JPH08291A - α−アミラーゼ活性の測定方法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 α−アミラーゼ含有試料に、一般式 【化１】 （Ｘはアジド基、ハロゲン原子、Ｎ−モノアルキルカル
バモイルオキシ基、アルキル若しくはアリールスルホニ
ルオキシ基又はアルキルオキシ基、ＹはＮ−モノアルキ
ルカルバモイルオキシ基、アルキル若しくはアリールス
ルホニルオキシ基、水酸基又はアルキルオキシ基、Ｒは
芳香族発色性基）で表わされる非還元末端修飾α−マル
トトリオシド誘導体を添加して酵素反応を行わせ、遊離
する芳香族発色性化合物を定量するα−アミラーゼ活性
の測定法であり、また、該非還元末端修飾α−マルトト
リオシド誘導体を有効成分とするα−アミラーゼ活性測
定用試薬である。 【効果】 グルコシダーゼ類、グルコアミラーゼなどの
共役酵素を使用することなく、α−アミラーゼ活性を高
感度で、かつ正確に測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非還元末端修飾α−マ
ルトトリオシド誘導体を基質として用い、グルコシダー
ゼ類、グルコアミラーゼなどの共役酵素を使用すること
なく、α−アミラーゼ活性を高感度でかつ正確に測定す
る方法及び該誘導体を有効成分するα−アミラーゼ活性
測定用試薬に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、血清、尿、膵液、唾液などの体液
を対象とするα−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上
極めて重要であり、特に急性や慢性の膵臓炎、膵臓ガ
ン、流行性耳下腺炎、肺炎、腎不全などの鑑別診断にお
いては必須の測定項目となっている。このα−アミラー
ゼ活性の測定方法については従来より種々の方法が知ら
れているが、近年、各種の芳香族発色性基を還元末端に
配糖体として有し、その非還元末端グルコースが各種の
置換基で修飾されたマルトオリゴシド類（いわゆるブロ
ック体であり、共役酵素系に耐性すなわち安定性を有す
る特徴をもつ）を基質として利用し、α−アミラーゼに
より切断後、共役酵素系すなわちα−グルコシダーゼか
グルコアミラーゼ又はその両方を、あるいはさらにこれ
らの酵素とβ−グルコシダーゼを作用させ、生成する発
色性化合物をそのまま、あるいは必要に応じてｐＨを変
化させたり、縮合させたのちに比色定量する方法が、広
く用いられるようになってきた。

【０００３】ところで、前記の非還元末端グルコースが
修飾されたマルトオリゴシド類（ブロック体）は、共役
酵素系において安定性を示すが、ブロック体の製造時の
精製過程で、非還元末端グルコースが修飾されていない
マルトオリゴシド類、いわゆる非ブロック体を完全に分
離することができなかったり、あるいはブロック体が長
期間の保存中に一部分解するなどして非ブロック体を生
成するため、このブロック体製品中には非ブロック体が
微量含有されるのを免れない。この非ブロック体は、α
−グルコシダ−ゼやグルコアミラーゼなどの共役酵素が
存在すると、加水分解を受けやすく、そして該非ブロッ
ク体がα−アノマーのときはそのままで、またβ−アノ
マーのときはさらにβ−グルコシダーゼの作用を受け
て、発色性化合物が生成するため、前記のようなブロッ
ク体を基質として用いた場合には、α−アミラーゼ活性
の測定時に、あるいは前記共役酵素と共存させて保存し
たときには、その保存中にこの共役酵素類によって非ブ
ロック体が加水分解されて発色し、その結果、ブランク
値が上昇して相対的な感度が低下するという欠点を有し
ている。

【０００４】また、本発明者は、先に基質として非還元
末端修飾β−マルトテトラオシド誘導体を、また共役酵
素としてβ−グルコシダーゼのみを用いるα−アミラー
ゼ活性の測定方法を提案した（特開平６−４６８９５
号）。しかしながら、基質の他に不純物としてβ−グル
コシド誘導体が共存した場合にはやはりブランク値の上
昇をもたらし、測定法としてはまだ満足しうるものとは
いえない。こうした問題を解決するために、基質として
非ブロック体のα−マルトトリオシド誘導体やα−マル
トシド誘導体を用い、共役酵素系を使用しないα−アミ
ラーゼ活性の測定方法が知られている［「クリニカル・
ケミストリー（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．）」第２３巻、２
２７９ページ（１９７７年）、「クリニカル・ケミスト
リー（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．）」第３４巻、７５４ペー
ジ（１９８８年）］。しかしながら、これらの方法は、
α−アミラーゼによる切断速度が極めて遅いことや糖鎖
の切断位置が選択的でないことなどから測定感度が低
く、また非ブロック体であるため、α−グルコシダー
ゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなどのエキ
ソ型糖化酵素類にも加水分解されて発色するので、該エ
キソ型糖化酵素類が共存するα−アミラーゼ含有試料に
ついては事実上α−アミラーゼ活性を測定することがで
きないなどという欠点を有している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来のこの
ようなブロック体の基質とグルコシダーゼ類やグルコア
ミラーゼの共役酵素との組合せによるα−アミラーゼ活
性の測定方法、さらには、非ブロック体のα−マルトト
リオシド誘導体やα−マルトシド誘導体を基質に用い
る、共役酵素系を使用しないα−アミラーゼ活性の測定
方法が有する欠点を克服し、α−アミラーゼ活性を高感
度でかつ正確に測定しうる方法を提供することを目的と
してなされたものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は前記目的を達
成するために種々研究を重ねた結果、非還元末端修飾α
−マルトトリオシド誘導体を基質として用いると、その
修飾基の疎水的効果によりα−アミラーゼの結合部位と
位置選択的に結合したＥＳコンプレックスが形成され、
α−アミラーゼ（特にヒトα−アミラーゼで顕著であ
る）が選択的に、かつ速やかに、還元末端の芳香族発色
性基のα−グルコシド結合のみを切断して発色性化合物
だけを生成すること、すなわち、従来グルコシド結合を
切断するために共役酵素として用いていたα−又はβ−
グルコシダーゼやグルコアミラーゼなどを全く使用する
必要がないこと、そして生成した該発色性化合物を比色
法などによって定量することにより、α−アミラーゼ活
性を高感度で測定できることを見い出し、この知見に基
づいて本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、α−アミラーゼ含有
試料に、一般式

【化２】 （式中のＸはアジド基、ハロゲン原子、Ｎ−モノアルキ
ルカルバモイルオキシ基、アルキル若しくはアリールス
ルホニルオキシ基又はアルキルオキシ基、ＹはＮ−モノ
アルキルカルバモイルオキシ基、アルキル若しくはスル
ホニルオキシ基、水酸基又はアルキルオキシ基、Ｒは芳
香族発色性基である）で表わされる非還元末端修飾α−
マルトトリオシド誘導体を添加して酵素反応を行わせ、
遊離する芳香族発色性化合物を定量することを特徴とす
るα−アミラーゼ活性の測定方法及び前記一般式（Ｉ）
で表される非還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体
を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬を提供
するものである。

【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。前
記一般式（Ｉ）で表わされる非還元末端修飾α−マルト
トリオシド誘導体において、Ｘはアジド基、ハロゲン原
子、Ｎ−モノアルキルカルバモイルオキシ基、アルキル
若しくはアリールスルホニルオキシ基又はアルキルオキ
シ基、ＹはＮ−モノアルキルカルバモイルオキシ基、ア
ルキル若しくはアリールスルホニルオキシ基、水酸基又
はアルキルオキシ基である。Ｘのハロゲン原子としては
弗素、沃素、塩素、臭素のいずれでもよいが、水溶性を
低下させないこと、また製造が容易であることなどの理
由から、塩素、臭素が好ましい。Ｘ及びＹのＮ−モノア
ルキルカルバモイルオキシ基又はアルキルオキシ基のア
ルキル部は、例えばメチル基、エチル基、イソプロピル
基、ブチル基、シクロヘキシル基などの直鎖状、分枝状
又は環状のアルキル基であり、特にイソプロピル基、エ
チル基が製造が容易であることから好ましい。またＸ及
びＹのアルキル又はアリールアルキルスルホニルオキシ
基の例としては、メタンスルホニルオキシ基、トリフル
オロメタンスルホニルオキシ基、トルエンスルホニルオ
キシ基、ベンゼンスルホニルオキシ基、ナフタレンスル
ホニルオキシ基、４−フルオロベンゼンスルホニルオキ
シ基などが挙げられる。なお前記一般式（Ｉ）で表わさ
れる非還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体におい
て、Ｘが前記した修飾基でＹが水酸基である化合物（す
なわち６−Ｏ−モノ置換体）よりも、Ｘ、Ｙ共に前記し
た修飾基を有する化合物（すなわち４，６−ジ置換体）
がヒトα−アミラーゼにより速く加水分解されるので好
ましく、この観点から、Ｘ及びＹのいずれもがＮ−モノ
アルキルカルバモイルオキシ基、Ｘがハロゲン原子でＹ
がアルキルスルホニルオキシ基であるものがより好まし
い。中でもＸ及びＹのいずれもがＮ−モノアルキルカル
バモイルオキシ基であるものが、製造法が簡単であるこ
とから特に好ましい。

【０００９】次に、前記一般式（Ｉ）で表わされる非還
元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体において、還元
末端グルコ−スの１位の水酸基に置換されるＲの芳香族
発色性基としては、分光学的に検出できればどのような
ものを用いてもよいが、例えば、一般式

【化３】 （式中のＲ¹ないしＲ⁵は同一でも異なっていてもよく、
それぞれ水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、アルキル
基、アリール基、アリル基、アミノ基、スルホン酸基又
はカルボキシル基であり、またＲ¹とＲ²又はＲ²とＲ³と
で縮合芳香環を形成してもよい）、

【化４】 （式中のＲ⁶は水素原子又はアルキル基である）、

【化５】 （式中のＲ⁷は水素原子又はハロゲン原子である）、

【化６】 （式中のＲ⁸ないしＲ¹⁵は同一でも異なっていてもよ
く、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、アル
キル基、アリール基、アリル基、アミノ基、スルホン酸
基又はカルボキシル基であり、またＲ⁸とＲ⁹又はＲ¹⁰と
Ｒ¹¹とで縮合芳香環を形成してもよく、さらにＲ⁹とＲ
¹⁰及び／又はＲ¹³とＲ¹⁴とで酸素原子を介して縮合エ−
テル環を形成してもよく、Ｚは窒素原子又はＮ→Ｏであ
る）で表わされる基などが挙げられる。

【００１０】これらの中でも、前記一般式（ＩＩ）で表
わされる基において、ベンゼン環の４位（Ｒ³）がニト
ロ基で置換された４−ニトロフェニル基（Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ
⁴及びＲ⁵は水素原子）は酵素反応により遊離される４−
ニトロフェノールの分子吸光係数（ε）が大きいこと、
合成原料が入手しやすいことなどから好ましく、さらに
該４−ニトロフェニル基の２位（Ｒ¹）がハロゲン原子
やニトロ基などの電子吸引性基で置換された２−置換−
４−ニトロフェニル基（Ｒ²、Ｒ⁴及びＲ⁵は水素原子）
は前記した４−ニトロフェニル基の利点に加えて、酵素
反応により遊離される２−置換−４−ニトロフェノール
の、ｐＫａ値が小さい（酸性が強い）ことから、液性が
中性付近（ｐＨ＝７はヒトα−アミラーゼの至適ｐＨで
ある）でもほぼ１００％解離するため、高感度が得られ
るという優位性を有していて、より好ましい。

【００１１】前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物にお
いて、ＹがＮ−モノアルキルカルバモイルオキシ基でＸ
がアジド基、ハロゲン原子、Ｎ−モノアルキルカルバモ
イルオキシ基、アルキル若しくはアリールスルホニルオ
キシ基又はアルキルオキシ基、Ｙがアルキル若しくはア
リールスルホニルオキシ基又はアルキルオキシ基でＸが
アジド基又はＮ−モノアルキルカルバモイルオキシ基及
びＹが水酸基でＸがＮ−モノアルキルカルバモイルオキ
シ基の化合物は新規なものである。

【００１２】前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物とし
ては、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４³，
６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−
マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
４³，６³−ジＯ−（Ｎ−エチル）カルバモイル−α−マ
ルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６
³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトトリオシド、２
−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−クロロ−６³−デ
オキシ−α−マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル＝６³−アジド−６³−デオキシ−α−マルト
トリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−
Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−マルトト
リオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４³，６³
−ジＯ−メタンスルホニル−α−マルトトリオシド、２
−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−クロロ−６³−デ
オキシ−４³−Ｏ−メタンスルホニル−α−マルトトリ
オシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−クロ
ロ−６³−デオキシ−４³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カ
ルバモイル−α−マルトトリオシド、４−ニトロフェニ
ル＝６³−デオキシ−６³−ヨード−α−マルトトリオシ
ド、２，４−ジニトロフェニル＝６³−フルオロ−６³−
デオキシ−α−マルトトリオシド、２−フルオロ−４−
ニトロフェニル＝６³−アジド−６³−デオキシ−α−マ
ルトトリオシド、フェノールインド−３'−クロロフェ
ニル＝４³，６³−ジＯ−メタンスルホニル−α−マルト
トリオシド、４−メチルウンベリフェロニル＝４³，６³
−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−マル
トトリオシド、ルシフェリニル＝６³−Ｏ−（Ｎ−イソ
プロピル）カルバモイル−α−マルトトリオシド、フェ
ノールインドフェニル＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−
４³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−マ
ルトトリオシドなどが挙げられる。なお、上記におい
て、記号６³−、４³−などは、マルトトリオシドを構成
するグルコース鎖の還元末端側から３番目のグルコース
（すなわち、非還元末端側のグルコース）の６位、４位
などの水酸基が置換されていることを示す。

【００１３】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる非
還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体は、例えば次
の（１）〜（４）の方法によって製造することができる
が、勿論それ以外の方法で製造されたものでもよい。 （１） 前記一般式（Ｉ）において、Ｘ＝アジド基又は
ハロゲン原子、Ｙ＝水酸基の場合：例えば市販又は公知
の方法で得たα−マルトトリオシド誘導体にテトラメト
キシメタンを作用させて非還元末端４，６−ＯＨをジメ
トキシメチリデン化したのち、アセチル化し、得られた
生成物のジメトキシメチリデン基を酢酸／水を作用させ
て除去し、４，６−ＯＨ誘導体とし、続いてトシルクロ
ライドを作用させる選択的６−Ｏ−トシル化反応、さら
に４−Ｏ−アセチル化反応、そしてアジ化ナトリウムを
作用させるアジド化反応（Ｘ＝アジド基の場合）、又は
ハロゲン化ナトリウム若しくはハロゲン化リチウムを作
用させるハロゲン化反応（Ｘ＝ハロゲン原子の場合）を
行って非還元末端アジド又はハロゲノマルトオリゴ糖誘
導体としたのち、最後に塩酸／メタノールなどを作用さ
せて脱アセチル化反応を行う（特開平５−３２６８７
号、「カルボハイドレ−ト・リサ−チ」（Ｃａｒｂｏｈ
ｙｄｒ．Ｒｅｓ．）、第５１巻、第７３〜８４ペ−ジ
（１９７６年）、特開平５−１０９１号参照）。

【００１４】（２） 前記一般式（Ｉ）において、Ｘ＝
アジド基又はハロゲン原子、Ｙ＝Ｎ−モノアルキルカル
バモイルオキシ基又はアルキル若しくはアリールスルホ
ニルオキシ基の場合：例えば前記（１）における４，６
−ＯＨ誘導体にトシルクロライドを作用させる選択的６
−Ｏ−トシル化反応を行ったのち、Ｎ−モノアルキルイ
ソシアネ−トなどを作用させての４−Ｏ−（Ｎ−モノア
ルキル）カルバモイル化反応又はアルキル若しくはアリ
ールスルホニルクロライドなどを作用させる４−Ｏ−ス
ルホニル化反応を行い、次いで、前記（１）と同様にア
ジ化又はハロゲン化を行い、最後に脱アセチル化反応を
行う（前記特開平５−３２６８７号、前記「カルボハイ
ドレート・リサーチ」（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅ
ｓ．）、第５１巻、第７３〜８４ペ−ジ（１９７６
年）、「プロテクティブグループス・イン・オーガニッ
クシンセシス」（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ
ｉｎ ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第５０
〜６９ページ、１９８１年（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ著、
ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）、前記特開平５−１０９１号、特開平４−３４６９
９４号参照）。

【００１５】（３） 前記一般式（Ｉ）において、Ｘ＝
Ｎ−モノアルキルカルバモイルオキシ基又はアルキル若
しくはアリールスルホニルオキシ基、Ｙ＝Ｎ−モノアル
キルカルバモイルオキシ基、アルキル若しくはアリール
スルホニルオキシ基又は水酸基の場合：例えば前記
（Ｉ）における４，６−ＯＨ誘導体にＮ−モノアルキル
イソシアネ−トなど及び／又はアルキル若しくはアリー
ルスルホニルクロライドなどを同時又は順次に作用させ
て６−Ｏ−及び／又は４−Ｏ−置換反応を行う。その際
の反応試薬、反応温度、反応時間などの反応条件及び精
製法を適宜選択することにより、６−Ｏ−モノ置換体又
は４，６−Ｏ−ジ置換体を得ることができ、最後にこれ
らに脱アセチル化反応を行う（前記特開平５−３２６８
７号、前記「プロテクティブグループス・イン・オーガ
ニックシンセシス」（ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐ
ｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第
５０〜６９ページ、１９８１年（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ
著、ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ）、前記特開平４−３４６９９４号参照）。

【００１６】（４） 非還元末端の修飾を先に行ったの
ちに芳香族発色性基の導入を行う場合：例えば市販又は
公知の方法で得たマルトトリオースを原料として前記
（１）〜（３）の方法を用いて非還元末端に目的の修飾
を行ったのち、脱アセチル化する前に公知の方法で還元
末端に芳香族発色性基を導入し、最後にこれらに脱アセ
チル化反応を行う。

【００１７】以上のようにして得られた一般式（Ｉ）で
表わされる非還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体
を基質として用いることにより、グルコシダーゼ類やグ
ルコアミラーゼなどの共役酵素を使用することなく、α
−アミラーゼ活性を高感度で測定することができる。

【００１８】なお、例えば市販又は公知の方法で得た部
分的にアセチル化したα−マルトトリオシド誘導体の６
位水酸基をｔ−ブチルジメチルシリル基又はトリチル基
などで保護しておき、４位水酸基の置換反応を行ったの
ちに６位水酸基の脱保護反応を行い、最後にこれらに脱
アセチル化反応を行うことにより得られる、一般式

【化７】 （式中のＫはＮ−モノアルキルカルバモイルオキシ基、
アルキル若しくはアリールスルホニルオキシ基又はアル
キルオキシ基、Ｒは前記と同じ意味をもつ）で表わされ
る非還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体（すなわ
ち４−Ｏ−モノ置換体）を基質として用いた場合には、
後述するように、ヒトα−アミラーゼによる切断位置が
１カ所でないため、正確に測定を行なうための基質とし
て不適である。また、例えば市販又は公知の方法で得た
α−マルトトリオシド誘導体に酸性条件下で、例えばア
ルキル又はアリールアルデヒド（又はケトン）ジメチル
アセタールなどを作用させることにより得られる、一般
式

【化８】 （式中のＴ¹、Ｔ²は相互に独立して水素原子、アルキル
基又はアリール基、Ｒは前記と同じ意味をもつ）で表わ
される非還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体（す
なわち４，６−Ｏ−メチリデン誘導体）を基質として用
いた場合には、該基質に対するヒトα−アミラーゼの加
水分解速度が極めて遅いため、同様に基質として不適で
ある。

【００１９】次に、本発明のα−アミラーゼ活性の測定
方法における好適な実施態様を説明する。まず、α−ア
ミラーゼを含む試料に、前記一般式（Ｉ）で表わされる
非還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体を０．２〜
２０ｍＭ、好ましくは１．０〜１０ｍＭを緩衝剤ととも
に添加したのち、温度２５〜４５℃、好ましくは３５〜
４０℃、ｐＨ４〜１０、好ましくは６〜８の条件下で少
なくとも１分間、好ましくは２〜１０分間酵素反応を行
わせ、生成した芳香族発色性化合物を、常法に従いその
ままであるいは必要に応じｐＨを調整したのち、又は縮
合反応を行わせたのちに、適当な吸光波長で連続的に又
は断続的に吸光度変化量を測定し、あらかじめ測定した
α−アミラーゼ標品の吸光度変化量と対比させて試料中
のα−アミラーゼ活性を算出する。また芳香族発色性化
合物の分子吸光係数から算出することもできる。

【００２０】本発明に用いられるα−アミラーゼ含有試
料については、α−アミラーゼ活性を含有するものであ
ればよく、特に制限はないが、具体的には微生物の培養
液、植物の抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれ
らの抽出液などを用いることができる。α−アミラーゼ
含有試料が固体の場合には、いったん精製水又は後記の
ような緩衝液に溶解又は懸濁させるのが好ましい。また
必要により、この際、不溶物をろ過などの操作により除
去してもよい。

【００２１】α−アミラーゼ活性を測定するための有利
な系としては、例えば一般式（Ｉ）で表わされる非還元
末端修飾α−マルトトリオシド誘導体０．２〜２０ｍＭ
及び緩衝液２〜３００ｍＭを含有するｐＨ４〜１０の系
が挙げられる。この系に用いられる緩衝剤としては、例
えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、グッド緩衝液、ホウ酸
塩、クエン酸塩、β−グリセロリン酸塩、ジメチルグル
タル酸塩などが挙げられる。このような系に、前記成分
以外に、本発明の目的をそこなわない範囲で、さらに必
要に応じて慣用の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、
安定化剤として、グリセリン、牛血清アルブミン、α−
又はβ−シクロデキストリン、トリトンＸ−１００など
を加えることができるし、またα−アミラーゼ活性化剤
として、ＮａＣｌ，ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣ
ｌ₂、ＣａＣｌ₂・Ｈ₂Ｏなどの形で用いられるＣｌ^-イオ
ン、Ｃａ²⁺イオン、Ｍｇ²⁺イオンなどを加えることもで
きる。これらの添加成分は単独で用いてもよいし、２種
以上組み合せて用いてもよい。これらの成分は前記系調
製の適当な段階で加えることができる。

【００２２】本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した
形で用いてもよいし、薄膜状の担体、例えばシ−ト、含
浸性の紙などに含浸させて用いてもよい。このような試
薬を用いることにより、各種の試料に含有されるα−ア
ミラーゼ活性を簡単な操作で高感度でかつ正確に測定す
ることができる。

【００２３】

【発明の効果】本発明の方法によれば、α−アミラーゼ
により、基質としての前記一般式（Ｉ）で表わされる非
還元末端修飾α−マルトトリオシド誘導体における芳香
族発色性基が結合した還元末端のα−グルコシド結合の
みが切断されるため、α−又はβ−グルコシダーゼやグ
ルコアミラーゼなどの共役酵素を全く必要とせず、そし
て試料中に含まれるグルコース、マルトース、ビリルビ
ン、ヘモグロビン、グルコシダーゼ類、グルコアミラー
ゼなどの影響を受けることなく、α−アミラーゼ活性を
自動分析法、用手法などにより、低ブランク値で正確に
短時間で容易に測定することができる。また、前記一般
式（Ｉ）で表わされる化合物を有効成分とする本発明の
α−アミラーゼ活性測定用試薬は、前記のごとく、共役
酵素を用いないので、該試薬の製造コストが低減するこ
とは勿論のこと、その製造操作も容易となり、さらに基
質溶液を調製するときに共役酵素が共存しないため、長
期にわたって初期状態を維持しうるという利点がある。

【００２４】

【実施例】以下に実施例を示す。なお、各例中の高速液
体高速液体クロマトグラフィは、ＹＭＣ（株）製ＯＤＳ
ＡＱ−３１２カラム（６．０ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ）を
用い、その際の溶離液としてアセトニトリル／水（ｖ／
ｖ）の混合液を使用し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎの条件
で行った。各例中では検出法、溶離液の混合比及びリテ
ンションタイム（ｔ_R）のみを示す。また、各例中の吸
収極大波長は特に示されていない限り、メタノール中で
測定した値であり、比旋光度は２５℃においてナトリウ
ムのＤ線で測定した値である。そしてまた、各例中の市
販のヒトα−アミラーゼは、国際試薬（株）製キャリブ
ザイム・ＡＭＹ〔ヒト膵液由来（Ｐ型）α−アミラーゼ
（以下ＨＰＡという）：ヒト唾液由来（Ｓ型）α−アミ
ラーゼ（以下ＨＳＡという）＝１：１〕を使用した。さ
らにまた、α−アミラーゼ活性は、３７℃、１分間に１
μｍｏｌの２−クロロ−４−ニトロフェニル＝α−マル
トペンタオシド（市販品）を分解する酵素量を１単位
（Ｕ）として定義した。

【００２５】実施例１ ［１］ α−アミラーゼ活性の測定法（１） （１） 基質液の調製 下記［２］で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４
³，６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α
−マルトトリオシドを９．５６ｍＭ（最終濃度がＫｍ値
の５倍）の濃度になるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び
２ｍＭ−ＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ＝７．０）に溶解した。 （２） 標品α−アミラーゼ液の調製 市販のヒトα−アミラーゼに精製水を加え、０、１４
０、２６９、３９７Ｕ／ｌの濃度に溶解して標品α−ア
ミラーゼ液とした。

【００２６】（３） 試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とした。固体の場合は通常、試料５００ｍｇを正
確に秤量し、精製水を加えて全量を５ｍｌとして試料液
とした。必要に応じて、不溶物をろ過などの操作で除去
してから用いた。 （４） 検量線の作成 基質液２．０ｍｌを３７℃で１分間加温したのち、標品
α−アミラーゼ液２５０μｌを加えてかきまぜ、３７℃
で２分間加温したのちからの２分間の４００ｎｍにおけ
る吸光度の変化量を測定した。各標品α−アミラーゼ液
の活性と、吸光度の変化量の関係より検量線を作成し
た。その結果、検量線の式は ＴＡ＝２．４３・△Ａ ×１０³ ＋ １６．７ （ｒ²
＝０．９９９） ［ＴＡ；酵素活性（Ｕ／ｌ）、 △Ａ；１分間当りの吸
光度の変化量］ となった。そのグラフを図１に示す。 （５） 試料液中のα−アミラーゼ活性の測定 試料液２５０μｌを３７℃で１分間加温したのち、基質
液２．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温し
たのちからの２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変化
量を測定した。この測定値と（４）で作成した検量線か
ら算出して試料液中のα−アミラーゼ活性の測定を行う
ことができる。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線
の適用範囲（０〜３９７Ｕ／ｌ）を越えた場合は、精製
水を用いて相当する倍数の希釈を行ったのち、再測定を
行う。

【００２７】［２］ ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル
−α−マルトトリオシドの製造 （１） ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−
（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−
α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６
−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの製
造 市販の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝α−マルトト
リオシド１０．０ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ
２０ｍｌに溶解し、テトラメトキシメタン１０．０ｍｌ
（７５．４ｍｍｏｌ）及びアンバーリスト（１５Ｅ）
５．０ｇを加え、３５℃で４時間かきまぜながら反応さ
せた。次いでアンバーリスト（１５Ｅ）をグラスフィル
ターを用いて除去し、ろ液にピリジン１５０ｍｌ、無水
酢酸７５ｍｌ（７８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間
かきまぜながら反応させた。続いて反応液を減圧下濃縮
し、ここに含まれるピリジン、無水酢酸、酢酸を留去し
た。得られたオイル状のアセチル体をクロマトグラフィ
などによる精製を行わずに、酢酸１．０ｌに溶解し、水
２００ｍｌを加え、３０℃で２日間かきまぜながら反応
させた。この反応液を氷水１．０ｌ中へ、かきまぜなが
らゆっくりと滴下したのち、この混合液をジクロロメタ
ン５００ｍｌで３回抽出した。次いでジクロロメタン層
を水１．０ｌで３回洗浄し、ジクロロメタン層部を無水
硫酸ナトリウムで乾燥、ろ別したのち、ろ液を減圧下濃
縮し、ジクロロメタンを留去した。この残渣をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィにより精製し、酢酸エチル−
メタノール−ジクロロメタン混液（容量比５０：２：４
８）で溶出した目的区分を濃縮して、２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−α
−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，
３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−
α−Ｄ−グルコピラノシド８．７８ｇ（８．８２ｍｍｏ
ｌ，３工程通算収率５８％）が得られた。

【００２８】融点(℃)：９９〜１０１ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３４５０，２９６１，
１７５２，１５８６，１５２７，１４８２，１４３８，
１３７０，１３４９，１２３９，１０３６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ａｃｅ
ｔｏｎｅ−ｄ₆）：１．９８〜２．０７（２４Ｈ，ｅａ
ｃｈ ｓ），３．４１（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），３．４０〜
３．７５（ｍ），４．００〜４．４４（ｍ），４．４８
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２．４Ｈｚ），４．６
８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，３．９Ｈｚ），
４．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，３．９Ｈ
ｚ），５．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，３．
７Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，
８．６Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈ
ｚ），５．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），５．４
３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，７．９Ｈｚ），
５．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，８．６Ｈ
ｚ），５．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５
９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．２４（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．３２（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 薄層クロマトグラフィ［メルク（株）製シリカゲルＴＬ
ＣプレートＮｏ．５７１５，ＵＶ（２８０ｎｍ）検出，
展開液：酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタン混液
（容量比５０：２：４８）］：Ｒｆ＝０．５３ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１５７° 元素分析：Ｃ₄₀Ｈ₅₀ＣｌＮＯ₂₆として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４８．２２ ５．０６ １．４１ 実測値（％） ４８．１１ ５．１４ １．１９

【００２９】（２） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝Ｏ−［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジＯ−
（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル］−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ
−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）
−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシドの製造 （１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，
３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ド４．００ｇ（４．０２ｍｍｏｌ）をピリジン１００ｍ
ｌに溶解し、イソプロピルイソシアネート１９．７ｍｌ
（２００ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１２２ｍ
ｇ（１．００ｍｍｏｌ）及びモレキュラシーブス４Ａ
８．０ｇを加え、８０℃で４時間かきまぜながら反応さ
せた。次いでこの反応液を室温まで冷却し、メタノール
２０ｍｌを加え、室温で１．５時間かきまぜながら反応
させて過剰のイソプロピルイソシアネートを分解した。
得られた反応液をセライトベットでろ過し、ろ液中のピ
リジンを減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィにより精製し、酢酸エチル−メタノ
ール−ジクロロメタン混液（容量比３３：３：９７）で
溶出した目的区分を濃縮して、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル＝Ｏ−［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６−
ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル］−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−ト
リ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１
→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グ
ルコピラノシド３．９０ｇ（３．３４ｍｍｏｌ，収率８
３％）を得た。

【００３０】融点(℃)：１０６〜１０８ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３７８，２９７５，
１７５２，１５８７，１５２７，１３７１，１３４９，
１２３７，１０３８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ａｃｅ
ｔｏｎｅ−ｄ₆）：１．１１（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈ
ｚ），１．１２（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．０
０〜２．１９（２４Ｈ，ｅａｃｈ ｓ），３．６５〜
４．５５（ｍ），４．７０〜４．９０（ｍ），５．０８
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０ Ｈｚ，３．７Ｈｚ），
５．２０〜５．５０（ｍ），５．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ
＝１０．０Ｈｚ，８．６Ｈｚ），５．８８（１Ｈ，ｂ
ｒ．ｓ），５．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），
６．０４（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝９．３Ｈｚ），８．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈ
ｚ，２．９Ｈｚ），８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈ
ｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，３：１）：ｔ_R＝
７．０ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１５０°

【００３１】（３） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル
−α−マルトトリオシドの製造 （２）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジＯ−（Ｎ−イ
ソプロピル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル］−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，
３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ド３．２５ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）にメタノール−クロ
ロホルム−濃塩酸混液（容量比１０：４：１）１７５ｍ
ｌを加え、２５℃で２．５日間、さらに３０℃で１日間
かきまぜながら反応させた。次いで反応液を１ＮのＮａ
ＯＨ水で中和（ｐＨ→５．５）したのち減圧濃縮し、こ
こに含まれるメタノール、クロロホルムを留去した。そ
の濃縮液をＯＤＳカラムクロマトグラフィにより精製
し、アセトニトリル−水混液（容量比３３：６７)で溶
出した目的区分を濃縮し、凍結乾燥して、２−クロロ−
４−ニトロフェニル＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロ
ピル）カルバモイル−α−マルトトリオシド１．３９ｇ
（１．６７ｍｍｏｌ，収率６４％）を得た。

【００３２】融点(℃)：１５８〜１６０ 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２９１（ｌｏｇε＝
３．９３），２２７（ｌｏｇε＝３．９３），２０９
（ｌｏｇε＝４．１２） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３９２，２９７４，
２９３１，１７０１，１５８７，１５２３，１３４７，
１２７１，１１５２，１０８４，１０３６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ〔ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１（ｖ／ｖ）〕：１．０７（３
Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．６Ｈｚ），３．２５〜４．２５（ｍ），４．４０
（２Ｈ，ｔ様），５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈ
ｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．８
３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
９．３Ｈｚ，２．９Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．９Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（２８０ｎｍ，３：７）：ｔ
_R＝１５．８ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，メタノール）；＋
１４８° 元素分析：Ｃ₃₂Ｈ₄₈ＣｌＮ₃Ｏ₂₀として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４６．３０ ５．８３ ５．０６ 実測値（％） ４６．０８ ５．９４ ４．９４ Ｋｍ値： 対ＨＰＡ；１．１ｍＭ 対ＨＳＡ；１．７ｍＭ

【００３３】実施例２ ［１］ α−アミラーゼ活性の測定法（２） （１） 基質液の調製 下記［２］で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６
³−ブロモ−６³−デオキシ−４³−Ｏ−メタンスルホニ
ル−α−マルトトリオシドを３．３８ｍＭ（最終濃度が
Ｋｍ値の５倍）の濃度になるように、４０ｍＭ−ＮａＣ
ｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。 （２） 標品α−アミラーゼ液の調製 市販のヒトα−アミラーゼに精製水を加え、０、１９
９、３７２、５３９Ｕ／ｌの濃度に溶解して標品α−ア
ミラーゼ液とした。 （３） 試料液の調製 実施例１の（３）と同一の操作で試料液の調製を行っ
た。 （４） 検量線の作成 実施例１の（４）と同様の操作で検量線の作成を行っ
た。その結果、検量線の式は ＴＡ＝５．６６・△Ａ ×１０³ ＋ ３１．４ （ｒ²
＝０．９９９） ［ＴＡ；酵素活性（Ｕ／ｌ）、 △Ａ；１分間当りの吸
光度の変化量］ となった。そのグラフを図２に示す。 （５） 試料液中のα−アミラーゼ活性の測定 実施例１の（５）と同一の操作で試料液中のα−アミラ
ーゼ活性の測定を行った。

【００３４】［２］ ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−４³−Ｏ−メタンスル
ホニル−α−マルトトリオシドの製造 （１） ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−６−ブロモ−６−デオキシ−４
−Ｏ−メタンスルホニル−α−Ｄ−グルコピラノシル）
−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル
−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，
６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの
製造 後記実施例３の［３］の（１）で得た２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−
４，６−ジＯ−メタンスルホニル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド４．２０ｇ（３．６５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ１０
０ｍｌに溶解し、ＮａＢｒ１５．０ｇ（１４６ｍｍｏ
ｌ）を加えて７０℃で３．５時間反応させた。この反応
液にトルエン１．０ｌを加え、３％ＮａＣｌ水各５００
ｍｌで３回洗浄した。次にトルエン層を無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、綿栓でろ過したのち、ろ液中のトルエン
を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィにより精製し、酢酸エチル−メタノール
−ジクロロメタン混液（容量比１２．５：１：９９）で
溶出した目的区分を濃縮して、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−ブロ
モ−６−デオキシ−４−Ｏ−メタンスルホニル−α−Ｄ
−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６
−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−
（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ
−グルコピラノシド２．４０ｇ（２．１１ｍｍｏｌ，収
率５８％）を得た。

【００３５】融点(℃)：１１４〜１１６ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：２９６０，１７５２，
１５８７，１５２３，１４８２，１３７０，１３４９，
１２３６，１１８０，１０３７ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ₃）：２．０３〜２．１５（２４Ｈ，ｅａｃｈ
ｓ），３．０７（３Ｈ，ｓ），３．５３（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝１１．５Ｈｚ，４．６Ｈｚ），３．６５（１Ｈ，ｂ
ｒ．ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），３．９０〜４．３５
（ｍ），４．５０（２Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈ
ｚ），４．６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），４．７
７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，５．１Ｈｚ），
４．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，４．２Ｈ
ｚ），４．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，３．
７Ｈｚ），５．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），
５．３５〜５．５０（ｍ），５．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ），５．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．３Ｈ
ｚ），７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），８．
１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ），
８．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，３：１）：ｔ_R＝
７．５ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１６３°

【００３６】（２） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−４³−Ｏ−メタンスル
ホニル−α−マルトトリオシドの製造 （１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−ブロモ−６−デオキ
シ−４−Ｏ−メタンスルホニル−α−Ｄ−グルコピラノ
シル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド２．３０ｇ（２．０２ｍｍｏｌ）を出発原料に用
いること以外は実施例１の［２］の（３）と同様の操作
を行い、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−ブロ
モ−６³−デオキシ−４³−Ｏ−メタンスルホニル−α−
マルトトリオシド９４２ｍｇ（１．１８ｍｍｏｌ，収率
５８％）を得た。

【００３７】融点(℃)：１５０〜１５２ 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長[λmax]（ｎｍ）＝２９０（ｌｏｇε＝
３．９３），２２７（ｌｏｇε＝３．９２），２０９
（ｌｏｇε＝４．１２） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３８７，２９３１，
１５８７，１５２２，１４８３，１３４８，１２７３，
１１７４，１１５３，１０８１，１０３２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ［ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１（ｖ／ｖ）］：３．２６（３
Ｈ，ｓ），３．２０〜３．８０（ｍ），３．９０〜４．
１０（ｍ），４．２８（２Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝９Ｈ
ｚ），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．２
７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．
３Ｈｚ），８．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，
２．７Ｈｚ），８．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（２８０ｎｍ，３：７）：ｔ
_R＝１２．３ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，メタノール）；＋
１５３° 元素分析：Ｃ₂₅Ｈ₃₅ＢｒＣｌＮＯ₁₉Ｓとして Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ３７．４９ ４．４０ １．７５ 実測値（％） ３７．２４ ４．６５ １．５６ Ｋｍ値： 対ＨＰＡ；０．５０ｍＭ 対ＨＳＡ；０．８６ｍＭ

【００３８】実施例３ ［１］ α−アミラーゼ活性の測定法（３） （１） 基質液の調製 下記［２］で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６
³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−マル
トトリオシド（６ＣＭ−ＣＮＰ）、下記［３］で得た２
−クロロ−４−ニトロフェニル＝４³，６³−ジＯ−メタ
ンスルホニル−α−マルトトリオシド（４６ＤＭ−ＣＮ
Ｐ）、下記［４］で得た２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝６³−アジド−６³−デオキシ−α−マルトトリオシ
ド（６Ａ４Ｍ−ＣＮＰ）、［５］で得た２−クロロ−４
−ニトロフェニル＝６³−クロロ−６³−デオキシ−４³
−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−マルト
トリオシド（６Ｃ４ＣＭ−ＣＮＰ）及び下記［６］で得
た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−ブロモ−６³
−デオキシ−α−マルトトリオシド（６Ｂ−ＣＮＰ）を
それぞれ表１に示す濃度（最終濃度がＫｍ値の５倍）に
なるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ
₂を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に
溶解した。 （２） 標品α−アミラーゼ液の調製 実施例１の（２）と同一の操作で標品α−アミラーゼ液
の調製を行った。 （３） 試料液の調製 実施例１の（３）と同一の操作で試料液の調製を行っ
た。 （４） 検量線の作成 実施例１の（４）と同様の操作で検量線の作成を行っ
た。その結果、検量線の式を ＴＡ＝Ｍ・△Ａ ×１０³ ＋ Ｎ ［ＴＡ；酵素活性（Ｕ／ｌ）、 △Ａ；１分間当りの吸
光度の変化量］ とすると、Ｍ及びＮは表１に示す値となった。

【００３９】

【表１】 （５） 試料液中のα−アミラーゼ活性の測定 実施例１の（５）と同一の操作で試料液中のα−アミラ
ーゼ活性の測定を精度よく行うことができた。

【００４０】［２］ ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−
マルトトリオシドの製造 （１） ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−［２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）
カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル］−（１→
４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ
−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ
−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの製造 実施例１の［２］の（１）と同様の方法で得た２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシド４．００ｇ（４．０２
ｍｍｏｌ）をピリジン１００ｍｌに溶解し、イソプロピ
ルイソシアネート５．９２ｍｌ（６０．２ｍｍｏｌ）及
びモレキュラシーブス４Ａ８．０ｇを加え、６０℃で２
２時間かきまぜながら反応させた。次いでこの反応液を
室温まで冷却し、メタノール１０ｍｌを加え、室温で
１．５時間かきまぜながら反応させて過剰のイソプロピ
ルイソシアネートを分解した。得られた反応液をセライ
トベットでろ過し、ろ液中のピリジンを減圧下留去し、
得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィによ
り精製し、酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタン混
液（容量比５０：２：９８）で溶出した目的区分を濃縮
して、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−［２，３
−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カ
ルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル］−（１→４）
−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ
−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド３．３７ｇ
（３．１２ｍｍｏｌ，収率７８％）を得た。

【００４１】融点(℃)：１１０〜１１５ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３４００，２９７３，
１７５２，１５２７，１３７１，１３４９，１２３９，
１１３５，１０４９，１０３９ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ａｃｅ
ｔｏｎｅ−ｄ₆）：１．１４（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈ
ｚ），１．９４〜２．１１（２４Ｈ，ｅａｃｈｓ），
２．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．５０〜
４．３５（ｍ），４．４８（２Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝１３
Ｈｚ），４．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，
３．９Ｈｚ），４．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１Ｈ
ｚ，３．９Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．
１Ｈｚ，３．５Ｈｚ），５．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１
０．５Ｈｚ，９．５Ｈｚ），５．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ），５．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈ
ｚ），５．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，８．
５Ｈｚ），５．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，
８．６Ｈｚ），５．７９（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１１Ｈ
ｚ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），６．４
０（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），７．６１（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
９．３Ｈｚ，２．４Ｈｚ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．４Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，３：１）：ｔ_R＝
５．４ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１５８°

【００４２】（２） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−
マルトトリオシドの製造 （１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソプロ
ピル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル］−
（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−
α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６
−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド３．
２５ｇ（３．０１ｍｍｏｌ）を出発原料に用いること以
外は実施例１の［２］の（３）と同様の操作を行い、２
−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−Ｏ−（Ｎ−イソ
プロピル）カルバモイル−α−マルトトリオシド１．４
３ｇ（１．９２ｍｍｏｌ，収率６４％）を得た。

【００４３】融点(℃)：１５５〜１５７ 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長[λmax]（ｎｍ）＝２９０（ｌｏｇε＝
３．９３），２２７（ｌｏｇε＝３．９２），２０９
（ｌｏｇε＝４．１１） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３９１，２９２８，
１７０１，１５８７，１５２３，１４８８，１３４８，
１２７２，１１５１，１０８４，１０５０ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ［ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１（ｖ／ｖ）］：１．０５（３
Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．０５〜４．２５
（ｍ），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），５．
１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．
３Ｈｚ），８．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，
２．９Ｈｚ），８．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（２８０ｎｍ，３：７）：ｔ
_R＝５．１ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，メタノール）；＋
１５３° 元素分析：Ｃ₂₈Ｈ₄₁ＣｌＮ₂Ｏ₁₉として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４５．１４ ５．５５ ３．７６ 実測値（％） ４５．０１ ５．７３ ３．５６ Ｋｍ値： 対ＨＰＡ；０．７２ｍＭ 対ＨＳＡ；１．１ｍＭ

【００４４】［３］ ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝４³，６³−ジＯ−メタンスルホニル−α−マルトトリ
オシドの製造 （１） ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジＯ−メタンスルホニ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシドの製造 実施例１の［２］の（１）と同様にして得た２−クロロ
−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシド１６．８ｇ（１６．９
ｍｍｏｌ）をピリジン４００ｍｌに溶解し、メタンスル
ホニルクロライド１３．１ｍｌ（１６９ｍｍｏｌ）、ジ
メチルアミノピリジン２０ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）及
びモレキュラシーブス４Ａ８．０ｇを加え、室温で３時
間かきまぜながら反応させた。得られた反応液をセライ
トベットでろ過し、ろ液中のピリジンを減圧下留去し、
得られた残残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに
より精製し、酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタン
混液（容量比３３：２：９８）で溶出した目的区分を濃
縮して、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジＯ−メタンスルホニ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシド１８．３ｇ（１５．９
ｍｍｏｌ，収率９４％）を得た。

【００４５】融点(℃)：１１３〜１１６ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：２９４５，１７５２，
１５８６，１５２３，１４８２，１３５０，１２３６，
１１７８，１０３３ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ａｃｅ
ｔｏｎｅ−ｄ₆）：１．９６〜２．０９（２４Ｈ，ｅａ
ｃｈ ｓ），３．１５（３Ｈ，ｓ），３．１７（３Ｈ，
ｓ），３．９５〜４．６０（ｍ），４．７０〜４．８４
（ｍ），４．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，
３．９Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈ
ｚ，３．７Ｈｚ），５．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８
Ｈｚ，４．２Ｈｚ），５．３８〜５．５０（ｍ），５．
７７（２Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝９Ｈｚ），５．９８（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
９．０Ｈｚ），８．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈ
ｚ，２．７Ｈｚ），８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈ
ｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，３：１）：ｔ_R＝
６．５ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１５０°

【００４６】（２） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝４³，６³−ジＯ−メタンスルホニル−α−マルトトリ
オシドの製造 （１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジＯ−メタンス
ルホニル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−
Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グル
コピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド４．００ｇ（３．
４７ｍｍｏｌ）を出発原料に用いること以外は実施例１
の［２］の（３）と同様の操作を行い、２−クロロ−４
−ニトロフェニル＝４³，６³−ジＯ−メタンスルホニル
−α−マルトトリオシド１．３１ｇ（１．６１ｍｍｏ
ｌ，収率４６％）を得た。

【００４７】融点(℃)：１４０〜１４２ 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長[λmax]（ｎｍ）＝２９１（ｌｏｇε＝
３．９２），２２７（ｌｏｇε＝３．９２），２０９
（ｌｏｇε＝４．１１） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３４０７，２９３８，
１５８７，１５２３，１４８３，１４５９，１３５１，
１２７３，１１７７，１０８１，１０３０ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ［ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１（ｖ／ｖ）］：３．１４（３
Ｈ，ｓ），３．２６（３Ｈ，ｓ），３．３０〜３．８０
（ｍ），３．９０〜４．１０（ｍ），４．２０〜４．４
０（ｍ），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），
５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．８３（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
９．３Ｈｚ），８．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈ
ｚ，２．９Ｈｚ），８．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈ
ｚ） 高速液体クロマトグラフィ（２８０ｎｍ，３：７）：ｔ
_R＝９．３ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，エタノール）；＋
１４６° 元素分析：Ｃ₂₆Ｈ₃₈ＣｌＮＯ₂₂Ｓ₂として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ３８．２６ ４．６９ １．７２ 実測値（％） ３８．０４ ４．７７ １．４６ Ｋｍ値： 対ＨＰＡ；１．１ｍＭ 対ＨＳＡ；２．０ｍＭ

【００４８】［４］ ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−アジド−６³−デオキシ−４³−Ｏ−メタンスル
ホニル−α−マルトトリオシドの製造 （１） ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−６−アジド−６−デオキシ−４
−Ｏ−メタンスルホニル−α−Ｄ−グルコピラノシル）
−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル
−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，
６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの
製造 ＮａＢｒの代わりにＮａＮ₃を用いること以外は実施例
２の［２］の（１）と同様の操作を行って２−クロロ−
４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル
−４，６−ジＯ−メタンスルホニル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ
−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）
−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシド５．２０ｇ（４．５１ｍｍｏｌ）から２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセ
チル−６−アジド−６−デオキシ−４−Ｏ−メタンスル
ホニル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ
−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−α−Ｄ−グルコピラノシド２．００ｇ（１．８
２ｍｍｏｌ，収率４０％）を得た。

【００４９】融点(℃)：１０４〜１０６ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：２９６０，２１０８，
１７５３，１５８７，１５２４，１４８３，１３７０，
１３４９，１２３６，１１８０，１０３５ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ａｃｅ
ｔｏｎｅ−ｄ₆）：２．０１〜２．０９（２４Ｈ，ｅａ
ｃｈ ｓ），３．１４（３Ｈ，ｓ），３．５６（１Ｈ，
ｄｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，５．１Ｈｚ），３．７０（１
Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，２．７Ｈｚ），４．００
〜４．３８（ｍ），４．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．
２Ｈｚ，２．９Ｈｚ），４．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１
２．３Ｈｚ，２．３Ｈｚ），４．７３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝
９．５Ｈｚ），４．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈ
ｚ，３．９Ｈｚ），４．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．
５Ｈｚ，３．７Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１
０．０Ｈｚ，３．７Ｈｚ），５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．９Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈ
ｚ），５．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，８．
２Ｈｚ），５．７４〜５．８３（２Ｈ，ｍ），５．９８
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５９（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０
Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７
Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，３：１）：ｔ_R＝
６．３ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１６５°

【００５０】（２） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−アジド−６³−デオキシ−４³−Ｏ−メタンスル
ホニル−α−マルトトリオシドの製造 （１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−アジド−６−デオキ
シ−４−Ｏ−メタンスルホニル−α−Ｄ−グルコピラノ
シル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド１．９０ｇ（１．７３ｍｍｏｌ）を出発原料に用
いること以外は実施例１の［２］の（３）と同様の操作
を行い、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−アジ
ド−６³−デオキシ−４³−Ｏ−メタンスルホニル−α−
マルトトリオシド４５１ｍｇ（０．５９１ｍｍｏｌ，収
率３４％）を得た。

【００５１】融点(℃)：１３９〜１４１ 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝
３．９４），２２７（ｌｏｇε＝３．９４），２０９
（ｌｏｇε＝４．１４） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３８６，２９３１，
２１０７，１５８７，１５２２，１４８３，１３４８，
１２７３，１２４８，１１７４，１１５３，１０８３，
１０３２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ［ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１（ｖ／ｖ）］：３．２４（３
Ｈ，ｓ），３．１０〜３．８０（ｍ），３．８５〜４．
００（ｍ），４．２７（２Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝９Ｈ
ｚ），５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．２
５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．８２（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．
３Ｈｚ），８．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，
２．７Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（２８０ｎｍ，３：７）：ｔ
_R＝９．７ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，メタノール）；＋
１５１° 元素分析：Ｃ₂₅Ｈ₃₅ＣｌＮ₄Ｏ₁₉Ｓとして Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ３９．３５ ４．６２ ７．３４ 実測値（％） ３９．０１ ４．７５ ７．０２ Ｋｍ値： 対ＨＰＡ；０．６２ｍＭ 対ＨＳＡ；１．０ｍＭ

【００５２】［５］ ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−クロロ−６³−デオキシ−４³−Ｏ−（Ｎ−イソ
プロピル）カルバモイル−α−マルトトリオシドの製造 （１） ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−トルエンスルホニル−
α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，
３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−
α−Ｄ−グルコピラノシドの製造 実施例１の［２］の（１）と同様にして得た２−クロロ
−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシド２４．０ｇ（２４．１
ｍｍｏｌ）をピリジン２４０ｍｌに溶解し、トルエンス
ルホニルクロライド１６．１ｇ（８４．３ｍｍｏｌ）及
びモレキュラシーブス４Ａ２０ｇを加え、室温で９時間
かきまぜながら反応させた。得られた反応液をセライト
ベットでろ過し、ろ液中のピリジンを減圧下留去し、得
られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィにより
精製し、酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタン混液
（容量比５０：１：９９）で溶出した目的区分を濃縮し
て、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−
ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−トルエンスルホニル−α−
Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，
６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）
−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−
Ｄ−グルコピラノシド１８．４ｇ（１６．０ｍｍｏｌ，
収率６６％）を得た。

【００５３】融点(℃)：１１２〜１１４ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３４６４，２９６１，
１７５３，１５８８，１５２４，１４８３，１４３８，
１３７０，１３４９，１２３５，１１７８，１０３５ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ａｃｅ
ｔｏｎｅ−ｄ₆）：１．９６〜２．０６（２４Ｈ，ｅａ
ｃｈ ｓ），３．５０〜３．７０（ｍ），３．８５〜
４．４０（ｍ），４．４８（２Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１
２．２Ｈｚ），４．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６Ｈ
ｚ，３．８Ｈｚ），４．７０〜４．８５（ｍ），５．０
７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，３．７Ｈｚ），
５．１５〜５．５０（ｍ），５．６５〜５．８５
（ｍ），５．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．
４７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．５９（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．８２（Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３
Ｈｚ），８．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．
７Ｈｚ），８．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，７：３）：ｔ_R＝
９．５ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１５６°

【００５４】（２） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝Ｏ−［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（Ｎ−イ
ソプロピル）カルバモイル−６−Ｏ−トルエンスルホニ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル］−（１→４）−Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシドの製造 （１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−トルエンスルホ
ニル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシド２．７０ｇ（２．３５
ｍｍｏｌ）を出発原料に用いること以外は実施例１の
［２］の（２）と同様の操作を行い、２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝Ｏ−［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４
−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−６−Ｏ−ト
ルエンスルホニル−α−Ｄ−グルコピラノシル］−（１
→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−
Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−ト
リ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド１．３１
ｇ（１．０６ｍｍｏｌ，収率４５％）を得た。

【００５５】融点(℃)：１０７〜１０９ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３４１０，２９７５，
１７５２，１５８８，１５２４，１３７０，１２３５，
１１７９，１０４７ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ａｃｅ
ｔｏｎｅ−ｄ₆）：１．０９（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈ
ｚ），１．９３〜２．０８（２４Ｈ，ｅａｃｈｓ），
２．８４（３Ｈ，ｓ），３．５５〜３．７５（ｍ），
３．８５〜４．３５（ｍ），４．５０（１Ｈ，ｂｒ．
ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ），４．５３（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝
１１Ｈｚ），４．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６Ｈ
ｚ，３．７Ｈｚ），４．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．
３Ｈｚ，３．９Ｈｚ），４．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１
０．０Ｈｚ，６．２Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ
＝１０．１Ｈｚ，３．７Ｈｚ），５．２０（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝１０．０Ｈｚ），５．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７
Ｈｚ），５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），５．
４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，８．５Ｈｚ），
５．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，８．５Ｈ
ｚ），５．７９（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），
６．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），６．２５（１
Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝８．２Ｈｚ），７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈ
ｚ），７．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．２
７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．４Ｈｚ），８．
３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，３：１）：ｔ_R＝
９．５ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１５３°

【００５６】（３） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝Ｏ−［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−クロロ−６−
デオキシ−４−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル
−α−Ｄ−グルコピラノシル］−（１→４）−Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシドの製造 （２）と同様にして得た２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝Ｏ−［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（Ｎ−
イソプロピル）カルバモイル−６−Ｏ−トルエンスルホ
ニル−α−Ｄ−グルコピラノシル］−（１→４）−Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシド２．２６ｇ（１．８３
ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ４０ｍｌに溶解し、ＬｉＣｌ３．
５７ｇ（８５ｍｍｏｌ）を加えて７０℃で３時間反応さ
せた。この反応液にトルエン１．０ｌを加え、３％Ｎａ
Ｃｌ水各５００ｍｌで３回洗浄した。次にトルエン層を
無水硫酸ナトリウムで乾燥し、綿栓でろ過したのち、ろ
液中のトルエンを減圧下留去した。得られた残渣をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィにより精製し、酢酸エチ
ル−メタノール−ジクロロメタン混液（容量比１６．
７：１：９９）で溶出した目的区分を濃縮して、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−［２，３−ジ−Ｏ−ア
セチル−６−クロロ−６−デオキシ−４−Ｏ−（Ｎ−イ
ソプロピル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル］−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，
３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ド２．０ｇ（１．８２ｍｍｏｌ，収率９９％）を得た。

【００５７】融点(℃)：１１２〜１１４ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：２９７３，１７５２，
１５８７，１５２４，１４８３，１３７１，１３４９，
１２３５，１１３４，１０５０ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ａｃｅ
ｔｏｎｅ−ｄ₆）：１．１１（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈ
ｚ），１．９５〜２．０９（２４Ｈ，ｅａｃｈｓ），
３．５５〜３．８０（ｍ），３．８５〜４．３５
（ｍ），４．５０（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ），
４．５６（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），４．７９
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３．４Ｈｚ），４．８
４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３．３Ｈｚ），４．
８６（１Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．０８（１
Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，３．５Ｈｚ），５．２５
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），５．３５（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝３．９Ｈｚ），５．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈ
ｚ），５．４２（１Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝１０Ｈｚ），
５．８０（１Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．８０
（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），６．０１（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），６．３２（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ
＝９Ｈｚ），７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），
８．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．７Ｈ
ｚ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，３：１）ｔ_R＝７．
６ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１５７°

【００５８】（４） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−クロロ−６³−デオキシ−４³−Ｏ−（Ｎ−イソ
プロピル）カルバモイル−α−マルトトリオシドの製造 （３）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−クロロ−６−デオキ
シ−４−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−
Ｄ−グルコピラノシル］−（１→４）−Ｏ−（２，３，
６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）
−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−
Ｄ−グルコピラノシド２．００ｇ（１．８２ｍｍｏｌ）
を出発原料に用いること以外、実施例１の［２］の
（３）と同様の操作を行い、２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル＝６³−クロロ−６³−デオキシ−４³−Ｏ−（Ｎ
−イソプロピル）カルバモイル−α−マルトトリオシド
４１９ｍｇ（０．５４８ｍｍｏｌ，収率３０％）を得
た。

【００５９】融点(℃)：１５１〜１５３（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長[λmax]（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝
３．９４），２２７（ｌｏｇε＝３．９４），２０９
（ｌｏｇε＝４．１３） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３９３，２９３０，
１７０１，１５８７，１５２３，１４８３，１３４８，
１２７２，１２４８，１１５１，１０８０，１０３２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ［ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１（ｖ／ｖ）］：１．０８（６
Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．３０〜４．１０
（ｍ），４．４５（２Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝９Ｈｚ），
５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．２０（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ），７．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈ
ｚ），８．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２．７
Ｈｚ），８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（２８０ｎｍ，３：７）：ｔ
_R＝１４．０ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，メタノール）；＋
１５９° 元素分析：Ｃ₂₈Ｈ₄₀Ｃｌ₂Ｎ₂Ｏ₁₈として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４４．０５ ５．２８ ３．６７ 実測値（％） ４３．９１ ５．４２ ３．３３ Ｋｍ値： 対ＨＰＡ；０．５９ｍＭ 対ＨＳＡ；０．６４ｍＭ

【００６０】［６］ ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトトリオシド
の製造 （１） ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−６−ブロモ−６−デオキシ−α
−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，
３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−
α−Ｄ−グルコピラノシドの製造 ［５］の（１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−トルエン
スルホニル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）
−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ
−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド２．８５ｇ
（２．４８ｍｍｏｌ）を出発原料に用いること以外、実
施例２の［２］（１）と同様の操作を行い、２−クロロ
−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチ
ル−６−ブロモ−６−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド１．９９５ｇ（１．８８ｍｍｏｌ，収率７６％）
が得られた。

【００６１】融点(℃)：１１３〜１１５ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３４９７，２９６３，
１７５２，１５８７，１５２４，１４５８，１３７１，
１３４９，１２３６，１０３６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ａｃｅ
ｔｏｎｅ−ｄ₆）：１．９７〜２．１０（２４Ｈ，ｅａ
ｃｈ ｓ），３．５７〜３．８０（ｍ），３．８２〜
４．４０（ｍ），４．４９（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１１
Ｈｚ），４．５６（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），
４．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，３．９Ｈ
ｚ），４．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，３．
９Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），
５．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，３．７Ｈ
ｚ），５．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，９．
２Ｈｚ），５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），
５．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．４２（１
Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，８．２Ｈｚ），５．７９
（１Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．７９（１Ｈ，
ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），６．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ），７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈ
ｚ），８．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．７
Ｈｚ），８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，７：３）：ｔ_R＝
７．４ｍｉｎ

【００６２】（２） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトトリオシド
の製造 （１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−ブロモ−６−デオキ
シ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシド１．８０ｇ（１．７０
ｍｍｏｌ）を出発原料に用いること以外は実施例１の
［２］の（３）と同様の操作を行い、２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マ
ルトトリオシド９２７ｍｇ（１．２８ｍｍｏｌ，収率７
５％）を得た。

【００６３】融点(℃)：１５１〜１５３（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長[λmax]（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝
３．９５），２２７（ｌｏｇε＝３．９５），２０９
（ｌｏｇε＝４．１４） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３８４，２９２９，
１７０１，１５８７，１５２２，１４８３，１３４８，
１２７２，１１５０，１０３０ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ［ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１（ｖ／ｖ）］：３．１５〜
４．０５（ｍ），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈ
ｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），５．８
３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
９．３Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（２８０ｎｍ，１：３）：ｔ
_R＝７．４ｍｉｎ 元素分析：Ｃ₂₄Ｈ₃₃ＢｒＣｌＮＯ₁₇として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ３９．８８ ４．６０ １．９４ 実測値（％） ３９．４７ ４．７１ １．８８ Ｋｍ値： 対ＨＰＡ；０．７１ｍＭ 対ＨＳＡ；１．３ｍＭ

【００６４】実施例４ 測定試薬及びそれを用いてのα−アミラーゼ活性の測定 （１）試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することにより
試薬を調製した。 成 分 濃 度 ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４³，６³−ジＯ− （Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−マルトトリオシド ９．５６ｍＭ β−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０） ５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ） ４０ｍＭ 塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂） １ｍＭ （２）測定法 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とし、固体の場合は試料５００ｍｇを正確に秤量
し、精製水を加えて全量を５ｍｌとして試料液とした。
試薬２．０ｍｌを３７℃で１分間加温したのち、試料液
２５０μｌを加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温した
後からの２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変化量を
測定した。この測定値とあらかじめ作成した検量線から
算出して試料液中のα−アミラーゼ活性の測定を行っ
た。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲
を越えた場合には、精製水を用いて相当する倍数の希釈
を行ったのち、再測定した。

【００６５】実施例５ 測定試薬及びそれを用いてのα−アミラーゼ活性の測定 （１）試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することにより
試薬を調製した。 成 分 濃 度 ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−ブロモ−６³−デオキシ− ４³−Ｏ−メタンスルホニル−α−マルトトリオシド ３．３８ｍＭ β−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０） ５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ） ４０ｍＭ 塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂） １ｍＭ （２）測定法 実施例４と同様に行った。

【００６６】参考例１ ［１］ 加水分解部位の測定 前記実施例及び後記製造例（［２］及び［３］）で得た
表２に記載の本発明で用いられる基質及び公知の物質な
どを基質とした場合について、加水分解部位の測定を行
った。 （１） 基質液の調製 各基質の濃度を２ｍＭになるように、４０ｍＭ−ＮａＣ
ｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。 （２） α−アミラーゼ液の調製 市販のヒトα−アミラーゼ液に精製水を加え、約３００
Ｕ／ｌの濃度に溶解してα−アミラーゼ液とした。 （３） 加水分解反応 基質液１．０ｍｌに、（２）のα−アミラーゼ液２００
μｌを加えてよくかき混ぜたのち、３７℃で３０分間反
応させた。この反応液を高速液体クロマトグラフィで分
析することにより加水分解生成物を定量した。その結果
を表２に示す。なお、表における略称は表の下に記載し
た。

【００６７】

【表２】

【００６８】略称： ４６ＤＣＭ−ＣＮＰ；２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル
−α−マルトトリオシド ６ＣＭ−ＣＮＰ ；２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
６³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−マ
ルトトリオシド ４６ＤＭ−ＣＮＰ；２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
４³，６³−ジＯ−メタンスルフォニル−α−マルトトリ
オシド ６Ｂ４Ｍ−ＣＮＰ；２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
６³−ブロモ−６³−デオキシ−４³−Ｏ−メタンスルホ
ニル−α−マルトトリオシド ６Ａ４Ｍ−ＣＮＰ；２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
６³−アジド−６³−デオキシ−４³−Ｏ−メタンスルホ
ニル−α−マルトトリオシド ６Ｃ４ＣＭ−ＣＮＰ；２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−クロロ−６³−デオキシ−４³−Ｏ−（Ｎ−イソ
プロピル）カルバモイル−α−マルトトリオシド６Ｂ−
ＣＮＰ ；２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−
ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトトリオシド ４６ＢＥ −ＣＮＰ；２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル＝４³，６³−Ｏ−ベンジリデン−α−マルトトリ
オシド ４ＣＭ−ＣＮＰ ；２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
４³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−マ
ルトトリオシド Ｇ３−ＣＮＰ ；２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
α−マルトトリオシド Ｇ３−ＦＮＰ ；２−フルオロ−４−ニトロフェニル
＝α−マルトトリオシド Ｇ２−ＣＮＰ ；２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
α−マルトシド Ｇ−ＣＮＰ ；２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
α−Ｄ−グルコシド ＣＮＰ ；２−クロロ−４−ニトロフェノール Ａｍｙ ；ヒトα−アミラーゼ ＨＰＡ ；ヒト膵液由来（Ｐ型）α−アミラー
ゼ ＨＳＡ ；ヒト唾液由来（Ｓ型）α−アミラー
ゼ

【００６９】表２から、本発明の基質を用いた場合に
は、いずれもヒトα−アミラーゼの加水分解によって、
実質的にはＣＮＰのみを生成するため、α−アミラーゼ
活性を測定する際に共役酵素を全く必要としないことが
わかる。これに対して、基質として非還元末端４，６メ
チリデン誘導体を用いた場合には、は極めて反応速度が
遅いため活性測定が不可能であり、また、非還元末端４
位のみ修飾した誘導体及び非還元末端未修飾の物質を用
いた場合には、Ｇ２−ＣＮＰとＧ−ＣＮＰを生成するた
め、共役酵素としてグルコシダーゼ類がさらに必要とす
ることが判る。

【００７０】［２］ ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝４³，６³−Ｏ−ベンジリデン−α−マルトトリオシド
の製造 市販の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝α−マルトト
リオシド２．５０ｇ（３．７９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ
３５ｍｌに溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物２
１６ｍｇ（１．１４ｍｍｏｌ）及びベンズアルデヒドジ
メチルアセタール１．１４ｍｌ（７．５８ｍｍｏｌ）を
加え、減圧下（１８ｍｍＨｇ）５０℃で６時間、かきま
ぜながら反応させた。次いで氷冷した反応液に重炭酸ナ
トリウム０．３５ｇ（４．１７ｍｍｏｌ）及び氷水２０
０ｍｌを加え、ジクロロメタン５０ｍＬで３回洗浄し
た。水層をＯＤＳカラムクロマトグラフィにより精製
し、アセトニトリル−水混液（容量比３５：６５）で溶
出した目的区分を濃縮して、４³，６³−Ｏ−ベンジリデ
ン−α−マルトトリオシド１．７５ｇ（２．３４ｍｍｏ
ｌ，収率６２％）を得た。

【００７１】融点（℃）：２３４〜２３６（分解） 吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝
３．９４），２２７（ｌｏｇε＝３．９９），２０９
（ｌｏｇε＝４．３０） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３３７７，２９３２，
１５８７，１５２３，１４８３，１３４８，１２７２，
１１５１，１０２９ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ［ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１（ｖ／ｖ）］：３．２０〜
３．８５（ｍ），３．９０〜４．０５（ｍ），４．１２
（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ），５．１０（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．
７Ｈｚ），５．５６（１Ｈ，ｓ），５．８３（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．３０〜７．５０（５Ｈ，
ｍ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．２
０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．
３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，１：３）：ｔ_R＝
６．０ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１４１° 元素分析：Ｃ₃₁Ｈ₃₈ＣｌＮＯ₁₈として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４９．７７ ５．１２ １．８７ 実測値（％） ４９．４８ ５．３１ １．５９ Ｋｍ値： 対ＨＰＡ；０．８０ｍＭ 対ＨＳＡ；０．６４ｍＭ

【００７２】［３］ ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝４³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−
マルトトリオシドの製造 （１） ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−［２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）
カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル］−（１→
４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ
−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ
−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシドの製造 実施例１の［２］の（１）で得た２−クロロ−４−ニト
ロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ
−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６
−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−
（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ
−グルコピラノシド５．００ｇ（５．０２ｍｍｏｌ）を
ピリジン１００ｍＬに溶解し、（ｔ−ブチルジメチル）
シリルクロライド３．０３ｇ（２０．１ｍｍｏｌ）、イ
ミダゾール４．３７ｇ（４０．５ｍｍｏｌ）及びモレキ
ュラシーブス４Ａ５．０ｇを加え、室温下で１．５時間
かきまぜながら反応させた。次いで反応液にメタノール
３ｍｌを加え、さらに室温下で２時間かきまぜて過剰の
（ｔ−ブチルジメチル）シリルクロライドを分解した。
得られた反応液をセライトベットでろ過し、ろ液中のピ
リジンを減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィにより精製し、酢酸エチル−メタノ
ール−ジクロロメタン混液（容量比２０：１：９９）で
溶出した目的区分を濃縮して、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル＝Ｏ−［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−
（ｔ−ブチルジメチル）シリル−α−Ｄ−グルコピラノ
シル］−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド５．００ｇ（４．５０ｍｍｏｌ，収率９０％）を
得た。この内の４．９０ｇ（４．４１ｍｍｏｌ）を出発
原料に用いること以外は実施例１の［２］の（２）と同
様の操作を行い、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ
−［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（Ｎ−イソプ
ロピル）カルバモイル−６−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチ
ル）シリル−α−Ｄ−グルコピラノシル］−（１→４）
−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ
−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド４．１０ｇ
（３．４３ｍｍｏｌ，収率７８％）を得た。

【００７３】融点(℃)：１０７〜１０９ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：２９５７，２８５９，
１７５２，１５２３，１３７０，１３４９，，１２３
６，１１３８，１０３７ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ａｃｅ
ｔｏｎｅ−ｄ₆）：０．０６（３Ｈ，ｓ），０．０７
（３Ｈ，ｓ），０．９０５（９Ｈ，ｓ），１．１０（３
Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．１３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．４Ｈｚ），１．９３〜２．０９（２４Ｈ，ｅａｃｈ
ｓ），３．５５〜３．８０（ｍ），３．９５〜４．３
５（ｍ），４．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），
４．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，３．８Ｈ
ｚ），４．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，３．
９Ｈｚ），４．９４（１Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝１０Ｈ
ｚ），５．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，３．
７Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），
５．３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），５．４１（１
Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，２．２Ｈｚ），５．７９
（１Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．７９（１Ｈ，
ｂｒ．ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ），６．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．４Ｈｚ），６．２１（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝９Ｈ
ｚ），７．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．２
８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．
３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（ＲＩ，８５：１５）：ｔ_R
＝８．８ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１５４°

【００７４】（２） ２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝４³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−
マルトトリオシドの製造 （１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
［２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（Ｎ−イソプロ
ピル）カルバモイル−６−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチル）
シリル−α−Ｄ−グルコピラノシル］−（１→４）−Ｏ
−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−α−Ｄ−グルコピラノシド３．３０ｇ（２．７
６ｍｍｏｌ）を出発原料に用いること以外、実施例１の
［２］の（３）と同様の操作を行い、２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝４³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カル
バモイル−α−マルトトリオシド１．５３ｇ（２．０５
ｍｍｏｌ，収率７４％）を得た。

【００７５】融点(℃)：１７２〜１７４（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２９１（ｌｏｇε＝
３．９４），２２７（ｌｏｇε＝３．９３），２０９
（ｌｏｇε＝４．１２） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３９４，２９２，１
７０１，１５８７，１５２３，１４８３，１３４７，１
２７２，１１５１，１０８１，１０３０ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ［ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１（ｖ／ｖ）］：１．０６（３
Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．２５〜４．２０
（ｍ），４．３３（２Ｈ，ｂｒ．ｔ，Ｊ＝９Ｈｚ），
４．４２（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），５．０９
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），５．１０（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈ
ｚ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．２
３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２．９Ｈｚ），８．
３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ（２８０ｎｍ，３：７）：ｔ
_R＝６．６ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５００，メタノール）；＋
１６７° 元素分析：Ｃ₂₈Ｈ₄₁ＣｌＮ₂Ｏ₁₉として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４５．１４ ５．５５ ３．７６ 実測値（％） ４４．９７ ５．５１ ３．５５ Ｋｍ値： 対ＨＰＡ；１．４ｍＭ 対ＨＳＡ；２．４ｍＭ

【００７６】参考例２ α−アミラーゼ活性測定に際し、本発明で用いる物質及
び公知の物質などを基質とし、グルコシダーゼ類などの
共役酵素を用いない場合における感度、すなわち単位時
間における吸光度増加量（見かけの反応速度）の比較を
行った。 （１） 基質液（ア）の調製 実施例１の［２］で得た２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝４³，６³−ジＯ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイ
ル−α−マルトトリオシド（４６ＤＣＭ−ＣＮＰ）を
９．５６ｍＭ（最終濃度がＫｍ値の５倍）の濃度になる
ように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ₂を
含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解
した。 （２） 基質液（ロ）の調製 市販の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４³，６³−Ｏ
−ベンジリデン−α−マルトトリオシド（４６ＢＥ−Ｃ
ＮＰ）を４．５０ｍＭ（最終濃度がＫｍ値の５倍）の濃
度になるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−Ｍｇ
Ｃｌ₂を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
０）に溶解した。 （３） 基質液（ハ）の調製 市販の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝α−マルトト
リオシド（Ｇ３−ＣＮＰ）を１５．８ｍＭ（最終濃度が
Ｋｍ値の５倍）の濃度になるように、４０ｍＭ−ＮａＣ
ｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。なお、Ｇ３−ＣＮＰ
のＫｍ値は、対ＨＰＡが１．１ｍＭ、対ＨＳＡが２．８
ｍＭであった。

【００７７】（４） 標品α−アミラーゼ液の調製 市販のヒトα−アミラーゼに精製水を加え、２５０Ｕ／
ｌの濃度に溶解して標品α−アミラーゼ液とした。 （５） 加水分解反応と直線式の算出 各々の基質液［（イ）、（ロ）、（ハ）］２．０ｍｌを
３７℃で１分間加温したのち、標品α−アミラーゼ液を
２５０μｌ加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温したの
ちからの２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変化量を
測定した。吸光度の変化量と時間との関係により得られ
る直線の式は Ａ ＝ ａ・ｔ ＋ ｂ ［Ａ；吸光度（ＯＤ）、ｔ；反応時間（ｍｉｎ）、ａ；
速度定数（ＯＤ／ｍｉｎ），ｂ；初期（ｔ＝０）吸光度
（ＯＤ）］ であるから、各々の共役酵素液存在下における各々の基
質を用いた場合の感度、すなわち単位時間当りの吸光度
の増加量（見かけの反応速度）はａの値で比較される。
これらの結果を表３に示す。

【００７８】

【表３】 表３から、本発明の方法で用いられる基質では、十分な
感度が得られるのに対し、公知の物質などを基質とした
場合には、測定感度が低く、実質的にはα−アミラーゼ
の活性の定量が行えないことが判る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１におけるα−アミラーゼ活性の測定
に用いる検量線のグラフ。

【図２】 実施例２におけるα−アミラーゼ活性の測定
に用いる検量線のグラフ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 α−アミラーゼ含有試料に、一般式 【化１】 （式中のＸはアジド基、ハロゲン原子、Ｎ−モノアルキ
   ルカルバモイルオキシ基、アルキル若しくはアリールス
   ルホニルオキシ基又はアルキルオキシ基、ＹはＮ−モノ
   アルキルカルバモイルオキシ基、アルキル若しくはアリ
   ールスルホニルオキシ基、水酸基又はアルキルオキシ
   基、Ｒは芳香族発色性基である）で表わされる非還元末
   端修飾α−マルトトリオシド誘導体を添加して酵素反応
   を行わせ、遊離する芳香族発色性化合物を定量すること
   を特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法。
2. 【請求項２】 非還元末端修飾α−マルトトリオシド誘
   導体のＸ及びＹがＮ−モノアルキルカルバモイルオキシ
   基、又はＸがハロゲン原子でＹがアルキルスルホニルオ
   キシ基である請求項１記載のα−アミラーゼ活性の測定
   方法。
3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２記載の非還元末端
   修飾α−マルトトリオシド誘導体を有効成分とするα−
   アミラーゼ活性測定用試薬。