JP2003000236A - エステラーゼの安定化方法 - Google Patents
エステラーゼの安定化方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明はエステラーゼの安定化方法およびそ
の組成物に関する。特に臨床診断に用いられる生体成分
測定試薬に用いられるエステラーゼの安定化方法および
その組成物に関する。 【解決手段】 コレステロール測定試薬において、エス
テラーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを
共存させることを特徴とする、エステラーゼの安定化方
法。
の組成物に関する。特に臨床診断に用いられる生体成分
測定試薬に用いられるエステラーゼの安定化方法および
その組成物に関する。 【解決手段】 コレステロール測定試薬において、エス
テラーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを
共存させることを特徴とする、エステラーゼの安定化方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はエステラーゼの安定
化方法およびその組成物に関する。特に臨床診断に用い
られる生体成分中のコレステロール測定試薬に用いられ
るエステラーゼの安定化方法およびその組成物に関す
る。
化方法およびその組成物に関する。特に臨床診断に用い
られる生体成分中のコレステロール測定試薬に用いられ
るエステラーゼの安定化方法およびその組成物に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、エステラーゼはコレステロール測
定試薬の主反応酵素として診断用試薬に使用され重要視
されている。エステラーゼを用いるコレステロール測定
法は種々報告されているが、エステル型コレステロール
にエステラーゼを作用させ遊離型コレステロールを生成
させ、更にコレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼを用いて測定する方法、遊離型コレステロールをコ
レステロールデヒドロゲナーゼを用いて測定する方法が
ある。これらエステラーゼを用いる試薬の正確性はこれ
ら酵素の反応性、安定性が寄与しており、益々反応性、
安定性に対する要求が高まっている。
定試薬の主反応酵素として診断用試薬に使用され重要視
されている。エステラーゼを用いるコレステロール測定
法は種々報告されているが、エステル型コレステロール
にエステラーゼを作用させ遊離型コレステロールを生成
させ、更にコレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼを用いて測定する方法、遊離型コレステロールをコ
レステロールデヒドロゲナーゼを用いて測定する方法が
ある。これらエステラーゼを用いる試薬の正確性はこれ
ら酵素の反応性、安定性が寄与しており、益々反応性、
安定性に対する要求が高まっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】近年、臨床検査におい
ては益々精度管理の重要性が高まっている。診断用試薬
では液状試薬が主流になっているが、コレステロール測
定試薬ではこのようなエステラーゼの反応性を液状状態
で長期間維持する必要性から益々液状安定性に対する要
求が強くなっている。このことから、本発明が解決しよ
うとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうる安
定性を有し、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持し
たエステラーゼを提供することにある。
ては益々精度管理の重要性が高まっている。診断用試薬
では液状試薬が主流になっているが、コレステロール測
定試薬ではこのようなエステラーゼの反応性を液状状態
で長期間維持する必要性から益々液状安定性に対する要
求が強くなっている。このことから、本発明が解決しよ
うとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうる安
定性を有し、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持し
たエステラーゼを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために種々検討した結果、エステラーゼにポ
リオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させるこ
とにより、エステラーゼを液状状態で長期間安定に保
ち、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持することを
見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の
ような構成からなる。 （１）エステラーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキル
エーテルを共存させることを特徴とする、エステラーゼ
の安定化方法。 （２）さらに、十分な反応性が維持されている、（１）
記載のエステラーゼの安定化方法。 （３）ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルの濃度
が０．０１〜０．５％である（２）記載のエステラーゼ
の安定化方法。 （４）ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルのＨＬ
Ｂが１５以下である（２）記載のエステラーゼの安定化
方法。 （５）エステラーゼがさらにリパーゼ活性を有する
（１）〜（４）記載のエステラーゼの安定化方法。 （６）エステラーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキル
エーテルを共存させることを特徴とするエステラーゼの
安定化組成物。 （７）ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルの濃度
が０．０１〜０．５％である（６）記載のエステラーゼ
の安定化組成物。 （８）更にエステラーゼ活性化剤と組み合わせて用いら
れる（６）、（７）記載のエステラーゼの安定化組成
物。 （９）エステラーゼ活性化剤がポリオキシエチレン２級
アルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニ
ルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエー
テルから選ばれた少なくとも１種の界面活性剤である
（８）記載のエステラーゼの安定化組成物。 （１０）ＨＬＢが１５以下のポリオキシエチレン直鎖ア
ルキルエーテルと、エステラーゼ活性化剤の総ＨＬＢが
１２〜１４である（８）、（９）記載のエステラーゼの
安定化組成物。
を達成するために種々検討した結果、エステラーゼにポ
リオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させるこ
とにより、エステラーゼを液状状態で長期間安定に保
ち、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持することを
見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の
ような構成からなる。 （１）エステラーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキル
エーテルを共存させることを特徴とする、エステラーゼ
の安定化方法。 （２）さらに、十分な反応性が維持されている、（１）
記載のエステラーゼの安定化方法。 （３）ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルの濃度
が０．０１〜０．５％である（２）記載のエステラーゼ
の安定化方法。 （４）ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルのＨＬ
Ｂが１５以下である（２）記載のエステラーゼの安定化
方法。 （５）エステラーゼがさらにリパーゼ活性を有する
（１）〜（４）記載のエステラーゼの安定化方法。 （６）エステラーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキル
エーテルを共存させることを特徴とするエステラーゼの
安定化組成物。 （７）ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルの濃度
が０．０１〜０．５％である（６）記載のエステラーゼ
の安定化組成物。 （８）更にエステラーゼ活性化剤と組み合わせて用いら
れる（６）、（７）記載のエステラーゼの安定化組成
物。 （９）エステラーゼ活性化剤がポリオキシエチレン２級
アルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニ
ルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエー
テルから選ばれた少なくとも１種の界面活性剤である
（８）記載のエステラーゼの安定化組成物。 （１０）ＨＬＢが１５以下のポリオキシエチレン直鎖ア
ルキルエーテルと、エステラーゼ活性化剤の総ＨＬＢが
１２〜１４である（８）、（９）記載のエステラーゼの
安定化組成物。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明において「安定」とは、加
温処理に対しても酵素活性が維持されていることを意味
し、具体的には、ポリオキシエチレン直鎖アルキルエー
テルを、５0mMＰＩＰＥＳ (pH7.0)緩衝液中に、０．５
Ｕ／ｍＬのエステラーゼと共存させたとき、３５℃１４
日間保存後の残存酵素活性が加温処理していないものと
比較して、６０％以上（好ましくは８０％以上、さらに
好ましくは９０％以上）維持されていることをいう。
温処理に対しても酵素活性が維持されていることを意味
し、具体的には、ポリオキシエチレン直鎖アルキルエー
テルを、５0mMＰＩＰＥＳ (pH7.0)緩衝液中に、０．５
Ｕ／ｍＬのエステラーゼと共存させたとき、３５℃１４
日間保存後の残存酵素活性が加温処理していないものと
比較して、６０％以上（好ましくは８０％以上、さらに
好ましくは９０％以上）維持されていることをいう。
【０００６】本発明において「十分な反応性」とは、エ
ステル型コレステロールをエステラーゼにより遊離型コ
レステロール、および脂肪酸に分解し、生成した遊離型
コレステロールの量を追随反応を介して求めることによ
りエステル型コレステロールを測定する際に、精製水お
よび２００ｍｇ／ｄＬコレステロール溶液の測定吸光度
を対照とし算出したエステル型コレステロール濃度が、
１５００ｍｇ／ｄＬ以下の範囲において理論値を回収す
ることを意味し、具体的には測定値が理論値の９５％を
下回らないことを意味する。
ステル型コレステロールをエステラーゼにより遊離型コ
レステロール、および脂肪酸に分解し、生成した遊離型
コレステロールの量を追随反応を介して求めることによ
りエステル型コレステロールを測定する際に、精製水お
よび２００ｍｇ／ｄＬコレステロール溶液の測定吸光度
を対照とし算出したエステル型コレステロール濃度が、
１５００ｍｇ／ｄＬ以下の範囲において理論値を回収す
ることを意味し、具体的には測定値が理論値の９５％を
下回らないことを意味する。
【０００７】本発明の一実施態様として、第一試薬とし
てコレステロールエステラーゼ、エステラーゼ活性化剤
等を含有し、第二試薬としてコレステロールオキシダー
ゼ等を含有する２試薬系からなるコレステロール測定試
薬において、コレステロールエステラーゼを含む試薬に
ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させる
ことを特徴とするエステラーゼの安定化方法がある。
てコレステロールエステラーゼ、エステラーゼ活性化剤
等を含有し、第二試薬としてコレステロールオキシダー
ゼ等を含有する２試薬系からなるコレステロール測定試
薬において、コレステロールエステラーゼを含む試薬に
ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させる
ことを特徴とするエステラーゼの安定化方法がある。
【０００８】本発明で用いるポリオキシエチレン直鎖ア
ルキルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンラ
ウリルエーテル類としてエマルゲン１０４Ｐ（ＨＬＢ
９．６）、エマルゲン１０５（ＨＬＢ９．７）、エマル
ゲン１０６（ＨＬＢ１０．５）、エマルゲン１０８（Ｈ
ＬＢ１２．１）、エマルゲン１０９Ｐ（ＨＬＢ１３．
６）、エマルゲン１２０（ＨＬＢ１５．３）、エマルゲ
ン１２３Ｐ（ＨＬＢ１６．９）、エマルゲン１４７（Ｈ
ＬＢ１６．３）、エマルゲン１３０Ｋ（ＨＬＢ１８．
１）、ノニオンＫ−２０４（ＨＬＢ９．２）、ノニオン
Ｋ−２１５（ＨＬＢ１５．２）、ノニオンＫ−２２０
（ＨＬＢ１６．２）、ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ１
７．３）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２（ＨＬＢ９．５）、
ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２（ＨＬＢ１１．５）、ＮＩ
ＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ（ＨＬＢ１４．５）、ＮＩＫＫ
ＯＬ ＢＬ−２１（ＨＬＢ１９）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ
−２５（ＨＬＢ１９．５）、ポリオキシエチレンセチル
エーテル類として、エマルゲン２１０（ＨＬＢ１０．
７）、エマルゲン２２０（ＨＬＢ１４．２）、ＮＩＫＫ
ＯＬ ＢＣ−２（ＨＬＢ８．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ
−５．５（ＨＬＢ１０．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７
（ＨＬＢ１１．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ
（ＨＬＢ１３．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ
（ＨＬＢ１５．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ
（ＨＬＢ１７）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３（ＨＬＢ１
８）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ（ＨＬＢ１８．
５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ（ＨＬＢ１９．
５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ（ＨＬＢ２０）、
ノニオンＰ−２０８（ＨＬＢ１１．９）、ノニオンＰ−
２１０（ＨＬＢ１２．９）、ノニオンＰ−２１３（ＨＬ
Ｂ１４．１）、ポリオキシエチレンステアリルエーテル
類として、エマルゲン３０６Ｐ（ＨＬＢ９．４）、エマ
ルゲン３２０Ｐ（ＨＬＢ１３．９）、ＮＩＫＫＯＬ Ｂ
Ｓ−２（ＨＬＢ８．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４（Ｈ
ＬＢ９．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０（ＨＬＢ１
８）、ノニオンＳ−２０６（ＨＬＢ１０．１）、ノニオ
ンＳ−２０７（ＨＬＢ１０．７）、ノニオンＳ−２１５
（ＨＬＢ１４．２）、ノニオンＳ−２２０（ＨＬＢ１
５．３）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類とし
ては、エマルゲン４０４（ＨＬＢ８．８）、エマルゲン
４０８（ＨＬＢ１０．０）、エマルゲン４０９Ｐ（ＨＬ
Ｂ１２．０）、エマルゲン４２０（ＨＬＢ１３．６）、
エマルゲン４３０（ＨＬＢ１６．２）、ＮＩＫＫＯＬ
ＢＯ−２（ＨＬＢ７．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７
（ＨＬＢ１０．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ
（ＨＬＢ１４．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０（ＨＬ
Ｂ１７．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０（ＨＬＢ１
８．０）、ノニオンＥ−２０６（ＨＬＢ９．５）、ノニ
オンＥ−２１５（ＨＬＢ１４．２）、ノニオンＥ−２３
０（ＨＬＢ１６．６）、ポリオキシエチレンベヘニルエ
ーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５（ＨＬＢ
７．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０（ＨＬＢ１０．
０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０（ＨＬＢ１６．５）Ｎ
ＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０（ＨＬＢ１８）等が挙げられ
る。
ルキルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンラ
ウリルエーテル類としてエマルゲン１０４Ｐ（ＨＬＢ
９．６）、エマルゲン１０５（ＨＬＢ９．７）、エマル
ゲン１０６（ＨＬＢ１０．５）、エマルゲン１０８（Ｈ
ＬＢ１２．１）、エマルゲン１０９Ｐ（ＨＬＢ１３．
６）、エマルゲン１２０（ＨＬＢ１５．３）、エマルゲ
ン１２３Ｐ（ＨＬＢ１６．９）、エマルゲン１４７（Ｈ
ＬＢ１６．３）、エマルゲン１３０Ｋ（ＨＬＢ１８．
１）、ノニオンＫ−２０４（ＨＬＢ９．２）、ノニオン
Ｋ−２１５（ＨＬＢ１５．２）、ノニオンＫ−２２０
（ＨＬＢ１６．２）、ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ１
７．３）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２（ＨＬＢ９．５）、
ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２（ＨＬＢ１１．５）、ＮＩ
ＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ（ＨＬＢ１４．５）、ＮＩＫＫ
ＯＬ ＢＬ−２１（ＨＬＢ１９）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ
−２５（ＨＬＢ１９．５）、ポリオキシエチレンセチル
エーテル類として、エマルゲン２１０（ＨＬＢ１０．
７）、エマルゲン２２０（ＨＬＢ１４．２）、ＮＩＫＫ
ＯＬ ＢＣ−２（ＨＬＢ８．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ
−５．５（ＨＬＢ１０．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７
（ＨＬＢ１１．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ
（ＨＬＢ１３．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ
（ＨＬＢ１５．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ
（ＨＬＢ１７）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３（ＨＬＢ１
８）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ（ＨＬＢ１８．
５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ（ＨＬＢ１９．
５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ（ＨＬＢ２０）、
ノニオンＰ−２０８（ＨＬＢ１１．９）、ノニオンＰ−
２１０（ＨＬＢ１２．９）、ノニオンＰ−２１３（ＨＬ
Ｂ１４．１）、ポリオキシエチレンステアリルエーテル
類として、エマルゲン３０６Ｐ（ＨＬＢ９．４）、エマ
ルゲン３２０Ｐ（ＨＬＢ１３．９）、ＮＩＫＫＯＬ Ｂ
Ｓ−２（ＨＬＢ８．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４（Ｈ
ＬＢ９．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０（ＨＬＢ１
８）、ノニオンＳ−２０６（ＨＬＢ１０．１）、ノニオ
ンＳ−２０７（ＨＬＢ１０．７）、ノニオンＳ−２１５
（ＨＬＢ１４．２）、ノニオンＳ−２２０（ＨＬＢ１
５．３）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類とし
ては、エマルゲン４０４（ＨＬＢ８．８）、エマルゲン
４０８（ＨＬＢ１０．０）、エマルゲン４０９Ｐ（ＨＬ
Ｂ１２．０）、エマルゲン４２０（ＨＬＢ１３．６）、
エマルゲン４３０（ＨＬＢ１６．２）、ＮＩＫＫＯＬ
ＢＯ−２（ＨＬＢ７．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７
（ＨＬＢ１０．５）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ
（ＨＬＢ１４．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０（ＨＬ
Ｂ１７．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０（ＨＬＢ１
８．０）、ノニオンＥ−２０６（ＨＬＢ９．５）、ノニ
オンＥ−２１５（ＨＬＢ１４．２）、ノニオンＥ−２３
０（ＨＬＢ１６．６）、ポリオキシエチレンベヘニルエ
ーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５（ＨＬＢ
７．０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０（ＨＬＢ１０．
０）、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０（ＨＬＢ１６．５）Ｎ
ＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０（ＨＬＢ１８）等が挙げられ
る。
【０００９】これらの界面活性剤は単独または２種以上
または他の界面活性剤と組み合わせて用いることができ
る。また、各界面活性剤のＨＬＢは特に限定されず、エ
ステラーゼの反応性を考慮し選択されるべきであるが、
好ましくは単独でのＨＬＢが１５以下、さらには１４以
下がエステラーゼの反応性への影響が少ない点で好まし
い。中でも１２〜１３が好ましい。また、ポリオキシエ
チレン部分の重合度は好ましくは３０以下であり、さら
には２０以下がエステラーゼの反応性への影響が少ない
点で好ましい。中でも７〜１０が好ましい。また、エス
テラーゼを含む溶液中の濃度としては特に限定するもの
ではないが、好ましくは０．０１％〜０．５％の範囲で
あり、さらには０．０２％〜０．２％がエステラーゼの
反応性への影響が少ない点で好ましい。中でも０．０５
％〜０．１５％が好ましい。
または他の界面活性剤と組み合わせて用いることができ
る。また、各界面活性剤のＨＬＢは特に限定されず、エ
ステラーゼの反応性を考慮し選択されるべきであるが、
好ましくは単独でのＨＬＢが１５以下、さらには１４以
下がエステラーゼの反応性への影響が少ない点で好まし
い。中でも１２〜１３が好ましい。また、ポリオキシエ
チレン部分の重合度は好ましくは３０以下であり、さら
には２０以下がエステラーゼの反応性への影響が少ない
点で好ましい。中でも７〜１０が好ましい。また、エス
テラーゼを含む溶液中の濃度としては特に限定するもの
ではないが、好ましくは０．０１％〜０．５％の範囲で
あり、さらには０．０２％〜０．２％がエステラーゼの
反応性への影響が少ない点で好ましい。中でも０．０５
％〜０．１５％が好ましい。
【００１０】本発明は、更にエステラーゼ活性化剤と組
み合わせて用いることが出来る。本発明に用いるエステ
ラーゼ活性化剤としては、エステラーゼの反応性を向上
させる物質であればよく、特に限定されない。好ましく
はポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルとリパーゼ
またはエステラーゼが共存する反応混液において、該物
質の添加によりリパーゼまたはエステラーゼの反応性が
向上するものである。このような活性化剤として例えば
ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル、ポリオキシ
エチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレ
ンスチリルフェニルエーテル、脂肪酸が挙げられる。ポ
リオキシエチレン２級アルキルエーテルとしては、ＮＩ
ＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫ
ＫＯＬＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトー
ルＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカト
ールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカ
トールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７
０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエ
チレンアルキルフェニルエーテルとしては、トリトンＸ
−１００、トリトンＸ−１１４が挙げられる。ポリオキ
シエチレンスチリルフェニルエーテルとしてはエマルゲ
ンＡ６０、エマルゲンＡ９０、が挙げられる。脂肪酸と
してはコール酸が挙げられる。
み合わせて用いることが出来る。本発明に用いるエステ
ラーゼ活性化剤としては、エステラーゼの反応性を向上
させる物質であればよく、特に限定されない。好ましく
はポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルとリパーゼ
またはエステラーゼが共存する反応混液において、該物
質の添加によりリパーゼまたはエステラーゼの反応性が
向上するものである。このような活性化剤として例えば
ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル、ポリオキシ
エチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレ
ンスチリルフェニルエーテル、脂肪酸が挙げられる。ポ
リオキシエチレン２級アルキルエーテルとしては、ＮＩ
ＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫ
ＫＯＬＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトー
ルＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカト
ールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカ
トールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７
０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエ
チレンアルキルフェニルエーテルとしては、トリトンＸ
−１００、トリトンＸ−１１４が挙げられる。ポリオキ
シエチレンスチリルフェニルエーテルとしてはエマルゲ
ンＡ６０、エマルゲンＡ９０、が挙げられる。脂肪酸と
してはコール酸が挙げられる。
【００１１】これらエステラーゼ活性化剤は単独または
２種以上の活性化剤を組み合わせて用いられる。本発明
のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを含むエス
テラーゼ安定化組成物に対する混合方法は特に限定され
ず、エステラーゼ反応の直前に混合してもよいし、あら
かじめ混合し保存して使用できる。また、該活性化剤の
エステラーゼ溶液中の濃度は特に限定するものではない
が、本発明のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテル
を含むエステラーゼ安定化組成物にあらかじめ混合して
保存する場合は、ポリオキシエチレン直鎖アルキルエー
テルに対する活性化剤の相対濃度を好ましくは約５０倍
以下（さらに好ましくは２０倍以下、中でも好ましくは
１０倍以下）にし安定化効果を考慮して用いることがで
きる。該活性化剤が非イオン性界面活性剤の場合は各界
面活性剤の（ＨＬＢ）×（添加量）を界面活性剤の添加
量の総和で割った総ＨＬＢが１２〜１４であるのが好ま
しい。さらには１２．５〜１３．５が好ましい。中でも
約１３が好ましい。
２種以上の活性化剤を組み合わせて用いられる。本発明
のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを含むエス
テラーゼ安定化組成物に対する混合方法は特に限定され
ず、エステラーゼ反応の直前に混合してもよいし、あら
かじめ混合し保存して使用できる。また、該活性化剤の
エステラーゼ溶液中の濃度は特に限定するものではない
が、本発明のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテル
を含むエステラーゼ安定化組成物にあらかじめ混合して
保存する場合は、ポリオキシエチレン直鎖アルキルエー
テルに対する活性化剤の相対濃度を好ましくは約５０倍
以下（さらに好ましくは２０倍以下、中でも好ましくは
１０倍以下）にし安定化効果を考慮して用いることがで
きる。該活性化剤が非イオン性界面活性剤の場合は各界
面活性剤の（ＨＬＢ）×（添加量）を界面活性剤の添加
量の総和で割った総ＨＬＢが１２〜１４であるのが好ま
しい。さらには１２．５〜１３．５が好ましい。中でも
約１３が好ましい。
【００１２】また、従来から用いられている緩衝液とし
ては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液な
どが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝
液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価で
あるという利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥ
Ｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、
ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂ
ｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰ
Ｓなどが例示される。該緩衝液のｐＨは５〜９の範囲で
調整される。さらには６〜８が好ましい。中でも６．５
〜７．５が好ましい。
ては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液な
どが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝
液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価で
あるという利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥ
Ｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、
ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂ
ｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰ
Ｓなどが例示される。該緩衝液のｐＨは５〜９の範囲で
調整される。さらには６〜８が好ましい。中でも６．５
〜７．５が好ましい。
【００１３】本発明のエステラーゼとはＥＣ３．１．
１．１３に分類される以下の反応を触媒する酵素も含ま
れる。 エステル型コレステロール＋Ｈ2Ｏ→遊離型コレステロ
ール＋脂肪酸 上記酵素はシュードモナス属、シゾフィラム属などの微
生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の
微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造され
たものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したも
のを含有する。また、これら酵素の特異性、安定性を向
上させる目的または反応セルに吸着する性質を改変する
目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単
糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上
記酵素を化学的に修飾したものも用いられる。
１．１３に分類される以下の反応を触媒する酵素も含ま
れる。 エステル型コレステロール＋Ｈ2Ｏ→遊離型コレステロ
ール＋脂肪酸 上記酵素はシュードモナス属、シゾフィラム属などの微
生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の
微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造され
たものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したも
のを含有する。また、これら酵素の特異性、安定性を向
上させる目的または反応セルに吸着する性質を改変する
目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単
糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上
記酵素を化学的に修飾したものも用いられる。
【００１４】エステラーゼを含む溶液中のエステラーゼ
の濃度は、酵素の起源によっても異なるが、通常０．０
１〜２０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。さらには
０．０２〜２Ｕ／ｍＬが好ましい。中でも０．０４〜１
Ｕ／ｍＬが好ましい。
の濃度は、酵素の起源によっても異なるが、通常０．０
１〜２０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。さらには
０．０２〜２Ｕ／ｍＬが好ましい。中でも０．０４〜１
Ｕ／ｍＬが好ましい。
【００１５】本発明において、エステラーゼ溶液には、
さらに防腐剤などをエステラーゼの反応に特に悪い影響
を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、
アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げら
れる。
さらに防腐剤などをエステラーゼの反応に特に悪い影響
を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、
アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げら
れる。
【００１６】また、該エステラーゼ溶液中には診断用試
薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。コレス
テロール測定試薬としては、一般にエステラーゼの他、
コレステロールオキシダーゼ、マグネシウム、ペルオキ
シダーゼ、色源体が含有される。
薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。コレス
テロール測定試薬としては、一般にエステラーゼの他、
コレステロールオキシダーゼ、マグネシウム、ペルオキ
シダーゼ、色源体が含有される。
【００１７】エステラーゼの活性測定は以下の測定条件
で行うのが好ましい。 〈測定試薬〉 基質液 １０９ｍＭ Ｋ-りん酸緩衝液、ｐＨ７．０ １．４２％ コレステロールリノレート ０．３６％ トリトンＸ−１００ ０．２２％ フェノール ０．０３％ ４-アミノアンチピリン ５．５Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ ＣＯＤ溶液 ３００Ｕ／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ溶液 〈測定条件〉 （１）基質液２．７５ｍＬを試験管にとり、３７℃で約
５分間予備加温 する。 （２）ＣＯＤ溶液０．１ｍＬを加え、更に２分加温す
る。 （３）酵素溶液０．１ｍＬを添加し緩やかに混和後、精
製水を対照に３ ７℃に制御された分光光度計で５００
ｎｍの吸光度変化を３〜４分間 記録し、その初期直線
部分から１分間当たりの吸光度変化量を求める 。 （４）盲検はＣＯＤ溶液添加後、酵素溶液の代わりに酵
素希釈液を加え て、以下上記同様に操作して吸光度を
測定する。
で行うのが好ましい。 〈測定試薬〉 基質液 １０９ｍＭ Ｋ-りん酸緩衝液、ｐＨ７．０ １．４２％ コレステロールリノレート ０．３６％ トリトンＸ−１００ ０．２２％ フェノール ０．０３％ ４-アミノアンチピリン ５．５Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ ＣＯＤ溶液 ３００Ｕ／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ溶液 〈測定条件〉 （１）基質液２．７５ｍＬを試験管にとり、３７℃で約
５分間予備加温 する。 （２）ＣＯＤ溶液０．１ｍＬを加え、更に２分加温す
る。 （３）酵素溶液０．１ｍＬを添加し緩やかに混和後、精
製水を対照に３ ７℃に制御された分光光度計で５００
ｎｍの吸光度変化を３〜４分間 記録し、その初期直線
部分から１分間当たりの吸光度変化量を求める 。 （４）盲検はＣＯＤ溶液添加後、酵素溶液の代わりに酵
素希釈液を加え て、以下上記同様に操作して吸光度を
測定する。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、本発明は実施例により特に限定されるもので
はない。 （実施例１）エステラーゼ（東洋紡績製ＣＯＥ−３１
１）０．５Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加した下記コ
レステロール測定試薬 第一試液にエマルゲン４２０お
よびエマルゲンＡ６０の各濃度を組み合わせて添加溶解
し３５℃で１４日間保存し、残存活性（溶解直後の活性
値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。 （試薬の調製）下記組成からなるコレステロール測定試
薬の第一試薬をそれぞれ調製した。 第一試薬 ＰＩＰＥＳ ５０ｍＭ ｐＨ７．０ ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２ ０．１ｇ／Ｌ ＡＤＰＳ ０．１ｇ／Ｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２．
５Ｕ／ｍＬ アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１
１） ３Ｕ／ｍＬ
る。なお、本発明は実施例により特に限定されるもので
はない。 （実施例１）エステラーゼ（東洋紡績製ＣＯＥ−３１
１）０．５Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加した下記コ
レステロール測定試薬 第一試液にエマルゲン４２０お
よびエマルゲンＡ６０の各濃度を組み合わせて添加溶解
し３５℃で１４日間保存し、残存活性（溶解直後の活性
値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。 （試薬の調製）下記組成からなるコレステロール測定試
薬の第一試薬をそれぞれ調製した。 第一試薬 ＰＩＰＥＳ ５０ｍＭ ｐＨ７．０ ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２ ０．１ｇ／Ｌ ＡＤＰＳ ０．１ｇ／Ｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２．
５Ｕ／ｍＬ アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１
１） ３Ｕ／ｍＬ
【００１９】
【表１】
【００２０】結果 表１に示す。エマルゲン４２０とエ
ステラーゼの安定化効果を示さない界面活性剤エマルゲ
ンＡ６０との組み合わせにおいても良好な安定性が確認
された。
ステラーゼの安定化効果を示さない界面活性剤エマルゲ
ンＡ６０との組み合わせにおいても良好な安定性が確認
された。
【００２１】（実施例２）エステラーゼ（東洋紡績製Ｃ
ＯＥ−３１１）０．５Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加
した実施例５のコレステロール測定試薬にエマルゲン４
２０またはエマルゲン４３０を濃度を変えて添加した第
一試液に対し、第二試薬として下記試薬を組み合わせて
下記測定法にて濃度既知の血清を測定しコレステロール
濃度を求めた。
ＯＥ−３１１）０．５Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加
した実施例５のコレステロール測定試薬にエマルゲン４
２０またはエマルゲン４３０を濃度を変えて添加した第
一試液に対し、第二試薬として下記試薬を組み合わせて
下記測定法にて濃度既知の血清を測定しコレステロール
濃度を求めた。
【００２２】（試薬の調製）下記組成からなるコレステ
ロール測定試薬の第二試薬をそれぞれ調製した。 第二試薬 ＰＩＰＥＳ ５０ｍＭ ｐＨ７．０ アデカトールＳＯ−１２０ ８ｇ／Ｌ トリトンＸ−１００ ４ｇ／Ｌ ４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３１
１） ２Ｕ／ｍＬ
ロール測定試薬の第二試薬をそれぞれ調製した。 第二試薬 ＰＩＰＥＳ ５０ｍＭ ｐＨ７．０ アデカトールＳＯ−１２０ ８ｇ／Ｌ トリトンＸ−１００ ４ｇ／Ｌ ４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３１
１） ２Ｕ／ｍＬ
【００２３】（測定法）日立７１７０形自動分析機を用
いた。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３
７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。
その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーシ
ョンし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光
度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド
法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は、精
製水および２００ｍｇ／ｄＬコレステロール水溶液の測
定吸光度より算出しコレステロール濃度として求めた。
いた。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３
７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。
その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーシ
ョンし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光
度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド
法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は、精
製水および２００ｍｇ／ｄＬコレステロール水溶液の測
定吸光度より算出しコレステロール濃度として求めた。
【００２４】
【表２】
【００２５】結果 表２に示す。実施例ではいずれも
界面活性剤無添加の測定値をほぼ回収する。しかし、総
ＨＬＢが大きくなると測定値は相対的に低下する傾向で
ある。
界面活性剤無添加の測定値をほぼ回収する。しかし、総
ＨＬＢが大きくなると測定値は相対的に低下する傾向で
ある。
【００２６】
【発明の効果】本発明においては、エステラーゼを含有
する組成物中にポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテ
ルを共存させることで、長期間安定な液状試薬として耐
えうる安定性を有し、かつ各種試料に対し良好な反応性
を維持したエステラーゼを提供できる。
する組成物中にポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテ
ルを共存させることで、長期間安定な液状試薬として耐
えうる安定性を有し、かつ各種試料に対し良好な反応性
を維持したエステラーゼを提供できる。
Claims (10)
- 【請求項１】エステラーゼにポリオキシエチレン直鎖ア
ルキルエーテルを共存させることを特徴とする、エステ
ラーゼの安定化方法。 - 【請求項２】さらに、十分な反応性が維持されている、
請求項１記載のエステラーゼの安定化方法。 - 【請求項３】ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテル
の濃度が０．０１〜０．５％である請求項２記載のエス
テラーゼの安定化方法。 - 【請求項４】ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテル
のＨＬＢが１５以下である請求項２記載のエステラーゼ
の安定化方法。 - 【請求項５】エステラーゼがさらにリパーゼ活性を有す
る請求項１〜４記載のエステラーゼの安定化方法。 - 【請求項６】エステラーゼにポリオキシエチレン直鎖ア
ルキルエーテルを共存させることを特徴とするエステラ
ーゼの安定化組成物。 - 【請求項７】ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテル
の濃度が０．０１〜０．５％である請求項６記載のエス
テラーゼの安定化組成物。 - 【請求項８】更にエステラーゼ活性化剤と組み合わせて
用いられる請求項６、７記載のエステラーゼの安定化組
成物。 - 【請求項９】エステラーゼ活性化剤がポリオキシエチレ
ン２級アルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニ
ルエーテルから選ばれた少なくとも１種の界面活性剤で
ある請求項８記載のエステラーゼの安定化組成物。 - 【請求項１０】ＨＬＢが１５以下のポリオキシエチレン
直鎖アルキルエーテルと、エステラーゼ活性化剤の総Ｈ
ＬＢが１２〜１４である請求項８、９記載のエステラー
ゼの安定化組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001183882A JP2003000236A (ja) | 2001-06-18 | 2001-06-18 | エステラーゼの安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001183882A JP2003000236A (ja) | 2001-06-18 | 2001-06-18 | エステラーゼの安定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003000236A true JP2003000236A (ja) | 2003-01-07 |
Family
ID=19023749
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001183882A Ceased JP2003000236A (ja) | 2001-06-18 | 2001-06-18 | エステラーゼの安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003000236A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009298874A (ja) * | 2008-06-11 | 2009-12-24 | Nippon Paint Co Ltd | エポキシ基含有アクリル系樹脂水分散体および水系硬化性樹脂組成物 |
| JP2016034252A (ja) * | 2014-08-04 | 2016-03-17 | 東洋紡株式会社 | コレステロールエステラーゼの安定化方法およびその試薬 |
| WO2019181911A1 (ja) * | 2018-03-23 | 2019-09-26 | 東洋紡株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59173080A (ja) * | 1983-03-19 | 1984-09-29 | Nippon Oil & Fats Co Ltd | リパ−ゼの安定化方法 |
| JPS60224499A (ja) * | 1984-04-23 | 1985-11-08 | Toyobo Co Ltd | 安定なウリカ−ゼ製剤 |
| JPH05123170A (ja) * | 1991-11-08 | 1993-05-21 | Daicel Chem Ind Ltd | 新規リパーゼ |
| JPH0951797A (ja) * | 1995-08-17 | 1997-02-25 | Tama Seikagaku Kk | 高度不飽和脂肪酸アルコールエステルの製造方法 |
| JP2000019468A (ja) * | 1998-06-30 | 2000-01-21 | Lion Corp | コンタクトレンズ用洗浄シート |
| WO2000057191A1 (fr) * | 1999-03-24 | 2000-09-28 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Procede de quantification du cholesterol |
| JP2001204461A (ja) * | 2000-01-26 | 2001-07-31 | Toyobo Co Ltd | リパーゼの安定化方法およびリパーゼ組成物 |
-
2001
- 2001-06-18 JP JP2001183882A patent/JP2003000236A/ja not_active Ceased
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| JPWO2019181911A1 (ja) * | 2018-03-23 | 2021-03-11 | 東洋紡株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
| JP7294319B2 (ja) | 2018-03-23 | 2023-06-20 | 東洋紡株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
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