JP3627817B2 - α−アミラーゼ活性測定法およびその試薬組成物 - Google Patents
α−アミラーゼ活性測定法およびその試薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3627817B2 JP3627817B2 JP28936793A JP28936793A JP3627817B2 JP 3627817 B2 JP3627817 B2 JP 3627817B2 JP 28936793 A JP28936793 A JP 28936793A JP 28936793 A JP28936793 A JP 28936793A JP 3627817 B2 JP3627817 B2 JP 3627817B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nitrophenyl
- galactopyranosyl
- glucosidase
- amylase activity
- galactosidase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、非還元性末端グルコースの４位または６位の水酸基をβ−ガラクトースで修飾したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質として用いるアミラーゼ活性測定法及びその試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から膵液や尿等の体液中に含有されるα−アミラーゼ活性を測定することにより、各種疾患の診断が行われている。この方法ではα−アミラーゼの活性測定法には、例えばマルトオリゴ糖（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース等）を基質とする方法がある。この方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖とα−グルコシダーゼとを作用させて基質からグルコースを遊離させ、遊離するグルコース量の量を測定することにより、α−アミラーゼの活性を知ることができる。
【０００３】
またマルトオリゴ糖誘導体として、還元性末端グルコースにフェニル基、ナフチル基または、それらの誘導体をアグリコンとして結合させた基質を用いる方法も提案されている。例えば基質としてｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド（特公昭５７−５３０７９号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド（特公昭５７−５３０７９号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（特公昭６２−５０１１９号公報）、２，４−ジニトロマルトペンタオシド（特公昭５９−１３１９９号公報）等が利用されている。これらの基質を使用するとアグリコンが遊離し、遊離したアグリコン、例えばｐ−ニトロフェノールを光学的に測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定することが出来る。
【０００４】
上記方法では、α−グルコシダーゼの作用により、僅かではあるがブランク値が上昇し、その結果、測定値の誤差が大きくなるという欠点が生じ、α−グルコシダーゼと基質とを一液化することは難しいことであった。このような欠点を解消するために、マルトオリゴ糖の非還元性末端のグルコースの４位および／または６位の水酸基を修飾したタイプの基質が市販され利用されるようになった。
最近、上記合成糖より天然糖に近い形のα−アミラーゼの基質として、非還元性末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトース修飾された、β−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体が開発された（特開平３−２６４５９６号公報、特開平５−２０８９８９号公報など） 。
【０００５】
このような基質としては、例えば、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドなどがある。この基質は、追随酵素（α−グルコダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等）の一液化条件において、α−グルコシダーゼの作用を受けず、またその合成が容易であり、水溶性に優れ、かつアミラーゼの作用様式をより純粋に反映するなど多くの利点がある。
通常、臨床診断の場においては血清および尿中のα−アミラーゼを測定し、疾患の有無を判断する。しかしながら、血清および尿中にはβ−ガラクトシダーゼが存在する可能性を有する。具体的に尿中には数ユニット（ＩＵ）存在することが知られている（東京化学同人発行、生化学データブック、第１６０６頁、１９７９年発行） 。
【０００６】
したがって、尿中にβ−ガラクトシダーゼが存在すると、基質であるガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末端グルコースに修飾されたガラクトシル基のβ結合を加水分解し、ガラクトースとマルトオリゴ糖誘導体を生じることになる。生じたマルトオリゴ糖誘導体は、追随酵素であるα−グルコシダーゼの作用を受けることになり、測定のブランク値を上昇させ、その結果、測定値の誤差が大きくなる。このことは非還元性末端グルコースをブロックし、上記追随酵素の作用から基質の分解を阻止するという本来の効果が消失することになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記非還元性末端グルコースがβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質とするアミラーゼ測定方法において、血清や尿などの体液中のβ−ガラクトシダーゼの作用により基質が分解することを抑制し、アミラーゼ活性を正確に測定する方法および試薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料中のα−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法である。
【０００９】
また本発明は還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物である。
【００１０】
本発明において使用する還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖とは、グルコース数が２〜７であるマルトオリゴ糖の還元末端グルコースの１位の水酸基に、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼの追随酵素により加水分解を受けると呈色する色原体をα−結合またはβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ− ガラクトシル基で修飾されたものをいう。
【００１１】
色原体としては、可視部に吸光度を有するものに限定されるものではなく、紫外部に吸光度を有するものや、蛍光測定あるいは発光測定が可能である化合物でもよい。可視部に吸光度を有する色原体としては、置換基としてニトロ基を有するフェノール類、例えば２−クロロ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール等がある。
紫外部に吸光度を有する色原体としては、アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニルアミノ基などがある。
蛍光測定が可能である化合物としては、２−ピリジルアミノ基、３−ピリジルアミノ基、ウンベリフェリル基などがある。
【００１２】
本発明に使用する基質としては、下記式にて示される化合物が例示される。
【００１３】
【化１】
（式中、Ｒ１ およびＲ２ のいずれか一方はβ−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ３ はｐ−ニトロフェニル基またはハロゲン置換ｐ−ニトロフェニル基を示し、ｎは０〜５の整数を示す。）
【００１４】
還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖としては、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオシド、４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−テトラオシドまたは２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトペンタオシド等がある。
【００１５】
還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖としては、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドまたは２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドまたは２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−テトラオシドまたは４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトペンタオシド等が挙げられる。
このような化合物の製造法としては、特開平３−２６４５９６号公報、特開平５−２０８９８９号公報および特願平４−２０９２７７号明細書に記載された方法などがある。
【００１６】
β−ガラクトシダーゼ阻害剤としては、例えばβ−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤またはアミン類、または１ｍＭ以上のカルシウムイオン、ラクトース、ガラクトスタチンが挙げられる。β−チオガラクトシド誘導体としては、例えばイソプロピルチオガラクトシド、等がある。
またキレート剤としては、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−３Ｎａ等がある。
さらにアミン類としては、例えばエタノールアミン、メルカプチルアミン等がある。カルシウムイオンの供給源としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等がある。
【００１７】
本発明に用いるα−グルコシダーゼは、動物、植物または微生物などから得られるα−グルコシダーゼが利用でき、その起源を問わない。
【００１８】
本発明において用いるβ−グルコシダーゼは、植物、微生物などから得られるβ−グルコシダーゼが利用でき、その起源を問わない。
【００１９】
本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物は、上記ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／又はβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含有するものであり、緩衝液のほかに必要に応じてその他の添加物、例えば界面活性剤、塩化ナトリウム等の塩類、蛋白結合防止剤、防腐剤などを含有しても良い。
【００２０】
還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質とする場合、α−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。
【００２１】
還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が２または３のものを基質とする場合、β−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。
【００２２】
還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が４〜７のものを基質とする場合、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。
【００２３】
本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物を用いたα−アミラーゼ活性の測定は、還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料中のα−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定する。生成された色原体は常法に従って測定する。例えば可視部に吸光度を有する化合物であれば、吸光度計により吸光度変化を測定する。
【００２４】
本発明において、体液中のβ−ガラクトシダーゼ活性は以下の方法により測定する。
ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を基質として、β−ガラクトシダーゼの作用より生成するｏ−ニトロフェノールの生成量を４１０ｎｍの吸光度の変化で測定する。１分間の１マイクロモルのｏ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１ユニット（ＩＵ）とする。
【００２５】
β−ガラクトシダーゼの活性測定方法
１．試薬
０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．３ （３７℃）
３．３６Ｍ メルカプトエタノール溶液
３０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 溶液
０．３４ｍＭ ＯＮＰＧ溶液（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）
２．操作方法
下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分予備加温する。
２．５ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．３
０．１ｍｌ メルカプトエタノール溶液
０．１ｍｌ ＭｇＣｌ２ 溶液
０．１ｍｌ ＯＮＰＧ溶液
酵素液を０．１ｍｌ添加し、緩やかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で４１０ｎｍの吸光度変化を２〜３分間記録し、その初期直線部分から、１分間あたりの吸光度変化量を求める。（△ＯＤｔｅｓｔ）
盲検は、酵素液の代わりに酵素希釈液（１．０ｍＭのＭｇＣｌ２ を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３）を０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行って１分あたりの吸光度変化を求める。（△ＯＤｂｌａｎｋ）
【００２６】
３．計算式
【数１】
３．５ ：ｏ−ニトロフェノールの上記測定条件下でのミリモル分子吸光係数 （ｃｍ２／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）
１．０ ：光路長（ｃｍ）
【００２７】
【実施例】
次に実施例および比較例により本発明を更に詳細に説明する。
参考例１
非還元末端グルコースをガラクトースで修飾し基質を使用するα−アミラーゼの活性測定法へのβ−ガラクトシダーゼの影響
２．サンプル
大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを０ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌになるように蒸留水で調製した。
３．検討方法
上記試薬３ｍｌにサンプル０．２５ｍｌを添加し、３７℃において３分間放置した後、４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、１分間あたりの吸光度変化量からα−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響（△ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。その結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
β−ガラクトシダーゼ活性が高くなるのにつれて、測定値（△ＯＤ／ｍｉｎ）が上昇し、α−アミラーゼの活性測定法に対する影響度が大きくなっていることが表１から明らかである。
【００３０】
実施例１
イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その１）
参考例１の試薬に、イソプロピルチオガラクトシドを各種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルとして大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施した。なお、結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
イソプロピルチオガラクトシドの添加濃度を高くするのに従い、測定値は低くなりα−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回避されていることが表２から明らかである。。
【００３３】
実施例２
各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤の効果の検討
参考例１の試薬に、各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤を各種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルとして大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施した。なお、結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】
β−ガラクトシダーゼ阻害剤を添加することにより、測定値は低下しα−アミラーゼ活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は、回避されていることが表３から明らかである。
【００３６】
参考例２
尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定
健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性を上記方法により測定した。結果を表４に示す。
【００３７】
【表４】
【００３８】
健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性は、０〜６ＩＵ／ｌ程度含まれていることがわかった。各種疾患では、高値のβ−ガラクトシダーゼ含有尿検体が存在する可能性は否定できない。
【００３９】
実施例３
イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その２）
健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法により測定した。また、終濃度５ｍＭのイソプロピルチオガラクトシドを添加した試薬でも上記β−ガラクトシダーゼを添加した尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定し、両者の測定値を比較した。また、非還元末端グルコースがガラクトースで修飾されていないマルトオリゴ糖誘導体基質を用いたα−アミラーゼ測定法である、体外診断用医薬品ダイヤカラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡績社製）を対照試薬として用いて同時に尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定した。
α−アミラーゼ活性は、キャリブザイムＰ（国際試薬社製）のα−アミラーゼ活性表示値をもとに各試薬での測定値を補正して、α−アミラーゼ活性値とした。結果を表５に示す。
【００４０】
【表５】
【００４１】
イソプロピルチオガラクトシドを添加しない試薬（比較例）では、α−アミラーゼ活性測定値が、約７ＩＵ／Ｌ程度高く測定されている。
【００４２】
実施例４
カルシウムイオンの効果の検討（その１）
参考例１の試薬に、ＣａＣｌ２ を各種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルとして大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施した。なお、結果を表６に示す。
【００４３】
【表６】
【００４４】
カルシウムイオンの添加濃度を高くするのに従い、測定値は低くなりα−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回避されていることが表６ から明らかである。またカルシウムイオン０．５ｍＭ 以下では影響を回避する効果がなく、１ｍＭ 以上でβ−ガラクトシダーゼの影響を回避する効果があることがわかる。
【００４５】
実施例５
カルシウムイオンの効果の検討（その２）
健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法により測定した。また、終濃度５ｍＭのＣａＣｌ２ を添加した試薬でも上記β−ガラクトシダーゼを添加した尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定し、両者の測定値を比較した。また、非還元末端グルコースがガラクトースで修飾されていないマルトオリゴ糖誘導体基質を用いたα−アミラーゼ測定法である、体外診断用医薬品ダイヤカラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡績社製）を対照試薬として用いて同時に尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定した。
α−アミラーゼ活性は、キャリブザイムＰ（国際試薬社製）のα−アミラーゼ活性表示値をもとに各試薬での測定値を補正して、α−アミラーゼ活性値とした。結果を表７に示す。
【００４６】
【表７】
【００４７】
ＣａＣｌ ２ を添加しない試薬（比較例）では、α−アミラーゼ活性測定値が、約７ＩＵ／Ｌ程度高く測定されている。
【００４８】
上記試薬組成にさらにＣａＣｌ ２ を下表にように各種濃度添加したのち、３ｍｌをとり、サンプルを０．２５ｍｌ添加して、３７℃において３分間放置した後、４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、１分間当たりの吸光度変化量からα−アミラーゼの活性を測定した。その結果を表８に示す。
【００４９】
【表８】
【００５０】
カルシウムイオンの添加濃度を高くするに従い、ＣａＣｌ ２ ０．８ｍＭ以上では測定値が変わらず、α−アミラーゼの活性測定法それ自体へのカルシウムイオンの影響はないことが確認された。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の非還元末端グルコースをβ−ガラクトースで修飾したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質として測定するアミラーゼ活性測定法では、β−ガラクトシダーゼ阻害剤を使用することにより、試料中のβ−ガラクトシダーゼによるガラクトシルマルトオリゴ糖の分解を阻止し、正確に試料中のα−アミラーゼ活性測定方法を提供できる。
さらに本発明では上記利点を有するα−アミラーゼ活性測定試薬組成物を提供できる。
【産業上の利用分野】
本発明は、非還元性末端グルコースの４位または６位の水酸基をβ−ガラクトースで修飾したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質として用いるアミラーゼ活性測定法及びその試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から膵液や尿等の体液中に含有されるα−アミラーゼ活性を測定することにより、各種疾患の診断が行われている。この方法ではα−アミラーゼの活性測定法には、例えばマルトオリゴ糖（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース等）を基質とする方法がある。この方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖とα−グルコシダーゼとを作用させて基質からグルコースを遊離させ、遊離するグルコース量の量を測定することにより、α−アミラーゼの活性を知ることができる。
【０００３】
またマルトオリゴ糖誘導体として、還元性末端グルコースにフェニル基、ナフチル基または、それらの誘導体をアグリコンとして結合させた基質を用いる方法も提案されている。例えば基質としてｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド（特公昭５７−５３０７９号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド（特公昭５７−５３０７９号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（特公昭６２−５０１１９号公報）、２，４−ジニトロマルトペンタオシド（特公昭５９−１３１９９号公報）等が利用されている。これらの基質を使用するとアグリコンが遊離し、遊離したアグリコン、例えばｐ−ニトロフェノールを光学的に測定することにより、α−アミラーゼの活性を測定することが出来る。
【０００４】
上記方法では、α−グルコシダーゼの作用により、僅かではあるがブランク値が上昇し、その結果、測定値の誤差が大きくなるという欠点が生じ、α−グルコシダーゼと基質とを一液化することは難しいことであった。このような欠点を解消するために、マルトオリゴ糖の非還元性末端のグルコースの４位および／または６位の水酸基を修飾したタイプの基質が市販され利用されるようになった。
最近、上記合成糖より天然糖に近い形のα−アミラーゼの基質として、非還元性末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトース修飾された、β−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体が開発された（特開平３−２６４５９６号公報、特開平５−２０８９８９号公報など） 。
【０００５】
このような基質としては、例えば、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドなどがある。この基質は、追随酵素（α−グルコダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等）の一液化条件において、α−グルコシダーゼの作用を受けず、またその合成が容易であり、水溶性に優れ、かつアミラーゼの作用様式をより純粋に反映するなど多くの利点がある。
通常、臨床診断の場においては血清および尿中のα−アミラーゼを測定し、疾患の有無を判断する。しかしながら、血清および尿中にはβ−ガラクトシダーゼが存在する可能性を有する。具体的に尿中には数ユニット（ＩＵ）存在することが知られている（東京化学同人発行、生化学データブック、第１６０６頁、１９７９年発行） 。
【０００６】
したがって、尿中にβ−ガラクトシダーゼが存在すると、基質であるガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末端グルコースに修飾されたガラクトシル基のβ結合を加水分解し、ガラクトースとマルトオリゴ糖誘導体を生じることになる。生じたマルトオリゴ糖誘導体は、追随酵素であるα−グルコシダーゼの作用を受けることになり、測定のブランク値を上昇させ、その結果、測定値の誤差が大きくなる。このことは非還元性末端グルコースをブロックし、上記追随酵素の作用から基質の分解を阻止するという本来の効果が消失することになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記非還元性末端グルコースがβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質とするアミラーゼ測定方法において、血清や尿などの体液中のβ−ガラクトシダーゼの作用により基質が分解することを抑制し、アミラーゼ活性を正確に測定する方法および試薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料中のα−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法である。
【０００９】
また本発明は還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物である。
【００１０】
本発明において使用する還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖とは、グルコース数が２〜７であるマルトオリゴ糖の還元末端グルコースの１位の水酸基に、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼの追随酵素により加水分解を受けると呈色する色原体をα−結合またはβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ− ガラクトシル基で修飾されたものをいう。
【００１１】
色原体としては、可視部に吸光度を有するものに限定されるものではなく、紫外部に吸光度を有するものや、蛍光測定あるいは発光測定が可能である化合物でもよい。可視部に吸光度を有する色原体としては、置換基としてニトロ基を有するフェノール類、例えば２−クロロ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール等がある。
紫外部に吸光度を有する色原体としては、アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニルアミノ基などがある。
蛍光測定が可能である化合物としては、２−ピリジルアミノ基、３−ピリジルアミノ基、ウンベリフェリル基などがある。
【００１２】
本発明に使用する基質としては、下記式にて示される化合物が例示される。
【００１３】
【化１】
【００１４】
還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖としては、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオシド、４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−テトラオシドまたは２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトペンタオシド等がある。
【００１５】
還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖としては、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドまたは２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシドまたは２−クロロ−４−ニトロフェニル ６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−テトラオシドまたは４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトペンタオシド等が挙げられる。
このような化合物の製造法としては、特開平３−２６４５９６号公報、特開平５−２０８９８９号公報および特願平４−２０９２７７号明細書に記載された方法などがある。
【００１６】
β−ガラクトシダーゼ阻害剤としては、例えばβ−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤またはアミン類、または１ｍＭ以上のカルシウムイオン、ラクトース、ガラクトスタチンが挙げられる。β−チオガラクトシド誘導体としては、例えばイソプロピルチオガラクトシド、等がある。
またキレート剤としては、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−３Ｎａ等がある。
さらにアミン類としては、例えばエタノールアミン、メルカプチルアミン等がある。カルシウムイオンの供給源としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等がある。
【００１７】
本発明に用いるα−グルコシダーゼは、動物、植物または微生物などから得られるα−グルコシダーゼが利用でき、その起源を問わない。
【００１８】
本発明において用いるβ−グルコシダーゼは、植物、微生物などから得られるβ−グルコシダーゼが利用でき、その起源を問わない。
【００１９】
本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物は、上記ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／又はβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含有するものであり、緩衝液のほかに必要に応じてその他の添加物、例えば界面活性剤、塩化ナトリウム等の塩類、蛋白結合防止剤、防腐剤などを含有しても良い。
【００２０】
還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をα−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質とする場合、α−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。
【００２１】
還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が２または３のものを基質とする場合、β−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。
【００２２】
還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体をβ−結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖であって、グルコース数が４〜７のものを基質とする場合、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む。
【００２３】
本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物を用いたα−アミラーゼ活性の測定は、還元末端グルコースの１位の水酸基が色原体を結合し、非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基がβ−ガラクトースで修飾されたβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料中のα−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定する。生成された色原体は常法に従って測定する。例えば可視部に吸光度を有する化合物であれば、吸光度計により吸光度変化を測定する。
【００２４】
本発明において、体液中のβ−ガラクトシダーゼ活性は以下の方法により測定する。
ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を基質として、β−ガラクトシダーゼの作用より生成するｏ−ニトロフェノールの生成量を４１０ｎｍの吸光度の変化で測定する。１分間の１マイクロモルのｏ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１ユニット（ＩＵ）とする。
【００２５】
β−ガラクトシダーゼの活性測定方法
１．試薬
０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．３ （３７℃）
３．３６Ｍ メルカプトエタノール溶液
３０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 溶液
０．３４ｍＭ ＯＮＰＧ溶液（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）
２．操作方法
下記反応混液をキュベットに調製し、３７℃で約５分予備加温する。
２．５ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．３
０．１ｍｌ メルカプトエタノール溶液
０．１ｍｌ ＭｇＣｌ２ 溶液
０．１ｍｌ ＯＮＰＧ溶液
酵素液を０．１ｍｌ添加し、緩やかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で４１０ｎｍの吸光度変化を２〜３分間記録し、その初期直線部分から、１分間あたりの吸光度変化量を求める。（△ＯＤｔｅｓｔ）
盲検は、酵素液の代わりに酵素希釈液（１．０ｍＭのＭｇＣｌ２ を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３）を０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行って１分あたりの吸光度変化を求める。（△ＯＤｂｌａｎｋ）
【００２６】
３．計算式
【数１】
１．０ ：光路長（ｃｍ）
【００２７】
【実施例】
次に実施例および比較例により本発明を更に詳細に説明する。
参考例１
非還元末端グルコースをガラクトースで修飾し基質を使用するα−アミラーゼの活性測定法へのβ−ガラクトシダーゼの影響
大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを０ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌになるように蒸留水で調製した。
３．検討方法
上記試薬３ｍｌにサンプル０．２５ｍｌを添加し、３７℃において３分間放置した後、４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、１分間あたりの吸光度変化量からα−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響（△ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。その結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
β−ガラクトシダーゼ活性が高くなるのにつれて、測定値（△ＯＤ／ｍｉｎ）が上昇し、α−アミラーゼの活性測定法に対する影響度が大きくなっていることが表１から明らかである。
【００３０】
実施例１
イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その１）
参考例１の試薬に、イソプロピルチオガラクトシドを各種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルとして大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施した。なお、結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
イソプロピルチオガラクトシドの添加濃度を高くするのに従い、測定値は低くなりα−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回避されていることが表２から明らかである。。
【００３３】
実施例２
各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤の効果の検討
参考例１の試薬に、各種β−ガラクトシダーゼ阻害剤を各種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルとして大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施した。なお、結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
β−ガラクトシダーゼ阻害剤を添加することにより、測定値は低下しα−アミラーゼ活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は、回避されていることが表３から明らかである。
【００３６】
参考例２
尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定
健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性を上記方法により測定した。結果を表４に示す。
【００３７】
【表４】
健常者２０名の尿中のβ−ガラクトシダーゼ活性は、０〜６ＩＵ／ｌ程度含まれていることがわかった。各種疾患では、高値のβ−ガラクトシダーゼ含有尿検体が存在する可能性は否定できない。
【００３９】
実施例３
イソプロピルチオガラクトシドの効果の検討（その２）
健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法により測定した。また、終濃度５ｍＭのイソプロピルチオガラクトシドを添加した試薬でも上記β−ガラクトシダーゼを添加した尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定し、両者の測定値を比較した。また、非還元末端グルコースがガラクトースで修飾されていないマルトオリゴ糖誘導体基質を用いたα−アミラーゼ測定法である、体外診断用医薬品ダイヤカラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡績社製）を対照試薬として用いて同時に尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定した。
α−アミラーゼ活性は、キャリブザイムＰ（国際試薬社製）のα−アミラーゼ活性表示値をもとに各試薬での測定値を補正して、α−アミラーゼ活性値とした。結果を表５に示す。
【００４０】
【表５】
イソプロピルチオガラクトシドを添加しない試薬（比較例）では、α−アミラーゼ活性測定値が、約７ＩＵ／Ｌ程度高く測定されている。
【００４２】
実施例４
カルシウムイオンの効果の検討（その１）
参考例１の試薬に、ＣａＣｌ２ を各種濃度添加し、α−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響度を測定した。サンプルとして大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ２５ＩＵ／ｍｌを用い、比較例１に記載した検定方法に基づき検討を実施した。なお、結果を表６に示す。
【００４３】
【表６】
カルシウムイオンの添加濃度を高くするのに従い、測定値は低くなりα−アミラーゼの活性測定法に対するβ−ガラクトシダーゼの影響は回避されていることが表６ から明らかである。またカルシウムイオン０．５ｍＭ 以下では影響を回避する効果がなく、１ｍＭ 以上でβ−ガラクトシダーゼの影響を回避する効果があることがわかる。
【００４５】
実施例５
カルシウムイオンの効果の検討（その２）
健常者２名の尿に大腸菌由来β−ガラクトシダーゼを１０ＩＵ／ｍｌとなるように添加したサンプルを調製し、尿中α−アミラーゼ活性を参考例１で記載した方法により測定した。また、終濃度５ｍＭのＣａＣｌ２ を添加した試薬でも上記β−ガラクトシダーゼを添加した尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定し、両者の測定値を比較した。また、非還元末端グルコースがガラクトースで修飾されていないマルトオリゴ糖誘導体基質を用いたα−アミラーゼ測定法である、体外診断用医薬品ダイヤカラー・ＡＭＹネオレート（東洋紡績社製）を対照試薬として用いて同時に尿サンプル中のα−アミラーゼ活性を測定した。
α−アミラーゼ活性は、キャリブザイムＰ（国際試薬社製）のα−アミラーゼ活性表示値をもとに各試薬での測定値を補正して、α−アミラーゼ活性値とした。結果を表７に示す。
【００４６】
【表７】
ＣａＣｌ ２ を添加しない試薬（比較例）では、α−アミラーゼ活性測定値が、約７ＩＵ／Ｌ程度高く測定されている。
【００４８】
【００４９】
【表８】
カルシウムイオンの添加濃度を高くするに従い、ＣａＣｌ ２ ０．８ｍＭ以上では測定値が変わらず、α−アミラーゼの活性測定法それ自体へのカルシウムイオンの影響はないことが確認された。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の非還元末端グルコースをβ−ガラクトースで修飾したβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖を基質として測定するアミラーゼ活性測定法では、β−ガラクトシダーゼ阻害剤を使用することにより、試料中のβ−ガラクトシダーゼによるガラクトシルマルトオリゴ糖の分解を阻止し、正確に試料中のα−アミラーゼ活性測定方法を提供できる。
さらに本発明では上記利点を有するα−アミラーゼ活性測定試薬組成物を提供できる。
Claims (5)
- ４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド、より選択されるβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよび、β−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下のカルシウムイオン、ラクトース、ガラクトスタイン、より選択されるβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含む試薬を、試料中のα−アミラーゼに作用させ、生成する色原体を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法。
- ４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド、より選択されるβ−ガラクトシルマルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼおよび、β−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下のカルシウムイオン、ラクトース、ガラクトスタイン、より選択されるβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物。
- ４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオシド、α−グルコシダーゼおよび、β−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下のカルシウムイオン、ラクトース、ガラクトスタイン、より選択されるβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求項２記載のα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物。
- ２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド、β−グルコシダーゼおよび、β−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下のカルシウムイオン、ラクトース、ガラクトスタイン、より選択されるβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求項２記載α−のアミラーゼ活性測定用試薬組成物。
- ２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼおよび、β−Ｄ−チオガラクトシル類、キレート剤、アミン類、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下のカルシウムイオン、ラクトース、ガラクトスタイン、より選択されるβ−ガラクトシダーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求項２記載のα−アミラーゼ活性測定用試薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28936793A JP3627817B2 (ja) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | α−アミラーゼ活性測定法およびその試薬組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28936793A JP3627817B2 (ja) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | α−アミラーゼ活性測定法およびその試薬組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07135998A JPH07135998A (ja) | 1995-05-30 |
| JP3627817B2 true JP3627817B2 (ja) | 2005-03-09 |
Family
ID=17742295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28936793A Expired - Lifetime JP3627817B2 (ja) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | α−アミラーゼ活性測定法およびその試薬組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3627817B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4975221B2 (ja) * | 2001-06-01 | 2012-07-11 | 協和メデックス株式会社 | α−アミラーゼ活性測定用試薬と測定方法 |
-
1993
- 1993-11-18 JP JP28936793A patent/JP3627817B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07135998A (ja) | 1995-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2807949B2 (ja) | α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法 | |
| JP3627817B2 (ja) | α−アミラーゼ活性測定法およびその試薬組成物 | |
| IE45395B1 (en) | Method and test kit for serum amylase assay | |
| JP3075377B2 (ja) | α−アミラーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬 | |
| EP0260414B1 (en) | Method of differential assay for alpha-amylase isozymes and a kit for the same | |
| CA2095200C (en) | Imoroved stable, single-liquid alph-amylase reagent | |
| JP2542251B2 (ja) | 安定な一液性α―アミラ―ゼ検定用試薬 | |
| JPS61502515A (ja) | のう胞性線維症の線毛静態化因子決定方法 | |
| JPS5931699A (ja) | α−アミラ−ゼ活性の測定法 | |
| JP3685268B2 (ja) | α−アミラーゼ活性測定法および測定試薬組成物 | |
| JPH0113840B2 (ja) | ||
| US4990445A (en) | Stable reagent and kinetic assay for alpha-amylase | |
| JPH0824598B2 (ja) | アミラ−ゼ定量用試験試薬 | |
| JP3901990B2 (ja) | α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法 | |
| US5494804A (en) | Differential determination process of α-amylase isoenzyme activities | |
| JPS63305000A (ja) | α−アミラ−ゼ活性の測定試薬 | |
| JP4505651B2 (ja) | 酵素活性の測定方法および測定用試薬キット | |
| JPH02276597A (ja) | 体液中のカルシウム測定方法 | |
| JPS63214193A (ja) | ６−グルコシルマルトオリゴ糖誘導体の製法およびそれを用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 | |
| JP2990753B2 (ja) | 塩素イオン測定用組成物 | |
| JP3120892B2 (ja) | α−アミラーゼの活性測定用試薬 | |
| JPS6150990A (ja) | α―アミラーゼ測定用基質溶液 | |
| JP2000189194A (ja) | α―アミラ―ゼ活性測定試薬及び測定方法 | |
| JPS6365313B2 (ja) | ||
| JPS63109798A (ja) | α−アミラ−ゼの定量法及び定量用試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040902 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041014 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20041118 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20041201 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071217 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081217 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081217 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091217 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091217 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101217 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101217 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111217 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111217 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121217 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121217 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131217 Year of fee payment: 9 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |