JPS61502515A - のう胞性線維症の線毛静態化因子決定方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 のう胞性線維症の線毛静態化因子決定方法発明の背景 本発明は、のう飽性線維症に悩む患者ののう飽性線維症を診断する方法に関する 。特に、本発明は、患者および保因者の体液中に存在するのう飽性線維症の線毛 静態化因子（ｃ　ｉ　１１１ｏｓｔａｔ　１ｃｆａｃｔｏｒ　）　’に検出する ことによってのう飽性線維症を診断する方法に関する。

従来技術の説明 のう飽性線維症（ＣＦ）は、身体中の分泌器官の異常を特徴とする衰弱の激しい 遺伝病である。この病気は、コーカサス人の小児間に最も普遍的に見られる致死 遺伝病である。のう飽性線維症と診断された個体は、通常、２５才までに死亡す る。原因となる遺伝子欠失およびこれによる影響は知られていない。

しかし、欠失遺伝子は、コーカサス人の間に比較的普通に見られる。すなわち、 全住民の約５％が異形接合体の保因者である。

この遺伝は、典型的な常染色体劣性パターンに従うから、のう飽性線維症の同形 接合体は、欠失遺伝子を発現し、病気の症候を示す。他方、のう飽性線維症の異 形接合体は、欠失遺伝子の保因者であるが病気の症候を示さない。

この病気は生命を脅かすものであるから、治療が不可欠である。したがって、正 確で信頼できる診断方法が極めて重要である。しかし、この病気の臨床図は、極 めて変態が多い。ｆた、臨床的認定そのものも診断として信頼できない。のう飽 性線維症に関する色々な生化学的テストの要約は、臨床化学（Ｃ１１ｎ。

Ｃｈｅｍ、　）　２９号、第２０１１頁〜第２０１８頁（１９８３年］のヒーリ ー、エイ・エフその他の論文に示されている。のう飽性線維症の診断に関して、 現在、最も頻繁に使用される方法は、「汗テスト」である。この汗テストにおい て、のう飽性線維症の同形接合体は、汗中に塩分の再吸収異常によって高濃度の 塩化ナトリウムを生じさせる。しかし、のう飽性線維症の異形接合体に対しては 、現在テスト方法がない。

のう飽性線維症に関する他の生化学的テストは、のう飽性線維症の陽性患者の体 液（血液、尿、唾液及びその他）が異常物質を含むという発見に基づいている。

のう飽性線維症の有用な目印と認められたーの異常物質は、線毛静態化因子であ る。

この物質は、能動的に動く線毛の動きを抑制する生物学的特性を有しているので 、のう飽性線維症の線毛静態化因子と名づはられている。この生物学的特性は、 幾つかの線毛生物学的検定法の基礎となる。これらの生物学的検定法は、のう飽 性線維症の庫毛静態化因子を含む体液がカキのえらの線毛、イガイの線毛、ウサ ギの気管の線毛およびその他数多くの線毛糸に及ぼす効果を観察することによっ て、のう飽性線維症を検出する友めに開発されたものである。これらの生物学的 検定法は、それほど精密でもなく定量的でもないが、のう飽性線維症を有する個 体を同定できる。しかし、この生物学的検定法は、時間が長くかかり、取扱いの 難しい方法である。したがって、高度な訓練を受けた要員が必要となるから、線 毛を有する細胞系を使用するこの検定方法は、臨床には適さない。

線毛を有する細胞を使用しての検定は、取扱いが難しいから、のう飽性線維症の 線毛静態化因子を検定する他の方法がめられていた。線毛静態化活性を有するあ る種の化合物（例えば、ポリヒドロキシアミン）が哺乳類抜切り酵素（人体中の グリコゲンの分解過程に重要な酵素）のインヒビタでもあることは卸られていた ので、この枝切り酵素に及ぼすのう飽性線維症の線毛静態化因子の効果が調査さ れた。そして、のう飽性線維症の線毛静態化因子が哺乳類抜切り酵素のインヒビ タであることが認められた。したがって、この線毛静態化因子の酵素阻害特性全 使用する検定方法が開発された。基質としては、ホスホリラーゼ限界デキストリ ンが使用され定（小児科学研究ジャーナル（Ｊ、　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓ 、　）　１０号、第９０７頁〜第９１０頁（１９７６３中のギラード、ピー・ケ イその他の論文）。

上記阻害検定法の他の優れた点は、この方法によって正常な個体から同形接合体 ののう飽性線維症の患者を区別できるだけでなく、同形接合体ののう飽性線維症 の患者から異形接合体ののう飽性線維症の保因者を区別し、同定できそうなこと である。

しかし、上述した文献に記載された検定方法は、幾つかの欠点を有している。す なわち、（ａ）α−アミラーゼの標本を除くために多大な労力を要する標本化処 理をしなければならない、（ｂ）器材をすぐに市場から入手できない、（ｃ）大 規模な臨床的評価が全く行われていない。上述した文献の検定方法に使用された 基質にはα−アミラーゼも作用するので、標本からα−アミラーゼを取除くこと が必要である。さらに、のう飽性線維症の線毛静態化因子は、体液中のα−アミ ラーゼと結合するので（この線毛静態化因子は、α−アミラーゼを阻害しないが ）、その精製は特に多大の労力を要する。これらの問題点から見て、上述の検定 方法は、のう飽性線維症の臨床的診断方法として受入れ難い。しかし、のう飽性 線維症の線毛静態化因子の検出に使用できる臨床的に有用な方法は、これまで皆 無であった。

したがって、のう飽性線維症の臨床的診断にとって有用な、のう飽性線維症の線 毛静態化因子の生化学的分析方法が長い間求められていた。

発明の要約 したがって、本発明の目的は、のう飽性線維症を検出する生化学的方法を提供す ることである。

本発明の他の目的は、のう飽性線維症の線毛静態化因子を検出する生化学的方法 を提供することである。

本発明の他の目的は、のう飽性線維症全保有する患者の体液中ののう飽性線維症 の線毛静態化因子を検出する方法全提供することである。

本発明の他の目的は、体液のサンプルを予じめ精製することなく、のう飽性線維 症の線毛静態化因子全検出する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、のう飽性線維症の遺伝子の保因者の体液中ののう飽性線維 症の線毛静態化因子を検出する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、酵素阻害に基づいてのう飽性線維症を検出する生化学的方 法を提供することである。

本発明の他の目的は、後の発明の説明から明らかになるであろう。

上述した本発明の諸口的は、哺乳類の体液中にのう飽性線維症の線毛静態化因子 が存在することを検出する方法によって達成される。この方法は、活性かのう飽 性線維症の線毛静態化因子によって阻害される−の酵素とこの酵素に触媒されて 化学反応を起しうるとともに哺乳類の体液中の他の酵素に触媒される化学反応に 対して実質的に耐性を有する基質と金哨乳類の体液中で接触させ、測定できる基 質変換速度で基質を上記−の酵素によって変換する工程と、この基質変換速度と のう飽性線維症の線毛静態化因子が存在しない状態での上記−の酵素による基質 変換速度とを比較する工程とから成る。

発明および好適な実施例の詳細な説明 本発明の方法に使用される酵素は、その活性がのう飽性線維症の線毛静態化因子 との接触によって阻害される酵素でなければならない。

どのタイプの酵素も、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼまたはその 他の酵素も使用できる。酵素活性の阻害は、通常、基質の変換速度全モニタし、 この基質の変換速度とインヒビタが存在しない状態での酵素による基質変換速度 と比較することによって検出される。酵素触媒反応の速度をモニタするいずれの 方法も適当なものである。しかし、この速度は、通常、酵素触媒反応による生成 物の生成速度全モニタすることによってめられる。

グルコースのような単糖に対する試験方法の開発は、進んでいるから、酵素とし ては、多糖炭水化物基質の加水分解を触媒する酵素全使用することが望ましい。

したがって、酵素反応の生成物は、当業者に矧られている方法によってすぐに検 出される少糖または単糖であり、また、酵素触媒反応の速度は、生成物の生成速 度をモニタすることにより容易にめることができる。

哺乳類抜切り酵素およびプルラナーゼのような酵素が上述した基準を＃７’Ｃす 。のう飽性線維症の線毛静態化因子がこれらの酵素を阻害するメカニズムは、知 られていない。しかし、多糖に関しては、阻害が競合しない。

補乳類抜切り酵素は、ウサギの筋肉からすでに分離され、１個のポリペプチド鎖 として示されている。このポリペプチド鎖は、それぞれ異なる３個の主結合部位 および互いに異なる２個の触媒部位を有する。上述した枝切り酵素の酵素活性は 、アミ０−１．６−ｆルコシダーゼ／４−グルカノトランスフェラーゼとして説 明できるであろう。のう飽性線維症の線毛静態化因子によって阻害される酵素活 性の通常の基質は、一部減成したグリコーゲン、すなわち、桟付多糖である。こ の桟付多糖は、主ポリマー鎖に結合した１個のダルコース残基のみを残して枝中 の幾つかの糖残基がトランスフェラーゼ活性によって除去された後、形成される ものである。哺乳類抜切り酵素の調製および分離は、分析生化学（Ａｎａｌｙｔ ｉｃａｌ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　４９号、第４７９頁（１９７２）のワグツ 、ティー・イーその他の論文で説明されている。

のう飽性線維症の線毛静態化因子との接触によって阻害される酵素として本発明 者らによって発見された他の適当な酵素は、プルラナーゼである。プルラナーゼ は、エンテロバクタ　アエロシェフ類から得られ、市販されている細菌限界デキ ストリナーゼ（ポリ１−６マルトトリオース・ヒドラーゼ）である。この細菌限 界デキストリナーゼは、プルラン（ポリ１−６マルトトリオース）のみをマルト トリオース単位に分解する。この酵素は、哺乳類抜切り酵素中に見られるような トランスフェラーゼ活性またはグルコシダーゼ活性を持たないグルカナーゼであ る（酵素学的方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第８巻、 第５５５頁〜第５５９頁（１９６６）のペングー、エッチその他の論文）。

のう飽性線維症の線毛静態化因子によって阻害される酵素の基質は、検定に使用 される体液中に存在する酵素類の作用に対して不活性でなければならない。この 基質特性は、不可欠のものである。もしも、上述の基質が検定に使用される体液 中の酵素類の作用を受けるとすれば、これらの酵素類によって生成される反応生 成物は、のう飽性線維症の線毛静態化因子によって阻害できる酵素によって生成 される反応生成物と区別できない。

このような状態では、検定に使用される体液中の酵素類の作用は、明らかに本発 明の酵素阻害検定方法の障害となる。

本発明の検定方法に好適な基質は５．プルランである。プルランは、アウレオバ シジウム　プルランス菌から得られた細胞壁グルカンである。このアウレオバシ ジウム　プルランス菌は、ポリ１−６マルトトリオ一ス単位によって構成されて いる。マルトトリオース単位間の結合は、１−６であるから、プルラ／の分岐点 と澱粉の分岐点との間にはある種の類似性がある。本発明において利用される、 プルランの新規な特性は、プルランが血清、唾液および尿のような、精製してな い人間の体液中に存在する人間アミラーゼによって分解されないという事実であ る。したがって、プルランは、精製してない人間の体液を使用するのう飽性線維 症の炭水化物基礎診断試験方法にとって特に有用な基質である。

マルトトリオース中の３個のグルコース残基間の結合はｌ−４であり、マ友、プ ルラン中のマルトトリオース残基間の結合は１−６であるから、プルラナーゼは 、プルランをマルトトリオース単位まで分解し、それ以上には分解しない。マル トトリオースが存在していることを検出するためには、マルターゼのようなα− グルコシダーゼとの接触によりマルトトリオースをさらにそのグルコース成分に まで加水分解するとよい。この加水分解によって生成されるグルコースは、グル コース／ペルオキシダーゼ反応（５０Ｑ　ｎｍで吸光）（臨床生化学（ＣＩｉｎ 。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　６号、第２４頁（１９６９３のトリンダー、ピー・、ア ン・の論文）またはへキンキナーゼ／グルコース−６−リン酸塩デヒドロゲナー ゼ反応（３４０ｎｍで吸光）（臨床化学２０号、第５８６頁、（１９７４）のボ ンダー、アール・ジェイ・エルその他の論文）に基づく通常のグルコース分光測 光分析によって検出できる。存在するグルコースの量を検出し定量する上述の方 法は、当業者に同類である。また、上述の反応を起こさせる試薬は、市販されて おり、例えば、ベンンルバニア州、マルバー７所在のクーパーバイオメディカル 社から入手できる。

他の基質は、マルトデキストリン・ホスホリラーゼ限界デキストリンである。こ の限界デキストリンは、二ノクスその他に発行された米国特許証第４．３０４． ８５４号に開示されているように、マルトデキストリンにマルトデキストリン・ ホスホリラーゼを作用させて得た生成物である。この限界デキストリンは、工業 生産され市販されている。しかし、この基質は、唾液のような哺乳類の体液中に 存在するアミラーゼによって分解される。

したがって、この基質を使用する場合には、アミラーゼおよび不純物として混入 している糖類を除去するために、体液を少なくとも一部精製しなければならない 。

マルトデキストリン・ホスホリラーゼ限界デキストリンは、マルトデキストリン ・ホスホリラーゼ限界デキストリンのα−アミラーゼ消化物を調製するためにさ らにα−アミラーゼによって消化される。この消化物は、アミラーゼの作用に対 して耐性を有し、本発明の検定方法に適した基質となる。このα−アミラーゼ消 化物は、分割され加水分解されて１個の分子となった主長糖鎖を有する。この分 子は、１−４結合よって結合された３個の無水グルコースから成る。この１−４ 結合は、主鎖の中央にある無水グルコース単位に１−６結合された短枝（２個の １−４結合された無水グルコース単位）を有する。消化物は、透析のような通常 の手段を用いて単糖類から精製してもよい。

これにより、本発明の検定方法に適し之アミラーゼ耐性基質を得る。この基質は 、以下の分子式： を有する。分子式中、Ｇ１は、無水グルコース残基金意味し、カリフ内の数字は 、これら残基間の結合個所を示している。

一般に、桟付多糖のα−アミラーゼ限界消化物は、アミラーゼ耐性を有するから 、本発明の検定方法に適する基質である。

のう胞性線維症の純毛静態化因子によって示される酵素阻害度は、この因子が存 在する場合の基質変換速度とこの因子が存在しない場合（例えば、正常個体から 採られた体液を検定する場合）の基質変換速度とを比較することにより測定され る。酵素による変換反応の生成物を検出し定量するために使用される方法は、検 定方法において使用される特定の酵素／基質の組合せによって変わる。

哺乳類抜切り酵素またはプルラナーゼを使用して本発明の好適な方法１に実施す る場合には、阻害できる酵素の基質の余剰量は、適当なｐＨ（例えば、ｐＨ５， ３〜７．１）となるように緩衝剤で処理された水溶液中に溶ける。ｐ　Ｈ６，６ の適当な緩衝液は、５．９ｇのマレイン酸と％　１．９　ｍｇのエチレンジアミ ／テトラ酢酸菌ナトリウム（ＥＤＴＡ）と、１００ｍｔの水とから成る溶液であ る。他の緩衝液として、普通に使用されているｐ　Ｈ６，６のリン酸塩緩衝液を 使用してもよい。基質溶液は、グルコース検出試薬（例えば、上述したグルコー ス・オキシダーゼ反応ま几はへキソキナーゼ反応に基づく試薬）の溶′液と混合 される。

阻害できる酵素（例えば、プルラナーゼま几は哺乳類抜切り酵素）の水溶液は、 １〜５０ミリ単位の酵素を含むように調製される。好適な基質としてプルランを 使用する場合には、酵素溶液は、さらに、０．５６〜２２単位のマルターゼを含 むべきである。一定量の酵素溶液は、一定量（酵素溶液と等量が望ましい）の体 液と混合される。体液は、この体液中ののう胞性線維症の線毛静態化因子による 最大限の酵素阻害を生ずるように成る時間培養され、その間、テストされる。酵 素と基質との間の反応は、酵素／体液混合物と基質／グルコース試薬混合物とを 混合することによって開始される。この反応は、適当な温度（例えば、約３０℃ ）で、かつ、溶液中で有意差のある吸光度が発現するのに必要な時間の間、進行 する。この時間は、試薬の濃度によって３〜３０分間の間で変化する。試薬の濃 度は、有意差のある吸光度の変化が阻害されない標本（正常なもの）に対して比 較的短い間（例えば、３〜１２分）に生ずるように、調整されることが望フしい 。

阻害できる酵素の濃度およびマルターゼの１１１度を調整することによって、阻 害されない標本（のう胞性線維症の線毛静態化因子が存在しないもの）中で、３ 〜６分間の間に吸光度が十分発現し、他方、のう胞性線維症の線毛静態化因子を 含む標本に対して１２〜１５分間またはこれより長い時間の間に有意差のある吸 光度が生じないようにすることができる。

本発明の検定方法を実施するための試薬を含む器材一式を準備することも本発明 の範囲内にある。この器材一式には、のう胞性線維症の線毛静態化因子によって 阻害できる酸素を入れた第１の容器と、酵素が作用する基質を入れた第２の容器 とが含まれる。　試薬は、容器中に凍結乾燥された状態で入っていてもよい。上 述の器材一式ヲ使用して本発明の検定方法を実施する場合には、酵素を入れた容 器中に体液が加えられる。ついで、酵素と体液との混合物は、培養される。これ によって、酵素は、体液の標本中に存在しうる線毛静態化因子との接触によって 阻害される状態となる。ついで、酵素と体液との混合物は、酵素の基質を入れた 第２の容器中に加えられ、ついで、適当な時間（例えば、３〜１２分間）培養さ れる。ついで、第２容器中の溶液は、発色するかどうか検査される。しかし、吸 光度を分光測光器によって定量的に測定してもよい。上述の器材一式の好適な実 施例において、第１の容器には、プルラナーゼおよびマルターゼのような、多糖 基質の加水分解を触媒する酵素が入っていてもよい。他方、第２の容器には、プ ルランのように酵素の基質として好適なものが入っていてもよい。また、上述の 器材一式には、対照テストを実施する際に有用な試薬を入れた容くイ （ｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ　）　’！たけ１−デオキシノジリキシン（１−ｄｅ ｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ　）　のような陰性対照試薬を入れてもよい。

この容器によって、実施例１で説明する対照テストが行われる。

本発明は、以下に記載する諸実施例によってさらに説明される。これらの実施例 は、説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１ 本実施例は、酵素の基質としてプルランを使用する場合を示しており、のう胞性 線維症の線毛静態化因子によるプルラナーゼ阻害を説明するものである。

プルランの基質溶液は、ｐＨ約６．６の０．０３モルリン酸塩緩衝液中に余分量 （例えば、２０００ｍｇ）のプルランを溶解させて調製される。ついで、プルラ ンの基質溶液は、適当な割合（例えば、１対３）でグルコース・オキシダーゼ反 応に基づくクルコース決定試薬ト混合すレル（ペンンルバニＭＬマルパーン所在 のクーパーバイオメディカル社から市販されているウォーシントン　スタットザ イム　グルコース（ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＳｔａｔｚｙｍｅ　Ｇｌｕｃｏｓｅ 　）　（５００ｎｍ　）　）。

１　ｍｌについて６８単位のマルターゼ（α−グルコシダーゼ）と１，５単位の プルラナーゼとを含む水溶液が調製される。ついで、４５μｔの酵素浴ｉｋ含む 部分標本と４５μｔの被験体液とが混合される。２５０μｔのプルラン／グルコ ース試薬混合液を加え、全反応体積を３４０μｔにして反応が開始される。

この反応は、３０°Ｃの温度で３〜１２分間進行する。他方、反応溶液の吸光度 は、５００　ｎｍの波長で測定される。

のう飽性線維症の線毛静態化因子（のう飽性線維症の患者から採られたもの）を 含む標本は、３〜１２分間の観察の間にほとんど発色しない。他方、正常個体か ら採られた体ｐ？ｉ、を含む標本は、５００ｎｍで十分な吸光度を示す。このテ ストにおける疑似陽性（体液中の抗生物質および／またはアスコルビン酸のため に生ずると考えられる）に対する確認対照テストは、試薬中のプルランをマルト ースに代えることによって行われる。この確認対照テストは、疑似陽性テストヲ 受けた正常個体に対して標準より低い発色を持続的に示す。他方、のう飽性線維 症の線毛静態化因子を含む標本（しかし、抗生物質もアスコルビン酸も含まない ）は、発色する。

疑似陰性に対する対照テストは、阻害できる酵素（プルラナーゼ）および／また はマルターゼに対するインヒビタを、酵素病の結果として通常生ずる体液標本中 のグルコースのために、色が現われる。この対照テストにおいて、阻害された酵 素は、グルコースを生成しないから、糖尿病でない正常な体液は、発色しない。

他方、糖尿病の体液は、この体液中に元から存在するグルコースのために発色す る。

実施例２ 本実施例は、酵素の基質としてプルラン１［用する場合を示しており、のう飽性 線維症の線毛静態化因子による補乳類抜切り酵素阻害を説明するものである。

プルラナーゼが哺乳類抜切り酵素に代えられた点を除き、実施例１の手順が繰り 返された。正常個体から採られた体液を含む標本の発色率と比較して、のう飽性 線維症の患者から採られた体液を含む標本では、発色の抑制が見られた。疑似陽 性に対する対照テストは、試薬溶液中のプルラ／の代りにマルトースを用いて実 施例１の場合と同一の方法で行われた。

実施例３ 本実施例は、基質としてマルトデキストリン・ホスホリラーゼ限界デキストリン を使用する場合を示しており、のう飽性線維症（７）　８毛静態化因子によるプ ルラナーゼ阻害全説明するものである。

マルトテキストリン・ホスホリラーゼ限界デキストリンの基質溶液は、実施例１ の緩衝液中に余分量（例えば、２ｏｏｏｍｇ）のマルトデキストリン・ホスホリ ラーゼ限界デキストリンを溶解させて調製される。

マルターゼ、プルラナーゼおよび体液を含む標本は、実施例１と同様の方法で調 製される。しかし、基質としてマルトデキストリン・ホスホリラーゼ限界デキス トリンを使用する場合には、体液は、少なくとも部分的に精製されていなければ ならない。これにより、基質を分解する虞れのある内在性アミラーゼが除去嘔れ る。

反応は、実施例１と同様に行われ、観測される。正常個体から採られた体液を含 む標本の発色率と比較して、のう飽性線維症の患者から採られた体液を含む標本 の発色率の抑制が見られた。疑似陽性に対する確認対照テストは、試薬溶液中の マルトデキストリン・ホスホリラーゼ限界デキストリン全マルトースに代え、実 施例１と同様の方法で行われる。

実施例４ 本実施例は、基質としてマルトデキストリン・ホスホリラーゼ限界デキストリン ｅＰ用する場合金示しており、のう飽性線維症の線毛静態化因子による輔乳類抜 切り酵素阻害を説明するものである。

実施例３で使用されたプルラナーゼが哺乳類抜切り酵素に代えられた点を除き、 実施例３の手順が繰り返された。正常個体から採られた体液ヲ含む標本の発色率 と比較して、のう飽性線維症の患者から採られた体液を含む標本では、発色の抑 制が見られた。疑（ＬＳＩ陽性に対する対照テストは、試薬溶液中のプルランの 代りにマルトースを用いて実施例１の場合と同一の方法で行われた。

実施例５ 本実施例は、のう飽性線維症の線毛静態化因子の精製調製物を使用する場合を示 しており、のう飽性線維症の線毛静態化因子によるプルラナーゼ阻害全説明する ものである。

のう飽性線維症の線毛静態化因子は、公開さ・れた科学文献（小児科学研究１２ 号、第１０８〜第１１４頁（１９７８１のインペロ、ジエイ・イーの論文）に記 載された親和法およびクロマトグラフィー法によって精製された。対照テスト用 の標本は、正常個体から採られた体液を同精製法で処理することによって調製さ れた。精製された体液の一定量（４０μｔ）が２０μｔのプルラナーゼ（２，９ 単位１．１０μｔのマルトース（０，５６単位）、および１０ｍｇ／ｍｔのプル ランｆ含みｐ　Ｈ６，６の８０μｔの緩衝液とともに前培養された。この場合の 全反応体積は、１１５０μｔであった。標本は、３０℃の温度で１５分間培養さ れた。反応は、反応管’ｔ、１００℃の熱ブＯ−／り中に１分間入れることによ って停止された。ついで、標本は、冷却された。

グルコースの生成は、ヘキソキナーゼをペースとする１ｍｔのグルコース試薬を 加えることによってモニタされた。吸光度の変化は、実施例１に記載された方法 によって測定された。正常個体から採られた体液金倉む標本と比較して、のう飽 性線維症の線毛静態化因子を含む標本では、グルコースの生成景が減少している ことが認められた。

実施例６ 本実施例は、のう飽性線維症の線毛静態化因子の精製調製物全使用する場合を示 しており、のう飽性線維症の線毛静態化因子による哺乳類抜切り酵素阻害を説明 するものである。

のう飽性線維症の線毛静態化因子は、実施例５で記載した通常の親和法およびク ロマトグラフィー法によって精製された。

対照テスト用の標本は、正常と考えられる個体から採られた体液を同精製法で処 理することによって調製された。各標本および各対照テスト用標本の一定量（４ ０μｔ）が、１０μｔのマルターゼ（０，５６単位）を含む補乳類抜切り酵素溶 液の２０μＬとともに前培養された。ついで、前培養溶液は、ｐＨ６，６の緩衝 液中で、８０μｔのマルトデキストリン・ホスホリラーゼ限界デキストリンの基 質溶液に加えられた。標本は、３０℃の温度で１５分間培養された。ついで、反 応は、反応管を、１００°Ｃの熱ブロック中に１分間入れることによって停止さ れた。ついで、標本は、室温まで冷却された。生成されたグルコースは、実施例 １に記載されたようにヘキソキナーゼをベースとする１ｍｌのグルコース試薬を 加えることによって決定された。

対照テスト用の標本と比較して、のう飽性線維症の線毛静態化因子を含む標本は 、グルコースの生成が抑制されていることを示した。

実施例７ 本実施例は、のう胞性線維症の線毛静態化因子の精製調製物を使用する場合を示 １〜ており、のう胞性線維症の線毛静態化因子による噴孔頌抜切り酵素阻害を説 明するものである。

酵素の基質としてマルトデキストリン・ホスホリラーゼ限界デキストリンの代り にグルランが使用された点を除き、実施例６の千１１Ｅ＋が繰り返された。

対照テスト用の標本と比較して、のう胞性線維症の線毛静態化因子を含む標本は 、グルコースの生成が抑制されていることを示した。

実施例８ 本実施例は、のう胞性線維症の線毛静態化因子の精製調製物を使用する場合を示 しており、のう胞性線維症の線毛静態化因子によるプルラナーゼ阻害を説明する ものである。

哺乳類抜切り酵素の代りにプルラナーゼが使用された点を除き、実施例６の手順 が繰り返された。

対照テスト用の標本と比較して、のう胞性線維症の線毛静態化因子を含む標本は 、グルコースの生成が抑制されていることを示した。

以上の通り、本発明は、完全に記載された。本発明の趣旨および範囲から外れな いで、多くの変形例を作りうろことは、当業者にとって明らかである。

国際調査報告 Ｉ噂自−＾−−−−１轍ＰＣＴ１０Ｓ８５１０１２３１ＰＣＴ１０５８５１０１ ２３ユ ＵＪ、　ｃＬ２１０，１３１０．５１４１５４，５１１．５３６／１．Ｌ、１０ ３，１１４

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．活性がのう胞性線維症の線毛静態化因子によって阻害される一の酵素とこの 酵素に触媒されて化学反応を起しうるとともに哺乳類の体液中の他の酵素に触媒 される化学反応に対して耐性を有する基質とを哺乳類の体液中で接触させ、測定 できる基質変換速度で基質を上記一の酵素によって変換する工程と、上記基質変 換速度とのう胞性線維症の線毛静態化因子が存在しない状態での上記一の酵素に よる基質変換速度とを比較する工程と から成る哺乳類の体液中ののう胞性線維症の線毛静態化因子の存在を検出する方 法。
2. ２．上記酵素がプルラナーゼであることを特徴とする請求の範囲第１項の方法。
3. ３．上記酵素が哺乳類枝切り酵素であることを特徴とする請求の範囲第１項の方 法。
4. ４．基質がアミラーゼ耐性多糖であることを特徴とする請求の範囲第１項の方法 。
5. ５．アミラーゼ耐性多糖がブルランであることを特徴とする請求の範囲第４項の 方法。
6. ６．アミラーゼ耐性多糖がマルトトリオース・ホスホリラーゼ限界デキストリン のα−アミラーゼ消化物であることを特徴とする請求の範囲第４項の方法。
7. ７．アミラーゼ耐性多糖が分子式：▲数式、化学式、表等があります▼（ただし 、Ｇ１は、無水グルコース残基を意味し、カッコ内の数字は、これらの残基間の 結合個所を示す）を有することを特徴とする請求の範囲第６項の方法。
8. ８．活性がのう胞性線維症の線毛静態化因子によって阻害される酵素を含む第１ の組成物と、 この酵素に触媒されて化学反応を起しうるとともに体液中の他の酵素に触媒され る化学反応に対して耐性を有する基質を含む第２の組成物と から成る哺乳類の体液中ののう胞性線維症の線毛静態化因子を決定する試薬組成 物。
9. ９．上記酵素がプルラナーゼであることを特徴とする請求の範囲第８項の組成物 。
10. １０．上記酵素が哺乳類枝切り酵素であることを特徴とする第８項の請求の範囲 第８項の組成物。
11. １１．基質がアミラーゼ耐性多糖であることを特徴とする請求の範囲第８項の組 成物。
12. １２．アミラーゼ耐性多糖がプルランであることを特徴とする請求の範囲第１１ 項の組成物。
13. １３．第１の組成物がマルターゼを含むことを特徴とする請求の範囲第８項の組 成物。
14. １４．第２の組成物がグルコース検出試薬を含むことを特徴とする請求の範囲第 ８項の組成物。
15. １５．活性がのう胞性線維症の線毛静態化因子によって阻害される酵素を入れた 第１の容器と、 この酵素に触媒されて化学反応を起しうるとともに体液中の他の酵素に触媒され る化学反応に対して耐性を有する基質を入れた第２の容器と から成る哺乳類の体液中ののう胞性線維症の線毛静態化因子を決定する器材一式 。
16. １６．上記酵素がプルラナーゼであることを特徴とする請求の範囲第１５項の器 材一式。
17. １７．上記酵素が哺乳類枝切り酵素であることを特徴とする請求の範囲第１５項 の器材一式。
18. １８．基質がアミラーゼ耐性多糖であることを特徴とする請求の範囲第１５項の 器材一式。
19. １９．アミラーゼ耐性多糖がプルランであることを特徴とする請求の範囲第１８ 項の器材一式。
20. ２０．第１の容器にマルターゼが入っていることを特徴とする請求の範囲第１５ 項の器材一式。
21. ２１．第２の容器にグルコース検出試薬が入っていることを特徴とする請求の範 囲第１５項の器材一式。
22. ２２．マルトースを入れた第３の容器が含まれることを特徴とする請求の範囲第 １５項の器材一式。
23. ２３．ノジリマイシシンおよび１−デオキシノジリマイシンから成るグループか ら選択された酵素インヒビタを入れた第３の容器が含まれることを特徴とする請 求の範囲第１５項の器材一式。
24. ２４．マルトデキストリン・ホスホリラーゼ限界テキストリンのα−アミラーゼ 消化物を有する、のう胞性線維症の線毛静態化因子の酵素的検定方法用アミラー ゼ耐性基質。
25. ２５．分子式：▲数式、化学式、表等があります▼（ただし、Ｇ１は、無水グル コース残基を意味し、カッコ内の数字は、これらの残基間の結合個所を示す）を 有する、のう胞性線維症の線毛静態化因子の酵素的検定方法用アミラーゼ耐性基 質。