲ１２及び／又は
Ｒ１５とＲ１６が共通の酸素原子となって縮合エーテル
環を形成してもよく、またＸは窒素原子又はＮ→Ｏであ
る）

【００２２】また、グルコースを除く単糖類としては広
義の単糖類あるいはその誘導体でもよく、例えばフルク
トース、イノシトール、グルシトール、グルコース‐６
‐リン酸等が挙げられる。

【００２３】このような前記一般式（Ｉ）で表わされる
化合物の代表例としては、２‐クロロ‐４‐ニトロフェ
ニル＝６５‐デオキシ‐β‐Ｄ‐マルトペンタオシド、
４‐ニトロフェニル＝６５‐デオキシ‐α‐Ｄ‐マルト
ペンタオシド、２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝６７
‐デオキシ‐β‐Ｄ‐マルトペンタオシド、フェノール
インド‐３′‐クロロフェニル＝６５‐デオキシ‐β‐
Ｄ‐マルトペンタオシド、６５‐デオキシ‐Ｄ‐マルト
ペンタオース、１‐（６６‐デオキシ‐α‐Ｄ‐マルト
ヘキサオシル）‐α‐Ｄ‐フルクトース等が挙げられる
。

【００２４】また、前記一般式（ＩＩ）で表わされる化
合物の代表例としては、マルトペンタオース、マルトヘ
プタオース、２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝β‐Ｄ
‐マルトペンタオシド、４‐ニトロフェニル＝６５‐Ｏ
‐ベンジル‐α‐Ｄ‐マルトペンタオシド、２‐クロロ
‐４‐ニトロフェニル＝６７‐クロロ‐β‐Ｄ‐マルト
ヘプタオシド、２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝４５
，６５‐Ｏ‐ベンジリデン‐β‐Ｄ‐マルトペンタオシ
ド、フェノールインド‐３′‐クロロフェニル＝６５‐
Ｏ‐トルエンスルホニル‐β‐Ｄ‐マルトペンタオシド
、６５‐クロロ‐Ｄ‐マルトペンタオース、１‐（４６
‐Ｏ‐，６６‐Ｏ‐ジメタンスルホニル‐α‐マルトヘ
キサオシル）‐α‐Ｄ‐グルシトール等が挙げられる。

【００２５】次に、前記一般式（Ｉ）で表わされる６‐
デオキシマルトオリゴ糖誘導体は、例えば次の方法によ
って得ることができる。

【００２６】すなわち、Ｒが発色性芳香族であるものは
、出発原料として市販の発色性芳香族を配糖体として有
するＤ‐マルトオリゴシドを用い、まずアルデヒド類の
ジメチルアセタールなどを作用させ、続いて酸無水物と
ピリジンとの混合物等を作用させて４，６‐Ｏ‐アリー
リデン又はアルキリデン化アシルマルトオリゴシドとす
る。次いでＮＢＳ等を作用させて６‐ブロモ体とし、こ
れを接触還元などの方法で還元的に脱ブロモ化し、６‐
デオキシアシルマルトオリゴ糖類とするか、あるいはＮ
ＢＳ等を作用させずに、適当な酸で脱アリーリデン又は
アルキリデン化した後に、６‐Ｏ‐トシル化等を行い、
続いて還元的に脱トシルオキシ化し、６‐デオキシアシ
ルマルトオリゴ糖とする。

【００２７】また、６‐ブロモ体や６‐Ｏ‐トシル体を
６‐Ｓ‐フェニル体に誘導してから還元的に脱硫化し、
６‐デオキシ体としてもよい。このようにして得られた
６‐デオキシ体にメタノール中炭酸カリウム等を作用さ
せて、脱アシル化すれば還元末端置換基Ｒが発色性芳香
族であるもので得られる。

【００２８】還元末端置換基Ｒが水素原子あるいはグル
コース以外の単糖類の残基であるものについては、出発
原料として市販のグルコース、フルクトース等の単糖類
を用い、これらと既知の方法で製造した６‐デオキシシ
クロデキストリン〔「カルボハイドレート・リサーチ（
Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．）」第１８巻、第２９ペー
ジ、１９７１年〕及び公知の酵素シクロデキストリング
ルコシルトランスフェラーゼの３種を混合して反応させ
たのち、グルコアミラーゼ等のエキソ型糖化酵素類を作
用させ、必要に応じて通常用いられる方法で精製するこ
とにより得ることができる。この際、出発原料として単
糖類の代わりに市販の発色性芳香族を配糖体として有す
るグリコシドを用いて同様の操作を行えば、前記した還
元末端置換基Ｒが発色性芳香族であるものが得られる。

【００２９】さらに、一般式（ＩＩ）で表わされるマル
トオリゴ糖誘導体は市販品をそのまま用いてもよいが、
これまで提案されている公知の製造方法により得ること
ができる。

【００３０】本発明の方法においては、試料中のα‐ア
ミラーゼアイソザイム活性を定量的に際し、前記一般式
（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）で表わされる２種の基質を用
いておのおのα‐アミラーゼ活性を測定するのであるが
、この場合常法により共役酵素の存在下でα‐アミラー
ゼと基質を反応させる。基質を用いる共役酵素の関係に
ついては、特に制限はなく、常法に従えばよい。

【００３１】例えば、前記一般式（Ｉ）で表わされる６
‐デオキシマルトオリゴ糖誘導体及び前記一般式（ＩＩ
）で表わされるマルトオリゴ糖誘導体の場合の共役酵素
としては、次のものが用いられる。 （１）Ｒ又はＲ′が水素原子である化合物（α‐アノマ
ー及び／又はβ‐アノマー）の場合 α‐グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼ（２）
Ｒ又はＲ′が芳香族発色性基である化合物の場合■　　
α‐アノマーのみの場合 α‐グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼ■　　
β‐アノマーのみあるいはα‐アノマーとβ‐アノマー
の混合物の場合 α‐グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼに加え
てさらにβ‐グルコシダーゼ

【００３２】なお、前記一般式（ＩＩ）で表わされるマ
ルトオリゴ糖誘導体の内、非還元末端が非修飾のＲ１及
びＲ２が水酸基である化合物を基質として用いる場合は
、共役酵素としてグルコアミラーゼを用いないことなど
も通常通りである。

【００３３】ここで使用するα‐グルコシダーゼは動物
、植物、微生物などいずれの由来の物を用いてもよいが
、例えば酵母由来のものを用いるのが好ましい。また、
グルコアミラーゼもいかなる起源の物を用いてもよいが
、例えばリゾプス属（Ｒｉｚｏｐｕｓ　ｓｐ）等に由来
するものが好ましい。さらに、また、β‐グルコシダー
ゼもいかなる起源のものを用いてもよく、例えばアーモ
ンドの種子から得たものが用いられる。

【００３４】次に、α‐アミラーゼアイソザイム活性の
分別定量のための有利な系としては、例えば第一の基質
である前記一般式（Ｉ）で表わされる６‐デオキシマル
トオリゴ糖誘導体を含む系及び第二の基質である前記一
般式（ＩＩ）で表わされるマルトオリゴ糖誘導体を含む
系では、各基質０．１〜１０ｍＭ及び緩衝液２〜３００
ｍＭを含有し、かつ各系の共役酵素として、前記の基質
と共役酵素の組み合わせを考慮し、α‐グルコシダーゼ
及び／又はグルコアミラーゼを用いるときはそれぞれ５
〜１０００単位／ｍｌ、さらにβ‐グルコアミラーゼを
用いるときは０．５〜３０単位／ｍｌを含有するｐＨ４
〜１０の系で挙げられる。この系に用いられる緩衝剤と
しては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、ｇｏｏｄ’
ｓの緩衝液、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル
酸塩等が挙げられる。

【００３５】このような系に前記成分以外に本発明の目
的をそこなわない範囲で、さらに必要に応じて慣用の種
々の添加成分を加えることができる。例えば、溶解補助
剤、安定化剤として、グリセリン、牛血清アルブミン、
α‐又はβ‐シクロデキストリン、トリトンＸ‐１００
等を加えることができるし、ヒトα‐アミラーゼ活性化
剤として、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣａＣ
ｌ２、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ等の形でＣｌ−イオン、Ｃａ
２＋イオン、Ｍｇ２＋イオン等を加えることもできる。 これらの添加成分は１種用いてもよいし、２種以上組合
わせて用いてもよい。これらは前記系調製の適当な段階
で加えることができる。

【００３６】また、前記一般式（Ｉ）で表わされる６‐
デオキシマルトオリゴ糖誘導体及び前記一般式（ＩＩ）
で表わされるマルトオリゴ糖誘導体において、Ｒ又はＲ
′が水素原子若しくは単糖類の残基である基質を用いる
場合、酵素反応によって生成するグルコース、マルトー
ス、あるいはその他の単糖類を吸光度法によって定量す
るときには、ＮＡＤ→ＮＡＤＨ又はＮＡＤＨ→ＮＡＤの
酸化‐還元反応に伴う光度変化測定系に通常用いられる
酵素類、すなわち、グルコース‐６‐リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（例えばＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔ
ｅｒｏｉｄｅｓなどに由来するもの）、マルトースホス
ホリラーゼ（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒ
ｅｖｉｓなどに由来するもの）、ヘキソキナーゼ（例え
ば酵母などに由来するもの）、β‐ホスホムターゼ［例
えば兎筋肉（ｒａｂｂｉｔｍｕｓｃｌｅ）などに由来す
るもの］、ソルビトールデヒドロゲナーゼ［例えば羊肝
（ｓｈｅｅｐ　ｌｉｖｅｒ）に由来するもの］及びＮＡ
Ｄ（又はＮＡＤＨ）、ＡＴＰ等を加えればよい。

【００３７】なお、Ｒ又はＲ′が芳香族発色性基である
基質を用いる場合には、α‐アミラーゼ反応に係わる共
役酵素系以外に上記のごとく、吸光系に係わる酵素等を
必要としないで吸光度法を適用できるため、より好まし
い。

【００３８】次に、本発明方法の好適な実施態様を説明
する。先ず、前記一般式（Ｉ）で表わされる６‐デオキ
シマルトオリゴ糖誘導体を第一の基質とし、活性既知の
Ｐ型α‐アミラーゼ標品及びＳ型α‐アミラーゼ標品を
用いて、これらに対する反応速度比（ｋ１／ｋ２）を測
定する。次いで、α‐アミラーゼ活性を有する試料に、
共役酵素としてのα‐グルコシダーゼ又はグルコアミラ
ーゼあるいはその両方をそれぞれ５〜１０００単位／ｍ
ｌ、好ましくは１０〜５００単位／ｍｌ加え、第一の基
質がβ‐アノマーを含むときは、さらにβ‐グルコシダ
ーゼを０．５〜３０単位／ｍｌ、好ましくは１〜１５単
位／ｍｌ加え、これと同時又はこれらの後に第一の基質
の０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．３〜５ｍＭを緩衝
剤と共に添加したのち、温度２５〜４０℃、好ましくは
３５〜４０℃、ｐＨ４〜１０、好ましくは６．５〜７．
５の条件下で少なくとも１分間、好ましくは２〜１０分
間反応させ、生成した発色性芳香族化合物を、常法に従
いそのままであるいは必要に応じｐＨを調整したのち、
適当な吸収波長で連続的に又は断続的に吸光度変化量（
Ａ１）を測定する。

【００３９】次に、活性既知のＰ型α‐アミラーゼ標品
及びＳ型α‐アミラーゼ標品を用いて、あらかじめ反応
速度比（ｋ３／ｋ４）を測定しておいた第二の基質につ
いて、第一の基質の場合と同様にして吸光度変化量（Ａ
２）を測定する。ただし、この第二の基質としては、そ
の反応速度比（ｋ３／ｋ４）が第一の基質の反応速度比
（ｋ１／ｋ２）と同じにならないようなものを選ぶ必要
がある。

【００４０】このようにして得たｋ１，ｋ２，ｋ３，ｋ
４，Ａ１及びＡ２の値を数３及び数４に代入することに
より、試料中のＰ型α‐アミラーゼ活性（ａｐ）及びＳ
型α‐アミラーゼ活性（ａｓ）を求めることができる。

【００４１】なお、前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表
わされる化合物のＲ又はＲ′が水素原子又は単糖類の残
基であるときは、吸光系に係る酵素その他必要な成分を
適宜添加し、Ｒ又はＲ′が芳香族発色性基である場合同
様にして行うことができる。

【００４２】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。なお、実施例において、第一の基質のＤＯＧ５
‐ＣＮＰは２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝６５‐デ
オキシ‐β‐Ｄ‐マルトペンタオシドをＤＯＰ７‐ＣＮ
Ｐは２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝６７‐デオキシ
‐β‐Ｄ‐マルトヘプタオシドを、また第二の基質のＧ
５‐ＣＮＰは２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝β‐Ｄ
‐マルトペンタオシドを、Ｇ７‐ＣＮＰは２‐クロロ‐
４‐ニトロフェニル＝β‐Ｄ‐マルトヘプタオシドをそ
れぞれ意味する。

【００４３】参考例１（ＤＯＧ５‐ＣＮＰの製造）市販
のＧ５‐ＣＮＰ１５．０ｇを無水のジメチルホルムアミ
ド１００ｍｌに溶解し、ベンズアルデヒドジメチルアセ
タール９．１ｍｌとｐ‐トルエンスルホン酸０．９０ｇ
を加え、５０℃、減圧下（２０ｍｍＨｇ）で４時間かき
まぜながら反応させた。この反応液を氷冷下トリエチル
アミンで中和した後、ジメチルホルムアミドを留去した
。未精製の４５，６５‐Ｏ‐ベンジリデン体を含有する
この残さに、ピリジン１０００ｍｌ、無水酢酸５００ｍ
ｌを加え、室温で２日間反応させた。次いでこの反応液
を減圧下濃縮し、ピリジン、無水酢酸、酢酸を留去した
。このようにして得られた未精製のパーアセチル４５，
６５‐Ｏ‐ベンジリデン体を含有する残さに、酢酸２０
００ｍｌ、蒸留水５００ｍｌを加え、２５℃で２日間か
きまぜながら反応させた。次いでこの反応液に３％食塩
水４０００ｍｌを加えた後、ジクロロメタン２０００ｍ
ｌで３回抽出した。ジクロロメタン層を無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥、ろ別した後、ろ液を減圧蒸留して、ジクロ
ロメタンを留去した。 次に、この４５，６５‐ＯＨアセチル体を含有する残さ
をピリジン３００ｍｌに溶解し、トシルクロリド２１．
１ｇを加え、室温下５時間かきまぜながら、反応させた
。次いでこの反応液を減圧下濃縮し、ピリジンを留去し
た。 ここで得られた６５‐Ｏ‐トシル体を含有する残さを、
未精製のままジメチルホルムアミド５００ｍｌに溶解し
、チオフェノール１．５９ｇ及びトリエチルアミン２．
０ｃｃを加え、２５℃で３時間かきまぜながら反応させ
た。 次いでこの反応液を減圧下濃縮し、ジメチルホルムアミ
ドを留去した。ここで得られた６５‐Ｓ‐フェニル体を
含有する残さを、未精製のまま１，４‐ジオキサン１ｌ
に溶解し、ラネーニッケル２１ｇを加え、７０℃で２日
間反応させた。この反応液をグラスフィルターでろ過し
、ジクロロメタン２００ｍｌで３回洗い、ろ液と洗液を
あわせて減圧下留去した。ここで得られた６５‐デオキ
シ体を含有する残さを、未精製のままメタノール１６０
ｍｌに溶解し、２８％アンモニア水８０ｍｌ、蒸留水４
０ｍｌを加え、３５℃で２０時間反応させた。この反応
液を減圧下留去した。この残さをＯＤＳカラムクロマト
グラフィーにより精製し、エタノール‐水混液（容量比
１：４）で溶出した目的区分を濃縮し、水から再結晶し
て、以下に示す物性を有するＤＯＧ５‐ＣＮＰ１．７ｇ
を得た（収率１１％）。

【００４４】このものの性質は次のとおりである。 　　融点（℃）：１８７．５〜１９０．５　　紫外部・
可視部吸収スペクトル：吸収極大波長（メタノール中最
大値）（ｎｍ）＝２８８（ｌｏｇε＝４．０２），２８
８（ｓｈ），２０７（ｌｏｇε＝４．２７）　　赤外吸
収スペクトル（ｃｍ−１）：３４３０，２９４０，１６
４４，１５８８，１５２２，１４８８，１３５２，１２
７６，１２５２，１１５４，１０８２，１０４６，１０
２６ 　　核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ｄ
２Ｏ）：１．２８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），３．
１４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），３．５０〜４．０
０（ｍ），５．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５
．３５（３Ｈ，ｍ），５．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８
Ｈｚ），７．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），８．
２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８
．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）　　高速液体クロ
マトグラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ａｍ
ｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ　ＩＤ×２５０ｍｍ）
、ＵＶ（波長２８０ｎｍ）検出、溶離液：アセトニトリ
ル／水＝３／１（Ｖ／Ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
］：ｔＲ＝９．２ｍｉｎ　　元素分析値：Ｃ３６Ｈ５４
ＣｌＮＯ２７として

【表１】 比旋光度（２５℃、Ｄ線、水中Ｃ０．３７）：＋９５°

【００４５】参考例２（ＤＯＧ７‐ＣＮＰの製造）Ｇ５
‐ＣＮＰの代りに市販のＧ７‐ＣＮＰを用いる以外は、
参考例１と同様に処理することにより、ＤＯＧ７‐ＣＮ
Ｐを得た。このものの性質を以下に示す。融点：２０９
．０〜２１０．０℃（分解）高速液体クロマトグラフィ
ー〔東ソー（株）製、ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ａｍｉｄｅ‐８
０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ）、ＵＶ（波長
２８０ｎｍ）検出、溶離液：アセトニトリル／水＝７／
３（Ｖ／Ｖ）、流速：１．０ｃｃ／分〕：Ｒ＝１１．０
分元素分析値：Ｃ４８Ｈ７４ＣｌＮＯ３７として

【表２】 比旋光度（２５℃、Ｄ線、水中Ｃ０．４８）：＋１２０
°

【００４６】実施例１ （１）第一の基質ＤＯＧ５‐ＣＮＰのＫｍ値の測定（イ
）ＤＯＧ５‐ＣＮＰ溶液の調製 ＮａＣｌ　　４０ミリモル及びＭｇＣｌ２２ミリモルを
含有する濃度５０ミリモルのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
０）に、参考例１で得た第一の基質ＤＯＧ５‐ＣＮＰ（
分子量９６７．５）を溶解し、濃度５．００×１０−５
モル、４．５０×１０−５モル、３．５０×１０−５モ
ル、３．００×１０−５モル、２．５０×１０−５モル
、２．００×１０−５モル、１．５０×１０−５モル及
び１．００×１０−５モルのＰ型α‐アミラーゼ測定用
基質溶液を調製した。 同様にして、５０．０×１０−５モル、４０．０×１０
−５モル、３０．０×１０−５モル、２０．０×１０−
５モル、１６．０×１０−５モル、１４．０×１０−５
モル、１２．０×１０−５モル、１０．０×１０−５モ
ル、８．００×１０−５モル、６．００×１０−５モル
及び４．００×１０−５モルのＳ型α‐アミラーゼ測定
用基質溶液を調製した。

【００４７】（ロ）共役酵素の調製 酵母由来の市販α‐グルコシダーゼ及びアーモンド由来
の市販β‐グルコシダーゼをそれぞれ１２５ｕ／ｍｌ、
１２．７ｕ／ｍｌの濃度になるように４０ｍＭ‐ＮａＣ
ｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ＝７．０）に混合して溶解した。なお、これ
ら市販のα‐及びβ‐グルコシダーゼは東洋紡績（株）
製を使用した。

【００４８】（ハ）α‐アミラーゼ液の調製市販のヒト
Ｐ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐アミラーゼをそれ
ぞれ約１５０ｕ／ｌの濃度になるように、蒸留水に溶解
した。なお、この市販のヒト両α‐アミラーゼは国際試
薬（株）製キャリブザイム・ＡＭＹを使用した。

【００４９】（ニ）Ｋｍ値の測定 ヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐アミラーゼ液
おのおのについて、α‐アミラーゼ液２５０μｌに共役
酵素液１．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分間加
温した後、各濃度のＤＯＧ５‐ＣＮＰ液２．０ｍｌを加
えてかきまぜ、３７℃で２．５分間加温した後２分間、
４００ｎｍにおける吸光度の変化量を測定した。また、
α‐アミラーゼ液の代わりに蒸留水２５０μｌを用いて
ブランク試験を行った。得られた測定値をラインウエー
バー・バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ）プロ
ットし、最小二乗法を用いてＫｍ値を算出した。この結
果ＤＯＧ５‐ＣＮＰのヒトＰ型及びヒトＳ型α‐アミラ
ーゼに対するＫｍ値はそれぞれ、２．５×１０−５モル
、８．３×１０−５モルとなった。このラインウエーバ
ー・バークプロットしたグラフを図１に示す。図１（Ａ
）はＰ型α‐アミラーゼについてのものであり、図１（
Ｂ）はＳ型α‐アミラーゼについてのものである。

【００５０】（２）第二の基質Ｇ５‐ＣＮＰの速度定数
の測定 （イ）α‐アミラーゼ液の調製 市販のヒトＰ型スイ臓α‐アミラーゼ及びヒト唾液腺由
来の市販のＳ型α‐アミラーゼをそれぞれブルースター
チに対して同一の活性になるように、蒸留水に溶解した
。なお、この市販のヒト両α‐アミラーゼは国際試薬（
株）製キャリブザイム・ＡＭＹを使用した。

【００５１】（ロ）Ｇ５‐ＣＮＰ液の調製常法により得
たＧ５‐ＣＮＰ（Ｍｗ　９８３．５）を２．０ｍＭ濃度
になるように、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣ
ｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）
に溶解した。この濃度は、ヒトＰ型α‐アミラーゼ及び
ヒトＳ型α‐アミラーゼに対してＫｍ値の４．４倍に相
当するため、最大反応速度を得るに十分な基質量である
。なお、Ｇ５‐ＣＮＰのＫｍ値は、前記ＤＯＧ５‐ＣＮ
Ｐと同様にして測定した結果、０．４５ｍＭであった。

【００５２】（ハ）共役酵素液の調製 酵母由来の市販α‐グルコシダーゼ及びアーモンド由来
の市販β‐グルコシダーゼをそれぞれ１１０ｕ／ｍｌ、
１２．６ｕ／ｍｌの濃度になるように、４０ｍＭ‐Ｎａ
Ｃｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ＝７．０）に混合して溶解した。なお、こ
れらの市販のα‐及びβ‐グルコシダーゼは東洋紡績（
株）製を使用した。

【００５３】（ニ）速度定数の測定 α‐アミラーゼ液２５０μｌに共役酵素液；１．０ｍｌ
を加えてかきまぜ、３７℃で１分間加温したのち、Ｇ５
‐ＣＮＰ液２．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で２．
５分間加温したのち２分間、４００ｎｍにおける吸光度
変化量を測定した。この結果、ヒトＰ型α‐アミラーゼ
及びヒトＳ型α‐アミラーゼに対する吸光度変化量は等
しく（ｋ３＝ｋ４）、０．１６／分であった。また、２
‐クロロ‐４‐ニトロノフェノールの分子吸光係数εを
１６１００とし、α‐アミラーゼの活性を３７℃、１分
間に１μｍｏｌのＧ５‐ＣＮＰを分解する酵素量を１国
際単位（ＩＵ）と定義すると（以下同じ）、次の式が成
り立つ。

【数５】

【００５４】（３）直線性の確認試験、ｋ１，ｋ２の測
定前出の数３及び数４に対し、前記（２）の結果、すな
わちｋ３＝ｋ４＝ｋを代入すると、数３は

【数６】 になり、数４は

【数７】 になる。これらの式を用いて、直線性の確認、ｋ１，ｋ
２の値の算出を行った。

【００５５】（イ）ＤＯＧ５‐ＣＮＰ液の調製ＤＯＧ５
‐ＣＮＰ（Ｍｗ９６７．５）を０．４０ｍＭ濃度になる
ように、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を
含有する５０ｍＭ‐リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶
解した。この濃度は、前記（１）の結果によるとヒトＰ
型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐アミラーゼに対して
それぞれＫｍ値の１６倍、４．８倍に相当するため、最
大速度に達するには十分な基質量である。

【００５６】（ロ）Ｇ５‐ＣＮＰ液の調製Ｇ５‐ＣＮＰ
（Ｍｗ９８３．５）を２．０ｍＭ濃度になるように、４
０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有する５
０ｍＭ‐リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。 この濃度は、ヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐
アミラーゼに対してＫｍ値の４．４倍に相当するため、
最大速度に達するには十分な基質量である。

【００５７】（ハ）α‐アミラーゼ液の調製前記市販の
ヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐アミラーゼを
蒸留水で溶解し、それぞれ４１１　ＩＵ／ｌ、３８３　
ＩＵ／ｌのα‐アミラーゼ液を得た。これらを原液とし
、蒸留水を用いてそれぞれ希釈し、原液１００％，８０
％，５０％，３０％，２０％及び１０％（Ｖ／Ｖ）を含
有する６種のα‐アミラーゼ液を調製した。

【００５８】（ニ）共役酵素液の調製 酵母由来の市販α‐グルコシダーゼ及びアーモンド由来
の市販β‐グルコシダーゼをそれぞれ１１０ｕ／ｍｌ、
１２．６ｕ／ｍｌの濃度になるように、４０ｍＭ‐Ｎａ
Ｃｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭ‐リン
酸緩衛液（ｐＨ＝７．０）に混合して溶解した。

【００５９】（ホ）直線性の確認、ｋ１とｋ２の値の測
定前記ヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐アミラ
ーゼ液各６種について、α‐アミラーゼ液２５０μｌに
共役酵素液１．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分
間加温したのち、ＤＯＧ５‐ＣＮＰ液又はＧ５‐Ｎ２．
０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で２．５分間加温した
のち２分間、４００ｎｍにおける吸光度変化量を測定し
た。また、両基質に関してα‐アミラーゼ液の代わりに
蒸留水２５０μｌを用いてブランク試験を行った。この
結果、ヒトＰ型α‐アミラーゼに関しては４１１　ＩＵ
／ｌまで（ｒ＝０．９９９８）、ヒトＳ型α‐アミラー
ゼに関しては３８３　ＩＵ／ｌまで（ｒ＝０．９９９０
）まで直線性が確認された。

【００６０】また、最小二乗法により得た直線の傾きか
ら を得た。この数値を数６及び数７に代入することにより
、次のようにしてａｐとａｓが求められる。 　　ここで用いたヒトＰ型α‐アミラーゼの活性値と吸
光度変化量（ΔＯＤ）との関係を示すグラフを図２（Ａ
）に、Ｓ型α‐アミラーゼの活性値と吸光度変化量（Δ
ＯＤ）との関係を示すグラフを図２（Ｂ）に示す。

【００６１】（４）分別定量試験 活性既知のヒトＰ型α‐アミラーゼ液とヒトＳ型α‐ア
ミラーゼ液とを種々の割合で混合し、Ｇ５‐ＣＮＰを第
二の基質とした場合について、混合割合に基づいて得た
理論値と数６及び数７から算出される計算値との適合性
を調べた。

【００６２】（イ）ＤＯＧ５‐ＣＮＰ液の調製参考例１
で得たＤＯＧ５‐ＣＮＰ（Ｍｗ９６７．５）を０．４０
ｍＭ濃度になるように、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍＭ
‐ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭ‐リン酸緩衝液（ｐＨ
＝７．０）に溶解した。この濃度は、前記（１）の結果
からヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐アミラー
ゼに対してそれぞれＫｍ値の１６倍、４．８倍に相当す
るため、最大速度に達するには十分な基質量である。

【００６３】（ロ）Ｇ５‐ＣＮＰ液の調製Ｇ５‐ＣＮＰ
（Ｍｗ９８３．５）を２．０ｍＭ濃度になるように、４
０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有する５
０ｍＭ‐リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。 この濃度は、ヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐
アミラーゼに対してＫｍ値の４．４倍に相当するため、
最大速度に達するには十分な基質量ある。

【００６４】（ハ）α‐アミラーゼ試験液の調製市販の
ヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐アミラーゼを
蒸留水で溶解し、Ｐ：Ｓ＝１０：０又はＳ：Ｐ＝１０：
０に対応する理論値の各α‐アミラーゼ液を得た。この
活性は前記（３）で試験した直線性が保持されている範
囲内である。　　これらの溶液を原液とし、Ｐ型α‐ア
ミラーゼ及びＳ型α‐アミラーゼの混合液を混合容量比
（Ｐ：Ｓ）＝（１０：０），（９：１），（８：２），
（７：３），（６：４），（５：５），（４：６），（
３；７），（２：８），（１：９），（０：１０）で混
合し（計１１種）、α‐アミラーゼアイソザイム試験液
とした。また、市販ヒト両α‐アミラーゼは、国際試薬
（株）製キャリブザイム・ＡＭＹを使用した。

【００６５】（ニ）共役酵素液の調製 酵母由来の市販α‐グルコシダーゼ及びアーモンド由来
の市販β‐グルコシダーゼをそれぞれ１１０ｕ／ｍｌ，
１２．６ｕ／ｍｌの濃度になるように、４０ｍＭ‐Ｎａ
Ｃｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭ‐リン
酸緩衛液（ｐＨ＝７．０）に混合して溶解した。なお、
これら市販のα‐，β‐グルコシダーゼは東洋紡績（株
）製を使用した。

【００６６】（ホ）分別定量試験 各α‐アミラーゼアイソザイム試験液に２５０μｌに共
役酵素液１．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分間
加温したのち、ＤＯＧ５‐ＣＮＰ液又はＧＯ‐ＣＮＰ２
．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で２．５分間加温し
たのち２分間、４００ｎｍにおける吸光度変化量（ΔＯ
Ｄ）を測定した。また、両基質に関してα‐アミラーゼ
アイソザイム試験液の代わりに蒸留水２５０ｍｌを用い
てブランク試験を行い、Ａ１及びＡ２を求めた。混合前
の活性値と混合比から求められるａｐ及びａｓを理論活
性値とし、前記（３）で求められた数６及び数７にＡ１
及びＡ２を代入して算出されるａｐ及びａｓを計算活性
値とした試験結果について、Ｐ型α‐アミラーゼの分を
表３に、Ｓ型α‐アミラーゼの分を表４にそれぞれ示し
た。各活性値の単位はＩＵ／ｌである。

【表３】

【表４】

【００６７】また、ここで用いられた各種混合比のヒト
α‐アミラーゼアイソザイム試験液と吸光度変化量（Δ
ＯＤ）の関係（１回目）のグラフを図３に示す。表３及
び表４から、計算活性値と理論活性値は極めて高い相関
を示していることがわかる。すなわち、本発明はＤＯＧ
５‐ＣＮＰとこれとは異なる反応速度比を有するマルト
オリゴ糖誘導体を基質としてヒトα‐アミラーゼアイソ
ザイム活性を測定するものであるが、このようにすれば
、簡単に、しかも正確に、ヒトＰ型α‐アミラーゼ及び
Ｓ型α‐アミラーゼ活性を別々に定量（分別定量）する
ことができる。

【００６８】実施例２ 第一の基質のＤＯＧ５‐ＣＮＰの代わりに、参考例２で
得た２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝６７‐デオキシ
‐β‐Ｄ‐マルトヘプタオキシド（ＤＯＧ７‐ＣＮＰ）
を、またＧ５‐ＣＮＰの代わりに２‐クロロ‐４‐ニト
ロフェニル＝β‐Ｄ‐マルトヘプタオキシド（Ｇ７‐Ｃ
ＮＰ）を用いる以外は、本実施例と同様にしてヒトα‐
アミラーゼアイソザイム試験液の活性を測定した。この
ときのＤＯＧ７‐ＣＮＰのｋ１は０．０６８×１０−３
（ｌ・ΔＯＤ／ＩＵ）、ｋ２は０．２７×１０−３（ｌ
・ΔＯＤ／ＩＵ）、Ｇ７‐ＣＮＰのｋ３及びｋ４は０．
５５×１０−３（ｌ・ΔＯＤ／ＩＵ）であった。この場
合も、表３及び表４に示される内容とほぼ同様の結果が
得られ、Ｐ型α‐アミラーゼ及びＳ型α‐アミラーゼ活
性を高い正確度で分別定量することができることが分っ
た。

【００６９】実施例３ α‐アミラーゼ活性を有するヒト血清について、分別定
量を行った。この際、用いた各試薬の組成を表５に示す
。

【表５】 （１）先ず、試薬Ａ２４０μｌに下記の各試料液１０μ
ｌを加え、３７℃で５分間加温したのち、試薬Ｂ１２０
μｌを加えて３７℃で加温し、３分後から５分後にいた
る２分間の４０５ｎｍにおける吸光度変化量を測定した
。 別に上記の試料の代りに精製水１０μｌを加え、同様に
操作して得た試薬ブランク試験値と、上記の各試料で得
た数値との差から各試料の吸光度変化量を求めた。

【００７０】次に、試薬Ｃ２６０μｌに下記の各試料５
μｌを加え、３７℃で５分間加温後、試薬Ｄ１３０μｌ
を加え、３７℃で加温し、３分後から５分後までの２分
間の４０５ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。これ
と試料の代りに精製水５μｌを加え、同様に操作して得
た試薬ブランク試験値との差から、試料の吸光度変化量
を求めた。試料■：実施例１と同様に調製した活性既知
の市販Ｐ型α‐アミラーゼ標準液■：上記■と同様の活
性既知の市販Ｓ型α‐アミラーゼ標準液■：ヒト血清（
６０個の試料）以上のようにして得た各試料吸光度変化
量から実施例１と同様にしてｋ１，ｋ２，ｋ３，ｋ４及
びＡ１，Ａ２を求め、これらの数値を数３及び数４に代
入して、ヒト血清試料中のＰ型α‐アミラーゼ及びＳ型
α‐アミラーゼ活性値を計算した。

【００７１】（２）他方、同じ試料について、従来の小
麦インヒビター法による分別定量を行った。すなわち、
試薬Ｃ２６０μｌに前記（１）と同じ各試料５μｌを加
え、３７℃で５分間加温したのち、試薬Ｄ１３０μｌを
加え、３７℃で加温し、３分後から５分後にいたる２分
間の４０５ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。そし
て、これと試料の代わりに精製水５μｌを加え、同様に
操作して得た試薬ブランク試験値の差から、試料吸光度
変化量を求めた。そして、試料■の吸光度変化量をＡ３
、試料■のそれをＡ４、試料■のそれをＴとする。

【００７２】次に、試薬Ｃ２６０μｌに前記（１）と同
じ各試料６μｌを加え、３７℃で５分間加温したのち、
試薬Ｅ１３０μｌを加えて３７℃で加温し、３分後から
５分後にいたる２分間の４０５ｎｍにおける吸光度変化
量を測定し、これと試料の代わりに精製水６μｌを加え
、同様の操作を行って得た試薬ブランク試験値との差か
ら試料吸光度変化量を求めた。そして、試料■の吸光度
変化量をＡ５、試料■のそれをＡ６、試料■のそれをＲ
とする。次にこれらのＡ３，Ａ４，Ａ５，Ａ６，Ｔ及び
Ｒを数８に代入し、ヒト血清試料中のＰ型α‐アミラー
ゼによる吸光度変化量（Ａｐ）を求めた。

【数８】

【００７３】このようにして得た小麦インヒビター法に
よる測定値と本発明方法による測定値との整合性を確か
めるために、同じ試料に対する対応する測定値をプロッ
トしたグラフを図４に示す。この結果、両者の相関性は
ｒ＝０．９８３、ｙ＝０．９４９ｘ−９．０９７でよく
整合していることが分った。

【００７４】（３）また、ベーリンガーマンハイム山之
内（株）から市販されているアイソアミラーゼ測定用試
薬ＥＰＳを用い、その説明書に記載されているとおりに
操作して、前記試料■についてモノクローナル抗体阻害
法によるＰ型α‐アミラーゼ活性値の測定を行った。こ
のようにして得た測定値と本発明方法による測定値との
相関関係をプロットしたグラフを図５に示す。この結果
、両者の相関性は、ｒ＝０．９７６、ｙ＝１．８５５ｘ
−１５．４０７でよく整合していることが分った。

【００７５】（４）さらに、三光純薬（株）から市販さ
れているライトアッセイ「Ｐ‐アミラーゼ」を用い、そ
の説明書に記載されているとおり操作して、前記試料■
についてＥＩＡ法によるＰ型α‐アミラーゼタンパク量
の測定を行った。このようにして得た測定値と本発明方
法による測定値との相関関係をプロットしたグラフを図
６に示す。この結果、両者の相関性は、ｒ＝０．９５６
、ｙ＝０．５７６ｘ−１．３４９でよく整合しているこ
とが分った。

【００７６】

【発明の効果】本発明方法によると、簡単な操作で、し
かも正確にヒトα‐アミラーゼ中のアイソザイム活性を
分別定量することができるので、Ｐ型α‐アミラーゼ及
びＳ型α‐アミラーゼを別々に定量することが必要な疾
患の診断に、好適に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　本発明方法の実施例における第一の基質に
対するＰ型α‐アミラーゼ及びＳ型α‐アミラーゼのラ
インウエーバー・バークプロットグラフ。

【図２】　　本発明方法の実施例で用いたヒトＰ型α‐
アミラーゼ及びヒトＳ型α‐アミラーゼの活性値と吸光
度変化量との関係を示すグラフ。

【図３】　　本発明方法の実施例で用いた種々の混合比
率のヒトα‐アミラーゼアイソザイム試験液の吸光度変
化量を示すグラフ。

【図４】　　本発明方法と小麦インヒビター法との相関
性を示すグラフ。

【図５】　　本発明方法とモノクローナル抗体阻害法と
の相関性を示すグラフ。

【図６】　　本発明方法とＥＩＡ法との相関性を示すグ
ラフ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　α‐アミラーゼアイソザイムによる反
   応速度比が異なった２種の基質と、試料とを、共役酵素
   の存在下で反応させ、得られたα‐アミラーゼ活性の各
   測定値より、α‐アミラーゼアイソザイム活性を分別定
   量する方法において、第一の基質として、一般式【化１
   】 （式中のＲは水素原子又は芳香族発色性基であるか、グ
   ルコース以外の単糖類の残基であり、ｎは２〜６の整数
   である）で表わされる６‐デオキシマルトオリゴ糖誘導
   体を、第二の基質として、２種のα‐アミラーゼアイソ
   ザイムのそれに対する反応速度比が第一の基質に対する
   反応速度比と異なるα‐アミラーゼ活性測定用基質を用
   いることを特徴とするα‐アミラーゼアイソザイム活性
   の分別定量法。