JPH0113840B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は、共役酵素法を利用するα―アミラー
ゼ活性測定試薬に関するものである。 （従来技術） 血清、尿、膵液等の体液を対象とするα―アミ
ラーゼ活性の測定は臨床診断上重要な意義を有し
ており、特に急性或は慢性の膵炎、膵臓癌、更に
は流行性耳下膵炎等の鑑別診断に当つては必須の
測定項目となつている。 従来提供されているα―アミラーゼ活性の測定
試薬は、次に示す様な測定原理を利用するものと
して分類することができる。 (1) ヨードデンプン反応を利用するアミロクラス
チツク法 (2) デンプンより生成する還元糖量を測定するサ
ツカロジエニツク法 (3) 色素結合デンプンからの遊離色素を測定する
クロモジエニツク法 (4) デンプンによる濁りを測定するタービドメト
リツク法 これらの方法における使用基質は、デンプン、
その修飾体、或はデンプンから誘導されるアミロ
ースやアミロペクチン等であり、いずれの場合も
天然のデンプンに頼るものである。しかし天然デ
ンプンの場合はその品質、性状が一定せず、α―
アミラーゼ活性測定値に対する信頼性が低くなら
ざるを得ないという欠点があると共に、α―アミ
ラーゼによる鎖切断と測定される特性値との間の
量的関係が不明確であり、更には測定操作が繁雑
であるという問題もあつた。 そこでこれらの欠点を伴わない方法として、共
役酵素法が注目され、次に述べる様な測定方法が
考えられている。 (A) デンプン、デキストリン或はオリゴ糖を基質
とし、α―アミラーゼによる鎖切断を行なつた
後、追随酵素系としてα―グルコシダーゼを作
用させることによつてフラグメントからグルコ
ースを遊離させ、このグルコースを公知の手段
によつて測定する方法。 (B) デンプン、デキストリン或はオリゴ糖を基質
とし、α―アミラーゼによる鎖切断で生成する
マルトースを、追随酵素（マルトースホスホリ
ラーゼ）の作用によつて分解し、生成したグル
コース―１―燐酸を更にホスホグルコシダーゼ
の作用によつて分解し、ここに生成したグルコ
ース―６―燐酸の量を、グルコース―６―燐酸
脱水素酵素及び補酵素の存在下、紫外部吸光度
測定法によつて測定する方法。 (C) ホスホリラーゼ及びβ―アミラーゼを用いて
調製したリミツトデキストリンを基質とし、α
―アミラーゼの作用で生成したフラグメントに
マルトデキストリンホスホリラーゼを作用させ
てグルコース―１―燐酸を遊離せしめ、これを
上記(B)の方法で測定する方法。 (D) カルボキシメチル化等の修飾を施したデンプ
ンを基質とし、α―アミラーゼの作用で生成し
たフラグメントにグルコアミラーゼを作用さ
せ、ここに生成したグルコースを公知の手段に
よつて測定する方法。 (E) ｐ―ニトロフエニル基を還元末端にグルコシ
ド結合させたマルトオリゴ糖を基質とし、α―
アミラーゼによる鎖切断の後、追随酵素として
マルターゼ（α―グルコシダーゼ）を作用さ
せ、ここに生成したｐ―ニトロフエノールを比
色定量する方法（特開昭57−53079号公報）。 (F) 置換或は非置換フエニル基を還元末端にグル
コシド結合させたマルトオリゴ糖を基質とし、
α―アミラーゼによる鎖切断の後、追随酵素と
してグルコシダーゼを作用させ、ここに遊離し
たフエノール類に４―アミノアンチピリン等の
色原体を酸化縮合させ、生成した色素を比色定
量する方法。 上記(A)〜(F)の共役酵素法においても、天然デン
プンを利用するもの（デキストリン、リミツトデ
キストリン或は修飾デンプン等を基質とする場合
を含む）では、前記(1)〜(4)において述べたのと同
様の欠陥がある。しかしオリゴ糖自体、若しくは
これの末端基に発色基（アグリコン）をグルコシ
ド結合させたものを基質とする場合は、構造式が
明確に把握され且つ、高度に精製されたものを使
用するので、天然デンプンの場合に述べた様な変
動がなく、α―アミラーゼによる鎖切断回数と計
測特性値との間の化学量論的な関係も明確とな
り、高精度で信頼性の高い結果を得ることができ
る。 この様な観点からすると、(A)、(B)、(E)及び(F)法
が良いことになるが、体液、特に血清及び尿中に
はグルコースやマルトースが存在する為、これら
を反応中間体として経由する方法〔(A)、(B)及び
(D)〕では、計測特性値が高めにあらわれ、レート
法等の特殊な消去法を用いてもそれらの影響を完
全に解消することは困難である。 （発明が解決しようとする課題） 以上の如き観点からα―アミラーゼ測定に使用
する基質としてはオリゴ糖の還元性末端に発色基
（解裂して基質とは異なつたスペクトル吸収を示
す置換芳香族基）をグルコシド結合させたものが
よい。ところが４―ニトロフエニル基を還元性末
端にα―グルコシド結合させたマルトオリゴ糖を
基質とした場合、いろいろな問題点が明確になつ
てきた。その１つは血中又は尿中のα―アミラー
ゼは至適PHが6.6〜7.0にあるが、４―ニトロフエ
ノールはPH７において最大モル吸光係数の約半分
のモル吸光係数を示し、且つ微量のPH変化でもモ
ル吸光係数の変化は大きい。さらに中性付近にお
いて温度変化によるモル吸光係数の変化が非常に
大きいこと、塩化ナトリウム量の上昇、アルブミ
ン量の上昇でモル吸光係数が上昇するというよう
な問題点がある。更に４―ニトロフエノールをア
グリコンとする基質を用いたアミラーゼ活性測定
試薬では感度が不足するという問題点などがあげ
られる。 特に温度変化によるモル吸光係数の変化が大き
いことと、感度不足の二点は４―ニトロフエノー
ルの重大な問題である。 （課題を解決するための手段および作用） 本発明者らはこれらの状況を考慮して種々研究
した結果、次式：
ゼ活性測定試薬に関するものである。 （従来技術） 血清、尿、膵液等の体液を対象とするα―アミ
ラーゼ活性の測定は臨床診断上重要な意義を有し
ており、特に急性或は慢性の膵炎、膵臓癌、更に
は流行性耳下膵炎等の鑑別診断に当つては必須の
測定項目となつている。 従来提供されているα―アミラーゼ活性の測定
試薬は、次に示す様な測定原理を利用するものと
して分類することができる。 (1) ヨードデンプン反応を利用するアミロクラス
チツク法 (2) デンプンより生成する還元糖量を測定するサ
ツカロジエニツク法 (3) 色素結合デンプンからの遊離色素を測定する
クロモジエニツク法 (4) デンプンによる濁りを測定するタービドメト
リツク法 これらの方法における使用基質は、デンプン、
その修飾体、或はデンプンから誘導されるアミロ
ースやアミロペクチン等であり、いずれの場合も
天然のデンプンに頼るものである。しかし天然デ
ンプンの場合はその品質、性状が一定せず、α―
アミラーゼ活性測定値に対する信頼性が低くなら
ざるを得ないという欠点があると共に、α―アミ
ラーゼによる鎖切断と測定される特性値との間の
量的関係が不明確であり、更には測定操作が繁雑
であるという問題もあつた。 そこでこれらの欠点を伴わない方法として、共
役酵素法が注目され、次に述べる様な測定方法が
考えられている。 (A) デンプン、デキストリン或はオリゴ糖を基質
とし、α―アミラーゼによる鎖切断を行なつた
後、追随酵素系としてα―グルコシダーゼを作
用させることによつてフラグメントからグルコ
ースを遊離させ、このグルコースを公知の手段
によつて測定する方法。 (B) デンプン、デキストリン或はオリゴ糖を基質
とし、α―アミラーゼによる鎖切断で生成する
マルトースを、追随酵素（マルトースホスホリ
ラーゼ）の作用によつて分解し、生成したグル
コース―１―燐酸を更にホスホグルコシダーゼ
の作用によつて分解し、ここに生成したグルコ
ース―６―燐酸の量を、グルコース―６―燐酸
脱水素酵素及び補酵素の存在下、紫外部吸光度
測定法によつて測定する方法。 (C) ホスホリラーゼ及びβ―アミラーゼを用いて
調製したリミツトデキストリンを基質とし、α
―アミラーゼの作用で生成したフラグメントに
マルトデキストリンホスホリラーゼを作用させ
てグルコース―１―燐酸を遊離せしめ、これを
上記(B)の方法で測定する方法。 (D) カルボキシメチル化等の修飾を施したデンプ
ンを基質とし、α―アミラーゼの作用で生成し
たフラグメントにグルコアミラーゼを作用さ
せ、ここに生成したグルコースを公知の手段に
よつて測定する方法。 (E) ｐ―ニトロフエニル基を還元末端にグルコシ
ド結合させたマルトオリゴ糖を基質とし、α―
アミラーゼによる鎖切断の後、追随酵素として
マルターゼ（α―グルコシダーゼ）を作用さ
せ、ここに生成したｐ―ニトロフエノールを比
色定量する方法（特開昭57−53079号公報）。 (F) 置換或は非置換フエニル基を還元末端にグル
コシド結合させたマルトオリゴ糖を基質とし、
α―アミラーゼによる鎖切断の後、追随酵素と
してグルコシダーゼを作用させ、ここに遊離し
たフエノール類に４―アミノアンチピリン等の
色原体を酸化縮合させ、生成した色素を比色定
量する方法。 上記(A)〜(F)の共役酵素法においても、天然デン
プンを利用するもの（デキストリン、リミツトデ
キストリン或は修飾デンプン等を基質とする場合
を含む）では、前記(1)〜(4)において述べたのと同
様の欠陥がある。しかしオリゴ糖自体、若しくは
これの末端基に発色基（アグリコン）をグルコシ
ド結合させたものを基質とする場合は、構造式が
明確に把握され且つ、高度に精製されたものを使
用するので、天然デンプンの場合に述べた様な変
動がなく、α―アミラーゼによる鎖切断回数と計
測特性値との間の化学量論的な関係も明確とな
り、高精度で信頼性の高い結果を得ることができ
る。 この様な観点からすると、(A)、(B)、(E)及び(F)法
が良いことになるが、体液、特に血清及び尿中に
はグルコースやマルトースが存在する為、これら
を反応中間体として経由する方法〔(A)、(B)及び
(D)〕では、計測特性値が高めにあらわれ、レート
法等の特殊な消去法を用いてもそれらの影響を完
全に解消することは困難である。 （発明が解決しようとする課題） 以上の如き観点からα―アミラーゼ測定に使用
する基質としてはオリゴ糖の還元性末端に発色基
（解裂して基質とは異なつたスペクトル吸収を示
す置換芳香族基）をグルコシド結合させたものが
よい。ところが４―ニトロフエニル基を還元性末
端にα―グルコシド結合させたマルトオリゴ糖を
基質とした場合、いろいろな問題点が明確になつ
てきた。その１つは血中又は尿中のα―アミラー
ゼは至適PHが6.6〜7.0にあるが、４―ニトロフエ
ノールはPH７において最大モル吸光係数の約半分
のモル吸光係数を示し、且つ微量のPH変化でもモ
ル吸光係数の変化は大きい。さらに中性付近にお
いて温度変化によるモル吸光係数の変化が非常に
大きいこと、塩化ナトリウム量の上昇、アルブミ
ン量の上昇でモル吸光係数が上昇するというよう
な問題点がある。更に４―ニトロフエノールをア
グリコンとする基質を用いたアミラーゼ活性測定
試薬では感度が不足するという問題点などがあげ
られる。 特に温度変化によるモル吸光係数の変化が大き
いことと、感度不足の二点は４―ニトロフエノー
ルの重大な問題である。 （課題を解決するための手段および作用） 本発明者らはこれらの状況を考慮して種々研究
した結果、次式：
【式】
（ＸおよびＹは少なくとも一方がハロゲン原子で
あり、残りは水素原子である）で示される置換芳
香族基が、還元性末端にβ結合したマルトオリゴ
糖を基質の全部又は一部として使用すれば、これ
らの欠点が解決できることを知り、本発明を完成
するに到つた。すなわち本発明は次式： 〔式中ｎは０〜８で、Ｒは
あり、残りは水素原子である）で示される置換芳
香族基が、還元性末端にβ結合したマルトオリゴ
糖を基質の全部又は一部として使用すれば、これ
らの欠点が解決できることを知り、本発明を完成
するに到つた。すなわち本発明は次式： 〔式中ｎは０〜８で、Ｒは
【式】
（ＸおよびＹは少なくとも一方はハロゲン原子で
あり、残りは水素原子である）で示される置換芳
香族基であつて、αまたはβ結合で糖の還元性末
端に結合しており、解裂してアグリコンとしては
基質とは異なつたスペクトル吸収を示す置換芳香
族基である。〕で表わされる基質のうち、置換芳
香族基Ｒが糖の還元性末端にβ結合した化合物が
50〜100モル％である基質に、α―グルコシダー
ゼおよびβ―グルコシダーゼおよび試料を添加
し、遊離するアグリコンの可視部の吸収を測定す
ることにより、試料中のα―アミラーゼ活性を測
定することを特徴とするα―アミラーゼ活性測定
法である。 本発明では例えば置換芳香族基が２―クロロ―
４―ニトロフエノールでの感度はPH７において、
４―ニトロフエノールの約２倍以上あり、該ハロ
ゲン化ニトロフエニル基が還元性末端に結合した
オリゴ糖を基質とするα―アミラーゼ活性測定用
試薬では充分に高い感度を示す。さらに２―クロ
ロ―４―ニトロフエノールではPH６において最大
モル吸光係数の約90％のモル吸光係数を示し、PH
変化に対しても安定であり、またアルブミン量の
上昇に対しても安定である。 測定方法としてはα―アミラーゼの反応を連続
的に追跡するレート法、一定時間反応させた後、
反応を止めて測定するエンド法、いずれの方法を
用いてもよい。 本発明におけるマルトオリゴ糖は、マルトペン
タオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオ
ースである。置換芳香族Ｒ：
あり、残りは水素原子である）で示される置換芳
香族基であつて、αまたはβ結合で糖の還元性末
端に結合しており、解裂してアグリコンとしては
基質とは異なつたスペクトル吸収を示す置換芳香
族基である。〕で表わされる基質のうち、置換芳
香族基Ｒが糖の還元性末端にβ結合した化合物が
50〜100モル％である基質に、α―グルコシダー
ゼおよびβ―グルコシダーゼおよび試料を添加
し、遊離するアグリコンの可視部の吸収を測定す
ることにより、試料中のα―アミラーゼ活性を測
定することを特徴とするα―アミラーゼ活性測定
法である。 本発明では例えば置換芳香族基が２―クロロ―
４―ニトロフエノールでの感度はPH７において、
４―ニトロフエノールの約２倍以上あり、該ハロ
ゲン化ニトロフエニル基が還元性末端に結合した
オリゴ糖を基質とするα―アミラーゼ活性測定用
試薬では充分に高い感度を示す。さらに２―クロ
ロ―４―ニトロフエノールではPH６において最大
モル吸光係数の約90％のモル吸光係数を示し、PH
変化に対しても安定であり、またアルブミン量の
上昇に対しても安定である。 測定方法としてはα―アミラーゼの反応を連続
的に追跡するレート法、一定時間反応させた後、
反応を止めて測定するエンド法、いずれの方法を
用いてもよい。 本発明におけるマルトオリゴ糖は、マルトペン
タオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオ
ースである。置換芳香族Ｒ：
【式】
は、
上記マルトオリゴ糖とその還元性末端にαまた
はβ結合し、グルコシダーゼにより容易に遊離
し、定量が容易なものであればいずれでもよい。
遊離する化合物としては、たとえば２―クロロ―
４―ニトロフエノール、２，６―ジクロロ―４―
ニトロフエノール、２，６―ジプロモ―４―ニト
ロフエノール、２―ブロモ―４―ニトロフエノー
ルなどがある。還元性末端にα結合したもののみ
は溶解性が悪いのに対しβ結合したものは溶解性
がよいので、α―アミラーゼの活性測定を短時間
で簡単に行なうことができる。 本発明に用いる試薬の安定化のため塩化カルシ
ウム等を添加することが好ましい。また、血清中
の抗凝固剤としてしばしば用いられるEDTAが
存在するとアミラーゼは不安定となるが、Ca 2+イ
オンが存在することによつてアミラーゼは安定化
される。 本発明では血清または尿のような試料中のアミ
ラーゼ活性を次の反応によつて測定する。 （２―クロロ―４―ニトロフエニル）マルトペ
ンタオサイド ↓α―アミラーゼ マルトトリオース＋（２―クロロ―４―ニトロ
フエニル）マルトサイド ↓α―グルコシダーゼおよびβ―
グルコシダーゼ グルコース＋２―クロロ―４―ニトロフエノー
ル ↓OH- ２―クロロ―４―ニトロフエノールアニオン λmax400nm 通常すべての酵素反応におけるように反応溶液
を一定のPH、一定の濃度に保持する。 本発明では式（）で表わされる基質のうち、
Ｒが糖の還元末端とβ結合している基質を使用す
ることが必要であり、その量は全基質の50〜100
モル％である。全基質の50モル％未満であると基
質の溶解性が劣る。 本発明に用いる該置換芳香族基Ｒ：
はβ結合し、グルコシダーゼにより容易に遊離
し、定量が容易なものであればいずれでもよい。
遊離する化合物としては、たとえば２―クロロ―
４―ニトロフエノール、２，６―ジクロロ―４―
ニトロフエノール、２，６―ジプロモ―４―ニト
ロフエノール、２―ブロモ―４―ニトロフエノー
ルなどがある。還元性末端にα結合したもののみ
は溶解性が悪いのに対しβ結合したものは溶解性
がよいので、α―アミラーゼの活性測定を短時間
で簡単に行なうことができる。 本発明に用いる試薬の安定化のため塩化カルシ
ウム等を添加することが好ましい。また、血清中
の抗凝固剤としてしばしば用いられるEDTAが
存在するとアミラーゼは不安定となるが、Ca 2+イ
オンが存在することによつてアミラーゼは安定化
される。 本発明では血清または尿のような試料中のアミ
ラーゼ活性を次の反応によつて測定する。 （２―クロロ―４―ニトロフエニル）マルトペ
ンタオサイド ↓α―アミラーゼ マルトトリオース＋（２―クロロ―４―ニトロ
フエニル）マルトサイド ↓α―グルコシダーゼおよびβ―
グルコシダーゼ グルコース＋２―クロロ―４―ニトロフエノー
ル ↓OH- ２―クロロ―４―ニトロフエノールアニオン λmax400nm 通常すべての酵素反応におけるように反応溶液
を一定のPH、一定の濃度に保持する。 本発明では式（）で表わされる基質のうち、
Ｒが糖の還元末端とβ結合している基質を使用す
ることが必要であり、その量は全基質の50〜100
モル％である。全基質の50モル％未満であると基
質の溶解性が劣る。 本発明に用いる該置換芳香族基Ｒ：
【式】
が還元性末端に結合したマルトオリゴ糖は、上記
置換芳香族化合物とマルトオリゴ糖を通常の方法
に従つて合成する。化学的にはマルトオリゴ糖を
アセチル化し、このアセチル化マルトオリゴ糖と
置換芳香族化合物を結合させた後、脱アセチルす
ることにより合成できる（実験化学講座第24巻第
304頁、1958年参照）。生化学的にはサイクロデキ
ストリングリコシルトランスフエラーゼと置換芳
香族化合物と可溶性デンプン（またはα―サイク
ロデキストリンまたは白色デキストリン）を反応
させて、合成できる。 本発明に使用するα―グリコシダーゼは動物、
植物、微生物など如何なる起源のものを用いても
よいが、特に酵母から得たものがその基質特異性
の点で好ましい。すなわち、酵母起源のα―グル
コシダーゼはアグリコン特異性が広く、さらにマ
ルトトリオシド以下のグリコシドにはよく作用す
るが、マルトテトラオシド以上のグリコシドには
作用しない点で特に本発明の目的に適合してい
る。β―グルコシダーゼも如何なる起源のものを
用いてもよく、例えばアーモンドから得たものが
使用できる。 （効果） 本発明では基質として置換芳香族基Ｒ（ハロゲ
ン化ニトロフエニル基）が還元性末端にβ結合し
たマルトオリゴ糖を使用することにより、解裂し
たアグリコンは血中又は尿中α―アミラーゼの至
適PHであるPH6.6〜7.0においてモル吸光度係数が
大きく、また微量のPHの変化でもモル吸光係数の
変化は小さい。さらに中性付近において温度変化
によるモル吸光係数の変化が小さく、塩化ナトリ
ウムの量、アルブミンの量の変化による吸光係数
の変化が小さい。 したがつて、本願発明では血中又は尿中のα―
アミラーゼを充分高い感度で測定することが可能
となる。さらに基質の溶解性が優れるので短時間
に簡単に測定することができる。 本発明は、自動分析機にも容易にかけられる優
れた方法である。 （実施例） 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。 実施例 １ ２―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペンタ
オシド（α体／β体＝50／50、モル比）を50mM
MESバツフアー（PH７）に溶解させて4mMの基
質溶液を作り、0.5mlをとつた。30単位／mlのα
―グルコシダーゼ、0.005単位／mlのβ―グルコ
シダーゼとなにように50mM MESバツフアー
（PH７）に溶解させた酵素溶液0.5mlをとつた。上
記測定試薬に各種濃度（０〜500ソモギ―単位／
dl）に希釈した血清0.02mlを加え37℃において、
３分後から４分間の吸光度上昇を測定し、１分間
の吸光度変化を求めた。その結果を第１図に示
す。 実施例 ２ 実施例１とほとんど同様であるが、基質に
4mM2―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペン
タオシド（α体／β体＝50／50、モル比）と血清
のかわりに各種濃度（０〜500ソモギ―単位／dl）
に希釈した膵液を用いた点が異なつた。実例１と
同様にして測定した結果を第２図に示す。 比較例 １ 実施例１とほとんど同様であるが基質に4mM2
―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペンタオシ
ドの代わりに4mM4―ニトロフエニルマルトペン
タオシド（α体／β体＝50／50、モル比）を用い
た点が異なつた。実施例１と同様にして測定した
結果を第３図に示す。 第１図および第３図から明らかなように、本願
発明ではα―アミラーゼ濃度に対する１分間の吸
光度変化が比較例に比して大きく、α―アミラー
ゼ活性測定の感度がより高い。 比較例 ２ 実施例２とほとんど同様であるが、基質に
4mM2―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペン
タオシドの代わりに4mM4―ニトロフエニルマル
トペンタオシド（α体／β体＝50／50、モル比）
を用いた点が異なつた。実施例２と同様にして測
定した結果を第４図に示す。 第２図および第４図から明らかなように、本願
発明ではα―アミラーゼ濃度に対する１分間の吸
光度変化が比較例に比して大きく、α―アミラー
ゼ活性測定の感度がより大きい。 実施例 ３ ２―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペンタ
オシド（α体／β体＝50／50、モル比）を50mM
MESバツフアー（PH７）に溶解させた。この基
質溶液に塩化カルシウム（０〜500mg/）を加え
た。実施例１で用いた酵素溶液、1500ソモギー単
位／dlに調整した唾液を加え、37℃において３分
後から４分間の吸光度変化を求め、ソモギー単位
に直した。その結果を第５図に示す。 実施例 ４ 実施例１とほとんど同様であるが、基質に
4mM2，６―ジクロロ―４―ニトロフエニルマル
トペンタオシド（α体／β体＝50／50）を用いた
点が異なつた。実施例１と同様にして測定した結
果を第６図に示す。 実施例 ５ 実施例１とほとんど同様であるが基質に4mM2
―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペンタオサ
シド（β体）を用い、β―グルコシダーゼを0.01
単位／mlとしたところが異なつた。実施例１と同
様にして測定した結果を第７図に示す。 比較例 ３ ４―ニトロフエノールを50mM MESバツフア
ー（PH７）に１×10-2mg/mlになるように溶解さ
せた。２―クロロ―４―ニトロフエノールを
50mM MESバツフアー（PH７）に５×10-3mg/
mlになるように溶解させた。この両液の液温を変
化させて吸光度の変化を調べた。その結果を第８
図に示す。 第８図から明らかなように、本願発明の２―ク
ロロ―４―ニトロフエノール（●―●）では温度
変化に対して吸光度は一定であるが、４―ニトロ
フエノール（×―×）では温度が変化するにつれ
て吸光度が上昇している。 実施例 ６ 実施例１とほとんど同様であるが、基質に
4mM2―クロロ―４―ニトロフエニルマルトヘプ
タオシド（α体／β体＝50／50、モル比）を用い
た点が異なつた。実施例１と同様にして測定した
結果を第９図に示す。 実施例 ７ 実施例１とほとんど同様であるが、基質に
5mM2―クロロ―４―ニトロフエニルマルトヘプ
タオサイド（β体）を用い、β―グルコシダーゼ
を１単位／mlとしたところが異なつた。実施例１
と同様にして測定した結果を第１０図に示す。 比較例 ４ 実施例７とほとんど同様であるが、基質に
5mM2―クロロ―４―ニトロフエニルマルトヘプ
タオサイドの代わりに5mM4―ニトロフエニルマ
ルトヘプタオサイド（β体）を用いた点が異なつ
た。実施例１と同様にして測定した結果を第１１
図に示す。 第１０図および第１１図から明らかなように、
本願発明ではα―アミラーゼ濃度に対する１分間
の吸光度変化が比較例に比して大きく、α―ミラ
ーゼ活性測度の感度がより大きい。
置換芳香族化合物とマルトオリゴ糖を通常の方法
に従つて合成する。化学的にはマルトオリゴ糖を
アセチル化し、このアセチル化マルトオリゴ糖と
置換芳香族化合物を結合させた後、脱アセチルす
ることにより合成できる（実験化学講座第24巻第
304頁、1958年参照）。生化学的にはサイクロデキ
ストリングリコシルトランスフエラーゼと置換芳
香族化合物と可溶性デンプン（またはα―サイク
ロデキストリンまたは白色デキストリン）を反応
させて、合成できる。 本発明に使用するα―グリコシダーゼは動物、
植物、微生物など如何なる起源のものを用いても
よいが、特に酵母から得たものがその基質特異性
の点で好ましい。すなわち、酵母起源のα―グル
コシダーゼはアグリコン特異性が広く、さらにマ
ルトトリオシド以下のグリコシドにはよく作用す
るが、マルトテトラオシド以上のグリコシドには
作用しない点で特に本発明の目的に適合してい
る。β―グルコシダーゼも如何なる起源のものを
用いてもよく、例えばアーモンドから得たものが
使用できる。 （効果） 本発明では基質として置換芳香族基Ｒ（ハロゲ
ン化ニトロフエニル基）が還元性末端にβ結合し
たマルトオリゴ糖を使用することにより、解裂し
たアグリコンは血中又は尿中α―アミラーゼの至
適PHであるPH6.6〜7.0においてモル吸光度係数が
大きく、また微量のPHの変化でもモル吸光係数の
変化は小さい。さらに中性付近において温度変化
によるモル吸光係数の変化が小さく、塩化ナトリ
ウムの量、アルブミンの量の変化による吸光係数
の変化が小さい。 したがつて、本願発明では血中又は尿中のα―
アミラーゼを充分高い感度で測定することが可能
となる。さらに基質の溶解性が優れるので短時間
に簡単に測定することができる。 本発明は、自動分析機にも容易にかけられる優
れた方法である。 （実施例） 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。 実施例 １ ２―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペンタ
オシド（α体／β体＝50／50、モル比）を50mM
MESバツフアー（PH７）に溶解させて4mMの基
質溶液を作り、0.5mlをとつた。30単位／mlのα
―グルコシダーゼ、0.005単位／mlのβ―グルコ
シダーゼとなにように50mM MESバツフアー
（PH７）に溶解させた酵素溶液0.5mlをとつた。上
記測定試薬に各種濃度（０〜500ソモギ―単位／
dl）に希釈した血清0.02mlを加え37℃において、
３分後から４分間の吸光度上昇を測定し、１分間
の吸光度変化を求めた。その結果を第１図に示
す。 実施例 ２ 実施例１とほとんど同様であるが、基質に
4mM2―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペン
タオシド（α体／β体＝50／50、モル比）と血清
のかわりに各種濃度（０〜500ソモギ―単位／dl）
に希釈した膵液を用いた点が異なつた。実例１と
同様にして測定した結果を第２図に示す。 比較例 １ 実施例１とほとんど同様であるが基質に4mM2
―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペンタオシ
ドの代わりに4mM4―ニトロフエニルマルトペン
タオシド（α体／β体＝50／50、モル比）を用い
た点が異なつた。実施例１と同様にして測定した
結果を第３図に示す。 第１図および第３図から明らかなように、本願
発明ではα―アミラーゼ濃度に対する１分間の吸
光度変化が比較例に比して大きく、α―アミラー
ゼ活性測定の感度がより高い。 比較例 ２ 実施例２とほとんど同様であるが、基質に
4mM2―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペン
タオシドの代わりに4mM4―ニトロフエニルマル
トペンタオシド（α体／β体＝50／50、モル比）
を用いた点が異なつた。実施例２と同様にして測
定した結果を第４図に示す。 第２図および第４図から明らかなように、本願
発明ではα―アミラーゼ濃度に対する１分間の吸
光度変化が比較例に比して大きく、α―アミラー
ゼ活性測定の感度がより大きい。 実施例 ３ ２―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペンタ
オシド（α体／β体＝50／50、モル比）を50mM
MESバツフアー（PH７）に溶解させた。この基
質溶液に塩化カルシウム（０〜500mg/）を加え
た。実施例１で用いた酵素溶液、1500ソモギー単
位／dlに調整した唾液を加え、37℃において３分
後から４分間の吸光度変化を求め、ソモギー単位
に直した。その結果を第５図に示す。 実施例 ４ 実施例１とほとんど同様であるが、基質に
4mM2，６―ジクロロ―４―ニトロフエニルマル
トペンタオシド（α体／β体＝50／50）を用いた
点が異なつた。実施例１と同様にして測定した結
果を第６図に示す。 実施例 ５ 実施例１とほとんど同様であるが基質に4mM2
―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペンタオサ
シド（β体）を用い、β―グルコシダーゼを0.01
単位／mlとしたところが異なつた。実施例１と同
様にして測定した結果を第７図に示す。 比較例 ３ ４―ニトロフエノールを50mM MESバツフア
ー（PH７）に１×10-2mg/mlになるように溶解さ
せた。２―クロロ―４―ニトロフエノールを
50mM MESバツフアー（PH７）に５×10-3mg/
mlになるように溶解させた。この両液の液温を変
化させて吸光度の変化を調べた。その結果を第８
図に示す。 第８図から明らかなように、本願発明の２―ク
ロロ―４―ニトロフエノール（●―●）では温度
変化に対して吸光度は一定であるが、４―ニトロ
フエノール（×―×）では温度が変化するにつれ
て吸光度が上昇している。 実施例 ６ 実施例１とほとんど同様であるが、基質に
4mM2―クロロ―４―ニトロフエニルマルトヘプ
タオシド（α体／β体＝50／50、モル比）を用い
た点が異なつた。実施例１と同様にして測定した
結果を第９図に示す。 実施例 ７ 実施例１とほとんど同様であるが、基質に
5mM2―クロロ―４―ニトロフエニルマルトヘプ
タオサイド（β体）を用い、β―グルコシダーゼ
を１単位／mlとしたところが異なつた。実施例１
と同様にして測定した結果を第１０図に示す。 比較例 ４ 実施例７とほとんど同様であるが、基質に
5mM2―クロロ―４―ニトロフエニルマルトヘプ
タオサイドの代わりに5mM4―ニトロフエニルマ
ルトヘプタオサイド（β体）を用いた点が異なつ
た。実施例１と同様にして測定した結果を第１１
図に示す。 第１０図および第１１図から明らかなように、
本願発明ではα―アミラーゼ濃度に対する１分間
の吸光度変化が比較例に比して大きく、α―ミラ
ーゼ活性測度の感度がより大きい。
第１図は基質が２―クロロ―４―ニトロフエニ
ルマルトペンタオシド（α体／β体＝50／50、モ
ル比）の場合の各種濃度の血清と１分間の吸光度
変化との関係を示す。第２図は基質が２―クロロ
―４―ニトロフエニルマルトペンタオシド（α
体／β体＝50／50、モル比）の場合の各種濃度の
膵液と１分間の吸光度変化との関係を示す。第３
図は基質が４―ニトロフエニルマルトペンタオシ
ドの場合の各種濃度の血清と１分間の吸光度変化
との関係を示す。第４図は基質が４―ニトロフエ
ニルマルトペンタオシドの場合の各種濃度の膵液
と１分間の吸光度変化との関係を示す。第５図は
反応液中の塩化カルシウム濃度とアミラーゼ活性
との関係を示す。第６図は基質が２，６―ジクロ
ロ―４―ニトロフエニルマルトシド（α体／β体
＝50／50、モル比）の場合の各種濃度の血清と１
分間の吸光度変化との関係を示す。第７図は基質
が２―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペンタ
オサイド（β体）の場合の各種濃度の血清と１分
間の吸光度変化との関係を示す。第８図は４―ニ
トロフエノールと２―クロロ―４―ニトロフエノ
ールの温度と吸光度の関係を示す。図中、は４
―ニトロフエノール、は２―クロロ―４―ニト
ロフエノールを示す。第９図は基質が２―クロロ
―４―ニトロフエニルマルトヘプタオシド（α
体／β体＝50／50、モル比）の場合の各種濃度の
血清と１分間の吸光度変化との関係を示す。第１
０図は基質が２―クロロ―４―ニトロフエニルマ
ルトヘプタオサイド（β体）の場合の各種濃度の
血清と１分間の吸光度変化との関係を示す。第１
１図は基質が４―ニトロフエニルマルトペンタオ
サイドの場合の各種濃度の血清と１分間の吸光度
変化との関係を示す。
ルマルトペンタオシド（α体／β体＝50／50、モ
ル比）の場合の各種濃度の血清と１分間の吸光度
変化との関係を示す。第２図は基質が２―クロロ
―４―ニトロフエニルマルトペンタオシド（α
体／β体＝50／50、モル比）の場合の各種濃度の
膵液と１分間の吸光度変化との関係を示す。第３
図は基質が４―ニトロフエニルマルトペンタオシ
ドの場合の各種濃度の血清と１分間の吸光度変化
との関係を示す。第４図は基質が４―ニトロフエ
ニルマルトペンタオシドの場合の各種濃度の膵液
と１分間の吸光度変化との関係を示す。第５図は
反応液中の塩化カルシウム濃度とアミラーゼ活性
との関係を示す。第６図は基質が２，６―ジクロ
ロ―４―ニトロフエニルマルトシド（α体／β体
＝50／50、モル比）の場合の各種濃度の血清と１
分間の吸光度変化との関係を示す。第７図は基質
が２―クロロ―４―ニトロフエニルマルトペンタ
オサイド（β体）の場合の各種濃度の血清と１分
間の吸光度変化との関係を示す。第８図は４―ニ
トロフエノールと２―クロロ―４―ニトロフエノ
ールの温度と吸光度の関係を示す。図中、は４
―ニトロフエノール、は２―クロロ―４―ニト
ロフエノールを示す。第９図は基質が２―クロロ
―４―ニトロフエニルマルトヘプタオシド（α
体／β体＝50／50、モル比）の場合の各種濃度の
血清と１分間の吸光度変化との関係を示す。第１
０図は基質が２―クロロ―４―ニトロフエニルマ
ルトヘプタオサイド（β体）の場合の各種濃度の
血清と１分間の吸光度変化との関係を示す。第１
１図は基質が４―ニトロフエニルマルトペンタオ
サイドの場合の各種濃度の血清と１分間の吸光度
変化との関係を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次式 〔式中ｎは０〜８であり、Ｒは
【式】 （ＸおよびＹは少なくとも一方はハロゲン原子
であり、残りは水素原子である）で示される置換
芳香族基であつて、αまたはβ結合で糖の還元性
末端に結合しており、解裂したアグリコンとして
基質とは異なつたスペクトル吸収を示す置換芳香
族基である。〕で表わされる基質のうち、置換芳
香族基Ｒが糖の還元性末端にβ結合した化合物が
50〜100モル％である基質に、α―グルコシダー
ゼおよびβ―グルコシダーゼおよび試料を添加
し、遊離するアグリコンの可視部の吸収を測定す
ることにより、試料中のα―アミラーゼ活性を測
定することを特徴とするα―アミラーゼ活性測定
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11129683A JPS602199A (ja) | 1983-06-21 | 1983-06-21 | α−アミラ−ゼ活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11129683A JPS602199A (ja) | 1983-06-21 | 1983-06-21 | α−アミラ−ゼ活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS602199A JPS602199A (ja) | 1985-01-08 |
| JPH0113840B2 true JPH0113840B2 (ja) | 1989-03-08 |
Family
ID=14557620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11129683A Granted JPS602199A (ja) | 1983-06-21 | 1983-06-21 | α−アミラ−ゼ活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS602199A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0653076B2 (ja) * | 1986-05-28 | 1994-07-20 | 東洋紡績株式会社 | グリコシル化合物加水分解酵素活性測定試薬 |
| US4963479A (en) * | 1986-10-07 | 1990-10-16 | Hoechst Celanese Corporation | Reagent system for an alpha-amylase assay containing aromatic substituted glycoside |
| US5158872A (en) * | 1986-10-07 | 1992-10-27 | Hoechst Celanese Corporation | Aromatic substituted glycoside |
| JPH04305594A (ja) * | 1991-01-04 | 1992-10-28 | Seishin Seiyaku Kk | β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシド |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5312831A (en) * | 1976-07-13 | 1978-02-04 | Du Pont | Nitro aromatic glycoside and process for preparation thereof |
| JPS5425893A (en) * | 1977-07-28 | 1979-02-27 | American Hospital Supply Corp | Quantitative determination of amylase |
| US4145527A (en) * | 1976-07-13 | 1979-03-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nitro aromatic glycosides |
| JPS5753079A (en) * | 1980-09-17 | 1982-03-29 | Toshiba Electric Equip | Table tap |
-
1983
- 1983-06-21 JP JP11129683A patent/JPS602199A/ja active Granted
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5312831A (en) * | 1976-07-13 | 1978-02-04 | Du Pont | Nitro aromatic glycoside and process for preparation thereof |
| US4145527A (en) * | 1976-07-13 | 1979-03-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nitro aromatic glycosides |
| JPS5425893A (en) * | 1977-07-28 | 1979-02-27 | American Hospital Supply Corp | Quantitative determination of amylase |
| JPS5753079A (en) * | 1980-09-17 | 1982-03-29 | Toshiba Electric Equip | Table tap |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS602199A (ja) | 1985-01-08 |
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