JPH09322798A - α−アミラーゼ活性の測定方法及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 α−アミラーゼ活性を、精度よく、安全にか
つ短時間に効率的に測定する方法及びその測定試薬を提
供する。 【解決手段】 α−アミラーゼ含有試料に、次の一般式 【化１】 （式中のＲは芳香族発色性基、Ｘはアジド基、ハロゲン
原子、Ｎ−モノアルキルカルバモイルオキシ基又はアリ
ール若しくはアルキルスルホニルオキシ基、ＹはＮ−モ
ノアルキルカルバモイルオキシ基、アリール若しくはア
ルキルスルホニルオキシ基、α−グルコシル基、α−マ
ルトシル基又は水酸基である）で表される非還元末端修
飾α−マルトトリオシド誘導体を基質として用い、酵素
活性剤としてアルカリ金属シアン酸塩を添加して酵素反
応を行わせ、遊離する芳香族発色化合物を定量してα−
アミラーゼ活性を測定する方法及びその測定試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、非還元末端修飾α
−マルトトリオシド誘導体を基質とし、酵素活性剤とし
てアルカリ金属シアン酸塩を添加して、α−アミラーゼ
活性を精度よく、かつ安全に測定する方法及び測定試薬
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】血清、尿、膵液、唾液などの体液を対象
とするヒトα−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上極
めて重要であり、特に急性や慢性の膵臓炎、膵臓ガン、
流行性耳下腺炎、肺炎、腎不全などの鑑別診断において
は、従来必須の測定項目となっている。このα−アミラ
ーゼ活性の測定方法については従来より種々の方法が知
られているが、近年、各種の芳香族発色性基を還元末端
に配糖体として有するマルトオリゴシド類（グルコース
の重合度が４〜７）の非還元末端が各種の置換基で修飾
された物質（ブロック体；共役酵素系に耐性すなわち安
定性を有する特徴を持つ）を基質として利用し、α−ア
ミラーゼにより切断した後、共役酵素系すなわちα−及
び／又はβ−グルコシダーゼやグルコアミラーゼを作用
させ、生成する発色性物質をそのまま、あるいは必要に
応じてｐＨを変化させたり、縮合させた後に比色定量す
る方法が、広く用いられるようになってきた（特開平７
−１３５９９８号、特開平６−９６７６号、特開平６−
４６８９５号など参照）。

【０００３】 ところで、前記の非還元末端が修飾され
たマルトオリゴシド類（グルコース重合度が４〜７）、
いわゆるブロック体それ自体は、共役酵素系において安
定性を示すが、ブロック体の製造・精製過程で非還元末
端グルコースが修飾されていないマルトオリゴシド類、
いわゆる非ブロック体と完全に分離することができなか
ったり、あるいはブロック体を長期間保存中に一部が分
解するなどして非ブロック体を生成するため、ブロック
体製品中に非ブロック体が微量含有されるのを免れ得な
い。この非ブロック体は、前記した共役酵素類が存在す
ると、加水分解を受けやすく、発色性化合物が生成す
る。そのため前記のようなブロック体を基質として用
い、前記共役酵素が共存する場合には、α−アミラーゼ
活性の測定時に、あるいは保存中に目的としない発色が
起こり、その結果ブランク値が上昇して相対的な感度が
低下するという欠点を有している。

【０００４】 こうした問題を解決するために、基質に
α−マルトシド誘導体（グルコース重合度が２）やα−
マルトトリオシド誘導体（グルコース重合度が３）を用
い、共役酵素系を使用しない方法も用いられ、又は報告
されている（例えば「クリニカル・ケミストリー（Ｃｌ
ｉｎ．Ｃｈｅｍ．）」第２３巻、２２７９ページ（１９
７７年）、「クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｅｍ．）」第３４巻、７５４ページ（１９８８年）、
特開昭６３−１８３５９５号、特開平６−３１５３９９
号、特開平８−２９１号など）。しかしこれらの方法に
おいては、α−アミラーゼによる切断速度が極めて低い
こと、糖転移反応が起こるためにα−アミラーゼ水解反
応の一部しか測定できないこと、ヒトα−アミラーゼの
２種のアイソザイム（唾液腺由来及び膵臓由来）の切断
速度が異なるため、α−アミラーゼ活性の増減を正確に
知ることができないこと、などの欠点が指摘されてい
る。

【０００５】 一方基質にα−マルトトリオシド誘導体
を用い、酵素活性化剤としてアジ化物を添加することに
より、ヒトα−アミラーゼの２種のアイソザイムの切断
速度比を調節できることが知られている（例えば特開昭
６３−１８３５９５号参照）が、アジ化物又はアジ化水
素ガスは極めて毒性が強く、さらに爆発性を有するため
使用することが危険である。また、酵素活性剤としてチ
オシアン酸塩も知られているが、これはごく一部の基質
を使用したときのみに有効であり、一般的に利用されて
いない。またα−マルトトリオシド誘導体が非ブロック
体の場合には、α−グルコシダーゼなどのエキソ型の糖
化酵素類に加水分解されて発色するので、エキソ型の糖
化酵素類が共存するサンプルについては事実上、α−ア
ミラーゼ活性の正確な測定は不可能である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は従来用いら
れ、あるいは報告されている、α−アミラーゼ活性の測
定方法が有する前記した欠点を克服し、α−アミラーゼ
活性を精度よく、安全にかつ効率的に測定しうる方法を
提供することを目的としてなされたものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために種々研究を重ねた結果、特定の非還元
末端修飾基をもつα−マルトトリオシド誘導体を基質に
用い、酵素活性剤としてアルカリ金属シアン酸塩を添加
すると、２種のヒトα−アミラーゼが速やかにかつ同じ
速度で、還元末端の発色性基のα−グルコシド結合を切
断することを見い出した。そして本発明者らは、該非還
元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体を基質に用い、
酵素活性剤としてアルカリ金属シアン酸塩を添加してα
−アミラーゼ活性を測定すれば、従来用いられていた共
役酵素類を使用することなく、また糖転移反応も起こす
ことなく、生成した所定の発色性化合物をそのまま比色
などの定量系に、高感度、高正確度でかつ安全に導くこ
とができることを見い出し、この知見に基づいて本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、α−アミラー
ゼ含有試料に、一般式（３）

【０００８】

【化３】

【０００９】（式中のＲは芳香族発色性基、Ｘはアジド
基、ハロゲン原子、Ｎ−モノアルキルカルバモイルオキ
シ基又はアリール若しくはアルキルスルホニルオキシ
基、ＹはＮ−モノアルキルカルバモイルオキシ基、アリ
ール若しくはアルキルスルホニルオキシ基、α−グルコ
シル基、α−マルトシル基又は水酸基である）で表され
る非還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体を基質と
して用い、酵素活性剤としてアルカリ金属シアン酸塩を
添加して酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色化合物
を定量することを特徴とする、α−アミラーゼ活性の測
定方法であり、また前記の非還元末端修飾α−マルトト
リオシド誘導体及び前記の酵素活性剤を有効成分として
含有する、ヒトα−アミラーゼ活性測定試薬である。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
前記一般式（３）で表される非還元末端修飾α−マルト
トリオシド誘導体において、Ｘはアジド基、ハロゲン原
子、Ｎ−モノアルキルカルバモイルオキシ基又はアリー
ル若しくはアルキルスルホニルオキシ基、ＹはＮ−モノ
アルキルカルバモイルオキシ基、アリール若しくはアル
キルスルホニルオキシ基、α−グルコシル基、α−マル
トシル基又は水酸基である。Ｘ及びＹのＮ−モノアルキ
ルカルバモイルオキシ基のアルキル部は、例えばメチル
基、エチル基、イソプロピル基、ブチル基、シクロヘキ
シルなどの直鎖状、分枝状又は環状のアルキル基であ
る。またＸ及びＹのアリール若しくはアルキルスルホニ
ルオキシ基の例としては、メタンスルホニルオキシ基、
トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、トルエンスル
ホニルオキシ基、ベンゼンスルホニルオキシ基、ナフタ
レンスルホニルオキシ基、４−フルオロベンゼンスルホ
ニルオキシ基などが挙げられる。なお前記一般式（３）
で表される非還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体
において、Ｙが水酸基でＸに前記した修飾基を有する化
合物（すなわち６−Ｏ−モノ置換体）よりもＸ、Ｙとも
に前記した修飾基を有する化合物（すなわち４，６−ジ
置換体）の方がα−アミラーゼにより速く加水分解され
るため好適である。中でも特にＸ及びＹの両方がＮ−モ
ノアルキルカルバモイルオキシ基であるもの又はＸがト
ルエンスルホニルオキシ基、Ｙがα−グルコシル基であ
るものが、製造法が簡単であることからより好ましい。

【００１１】 次に前記一般式（３）で表される非還元
末端修飾α−マルトトリオシド誘導体において、還元末
端グルコースの１位の水酸基に置換されるＲの芳香族発
色性基としては、分光学的に検出できればどのようなも
のを用いてもよいが、例えば次の一般式（４）

【００１２】

【化４】

【００１３】（式中Ｒ¹〜Ｒ⁵は水素原子、ハロゲン原
子、ニトロ基、アルキル基、アリール基、アリル基、ア
ミノ基、スルホン酸基、又はカルボキシル基であり、そ
れぞれ同一であってもよいし、また異なっていてもよ
く、又Ｒ¹とＲ²、又はＲ²とＲ³が結合して、縮合芳香環
を形成してもよい）で表されるものが挙げられる。中で
も前記一般式（４）で表され、かつベンゼン環の４位が
ニトロ基で置換された４−ニトロフェニル＝非還元末端
修飾α−マルトトリオシドは、遊離される４−ニトロフ
ェノールの分子吸光係数（ε）が大きいこと、合成原料
が入手しやすいことなどから好ましい。さらにそのなか
でも一般式（５）

【００１４】

【化５】

【００１５】（式中のＷは水素原子、ハロゲン原子又は
ニトロ基である）で表される４−ニトロフェニル基の２
位がハロゲン原子やニトロ基などの電子吸引性基で置換
された、２−置換−４−ニトロフェニル＝非還元末端修
飾α−マルトトリオシドは、前記した４−ニトロフェニ
ル誘導体の利点に加えて、遊離される２−置換−４−ニ
トロフェノールのｐＫａ値が小さいことから、液性が中
性付近（例えばヒトα−アミラーゼの至適ｐＨは７であ
る）においてもほぼ１００％解離するため、高感度が得
られるという優位性を有している。

【００１６】 したがって、前記一般式（３）で表され
る化合物としては、例えば２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモ
イル−α−マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−エチル）カルバモイ
ル−α−マルトトリオシド、２−フルオロ−４−ニトロ
フェニル＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトト
リオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−Ｏ
−トシル−α−マルトテトラオシド、２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝６³−アジド−６³−デオキシ−α−マ
ルトテトラオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
６³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−マ
ルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４
³，６³−ジＯ−メタンスルホニル−α−マルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−デオキシ
−６³−ヨード−α−マルトペンタオシド、２−クロロ
−４−ニトロフェニル＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−
α−マルテトラオシド、２，４−ジニトロフェニル＝６
³−デオキシ−６³−ヨード−α−マルトペンタオシドな
どが挙げられる。これらのうち、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カ
ルバモイル−α−マルトトリオシド、２− クロロ−４
−ニトロフェニル＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−エチル）カ
ルバモイル−α−マルトトリオシドが特に好ましい。な
お、前記において使用している記号の６³−、４³−など
は、マルトオリゴシドを構成するグルコース鎖の還元末
端側から３番めのグルコースの６位、４位水酸基の位置
が置換されていることを示す。

【００１７】 本発明の前記一般式（３）で表される非
還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体を製造するた
めにはどのような方法を用いてもよいが、例えば次の方
法によって製造することが出来る。 （１） 前記一般式（３）において、Ｘがアジド基又は
ハロゲン原子、ＹがＮ−アルキルカルバモイルオキシ
基、アリール若しくはアルキルスルホニルオキシ基又は
水酸基である化合物を得る場合；例えば市販又は公知の
方法で得たα−マルトトリオシド誘導体に、テトラメト
キシメタンを作用させて非還元末端４³，６³−位ＯＨを
ジメトキシメチリデン化した後、アセチル化し、得られ
た生成物のジメトキシメチリデン基を酢酸／水を作用さ
せて除去し、４³，６³−ＯＨ誘導体とする。続いてトシ
ルクロライドを作用させる選択的６³−Ｏ−トシル化反
応を行う。６³位のみを修飾する場合は４³−Ｏ−アセチ
ル化反応を行い、４³位も修飾する場合はＮ−アルキル
イソシアネートなどを作用させて４³−Ｏ−（Ｎ−アル
キル）カルバモイル化反応又はアリール若しくはアルキ
ルスルホニルクロライドなどを作用させて４³−Ｏ−ス
ルホニル化反応を行う。次いでアジ化ナトリウムなどを
作用させるアジド化反応（Ｘがアジド基の場合）、又は
ハロゲン化ナトリウムなどを作用させるハロゲン化反応
（Ｘがハロゲン原子の場合）を行って６³−アジド又は
ハロゲノアセチルマルトオリゴ糖誘導体とした後、最後
に塩酸／メタノールなどを作用させて脱アセチル化反応
を行うことによって得られる（特開平５−３２６８７
号、「カルボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒ．Ｒｅｓ．）」第５１巻、第７３〜８４ページ（１
９７６年）、特開平５−１０９１号などを参照）。

【００１８】（２）前記一般式（３）において、ＸがＮ
−アルキルカルバモイルオキシ基又はアリール若しくは
アルキルスルホニルオキシ基、ＹがＮ−アルキルカルバ
モイルオキシ基、アリール若しくはアルキルスルホニル
オキシ基、又は水酸基である化合物を得る場合；例えば
前記一般式（３）における４³，６³−ＯＨ誘導体に、Ｎ
−アルキルイソシアネートなど及び／又はアリール若し
くはアルキルスルホニルクロライドなどを同時に又は順
次に作用させて６³−Ｏ−及び／又は４³−Ｏ−置換反応
を行う。その際の反応試薬、反応温度、反応時間などの
反応条件及び精製法を適宜選択することにより、６³−
Ｏ−モノ置換体又は４³，６³−Ｏ−ジ置換体を得ること
が出来る。最後にこれらに脱アセチル化反応を行うこと
により得られる（特開平５−３２６８７号、「プロテク
ティブグループス・イン・オーガニックシンセシス（Ｐ
ｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎ
ｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第１６〜３９ページ
（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ著、１９８１年、ＪＯＨＮ Ｗ
ＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、特開平
４−３４６９９４号参照）。

【００１９】（３）前記一般式（３）において、Ｙがα
−グルコシル基又はα−マルトシル基である化合物を得
る場合；例えばまず市販又は公知の方法で得たモノ６−
Ｏ−置換サイクロデキストリン（モノ６−Ｏ−トシル−
α−サイクロデキストリンなどが好適である）にグルコ
ースもしくはマルトースの存在下サイクロデキスグルカ
ノトランスフェラーゼを作用させるか、グルコースの存
在下もしくはグルコースがない状態でサイクロデキスト
リナーゼを作用させてサイクロデキストリン環を開環さ
せる。次いで例えばヒト唾液腺由来などのα−アミラー
ゼを作用させると糖鎖長選択的な水解が起こり、６³−
Ｏ−置換マルトペンタオース又は６³−Ｏ−置換マルト
テトラオースが得られる。これに公知の方法でα−配位
に芳香族発色性基を導入し、最後に脱アセチル化反応を
行うことによって得られる。

【００２０】 本発明の酵素活性化剤であるアルカリ金
属シアン酸塩の例としては、シアン酸ナトリウム、シア
ン酸カリウム、シアン酸カルシウム、シアン酸マグネシ
ウムなどが挙げられ、その添加濃度は５．０ｍＭ〜１．
０Ｍ程度が用いられる。前記のうちシアン酸ナトリウム
は、水溶性が高く、安価でかつ分子量が小さいため重量
濃度が低く抑えられるので特に好ましく用いられる。

【００２１】 α−アミラーゼ活性を測定するための有
利な系としては、例えば一般式（３）で表される非還元
末端修飾α−マルトトリオシド誘導体０．２〜２０ｍ
Ｍ、アルカリ金属シアン酸塩５．０ｍＭ〜１００ｍＭ及
び緩衝液２〜３００ｍＭを含有するｐＨ４〜７の系が挙
げられる。この系に用いられる緩衝剤としては例えばグ
ッド緩衝液、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸
塩、β−グリセロリン酸塩、ジメチルグルタル酸塩など
が挙げられる。このような系に、前記成分以外に、本発
明の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に応じて慣
用の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定化剤とし
て、グリセリン、牛血清アルブミン、α−又はβ−シク
ロデキストリン、トリトンＸ−１００などを加えること
もでき、また追加的な酵素活性化剤として、ＮａＣｌ、
ＭｇＣｌ₂、Ｃａ（ＣＨ₃ＣＯＯ）₂、ＣａＣｌ₂などの形
で用いられるＣｌ^-イオン、Ｃａ²+イオン、Ｍｇ²+イオ
ンなどを加えてもよい。これらの添加成分は１種用いて
もよいし、２種以上組合せて用いてもよく、またそれら
を前記系調製の適当な段階で加えることができる。

【００２２】 本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解し
た形で用いてもよいし、薄膜状の担体、例えばシート、
含浸性の紙などに含浸させて用いてもよい。このような
本発明の試薬を用いることにより、各種の試料中のα−
アミラーゼ活性を簡単な操作で正確に、かつ高感度で安
全に測定することができる。

【００２３】 次に、本発明方法の好適な実施態様を説
明する。まず、α−アミラーゼを含む試料に、前記した
非還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体を０．２〜
２０ｍＭ、好ましくは２．０〜１０ｍＭ及びアルカリ金
属シアン酸塩５．０ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１０
ｍＭ〜５０ｍＭを前記した緩衝剤とともに添加した後、
温度２５〜４５℃好ましくは３５〜４０℃、ｐＨ４〜
７、好ましくは５〜６の条件下で少なくとも１分間、好
ましくは２〜１０分間酵素反応させ、生成した発色性化
合物を常法に従いそのままであるいは必要に応じｐＨを
調整したのち又は縮合反応を行ったのちに、適当な吸光
波長で連続的に又は断続的に吸光度変化量を測定し、あ
らかじめ測定したα−アミラーゼ標品の吸光度変化量と
対比させて試料中のα−アミラーゼ活性を算出する。ま
た芳香族発色性化合物の分子吸光係数から算出すること
もできる。

【００２４】 本発明に用いられるα−アミラーゼ含有
試料については、α−アミラーゼ活性を含有するもので
あれば特に制限はないが、例えばヒトの体液や組織及び
それらの抽出液などを用いることができる。

【００２５】

【実施例】以下に参考例及び実施例を示し、さらに具体
的に説明するが、本発明は、これらの例に限定されるも
のではない。なお各例中の高速液体高速液体クロマトグ
ラフィは、ＹＭＣ社製ＯＤＳＡＱ−３１２カラム（６．
０ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ）（以下、「ＯＤＳ」と略す）
を用いた。またクロマトグラフィの溶離液はアセトニト
リル／水（ｖ／ｖ）の混合液を用い、流速は１．０ｍｌ
／分で行った。以下の例中には用いたカラム、検出法、
溶離液の混合比及びリテンションタイム（ｔR）を示
す。また例中の比旋光度は２５℃においてナトリウムの
Ｄ線で測定した値である。

【００２６】参考例 （２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイ
ル−α−マルトトリオシドの製造方法） 市販の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝α−マルトト
リオシド１０．０ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ
２０ｍｌに溶解し、テトラメトキシメタン１０．０ｍｌ
（７５．４ｍｍｏｌ）、及びアンバーリスト（１５Ｅ）
５．０ｇを加え、３５℃で４時間、かきまぜながら反応
させた。次いでアンバーリスト（１５Ｅ）をグラスフィ
ルターを用いて除去し、濾液にピリジン１５０ｍｌ、無
水酢酸７５ｍｌ（７８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日
間かきまぜながら反応させた。次いで反応液を減圧下濃
縮し、ここに含まれるピリジン、無水酢酸、酢酸を留去
した。得られたオイル状のアセチル体をクロマトグラフ
ィなどによる精製精製を行わずに、酢酸１．０ｌに溶解
し、水２００ｍｌを加え、３０℃で２日間、かきまぜな
がら反応させた。次いでこの反応液を氷水１．０ｌ中
へ、かきまぜながらゆっくりと滴下した後、この混合液
をジクロロメタン５００ｍｌで３回抽出した。次いでジ
クロロメタン層を水１．０ｌで３回洗浄し、ジクロロメ
タン層部を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濾別した後、濾
液を減圧下濃縮し、ジクロロメタンを留去した。この残
査をシリカゲルカラムクロマトグラフィにより精製し、
酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタン混液（容量比
５０：２：４８）で溶出した目的区分を濃縮して、２−
クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−
アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−
Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グル
コピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド８．７８ｇ（８．
８２ｍｍｏｌ，３工程通算収率５８％）が得られた。

【００２７】 この内の４．００ｇ（４．０２ｍｍｏ
ｌ）をピリジン１００ｍｌに溶解し、イソプロピルイソ
シアネート１９．７ｍｌ（２００ｍｍｏｌ）、ジメチル
アミノピリジン１２２ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）、及び
モレキュラシーブス４Ａ８．０ｇを加え、８０℃で４時
間かきまぜながら反応させた。次いでこの反応液を室温
まで冷却し、メタノール２０ｍｌを加え、室温で１．５
時間かきまぜながら反応させて過剰のイソプロピルイソ
シアネートを分解した。得られた反応液をセライトベッ
トで濾過し、濾液中のピリジンを減圧下留去し、得られ
た残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−により精
製し、酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタン混液
（容量比３３：３：９７）で溶出した目的区分を濃縮し
て、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−［２，３−
ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジＯ−（Ｎ−イソプロピ
ル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル］−（１
→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−
Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−ト
リ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド３．９０
ｇ（３．３４ｍｍｏｌ，収率８３％）を得た。この内の
３．２５ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）にメタノール−クロロ
ホルム−濃塩酸混液（容量比１０：４：１）１７５ｍｌ
を加え、２５℃で２．５日間さらに３０℃で１日間かき
まぜながら反応させた。次いで反応液を１ＮのＮａＯＨ
水で中和してｐＨを５．５とした後減、圧濃縮し、ここ
に含まれるメタノール、クロロホルムを留去した。次い
でその濃縮液をＯＤＳカラムクロマトグラフィにより精
製し、アセトニトリル−水混液（容量比３３：６７）で
溶出した目的区分を濃縮し、凍結乾燥して、２−クロロ
−４−ニトロフェニル＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−イソプ
ロピル）カルバモイル−α−マルトトリオシド１．３９
ｇ（１．６７ｍｍｏｌ，収率６４％）を得た。

【００２８】融点(℃） ：１５８〜１６０ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１，ｖ／ｖ） ：１．０７（３
Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．６Ｈｚ），３．２５〜４．２５（ｍ），４．４０
（２Ｈ，ｔ様），５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈ
ｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．８
３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
９．３Ｈｚ，２．９Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．９Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＯＤＳカラム，２８０ｎｍ
検出，溶離液３：７）：１５．８ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，メタノール）；＋
１４８° 元素分析 ：Ｃ₃₂Ｈ₄₈ＣｌＮ₃Ｏ₂₀として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４６．３０ ５．８３ ５．０６ 実測値（％） ４６．０８ ５．９４ ４．９４

【００２９】実施例１ （α−アミラーゼ活性の測定
法） （１）Ｋｍ値の測定 参考例で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４³，
６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−
マルトトリオシド（以下、ＤＩＰＧ３αＣＮＰと略す）
のヒトα−アミラーゼに対するＫｍ値を、２５ｍＭ−Ｎ
ａＯＣＮ、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＣａＣｌ₂
を含有する５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中で温
度３７℃の条件で測定した。その結果、ヒト膵臓由来α
−アミラーゼ（以下、ＨＰＡという）に対するＫｍ値
は、０．７０ｍＭ、ヒト唾液腺由来α−アミラーゼ（以
下、ＨＳＡという）に対するＫｍ値は、１．１９ｍＭで
あった。 （２）基質液の調製 ＤＩＰＧ３αＣＮＰを６．０ｍＭ（最終濃度がＫｍ値の
５倍以上）の濃度となるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及
び２ｍＭ−ＣａＣｌ₂を含有する５０ｍＭＭＥＳ緩衝液
（ｐＨ５．５）に溶解した。 （３）酵素活性剤液の調製 シアン酸ナトリウム（ＮａＯＣＮ）が最終濃度２５ｍＭ
になるように４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＣａＣｌ
₂を含有する５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に溶
解した。 （４）標品α−アミラーゼ液の調製 市販のヒトα−アミラーゼに精製水を加え、０、１０
０、２００、３００Ｕ／ｌ（ＨＰＡ：ＨＳＡ＝１：１）
の濃度に溶解して標品α−アミラーゼ液とした。なお、
この市販のヒトα−アミラーゼは、国際試薬（株）製の
「キャリブザイム・ＡＭＹ」を使用した。また、α−ア
ミラーゼの活性は、３７℃、１分間に１μｍｏｌの２−
クロロ−４−ニトロフェニル＝α−マルトペンタオシド
（市販品）を分解する酵素量を１単位（Ｕ）として定義
した。 （５）試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とし、固体の場合は、通常、試料５００ｍｇを正
確に秤量し、精製水を加えて全量を５．０ｍｌとし、こ
れを試料液とした。また不溶物があるときは、ろ過して
除去してから用いた。 （６）検量線の作成 基質液２．０ｍｌを３７℃で１分間加温したのち、前記
の酵素活性剤液２５０μｌ及び標品α−アミラーゼ液２
５０μｌを加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温した後
からの１分間の４００ｎｍにおける吸光度の変化量を測
定した。各標品α−アミラーゼ液の活性と、吸光度の変
化量の関係より検量線を作成した。その結果、検量線の
式 Ｕ＝１．１８・ΔＡ ×１０³ ＋ １０．４ ［式中、Ｕ；酵素活性（Ｕ／ｌ）、ΔＡ；１分間当りの
吸光度の変化量］を得た。そのグラフを図１に示す。

【００３０】（７）試料液中のα−アミラーゼ活性の測
定 基質液２．０ｍｌを３７℃で１分間加温したのち、酵素
活性剤液２５０μｌ及びα−アミラーゼ含有試料液２５
０μｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分間加温した後か
らの２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変化量を測定
した。この測定値と前記（６）で作成した検量線から算
出して、試料液中のα−アミラーゼ活性の測定を行っ
た。なお、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲を
越えた場合は、精製水を用いて相当する倍数の希釈を行
った後、再測定を行った。

【００３１】実施例２ （ヒトα−アミラーゼの２種の
アイソザイムの切断速度比の測定） 参考例と同様にして得たＤＩＰＧ３αＣＮＰを基質に用
い、以下の方法でヒトα−アミラーゼの２種のアイソザ
イムの切断速度比を測定した。 （１）α−アミラーゼ液の調製 市販のヒトα−アミラーゼ（ＨＰＡ、ＨＳＡ）に精製水
を加え、約３００Ｕ／ｌの濃度に溶解してα−アミラー
ゼ液とした。なお、この市販のヒトα−アミラーゼは国
際試薬（株）製「キャリブザイム・ＡＭＹ」を使用し
た。また、α−アミラーゼの活性は、実施例１の（４）
に示したように、３７℃、１分間に１μｍｏｌの２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル＝α−マルトペンタオシド
（市販品）を分解する酵素量を１単位（Ｕ）として定義
した。 （２）基質液の調製 ＤＩＰＧ３αＣＮＰの濃度が酵素加水分解反応時に６．
０ｍＭになるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−
ＣａＣｌ₂を含有する５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．
５）に溶解した。 （３）シアン酸ナトリウム（ＮａＯＣＮ）液の調整 シアン酸ナトリウムの濃度が酵素加水分解反応時に、
０、２５、５０、１００、１５０ｍＭになるように、４
０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＣａＣｌ₂を含有する５
０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解した。 （４）酵素加水分解反応 α−アミラーゼ液２５０μｌを３７℃で１分間加温後、
基質液２．０ｍｌ及び各濃度のシアン酸ナトリウム液２
５０μｌを同時に加え、よくかき混ぜた後３７℃で１分
間加温後からの２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変
化量を測定した。吸光度の変化量と時間との関係により
得られる直線の式は Ａ ＝ ａ・ｔ ＋ ｂ ［Ａ；吸光度（ＯＤ）、ｔ；反応時間（ｍｉｎ）、ａ；
速度定数（ＯＤ／ｍｉｎ）、ｂ；初期（ｔ＝０）吸光
度］であるから、各々の濃度のシアン酸ナトリウム存在
下におけるヒトα−アミラーゼがＤＩＰＧ３αＣＮＰを
加水分解する速度は、単位時間当りの吸光度の増加量す
なわちａの値で比較できる。さらにヒトα−アミラーゼ
の２種のアイソザイムの速度を比較するために、該ａ値
を、充分量の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝α−マ
ルトペンタオシド（市販品）を同条件でヒトα−アミラ
ーゼが加水分解したときのａ値で除することにより、ｃ
値を算出した。すなわちｃ値は基準物質である２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル＝α−マルトペンタオシドとの
相対速度を示す。これらを表１に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】表１から、シアン酸ナトリウムを系内に適
当な濃度で添加することにより、ヒトα−アミラーゼの
活性を共役酵素を共存させないで測定（直接定量）する
ときに、ヒトα−アミラーゼの２種のアイソザイムのそ
れぞれの水解速度を実質的に低下させることなく、速度
比を１．０に極めて近い範囲で任意に調整することがで
きることが分かる。また比較のため、シアン酸ナトリウ
ムの代わりに、チオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）
を２５ｍＭ、５０ｍＭ加えること以外は、前記と同様の
操作でヒトα−アミラーゼの２種のアイソザイムの切断
速度比の測定を行った。その結果を表２に示す。

【００３４】

【表２】

【００３５】表２から、チオシアン酸ナトリウムを系内
に適当な濃度で添加することにより、ヒトα−アミラー
ゼの水解速度が低下すること、すなわち正確に酵素活性
を測定するという目的において、チオシアン酸ナトリウ
ムを用いることは適していないことがわかる。

【００３６】実施例３ （測定用試薬） 精製水に、表３に示す濃度となるようにして各成分を溶
解して本発明の試薬を調製した。

【００３７】

【表３】

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、試料中に含まれるグル
コ−ス、マルト−ス、ビリルビン、ヘモグロビン、グル
コシダ−ゼ類、グルコアミラーゼなどの影響を受けるこ
となく、また全く糖転移反応を伴わずに、α−アミラー
ゼ活性を自動分析法、用手法などにより、低ブランク値
で精度よく短時間で容易に測定することができる。さら
に酵素活性剤としてアジ化物の代わりにアルカリ金属シ
アン酸塩を加えることにより、ヒトα−アミラーゼの２
種のアイソザイムの速度比を調整することが可能で、ア
ジ化物を使用したときのような毒性あるいは爆発性など
の危険性を伴わずに安全に、正確にかつ効率よくα−ア
ミラーゼ活性を測定することができるので、極めて有用
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 各標品α−アミラーゼ液の活性と、吸光度の
変化量の関係を示すグラフ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 α−アミラーゼ含有試料に、一般式
   （１） 【化１】 （式中のＲは芳香族発色性基、Ｘはアジド基、ハロゲン
   原子、Ｎ−モノアルキルカルバモイルオキシ基又はアリ
   ール若しくはアルキルスルホニルオキシ基、ＹはＮ−モ
   ノアルキルカルバモイルオキシ基、アリール若しくはア
   ルキルスルホニルオキシ基、α−グルコシル基、α−マ
   ルトシル基又は水酸基である）で表される非還元末端修
   飾α−マルトトリオシド誘導体を基質として用い、酵素
   活性剤としてアルカリ金属シアン酸塩を添加して酵素反
   応を行わせ、遊離する芳香族発色化合物を定量すること
   を特徴とする、α−アミラーゼ活性の測定方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の非還元末端修飾α−マル
   トトリオシド誘導体のＸ及びＹがＮ−モノアルキルカル
   バモイルオキシ基であり、Ｒが一般式（２） 【化２】 （式中のＷは水素原子、ハロゲン原子又はニトロ基であ
   る）で表される芳香族発色性基であり、酵素活性剤がシ
   アン酸ナトリウムである請求項１記載のα−アミラーゼ
   活性の測定方法。
3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２記載の非還元末端
   修飾α−マルトトリオシド誘導体及び酵素活性剤を有効
   成分として含有する、ヒトα−アミラーゼ活性測定試
   薬。