JPH06315399A - α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法 - Google Patents
α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法Info
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- JPH06315399A JPH06315399A JP4300103A JP30010392A JPH06315399A JP H06315399 A JPH06315399 A JP H06315399A JP 4300103 A JP4300103 A JP 4300103A JP 30010392 A JP30010392 A JP 30010392A JP H06315399 A JPH06315399 A JP H06315399A
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 一般式 （Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクト
ピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ3 はα−ア
ミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グ
ルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能
な物質となる基を示し、ｎは０〜２の整数を示す。）で
表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を含
有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬、およびこの試
薬を用いるα−アミラーゼ活性測定方法。 【効果】 追随酵素が不要であって、基質が追随酵素に
よる酵素分解を受けないため安定であり、かつ基質とα
−アミラーゼの親和性が高い高感度のアミラーゼ活性測
定試薬および測定方法を提供することができる。
ピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ3 はα−ア
ミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グ
ルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能
な物質となる基を示し、ｎは０〜２の整数を示す。）で
表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を含
有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬、およびこの試
薬を用いるα−アミラーゼ活性測定方法。 【効果】 追随酵素が不要であって、基質が追随酵素に
よる酵素分解を受けないため安定であり、かつ基質とα
−アミラーゼの親和性が高い高感度のアミラーゼ活性測
定試薬および測定方法を提供することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なα−アミラーゼ
活性測定用試薬およびα−アミラーゼ活性測定方法に関
する。さらに詳しくは非還元末端グルコースの４位ある
いは６位にβ−ガラクトピラノシル基を有するグルコー
ス数が２〜４個のマルトオリゴ糖誘導体を基質とし、追
随酵素を使用しないα−アミラーゼ活性測定用試薬、な
らびに当該試薬を用いるα−アミラーゼ活性測定方法に
関する。
活性測定用試薬およびα−アミラーゼ活性測定方法に関
する。さらに詳しくは非還元末端グルコースの４位ある
いは６位にβ−ガラクトピラノシル基を有するグルコー
ス数が２〜４個のマルトオリゴ糖誘導体を基質とし、追
随酵素を使用しないα−アミラーゼ活性測定用試薬、な
らびに当該試薬を用いるα−アミラーゼ活性測定方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から膵液や尿などの体液に含有され
るα−アミラーゼの活性を測定することにより各種疾患
の診断が行われている。このようなα−アミラーゼの活
性測定法には、例えば次のような方法がある。 （１）マルトオリゴ糖（マルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオースなど）を基質とする方
法：この方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マルト
オリゴ糖とα−グルコシダーゼ等の追随酵素とを作用さ
せて基質からグルコースを遊離させ、グルコースの量を
測定することにより、α−アミラーゼの活性値を知る。
生成したグルコースを測定する方法としては、グルコー
スオキシターゼ／パーオキシダーゼ／色素系を利用する
測定法、ヘキソキナーゼ／グルコース−６−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼを利用する測定法またはヘキソキナ
ーゼ／ホスフォグルコムターゼ／グルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ系を利用する測定
法などがある。しかしながら、これらの方法ではα−グ
ルコシダーゼが僅かではあるが基質に作用し、ブランク
値が上昇するためα−グルコシダーゼと基質とを一液化
した試薬とすることが困難である。
るα−アミラーゼの活性を測定することにより各種疾患
の診断が行われている。このようなα−アミラーゼの活
性測定法には、例えば次のような方法がある。 （１）マルトオリゴ糖（マルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオースなど）を基質とする方
法：この方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マルト
オリゴ糖とα−グルコシダーゼ等の追随酵素とを作用さ
せて基質からグルコースを遊離させ、グルコースの量を
測定することにより、α−アミラーゼの活性値を知る。
生成したグルコースを測定する方法としては、グルコー
スオキシターゼ／パーオキシダーゼ／色素系を利用する
測定法、ヘキソキナーゼ／グルコース−６−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼを利用する測定法またはヘキソキナ
ーゼ／ホスフォグルコムターゼ／グルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ系を利用する測定
法などがある。しかしながら、これらの方法ではα−グ
ルコシダーゼが僅かではあるが基質に作用し、ブランク
値が上昇するためα−グルコシダーゼと基質とを一液化
した試薬とすることが困難である。
【０００３】（２）マルトオリゴ糖の還元性末端にフェ
ニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコ
ンとして結合させた誘導体を基質とする方法：これらの
方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖
誘導体と必要に応じα−グルコシダーゼ等の追随酵素を
作用させて基質からアグリコンを遊離させ、遊離したア
グリコンの量を光学的に測定することにより、α−アミ
ラーゼの活性を測定することができる。このような測定
法としては、例えば基質としてｐ−ニトロフェニルマル
トペンタオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシ
ド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド、２，４−
ジクロロフェニルマルトペンタオシド、２−クロロ−４
−ニトロフェニルマルトペンタオシドなどを用いる測定
法がある。しかしながら、これらの方法においてもα−
グルコシダーゼが僅かではあるが基質に作用し、ブラン
ク値が上昇するという欠点がある。また、上記（１）お
よび（２）の方法ではα−グルコシダーゼの基質分解作
用のため、α−グルコシダーゼと基質とを一液化するこ
とは、試薬としての安定性が損なわれるため好ましくな
い。さらに、いずれの場合も追随酵素が必要であるので
高コストとなってしまう欠点がある。
ニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコ
ンとして結合させた誘導体を基質とする方法：これらの
方法では、α−アミラーゼ含有試料に該マルトオリゴ糖
誘導体と必要に応じα−グルコシダーゼ等の追随酵素を
作用させて基質からアグリコンを遊離させ、遊離したア
グリコンの量を光学的に測定することにより、α−アミ
ラーゼの活性を測定することができる。このような測定
法としては、例えば基質としてｐ−ニトロフェニルマル
トペンタオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシ
ド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド、２，４−
ジクロロフェニルマルトペンタオシド、２−クロロ−４
−ニトロフェニルマルトペンタオシドなどを用いる測定
法がある。しかしながら、これらの方法においてもα−
グルコシダーゼが僅かではあるが基質に作用し、ブラン
ク値が上昇するという欠点がある。また、上記（１）お
よび（２）の方法ではα−グルコシダーゼの基質分解作
用のため、α−グルコシダーゼと基質とを一液化するこ
とは、試薬としての安定性が損なわれるため好ましくな
い。さらに、いずれの場合も追随酵素が必要であるので
高コストとなってしまう欠点がある。
【０００４】（３）マルトオリゴ糖の還元性末端にフェ
ニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコ
ンとして結合させたマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末
端のグルコースの４位および／または６位のヒドロキシ
ル基が何らかの手段で修飾された誘導体を基質とする方
法：これらの方法も、（２）と同じく、α−アミラーゼ
含有試料に該マルトオリゴ糖誘導体と必要に応じα−グ
ルコシダーゼ等の追随酵素を作用させて基質からアグリ
コンを遊離させ、遊離したアグリコンの量を光学的に測
定することにより、α−アミラーゼの活性を測定するも
のである。具体例としては、非還元性末端グルコースの
６位のヒドロキシル基がハロゲン、グルコピラノシル基
などで修飾されたタイプの基質（例えば、特開昭６０−
２３７９９８号公報）、あるいは４位および６位のヒド
ロキシル基をアルキル基、アルコイル基またはフェニル
基で置換したタイプの基質（例えば、特開昭６０−５４
３９５号公報、特開昭１−１５７９９６号公報）あるい
は４位または６位のヒドロキシル基をβ−ガラクトピラ
ノシル基で置換したタイプの基質（特開平３−２６４５
９６号公報）などがある。これらの方法においては、マ
ルトオリゴ糖の非還元性末端のグルコ−スのヒドロキシ
ル基が修飾されているため、上記（１）、（２）の方法
にみられるような、α−グルコシターゼが僅かではある
が基質に作用しブランク値が上昇する、という欠点は理
論上は回避されている。しかしながら実用上において
は、これらの基質を用いた場合でも、非還元末端が修飾
されていない不純物が若干含まれるために、多少のブラ
ンク値の上昇は避けられない。さらに、上記（３）の基
質を用いる方法も追随酵素が必要であり高コストになっ
てしまうという問題がある。
ニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコ
ンとして結合させたマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末
端のグルコースの４位および／または６位のヒドロキシ
ル基が何らかの手段で修飾された誘導体を基質とする方
法：これらの方法も、（２）と同じく、α−アミラーゼ
含有試料に該マルトオリゴ糖誘導体と必要に応じα−グ
ルコシダーゼ等の追随酵素を作用させて基質からアグリ
コンを遊離させ、遊離したアグリコンの量を光学的に測
定することにより、α−アミラーゼの活性を測定するも
のである。具体例としては、非還元性末端グルコースの
６位のヒドロキシル基がハロゲン、グルコピラノシル基
などで修飾されたタイプの基質（例えば、特開昭６０−
２３７９９８号公報）、あるいは４位および６位のヒド
ロキシル基をアルキル基、アルコイル基またはフェニル
基で置換したタイプの基質（例えば、特開昭６０−５４
３９５号公報、特開昭１−１５７９９６号公報）あるい
は４位または６位のヒドロキシル基をβ−ガラクトピラ
ノシル基で置換したタイプの基質（特開平３−２６４５
９６号公報）などがある。これらの方法においては、マ
ルトオリゴ糖の非還元性末端のグルコ−スのヒドロキシ
ル基が修飾されているため、上記（１）、（２）の方法
にみられるような、α−グルコシターゼが僅かではある
が基質に作用しブランク値が上昇する、という欠点は理
論上は回避されている。しかしながら実用上において
は、これらの基質を用いた場合でも、非還元末端が修飾
されていない不純物が若干含まれるために、多少のブラ
ンク値の上昇は避けられない。さらに、上記（３）の基
質を用いる方法も追随酵素が必要であり高コストになっ
てしまうという問題がある。
【０００５】（４）２−クロロ−４−ニトロフェニルマ
ルトトリオシドを基質とする方法（特開昭６３−１８３
５９５号公報） この方法は、追随酵素を必要としないので低コストであ
り、ブランク値上昇も少ないが、感度が不良であるとい
う問題点がある。
ルトトリオシドを基質とする方法（特開昭６３−１８３
５９５号公報） この方法は、追随酵素を必要としないので低コストであ
り、ブランク値上昇も少ないが、感度が不良であるとい
う問題点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来のα
−アミラーゼ活性測定基質の欠点および従来のα−アミ
ラーゼ活性測定試薬の欠点を解消しようとするものであ
り、その目的とするところは、追随酵素が不要であって
（すなわち低コストであり、また基質が追随酵素分解を
受けないため安定である）、かつα−アミラーゼに親和
性が高い高感度のα−アミラーゼ活性測定試薬を提供す
ることにある。また本発明の目的は、追随酵素が不要で
あり、かつ高感度のα−アミラーゼ活性測定方法を提供
することにある。
−アミラーゼ活性測定基質の欠点および従来のα−アミ
ラーゼ活性測定試薬の欠点を解消しようとするものであ
り、その目的とするところは、追随酵素が不要であって
（すなわち低コストであり、また基質が追随酵素分解を
受けないため安定である）、かつα−アミラーゼに親和
性が高い高感度のα−アミラーゼ活性測定試薬を提供す
ることにある。また本発明の目的は、追随酵素が不要で
あり、かつ高感度のα−アミラーゼ活性測定方法を提供
することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、一般式
（Ｉ）
（Ｉ）
【０００８】
【化３】
【０００９】（式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方は
β−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、
Ｒ3 はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介し
て還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたと
き、測定可能な物質となる基を示し、ｎは０〜２の整数
を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、
追随酵素を含有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬に
関する。また本発明は、(a) 一般式（Ｉ）
β−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、
Ｒ3 はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介し
て還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたと
き、測定可能な物質となる基を示し、ｎは０〜２の整数
を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、
追随酵素を含有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬に
関する。また本発明は、(a) 一般式（Ｉ）
【００１０】
【化４】
【００１１】（式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方は
β−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、
Ｒ3 はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介し
て還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたと
き、測定可能な物質となる基を示し、ｎは０〜２の整数
を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を、追随酵
素の非存在下においてα−アミラーゼを含有する試料と
接触させて前記マルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼ
と反応させ、(b) 遊離した測定可能な物質の量を測定す
ることよりなる試料中のα−アミラーゼ活性測定方法に
関する。
β−ガラクトピラノシル基を示し、他方は水素を示し、
Ｒ3 はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介し
て還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたと
き、測定可能な物質となる基を示し、ｎは０〜２の整数
を示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を、追随酵
素の非存在下においてα−アミラーゼを含有する試料と
接触させて前記マルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼ
と反応させ、(b) 遊離した測定可能な物質の量を測定す
ることよりなる試料中のα−アミラーゼ活性測定方法に
関する。
【００１２】本発明におけるマルトオリゴ糖誘導体
（Ｉ）の骨格となるマルトオリゴ糖は、２〜４個の糖か
ら形成される。具体的には、マルトース、マルトトリオ
ースおよびマルトテトラオースである。マルトオリゴ糖
の非還元性末端グルコースの修飾基であるガラクトピラ
ノシル基は、非還元性末端グルコースの４位または６位
の水酸基にβ型で結合している。従来、マルトオリゴ糖
の非還元性末端グルコースの修飾形態としては、非還元
性末端グルコースの６位のヒドロキシル基がグルコピラ
ノシル基で修飾されたタイプの基質、あるいは４位また
は６位のヒドロキシル基をアルキル基、アルコイル基ま
たはフェニル基で置換したタイプの基質などがあるが、
これらの修飾基は天然の基質にはない構造のものであ
り、アミラーゼとの親和性を考慮した場合、ガラクトピ
ラノシル基は前述の修飾基より優れている。
（Ｉ）の骨格となるマルトオリゴ糖は、２〜４個の糖か
ら形成される。具体的には、マルトース、マルトトリオ
ースおよびマルトテトラオースである。マルトオリゴ糖
の非還元性末端グルコースの修飾基であるガラクトピラ
ノシル基は、非還元性末端グルコースの４位または６位
の水酸基にβ型で結合している。従来、マルトオリゴ糖
の非還元性末端グルコースの修飾形態としては、非還元
性末端グルコースの６位のヒドロキシル基がグルコピラ
ノシル基で修飾されたタイプの基質、あるいは４位また
は６位のヒドロキシル基をアルキル基、アルコイル基ま
たはフェニル基で置換したタイプの基質などがあるが、
これらの修飾基は天然の基質にはない構造のものであ
り、アミラーゼとの親和性を考慮した場合、ガラクトピ
ラノシル基は前述の修飾基より優れている。
【００１３】マルトオリゴ糖の還元性末端には、α−ア
ミラーゼによって切断されうる結合を介して還元性末端
グルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可
能な物質となる基Ｒ3 （以後アグリコンともいう）を有
している。Ｒ3 は還元性末端グルコースの１位水酸基に
グリコシド結合を介して結合しており、該グリコシド結
合はα型である。Ｒ3 で表される基としては、例えばｐ
−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、２−クロロ−
４−ニトロフェニル、２，４−ジクロロフェニルなどの
置換フェニル基、４−メチルウンベリフェリルなどの蛍
光性基などが挙げられる。α−アミラーゼの至適ｐＨで
あるｐＨ７付近における測定感度を考慮した場合、２−
クロロ−４−ニトロフェニルが優れている。
ミラーゼによって切断されうる結合を介して還元性末端
グルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可
能な物質となる基Ｒ3 （以後アグリコンともいう）を有
している。Ｒ3 は還元性末端グルコースの１位水酸基に
グリコシド結合を介して結合しており、該グリコシド結
合はα型である。Ｒ3 で表される基としては、例えばｐ
−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、２−クロロ−
４−ニトロフェニル、２，４−ジクロロフェニルなどの
置換フェニル基、４−メチルウンベリフェリルなどの蛍
光性基などが挙げられる。α−アミラーゼの至適ｐＨで
あるｐＨ７付近における測定感度を考慮した場合、２−
クロロ−４−ニトロフェニルが優れている。
【００１４】本発明に使用する一般式（Ｉ）で表される
マルトオリゴ糖誘導体としては、具体的には、一般式
（II）
マルトオリゴ糖誘導体としては、具体的には、一般式
（II）
【００１５】
【化５】
【００１６】（式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびｎは前記と同意
義であり、Ｒ4 は水素、またはハロゲン、炭素原子数１
〜６のアルキル基、−ＯＲ5 および−ＣＯＯＲ5 （Ｒ5
は炭素原子数１〜６のアルキル基を示す）よりなる群か
ら選ばれた置換基を示す。）で表される化合物が挙げら
れる。本明細書においてハロゲンとはフッ素原子、塩素
原子、臭素原子またはヨウ素原子を示す。アルキル基は
直鎖状または分枝鎖状のいずれでもよく、例えばメチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブ
チル、第３級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げら
れ、好ましくは炭素数１〜４である。
義であり、Ｒ4 は水素、またはハロゲン、炭素原子数１
〜６のアルキル基、−ＯＲ5 および−ＣＯＯＲ5 （Ｒ5
は炭素原子数１〜６のアルキル基を示す）よりなる群か
ら選ばれた置換基を示す。）で表される化合物が挙げら
れる。本明細書においてハロゲンとはフッ素原子、塩素
原子、臭素原子またはヨウ素原子を示す。アルキル基は
直鎖状または分枝鎖状のいずれでもよく、例えばメチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブ
チル、第３級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げら
れ、好ましくは炭素数１〜４である。
【００１７】一般式（Ｉ）で表されるマルトオリゴ糖誘
導体としては、さらに具体的には、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、２−クロロ−
４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−α−マルトトリオシド、ｐ−ニトロフェニル ４
−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオ
シド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオシド、ｐ
−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル−α−マルトテトラオシドなどが挙げられる。好まし
くはグルコース数が２であるマルトオリゴ糖誘導体、特
に好ましくは２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドであ
る。
導体としては、さらに具体的には、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、２−クロロ−
４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−α−マルトトリオシド、ｐ−ニトロフェニル ４
−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトトリオ
シド、２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトテトラオシド、ｐ
−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル−α−マルトテトラオシドなどが挙げられる。好まし
くはグルコース数が２であるマルトオリゴ糖誘導体、特
に好ましくは２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドであ
る。
【００１８】本発明で使用するマルトオリゴ糖誘導体
（Ｉ）は、特開平３−２６４５９６号公報に記載の方法
など種々の公知の方法で製造することができる。例え
ば、還元末端グルコースに２−クロロ−４−ニトロフェ
ノールを結合したマルトオリゴ糖誘導体 (III)
（Ｉ）は、特開平３−２６４５９６号公報に記載の方法
など種々の公知の方法で製造することができる。例え
ば、還元末端グルコースに２−クロロ−４−ニトロフェ
ノールを結合したマルトオリゴ糖誘導体 (III)
【００１９】
【化６】
【００２０】（式中、ｎは０〜２の整数を示す。）とラ
クトースをβ−ガラクトシダーゼ共存下に反応させてマ
ルトオリゴ糖誘導体 (III)の非還元性末端にβ−ガラク
トピラノシル基を導入することにより製造することがで
きる。
クトースをβ−ガラクトシダーゼ共存下に反応させてマ
ルトオリゴ糖誘導体 (III)の非還元性末端にβ−ガラク
トピラノシル基を導入することにより製造することがで
きる。
【００２１】また別法としては、マルトース、マルトト
リオース、マルトテトラオースなどのマルトオリゴ糖お
よびラクトースを用いてβ−ガラクトシダーゼによりマ
ルトオリゴ糖の非還元性末端にβ−ガラクトピラノシル
基を導入して合成したガラクトピラノシルマルトオリゴ
糖に、塩基触媒（ピリジンもしくは酢酸ナトリウムな
ど）の存在下、無水酢酸中で室温あるいは加温してアセ
チル化し、ガラクトピラノシルマルトオリゴ糖保護体と
する。次いで無機溶媒の存在下、もしくは無溶媒下、ア
ルカリおよび無水酢酸およびフェノール類、例えば２−
クロロ−４−ニトロフェノールとともに加熱して還元性
末端をフェノール類により修飾し、最後にメタノール
中、触媒量のナトリウムメチラートによる公知の脱保護
反応により、目的であるガラクトピラノシルマルトオリ
ゴ糖誘導体を製造する方法がある。
リオース、マルトテトラオースなどのマルトオリゴ糖お
よびラクトースを用いてβ−ガラクトシダーゼによりマ
ルトオリゴ糖の非還元性末端にβ−ガラクトピラノシル
基を導入して合成したガラクトピラノシルマルトオリゴ
糖に、塩基触媒（ピリジンもしくは酢酸ナトリウムな
ど）の存在下、無水酢酸中で室温あるいは加温してアセ
チル化し、ガラクトピラノシルマルトオリゴ糖保護体と
する。次いで無機溶媒の存在下、もしくは無溶媒下、ア
ルカリおよび無水酢酸およびフェノール類、例えば２−
クロロ−４−ニトロフェノールとともに加熱して還元性
末端をフェノール類により修飾し、最後にメタノール
中、触媒量のナトリウムメチラートによる公知の脱保護
反応により、目的であるガラクトピラノシルマルトオリ
ゴ糖誘導体を製造する方法がある。
【００２２】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬
は、上記マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を基質として含有
し、追随酵素を含有しないことを特徴とする。本発明に
おいて追随酵素とは、非還元性末端からグルコシド結合
を加水分解するエキソグルコシダーゼのことであり、α
−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラ
ーゼなどがこれに含まれる。本発明のα−アミラーゼ活
性測定用試薬は、必要に応じてその他の添加剤を含有し
ていてもよい。添加剤としては界面活性剤、安定化剤、
防腐剤、キレート剤などが挙げられる。また本発明の測
定試薬は基質を溶解した緩衝液も包含してもよい。該緩
衝液としては、ＰＩＰＥＳ緩衝液等のグッド緩衝液をは
じめ、ｐＨ７．０付近に緩衝能を有する各種緩衝液が用
いられる。
は、上記マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を基質として含有
し、追随酵素を含有しないことを特徴とする。本発明に
おいて追随酵素とは、非還元性末端からグルコシド結合
を加水分解するエキソグルコシダーゼのことであり、α
−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラ
ーゼなどがこれに含まれる。本発明のα−アミラーゼ活
性測定用試薬は、必要に応じてその他の添加剤を含有し
ていてもよい。添加剤としては界面活性剤、安定化剤、
防腐剤、キレート剤などが挙げられる。また本発明の測
定試薬は基質を溶解した緩衝液も包含してもよい。該緩
衝液としては、ＰＩＰＥＳ緩衝液等のグッド緩衝液をは
じめ、ｐＨ７．０付近に緩衝能を有する各種緩衝液が用
いられる。
【００２３】本発明のα−アミラーゼ活性測定方法は、
(1) 前記マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を、追随酵素の非
存在下においてα−アミラーゼを含有する試料と接触さ
せて前記マルトオリゴ糖誘導体とα−アミラーゼを反応
させ、(2) 遊離した測定可能な物質の量を測定すること
よりなる。
(1) 前記マルトオリゴ糖誘導体（Ｉ）を、追随酵素の非
存在下においてα−アミラーゼを含有する試料と接触さ
せて前記マルトオリゴ糖誘導体とα−アミラーゼを反応
させ、(2) 遊離した測定可能な物質の量を測定すること
よりなる。
【００２４】マルトオリゴ糖誘導体とα−アミラーゼの
反応は、マルトオリゴ糖誘導体を基質とする従来のα−
アミラーゼ活性測定と同様の条件下で行えばよい。例え
ば反応温度２５〜４０℃、ｐＨ６〜８にて、約１〜２０
分間反応を行う。
反応は、マルトオリゴ糖誘導体を基質とする従来のα−
アミラーゼ活性測定と同様の条件下で行えばよい。例え
ば反応温度２５〜４０℃、ｐＨ６〜８にて、約１〜２０
分間反応を行う。
【００２５】試料中のα−アミラーゼの作用によりマル
トオリゴ糖誘導体から遊離したアグリコンがそれ自体で
吸光度を示す化合物であれば、遊離後、吸光度測定を行
う。またアグリコンが蛍光物質である場合は、遊離後、
蛍光度測定を行う。アグリコンが２−クロロ−４−ニト
ロフェノールである場合は、４００ｎｍ付近における吸
光度の変化を測定する。
トオリゴ糖誘導体から遊離したアグリコンがそれ自体で
吸光度を示す化合物であれば、遊離後、吸光度測定を行
う。またアグリコンが蛍光物質である場合は、遊離後、
蛍光度測定を行う。アグリコンが２−クロロ−４−ニト
ロフェノールである場合は、４００ｎｍ付近における吸
光度の変化を測定する。
【００２６】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬を
使用する測定方法における基質分解の反応式を２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−α−マルトシドを基質とする場合を例にあげ
て説明する。以下の反応式に示すように追随酵素が不要
である。
使用する測定方法における基質分解の反応式を２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−α−マルトシドを基質とする場合を例にあげ
て説明する。以下の反応式に示すように追随酵素が不要
である。
【００２７】
【化７】
【００２８】上記反応にて遊離したアグリコン部分を適
当な手段により測定することによってα−アミラーゼの
活性を測定することができる。上記例では遊離する２−
クロロ−４−ニトロフェノールの吸収スペクトルを直接
測定する。２−クロロ−４−ニトロフェノールの測定方
法としては、α−アミラーゼの反応を連続的に追跡する
レート法および一定時間反応させた後、反応を止めて測
定するエンドポイント法のいずれもが使用されうる。
当な手段により測定することによってα−アミラーゼの
活性を測定することができる。上記例では遊離する２−
クロロ−４−ニトロフェノールの吸収スペクトルを直接
測定する。２−クロロ−４−ニトロフェノールの測定方
法としては、α−アミラーゼの反応を連続的に追跡する
レート法および一定時間反応させた後、反応を止めて測
定するエンドポイント法のいずれもが使用されうる。
【００２９】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は
体液中のα−アミラーゼ活性測定に限らず、α−アミラ
ーゼ活性を測定することにより試料中のカルシウムイオ
ン、塩素イオンなどを測定する方法にも適用可能であ
る。
体液中のα−アミラーゼ活性測定に限らず、α−アミラ
ーゼ活性を測定することにより試料中のカルシウムイオ
ン、塩素イオンなどを測定する方法にも適用可能であ
る。
【００３０】
【発明の効果】本発明の試薬および測定方法は、α−グ
ルコシダーゼあるいはβ−グルコシダーゼあるいはグル
コアミラーゼなどの追随酵素が不要であり、また基質が
これらの追随酵素による酵素分解を受けないため安定で
ある。さらに基質とα−アミラーゼの親和性が高い高感
度のα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法であ
る。本発明で使用する基質は、非還元性末端修飾基がガ
ラクトピラノシル基であるため、澱粉やアミロースなど
のグルコース鎖を認識してその結合を切断するα−アミ
ラーゼの作用様式が純粋に反映されると考えられる。
ルコシダーゼあるいはβ−グルコシダーゼあるいはグル
コアミラーゼなどの追随酵素が不要であり、また基質が
これらの追随酵素による酵素分解を受けないため安定で
ある。さらに基質とα−アミラーゼの親和性が高い高感
度のα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法であ
る。本発明で使用する基質は、非還元性末端修飾基がガ
ラクトピラノシル基であるため、澱粉やアミロースなど
のグルコース鎖を認識してその結合を切断するα−アミ
ラーゼの作用様式が純粋に反映されると考えられる。
【００３１】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明がこれら実施例に限定されるものではな
いことはいうまでもない。 実施例 実施例として後記表１に記載したマルトオリゴ糖誘導体
を基質として用い、下記組成からなるα−アミラーゼ活
性測定試薬をそれぞれ調製した（実施例ＡおよびＢ）。 試薬組成： ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） ＣａＣｌ2 １ｍＭ 基質 ２ｍＭ なお、比較例として後記表１に示した基質を用いて上記
と同様の試薬を調製した（比較例Ａ−１、Ａ−２および
比較例Ｂ−１、Ｂ−２）。
するが、本発明がこれら実施例に限定されるものではな
いことはいうまでもない。 実施例 実施例として後記表１に記載したマルトオリゴ糖誘導体
を基質として用い、下記組成からなるα−アミラーゼ活
性測定試薬をそれぞれ調製した（実施例ＡおよびＢ）。 試薬組成： ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） ＣａＣｌ2 １ｍＭ 基質 ２ｍＭ なお、比較例として後記表１に示した基質を用いて上記
と同様の試薬を調製した（比較例Ａ−１、Ａ−２および
比較例Ｂ−１、Ｂ−２）。
【００３２】
【表１】
【００３３】実験例 α−アミラーゼの活性測定 上記実施例および比較例で調製した各試薬３mlに三種類
の血清１、２および３をそれぞれ0.25ml添加し、３７℃
にて３分間放置したのち、４１５ｎｍにおける吸光度の
変化を測定し、１分間当りの吸光度の変化を算出した。
その結果を表２に示した。なお、表２には試薬ブランク
の１分間当りの吸光度の変化も伴せて記載した。
の血清１、２および３をそれぞれ0.25ml添加し、３７℃
にて３分間放置したのち、４１５ｎｍにおける吸光度の
変化を測定し、１分間当りの吸光度の変化を算出した。
その結果を表２に示した。なお、表２には試薬ブランク
の１分間当りの吸光度の変化も伴せて記載した。
【００３４】
【表２】
【００３５】表２に示したように、実施例Ａと比較例Ａ
−１の比較と、実施例Ｂと比較例Ｂ−１の比較から、β
−ガラクトピラノシル基がα−アミラーゼとの親和性に
優れ、非還元末端の修飾基として好ましいことがそれぞ
れわかる。また、実施例Ａと比較例Ａ−１、Ａ−２との
比較および実施例Ｂと比較例Ｂ−１、Ｂ−２との比較か
ら、本発明の試薬の測定感度が高いことがそれぞれわか
る。
−１の比較と、実施例Ｂと比較例Ｂ−１の比較から、β
−ガラクトピラノシル基がα−アミラーゼとの親和性に
優れ、非還元末端の修飾基として好ましいことがそれぞ
れわかる。また、実施例Ａと比較例Ａ−１、Ａ−２との
比較および実施例Ｂと比較例Ｂ−１、Ｂ−２との比較か
ら、本発明の試薬の測定感度が高いことがそれぞれわか
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 桑原 宣洋 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13番46号 塩 水港精糖株式会社内 (72)発明者 藤田 孝輝 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13番46号 塩 水港精糖株式会社内 (72)発明者 原 浩司 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13番46号 塩 水港精糖株式会社内 (72)発明者 馬島 肇一 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 手嶋 真一 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 林 勇藏 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 東洋紡 績株式会社内
Claims (2)
- 【請求項１】 一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクト
ピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ3 はα−ア
ミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グ
ルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能
な物質となる基を示し、ｎは０〜２の整数を示す。）で
表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を含
有しないα−アミラーゼ活性測定用試薬。 - 【請求項２】 (a) 一般式（Ｉ） 【化２】 （式中、Ｒ1 およびＲ2 のいずれか一方はβ−ガラクト
ピラノシル基を示し、他方は水素を示し、Ｒ3 はα−ア
ミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グ
ルコースに結合し、該結合が切断されたとき、測定可能
な物質となる基を示し、ｎは０〜２の整数を示す。）で
表されるマルトオリゴ糖誘導体を、追随酵素の非存在下
においてα−アミラーゼを含有する試料と接触させて前
記マルトオリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応させ、
(b) 遊離した測定可能な物質の量を測定することよりな
る試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4300103A JP2807949B2 (ja) | 1992-11-10 | 1992-11-10 | α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法 |
| US08/147,717 US5393660A (en) | 1992-11-10 | 1993-11-04 | Reagent for Determining α-amylase activity and method for determining α-amylase activity |
| DE4338375A DE4338375C2 (de) | 1992-11-10 | 1993-11-10 | Verwendung eines Maltooligosaccharidderivats zur Bestimmung der alpha-Amylaseaktivität |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4300103A JP2807949B2 (ja) | 1992-11-10 | 1992-11-10 | α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06315399A true JPH06315399A (ja) | 1994-11-15 |
| JP2807949B2 JP2807949B2 (ja) | 1998-10-08 |
Family
ID=17880753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4300103A Expired - Lifetime JP2807949B2 (ja) | 1992-11-10 | 1992-11-10 | α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5393660A (ja) |
| JP (1) | JP2807949B2 (ja) |
| DE (1) | DE4338375C2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1008853A2 (en) | 1998-12-11 | 2000-06-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Reagent compositions for measuring electrolyte using alpha-amylase |
| JP2002355097A (ja) * | 2001-06-01 | 2002-12-10 | Kyowa Medex Co Ltd | α−アミラーゼ活性測定用試薬と測定方法 |
| US7569208B2 (en) | 1998-09-25 | 2009-08-04 | Tokyo Gas Company Limited | Diagnostic agents for pancreatic exocrine function |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0770165A (ja) * | 1993-06-28 | 1995-03-14 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 非還元性オリゴ糖とその製造方法並びに用途 |
| US5725910A (en) | 1997-02-05 | 1998-03-10 | Eastman Kodak Company | Edge removal apparatus for curtain coating |
| US5763013A (en) | 1997-02-05 | 1998-06-09 | Eastman Kodak Company | Edge removal apparatus including air-flow blocking means for curtain coating |
| JPH11194A (ja) * | 1997-06-13 | 1999-01-06 | Oriental Yeast Co Ltd | 測定用試薬及び測定方法 |
| JPH11299498A (ja) * | 1998-02-19 | 1999-11-02 | Toyobo Co Ltd | アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 |
| JP3087891B2 (ja) | 1998-03-31 | 2000-09-11 | 東洋紡績株式会社 | 電解質測定用試薬組成物 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6078994A (ja) * | 1983-10-06 | 1985-05-04 | Seishin Seiyaku Kk | β−（２−クロロ−４−ニトロフエニル）−マルトペンタオシド及びその製造法 |
| US5158872A (en) * | 1986-10-07 | 1992-10-27 | Hoechst Celanese Corporation | Aromatic substituted glycoside |
| JPS63214193A (ja) * | 1987-03-03 | 1988-09-06 | Sapporo Breweries Ltd | ６−グルコシルマルトオリゴ糖誘導体の製法およびそれを用いるα−アミラ−ゼ活性測定法 |
| JP2886249B2 (ja) * | 1990-03-14 | 1999-04-26 | 日本食品化工株式会社 | ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法 |
| JP3029925B2 (ja) * | 1991-08-26 | 2000-04-10 | 東洋紡績株式会社 | マルトオリゴ糖誘導体およびその製造法 |
| JP3075377B2 (ja) * | 1991-11-06 | 2000-08-14 | 東洋紡績株式会社 | α−アミラーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬 |
-
1992
- 1992-11-10 JP JP4300103A patent/JP2807949B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-11-04 US US08/147,717 patent/US5393660A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-10 DE DE4338375A patent/DE4338375C2/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7569208B2 (en) | 1998-09-25 | 2009-08-04 | Tokyo Gas Company Limited | Diagnostic agents for pancreatic exocrine function |
| EP1008853A2 (en) | 1998-12-11 | 2000-06-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Reagent compositions for measuring electrolyte using alpha-amylase |
| JP2002355097A (ja) * | 2001-06-01 | 2002-12-10 | Kyowa Medex Co Ltd | α−アミラーゼ活性測定用試薬と測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2807949B2 (ja) | 1998-10-08 |
| DE4338375C2 (de) | 2000-05-31 |
| US5393660A (en) | 1995-02-28 |
| DE4338375A1 (de) | 1994-06-23 |
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