JPH11299498A - アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 - Google Patents
アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬Info
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Abstract
せず、かつS型アミラーゼもしくはP型アミラーゼを阻
害する作用を有する抗体を使用する、簡便かつ正確にア
ミラーゼアイソザイム活性を測定する試薬および測定法
を提供する。 【解決手段】 2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−
O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシド、S型アミ
ラーゼ活性もしくはP型アミラーゼを阻害する抗体およ
びチオシアン酸塩および/またはアジ化塩を含むことを
特徴とするアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬およ
びP型アミラーゼまたはS型アミラーゼアイソザイム測
定法。
Description
アイソザイム活性測定用試薬および測定法に関する。さ
らに詳細には、S型アミラーゼ活性もしくはP型アミラ
ーゼ活性を特異的に阻害する抗体を使用し、さらに追随
酵素を使用しないことを特徴とする、簡便なアミラーゼ
アイソザイム活性測定用試薬およびアミラーゼアイソザ
イム活性の測定法である。
ラーゼは、主として膵臓由来のP型アミラーゼおよび主
として唾液腺由来のS型アミラーゼの2種類のアイソザ
イムに大別され、これらを測定することにより、各種疾
患の診断が行われる。その中でも、P型アミラーゼは臓
器特異性が高く、急性膵炎のマーカーとして有用である
と言われている。
気泳動法や小麦由来のアミラーゼ活性阻害剤を用いる方
法が一般的であったが、これらの方法には、操作が煩雑
で時間がかかること、あるいは直接にP型アミラーゼ活
性が得られないことなどの欠点がある。例えば、小麦由
来のアミラーゼ阻害剤を用いる方法が知られているが、
この方法は阻害剤のアイソザイム選択性が十分でないた
めに、直接、P型アミラーゼ活性を測定することができ
ず、検量線の作成など複雑な定量計算を必要とする。ま
た、それより前には、電気泳動法についても公知である
が、操作が煩雑であることや結果の判定に熟練を要する
等の問題点が指摘されていた。
なる特定の2種の基質に対する反応性がアイソザイム間
で異なることを利用した方法が種々開示されている(特
公平4−24998号公報、特開平1−98498号公
報、特開平4−193892号公報、特開平4−229
196号公報、特公平4−52279号公報など)。し
かし、これらもまた、反応が複雑であるために、直接、
P型アミラーゼ活性を測定することができず、検量線の
作成など複雑な定量計算を必要とする。また、鉄イオン
を阻害剤とする方法が開示されている(特開昭61−2
09600号公報)が、同様に複雑な定量計算を必要と
する。
高い方法として、モノクローナル抗体を使用する方法が
種々開示されるようになった。抗P型アイソザイムモノ
クローナル抗体を使用する方法が公知である (特公平3
−46116号公報) が、抗原抗体複合物とそれ以外を
分離する工程を余分に含み、操作が煩雑になる欠点があ
る。
ル抗体を使用して、S型アイソザイムのみを特異的に阻
害し、P型アイソザイム活性を特異的に測定する方法が
知られている (特公平4−37380号公報、特公昭6
3−2600号公報)。これらの方法に使用するアミラ
ーゼ測定基質は、特に限定されていないが、逆に言え
ば、全てのアミラーゼ測定基質に適用できることが示さ
れているわけではなく、また、組み合わせるべきアミラ
ーゼ活性測定基質には性能上の優劣があるので、どの試
薬を選択するかが、実用上、重大な問題となる。
きα−アミラーゼ活性測定試薬には、自動分析機に適用
される汎用の試薬を使用することが多く、その中でも種
々のマルトオリゴ糖あるいはその誘導体を基質として含
む試薬が一般的であり、(1)グルコース数が4〜7で
あるマルトオリゴ糖、(2)遊離すると光学的に測定可
能となるアグリコンをマルトオリゴ糖の還元性末端に結
合させた誘導体(グルーオス数が4〜7)、(3)遊離
すると光学的に測定可能となるアグリコンをマルトオリ
ゴ糖の還元性末端に結合させ、非還元末端グルコースの
4位および/または6位のヒドロキシル基を修飾した誘
導体(グルコース数が4〜7)を基質とする方法などが
ある。
ラーゼ反応によって生成する水解物をさらに検出可能な
物質へ導くために添加されているα−グルコシダーゼな
どの追随酵素の作用により、ブランク反応が上昇する問
題点がある。また、(3)の試薬では理論上、α−グル
コシダーゼの作用を回避することができ、(1)および
(2)の試薬より好ましいと言える。しかし、実用上は
非還元性末端が修飾されていない不純物が若干、含まれ
るために、多少のブランク値の上昇は避けられない。ま
た、追随酵素の使用は高コストをもたらすなどの問題点
がある。これらの問題点は、試薬と抗体を組み合わせて
アイソザイムを測定する際にも同様に発生する。
ロ−4−ニトロフェニルマルトトリオシドを基質とする
方法(特開昭63−183595号公報)が開発され、
α−アミラーゼ活性測定時における上記の問題点を回避
できるようになった。しかし、この方法は感度が低いた
め、アミラーゼ活性化剤として、チオシアン酸塩やアジ
化塩を高濃度添加することが必要である。ところが、こ
の方法と抗体を組み合わせてアミラーゼアイソザイムを
測定する場合(Clin.Chim.Acta.,第259号、第147
〜160頁,1997)、高濃度の活性化剤を添加すると
充分なS型アミラーゼ阻害活性が得られないので、活性
化剤の添加量をある程度まで下げざるを得ず、それにと
もない感度が低下するという問題点がある。また、アジ
化塩の高濃度の添加については、毒性があり、重金属と
の結合により爆発性を持つ問題点が指摘されている。
性化剤を使用し、追随酵素を使用せず、かつ、S型アミ
ラーゼもしくはP型アミラーゼを阻害する作用を有する
抗体を使用する、簡便かつ正確にアミラーゼアイソザイ
ム活性を測定する試薬およびその測定法を提供すること
にある。
を達成するために鋭意検討し、アミラーゼ活性測定基質
として、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β
−D−ガラクトピラノシルマルトシドを使用すると所期
の目的が達成することを見出し、本発明に到達した。
ロフェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシルマル
トシド、S型アミラーゼ活性もしくはP型アミラーゼ活
性を阻害する抗体およびチオシアン酸塩および/または
アジ化塩を含むことを特徴とするアミラーゼアイソザイ
ム活性測定用試薬である。
ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル
マルトシド、S型アミラーゼ活性を阻害する抗体および
チオシアン酸塩および/またはアジ化塩を含み、アミラ
ーゼアイソザイム活性測定用試薬をP型アミラーゼとS
型アミラーゼを含有する試料と接触させて、2−クロロ
−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトピラ
ノシルマルトシドとP型アミラーゼのみを反応させ、
(b)遊離した2−クロロ−4−ニトロフェノールの量
を測定することを特徴とするP型アミラーゼ活性測定法
である。さらに、本発明は、(a)2−クロロ−4−ニ
トロフェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシルマ
ルトシド、P型アミラーゼ活性を阻害する抗体およびチ
オシアン酸塩および/またはアジ化塩を含み、アミラー
ゼアイソザイム活性測定用試薬をP型アミラーゼとS型
アミラーゼを含有する試料と接触させて、2−クロロ−
4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノ
シルマルトシドとS型アミラーゼのみを反応させ、
(b)遊離した2−クロロ−4−ニトロフェノールの量
を測定することを特徴とするS型アミラーゼ活性測定法
である。
−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシ
ルマルトシドおよびチオシアン酸塩および/またはアジ
化塩を含み、アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬を
P型アミラーゼとS型アミラーゼを含有する試料と接触
させて、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β
−D−ガラクトピラノシルマルトシドとP型アミラーゼ
およびS型アミラーゼを反応させ、(b)遊離した2−
クロロ−4−ニトロフェノールの量(A)を測定し、次
いで、(c)2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O
−β−D−ガラクトピラノシルマルトシド、S型アミラ
ーゼ活性を阻害する抗体およびチオシアン酸塩および/
またはアジ化塩を含むアミラーゼアイソザイム活性測定
用試薬をP型アミラーゼとS型アミラーゼを含有する試
料と接触させて、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4
−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシドとP型ア
ミラーゼのみを反応させ、(d)遊離した2−クロロ−
4−ニトロフェノールの量(B)を測定し、(e)前者
(A)から後者(B)を差し引くことを特徴とするS型
アミラーゼ活性測定法であり、また、(a)2−クロロ
−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトピラ
ノシルマルトシドおよびチオシアン酸塩および/または
アジ化塩を含むアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬
をP型アミラーゼとS型アミラーゼを含有する試料と接
触させて、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−
β−D−ガラクトピラノシルマルトシドとP型アミラー
ゼおよびS型アミラーゼを反応させ、(b)遊離した2
−クロロ−4−ニトロフェノールの量(A)を測定し、
次いで、(c)2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−
O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシド、P型アミ
ラーゼ活性を阻害する抗体およびチオシアン酸塩および
/またはアジ化塩を含むアミラーゼアイソザイム活性測
定用試薬をP型アミラーゼとS型アミラーゼを含有する
試料と接触させて、2−クロロ−4−ニトロフェニル
4−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシドとS型
アミラーゼのみを反応させ、(d)遊離した2−クロロ
−4−ニトロフェノールの量(B)を測定し、(e)前
者(A)から後者(B)を差し引くことを特徴とするP
型アミラーゼ活性測定法である。
ザイムを含む試料としては、特に限定されないが、例え
ば、血液(血清、血漿など)、尿、唾液、膵液などの各
種体液、分泌液、排泄物などが挙げられる。
用試薬に用いられる基質は、2−クロロ−4−ニトロフ
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシ
ドである。該化合物は、非還元末端のグルコースの修飾
基であるガラクトピラノシル基は、4位の水酸基にβ型
で結合している。また、還元末端にはアグリコンとし
て、1位水酸基にα型のグルコシド結合を介して、2−
クロロ−4−ニトロフェニル基が結合している。この結
合はα−アミラーゼによって切断され、該結合が切断さ
れたとき生じる2−クロロ−4−ニトロフェノールが測
定可能な物質となる。該基質は、特開平3−26459
6号公報に記載の方法など種々の公知の方法で製造する
ことができる。2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−
O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシドの試薬中の
最終濃度は、特に限定されないが、好ましくは0.5〜
20mMである。
用試薬に用いられるS型アミラーゼ阻害抗体とは、選択
的にS型アミラーゼと結合することにより、S型アミラ
ーゼと基質との反応を高率で阻害し、かつP型アミラー
ゼと基質との反応をほとんど阻害しないものをいう。ま
た、P型アミラーゼ阻害抗体とは、選択的にP型アミラ
ーゼと結合することにより、P型アミラーゼと基質との
反応を高率で阻害し、かつS型アミラーゼと基質との反
応をほとんど阻害しないものをいう。S型アミラーゼ
(もしくはP型アミラーゼ)の阻害率については、抗体
の作製方法や添加濃度などの条件により差があるため、
一概に特定できないが、一般に90%以上である。ま
た、同様にP型アミラーゼ(もしくはS型アミラーゼ)
の阻害率については、一般に10%以下である。なお、
1種の抗体で、上記の性質が得られない場合は、2種以
上の抗体を併用することも可能である。2種以上の抗体
を使用する場合、全体としてS型アミラーゼ(もしくは
P型アミラーゼ)を阻害する作用を有することが必要で
ある。
モノクローナル抗体のいずれでもよい。該抗体の調製法
としては、種々の公知方法が用いられる。たとえばマウ
ス等の適当な実験動物に免疫源としてS型アミラーゼも
しくはP型アミラーゼを使用して免疫化し、次いで、実
験動物の脾臓細胞を骨髄種細胞と融合させて、培養皿上
で、または腹水として生長させ、選別を行うことにより
モノクローナル抗体が得られる。該抗体としては、例え
ば、市販のS型アミラーゼ阻害抗体として、ベーリンガ
ーマンハイム社の66C7と88E8、ベーリンガー社
のTu88E8とTu66C7の2種の抗体の組み合わ
せなどが挙げられる。S型アミラーゼ活性もしくはP型
アミラーゼを特異的に阻害する抗体の試薬中の最終濃度
は特に限定されないが、好ましくは5〜100mg/L
である。
用試薬には、アミラーゼの反応活性化剤として、チオシ
アン酸塩および/またはアジ化塩が使用される。それら
の最終濃度は、好ましくはチオシアン酸イオン濃度が5
0〜400mM、および/またはアジ化ナトリウム濃度
は1〜90mMである。これらの使用量は、従来の基質
(2−クロロ−4−ニトロフェニルマルトトリオシド)
と対比すると、低濃度である。例えば、 Clin.Chim.Act
a., 第259号、第147頁、第5行では、チオシアン
酸塩は450mMであり、 Clin. Chem., 第34巻、第
10号、第2007頁、右欄第11行では、アジ化塩は
152mMである。チオシアン酸塩としては、チオシア
ン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウムなどが挙げられ
る。また、アジ化塩としては、アジ化ナトリウムなどが
挙げられる。
用試薬は、必要に応じて、界面活性剤、安定化剤、防腐
剤、キレート剤などを含む。また、本発明の測定試薬
は、基質を溶解した緩衝液を包含しても良い。該緩衝液
としては、MES緩衝液などのグッド緩衝液をはじめ、
中性付近に緩衝能を有する各種緩衝液、例えばリン酸緩
衝液、トリス塩酸緩衝液などが用いられる。
用試薬には、追随酵素を添加する必要はない。ここで、
追随酵素とは、非還元末端からグルコシド結合を加水分
解するエキソグルコシダーゼのことであり、α−グルコ
シダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなど
が該当する。
用試薬を用いたアミラーゼアイソザイム活性測定法は、
(1)前記マルトオリゴ糖誘導体を、S型アミラーゼ阻
害剤とチオシアン酸塩および/またはアジ化塩の存在下
で、P型アミラーゼとS型アミラーゼを含有する試料と
接触させて、前記マルトオリゴ糖誘導体とP型アミラー
ゼのみを反応させ、(2)遊離した測定可能な物質の量
を測定することよりなり、この手順により、P型アミラ
ーゼ活性が測定できる。また、S型アミラーゼ活性が必
要な場合は、別途、抗体を含まない試薬にて総活性を測
定したうえで、P型アミラーゼ活性を差し引く。
−β−D−ガラクトピラノシルマルトシドとP型アミラ
ーゼの反応は、例えば、反応温度25〜40℃、pH5
〜8にて約1〜20分反応を行う。該基質とP型アミラ
ーゼとS型アミラーゼの反応も同様に行う。
トロフェニノ−ルを適当な手段により測定することによ
り、P型アミラーゼの活性を測定することができる。た
とえば、2−クロロ−4−ニトロフェノールがそれ自体
400nm付近に吸収があることから、遊離後400n
m付近の吸光度の変化を測定する。2−クロロ−4−ニ
トロフェノールの測定方法としては、アミラーゼの反応
を連続的に追跡するレート法および一定時間反応させた
後、反応を止めて測定するエンドポイント法のいずれも
が使用されうる。
明するが、本発明がこれら実施例に限定されるものでな
い。
をそれぞれ調製した。なお、組成表中、GalG2CN
P(実施例1)は、2−クロロ−4−ニトロフェニル
4−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシド、G3
CNP(比較例1)は2−クロロ−4−ニトロフェニル
マルトトリオシドを示す。 試薬組成 (1)組成A グッド緩衝液(pH6.0) 50mM 塩化ナトリウム 300mM 塩化カルシウム 5mM S型アミラーゼ阻害抗体88E8(ベーリンガーマンマイム社製) 20mg/L S型アミラーゼ阻害抗体66C7(ベーリンガーマンマイム社製) 5mg/L チオシアン酸カリウム 900〜0mM(濃度は表1、2に記載) 基質 GalG2CNPまたはG3CNP 2.6mM
ザイムP) (3)S型アミラーゼ(国際試薬株式会社製、キャリブ
ザイムS)
れぞれ0.05mL添加し、37℃にて3分間放置した
後、405nmにおける吸光度の変化を測定し、1分あ
たりの吸光度変化を算出した。その結果を表1および2
に示す。表中、Pは試料としてP型アミラーゼを使用し
た場合、SはS型アミラーゼを使用した場合の結果を示
す。相対感度はP、Sそれぞれ、G3CNPのチオシア
ン酸カリウム900mMの時を100とした数値であ
る。なお、残存率および相対感度は、以下の式により算
出したものである。 残存率(%)=(組成Aでの吸光度変化)/(組成Bで
の吸光度変化)×100 相対感度(%)=(組成Bでの吸光度変化)/(比較例
のチオシアン酸カリウム900mMの時の吸光度変化)
×100
質の、チオシアン酸カリウム濃度と各アイソザイム阻害
率の関係を図1(実施例)および図2(比較例)に示
す。さらに、チオシアン酸カリウム濃度とP型アミラー
ゼ測定時の1分当たりの吸光度変化量の関係を図3に示
す。
ともにチオシアン酸カリウム濃度が高くなるにつれて、
S型アミラーゼの阻害率が低下しており、600mMで
は90%以下、900mMでは80%以下であり、阻害
率が95%を越えるのは、実施例、比較例においては5
0〜200mMの範囲でしかないことがわかる。一方、
図3より、P型アミラーゼの相対感度は、比較例1の場
合、チオシアン酸カリウム濃度500mM以下で下がり
はじめ、200mMでは、基準(2−クロロ−4−ニト
ロフェニルマルトトリオシドを用いチオシアン酸カリウ
ム濃度が900mMの場合の感度を100%)に対し、
約2/3になるが、実施例1の場合は、チオシアン酸カ
リウム200mMでの相対感度は、基準の約1.3倍と
なり、実施例1の感度が高いことがわかる。
をそれぞれ調製した。 1.試薬組成 (1)組成C グッド緩衝液(pH6.0) 50mM 塩化ナトリウム 300mM 塩化カルシウム 5mM S型アミラーゼ阻害抗体88E8(ベーリンガーマンマイム社製) 20mg/L S型アミラーゼ阻害抗体66C7(ベーリンガーマンマイム社製) 5mg/L アジ化ナトリウム 300〜0mM(濃度は表3、4に記載) 基質GalG2CNPまたはG3CNP 2.6mM
ザイムP) (3)S型アミラーゼ(国際試薬株式会社製、キャリブ
ザイムS)
ぞれ0.05mL添加し、37℃にて3分間放置した
後、405nmにおける吸光度の変化を測定し、1分あ
たりの吸光度変化を算出した。その結果を表3および4
に示す。表中、Pは試料としてP型アミラーゼを使用し
た場合、SはS型アミラーゼを使用した場合の結果を示
す。相対感度はP、Sそれぞれ、G3CNPのアジ化ナ
トリウム300mMの時を100とした数値である。な
お、残存率および相対感度は、以下の式により算出した
ものである。 残存率(%)=(組成Aでの吸光度変化)/(組成Bで
の吸光度変化)×100 相対感度(%)=(組成Bでの吸光度変化)/(比較例
のアジ化ナトリウム300mMの時の吸光度変化)×1
00
質の、アジ化ナトリウム濃度と各アイソザイム阻害率の
関係を図4と図5に示す。アジ化ナトリウム濃度とP型
アミラーゼ測定時の1分あたりの吸光度変化量の関係を
図6に示す。
ともアジ化ナトリウム濃度に関わらず、ほぼ95%前後
のS型アミラーゼの阻害率を示すことがわかる。一方、
図6より、P型アミラーゼの相対感度は、比較例2の場
合、アジ化ナトリウム濃度が低いほど下がり、30mM
では、基準(2−クロロ−4−ニトロフェニルマルトト
リオシドを用いアジ化ナトリウム濃度300mMの場合
の感度を100%)にし約45%になるが、実施例の場
合は、アジ化ナトリウム30mMでの相対感度は、基準
の約98%となり、実施例では、比較例と同等の感度を
得るために必要なアジ化ナトリウムの添加濃度が低いこ
とがわかる。
し、37℃にて3分間放置した後、405nmにおける
吸光度の変化を測定し、1分当たりの吸光度変化を算出
した。この吸光度変化を当該組成におけるCNPの分子
吸光係数を用いてPアミラーゼ活性値に変換した。その
結果を表5に示す。実施例(基質がGalG2CNPの
場合)の試薬による測定は、比較例(基質がG3CNP
の場合)に対し、吸光度変化が大きく、感度において優
れることを示している。
(比較例)) 2.6mM (2)試薬組成B グッド緩衝液(pH6.2) 50mM 塩化ナトリウム 300mM 塩化カルシウム 5mM チオシアン酸カリウム 140mM S型アミラーゼ阻害抗体88EB(ロシュ社製) 15mg/L S型アミラーゼ阻害抗体66C7(ロシュ社製) 1.25mg/L 基質(GalG2CNP(実施例)またはG3CNP(比較例) 2.6mM
添加し、37℃にて3分間放置した後、405nmにお
ける吸光度の変化を測定し、1分当たりの吸光度変化を
算出した(吸光度変化a)。ついで、試薬(B)を用
い、同様の操作を行って1分当たりの吸光度変化を算出
した(吸光度変化b)。次に、吸光度変化aから吸光度
変化bを差し引いて吸光度変化cを得て、これを当該組
成におけるCNPの分子吸光係数を用いて、Sアミラー
ゼ活性値に変換した。その結果を表6に示す。実施例
(基質がGalG2CNPの場合)の試薬による測定
は、比較例(基質がG3CNPの場合)に対し、吸光度
変化が大きく、感度において優れることを示している。
定試薬によれば、低濃度の活性化剤を使用し、追随酵素
を使用せず、かつ、S型アミラーゼもしくはP型アミラ
ーゼを阻害する作用を有する抗体を使用して、簡便かつ
正確にアミラーゼアイソザイム活性を測定できる。
アン酸カリウム濃度と各アイソザイム阻害率の関係を示
す図である。
ン酸カリウム濃度と各アイソザイム阻害率の関係を示す
図である。
P) を用いた場合のチオシアン酸カリウム濃度とP型ア
ミラーゼ測定時の1分あたりの吸光度変化量の関係を示
す図である。
ナトリウムと各アイソザイム阻害率の関係を示す図であ
る。
トリウム濃度と各アイソザイム阻害率の関係を示す図で
ある。
P) を用いた場合のアジ化ナトリウム濃度とP型アミラ
ーゼ測定時の1分あたりの吸光度変化量の関係を示す図
である。
Claims (8)
- 【請求項1】 2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−
O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシド、S型アミ
ラーゼ活性を阻害する抗体およびチオシアン酸塩および
/またはアジ化塩を含むことを特徴とするアミラーゼア
イソザイム活性測定用試薬。 - 【請求項2】 2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−
O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシド、P型アミ
ラーゼ活性を阻害する抗体およびチオシアン酸塩および
/またはアジ化塩を含むとを特徴とするアミラーゼアイ
ソザイム活性測定用試薬。 - 【請求項3】 チオシアン酸塩の最終濃度が50〜40
0mMであり、および/またはアジ化塩の最終濃度が1
〜90mMである請求項1または2に記載のアミラーゼ
アイソザイム活性測定用試薬。 - 【請求項4】 さらに、S型アミラーゼ活性もしくはP
型アミラーゼ活性を阻害する抗体の最終濃度が、5〜1
00mg/Lであり、かつ、2−クロロ−4−ニトロフ
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシ
ドの最終濃度が、0.5〜20mMである請求項1また
は2に記載のアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬。 - 【請求項5】 (a)2−クロロ−4−ニトロフェニル
4−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシド、S
型アミラーゼ活性を阻害する抗体およびチオシアン酸塩
および/またはアジ化塩を含み、アミラーゼアイソザイ
ム活性測定用試薬をP型アミラーゼとS型アミラーゼを
含有する試料と接触させて、2−クロロ−4−ニトロフ
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシ
ドとP型アミラーゼのみを反応させ、(b)遊離した2
−クロロ−4−ニトロフェノールの量を測定することを
特徴とするP型アミラーゼ活性測定法。 - 【請求項6】 (a)2−クロロ−4−ニトロフェニル
4−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシド、P
型アミラーゼ活性を阻害する抗体およびチオシアン酸塩
および/またはアジ化塩を含み、アミラーゼアイソザイ
ム活性測定用試薬をP型アミラーゼとS型アミラーゼを
含有する試料と接触させて、2−クロロ−4−ニトロフ
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシ
ドとS型アミラーゼのみを反応させ、(b)遊離した2
−クロロ−4−ニトロフェノールの量を測定することを
特徴とするS型アミラーゼ活性測定法。 - 【請求項7】 (a)2−クロロ−4−ニトロフェニル
4−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシドおよ
びチオシアン酸塩および/またはアジ化塩を含むアミラ
ーゼアイソザイム活性測定用試薬をP型アミラーゼとS
型アミラーゼを含有する試料と接触させて、2−クロロ
−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトピラ
ノシルマルトシドとP型アミラーゼおよびS型アミラー
ゼを反応させ、(b)遊離した2−クロロ−4−ニトロ
フェノールの量(A)を測定し、次いで、(c)2−ク
ロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクト
ピラノシルマルトシド、S型アミラーゼ活性を阻害する
抗体およびチオシアン酸塩および/またはアジ化塩を含
むアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬をP型アミラ
ーゼとS型アミラーゼを含有する試料と接触させて、2
−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラ
クトピラノシルマルトシドとP型アミラーゼのみを反応
させ、(d)遊離した2−クロロ−4−ニトロフェノー
ルの量(B)を測定し、(e)前者(A)から後者
(B)を差し引くことを特徴とするS型アミラーゼ活性
測定法。 - 【請求項8】 (a)2−クロロ−4−ニトロフェニル
4−O−β−D−ガラクトピラノシルマルトシドおよ
びチオシアン酸塩および/またはアジ化塩を含むアミラ
ーゼアイソザイム活性測定用試薬をP型アミラーゼとS
型アミラーゼを含有する試料と接触させて、2−クロロ
−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトピラ
ノシルマルトシドとP型アミラーゼおよびS型アミラー
ゼを反応させ、(b)遊離した2−クロロ−4−ニトロ
フェノールの量(A)を測定し、次いで、(c)2−ク
ロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクト
ピラノシルマルトシド、P型アミラーゼ活性を阻害する
抗体およびチオシアン酸塩および/またはアジ化塩を含
むアミラーゼアイソザイム活性測定用試薬をP型アミラ
ーゼとS型アミラーゼを含有する試料と接触させて、2
−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラ
クトピラノシルマルトシドとS型アミラーゼのみを反応
させ、(d)遊離した2−クロロ−4−ニトロフェノー
ルの量(B)を測定し、(e)前者(A)から後者
(B)を差し引くことを特徴とするP型アミラーゼ活性
測定法。
Priority Applications (4)
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JP11023804A JPH11299498A (ja) | 1998-02-19 | 1999-02-01 | アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 |
EP99102739A EP0937778B1 (en) | 1998-02-19 | 1999-02-19 | Reagent for assay of amylase isozyme activity |
DE69936359T DE69936359T2 (de) | 1998-02-19 | 1999-02-19 | Reagenz zum Assay von Amylase-Isoenzymaktivität |
US09/253,020 US6350585B1 (en) | 1998-02-19 | 1999-02-19 | Reagent for assay of amylase isozyme activity |
Applications Claiming Priority (3)
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---|---|---|---|
JP3758398 | 1998-02-19 | ||
JP10-37583 | 1998-02-19 | ||
JP11023804A JPH11299498A (ja) | 1998-02-19 | 1999-02-01 | アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 |
Publications (1)
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JPH11299498A true JPH11299498A (ja) | 1999-11-02 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP11023804A Pending JPH11299498A (ja) | 1998-02-19 | 1999-02-01 | アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 |
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EP (1) | EP0937778B1 (ja) |
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