JP4013108B2 - リパーゼの安定化方法 - Google Patents
リパーゼの安定化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4013108B2 JP4013108B2 JP2001180549A JP2001180549A JP4013108B2 JP 4013108 B2 JP4013108 B2 JP 4013108B2 JP 2001180549 A JP2001180549 A JP 2001180549A JP 2001180549 A JP2001180549 A JP 2001180549A JP 4013108 B2 JP4013108 B2 JP 4013108B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipase
- registered trademark
- polyoxyethylene
- reagent
- neutral fat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリパーゼの安定化方法およびその組成物に関する。特に臨床診断に用いられる生体成分中の中性脂肪（以下トリグリセライドとも称する）測定試薬に用いられるリパーゼの安定化方法およびその組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リパーゼは中性脂肪測定試薬の主反応酵素として診断用試薬に使用され重要視されている。リパーゼを用いる中性脂肪測定法は種々報告されているが、リパーゼの作用により生成したグリセロールを更にグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼを用いて測定する方法、グリセロールをグリセロールデヒドロゲナーゼを用いて測定する方法、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸デヒドロゲナーゼを用いて測定する方法、グリセロールキナーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼを用いて測定する方法がある。これらリパーゼを用いる試薬の正確性はこれら酵素の反応性、安定性が寄与しており、益々反応性、安定性に対する要求が高まっている。
【０００３】
リパーゼの安定性を維持するために、安定化剤としてグリセロール、グリシン（Methods Enzymol．129,691(1986)）、メルカプトエタノール(J.Biol.Chem.,247,6212(1972))、トリトンＸ−１００(Enzyme Handbook,3,Springer-Verlag(1991))、トリトンＮ−１０１、デオキシコール酸(Methods Enzymol.129,716(1986))、Ｍｇ2+、ＢＳＡ（東洋紡績（株）酵素カタログ）、塩類（特開昭６４−６０３８１）等の添加が知られているが、試薬溶液中で求められる安定性を維持するには不十分であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
近年、臨床検査においては益々精度管理の重要性が高まっている。その中で中性脂肪測定試薬においては、測定試薬によりトリオレイン水溶液、患者検体、管理血清等各試料に対するリパーゼの反応性が異なることから測定値が変動する点が問題視されている。また、診断用試薬では液状試薬が主流になっているが、中性脂肪測定試薬ではこのようなリパーゼの反応性を液状状態で長期間維持する必要性から益々液状安定性に対する要求が強くなっている。
このことから、本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有し、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持したリパーゼを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、リパーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることにより、リパーゼを液状状態で長期間安定に保ち、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）
リパーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることを特徴とする、リパーゼの安定化方法。
（２）
さらに、十分な反応性が維持されている、（１）記載のリパーゼの安定化方法。（３）
ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルの濃度が０．０１〜０．５％である（２）記載のリパーゼの安定化方法。
（４）
ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルのＨＬＢが１５以下である（２）記載のリパーゼの安定化方法。
（５）
リパーゼがさらにエステラーゼ活性を有する（１）〜（４）記載のリパーゼの安定化方法。
（６）
リパーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることを特徴とするリパーゼの安定化組成物。
（７）
ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルの濃度が０．０１〜０．５％である（６）記載のリパーゼの安定化組成物。
（８）
更にリパーゼ活性化剤と組み合わせて用いられる（６）、（７）記載のリパーゼの安定化組成物。
（９）
リパーゼ活性化剤がポリオキシエチレン２級アルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルから選ばれた少なくとも１種の界面活性剤である（８）記載のリパーゼの安定化組成物。
（１０）
ＨＬＢが１５以下のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルと、リパーゼ活性化剤の総ＨＬＢが１２〜１４である（８）、（９）記載のリパーゼの安定化組成物。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において「安定」とは、加温処理に対しても酵素活性が維持されていることを意味し、具体的には、ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを、５0mM HEPES (pH7.5)緩衝液中に、２Ｕ／ｍＬのリパーゼと共存させたとき、３５℃１４日間保存後の残存酵素活性が加温処理していないものと比較して、６０％以上（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）維持されていることをいう。
【０００７】
本発明において「十分な反応性」とは、中性脂肪をリパーゼによりグリセロール、および脂肪酸に分解し、生成したグリセロールの量を追随反応を介して求めることにより中性脂肪を測定する際に、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン溶液の測定吸光度を対照とし算出した中性脂肪濃度が、３０００ｍｇ／ｄＬ以下の範囲において理論値を回収することを意味し、具体的には測定値が理論値の９５％を下回らないことを意味する。
【０００８】
本発明の一実施態様として、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、リパーゼ活性化剤等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬において、リパーゼを含む試薬にポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることを特徴とするリパーゼの安定化方法がある。
【０００９】
本発明で用いるポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル類としてエマルゲン（登録商標）１０４Ｐ（ＨＬＢ９．６）、エマルゲン（登録商標）１０５（ＨＬＢ９．７）、エマルゲン（登録商標）１０６（ＨＬＢ１０．５）、エマルゲン（登録商標）１０８（ＨＬＢ１２．１）、エマルゲン（登録商標）１０９Ｐ（ＨＬＢ１３．６）、エマルゲン（登録商標）１２０（ＨＬＢ１５．３）、エマルゲン（登録商標）１２３Ｐ（ＨＬＢ１６．９）、エマルゲン（登録商標）１４７（ＨＬＢ１６．３）、エマルゲン（登録商標）１３０Ｋ（ＨＬＢ１８．１）、ノニオン（登録商標）Ｋ−２０４（ＨＬＢ９．２）、ノニオン（登録商標）Ｋ−２１５（ＨＬＢ１５．２）、ノニオン（登録商標）Ｋ−２２０（ＨＬＢ１６．２）、ノニオン（登録商標）Ｋ−２３０（ＨＬＢ１７．３）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２（ＨＬＢ９．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−４．２（ＨＬＢ１１．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−９ＥＸ（ＨＬＢ１４．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２１（ＨＬＢ１９）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２５（ＨＬＢ１９．５）、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）２１０（ＨＬＢ１０．７）、エマルゲン（登録商標）２２０（ＨＬＢ１４．２）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２（ＨＬＢ８．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−５．５（ＨＬＢ１０．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−７（ＨＬＢ１１．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−１０ＴＸ（ＨＬＢ１３．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−１５ＴＸ（ＨＬＢ１５．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２０ＴＸ（ＨＬＢ１７）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２３（ＨＬＢ１８）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２５ＴＸ（ＨＬＢ１８．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−３０ＴＸ（ＨＬＢ１９．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−４０ＴＸ（ＨＬＢ２０）、ノニオン（登録商標）Ｐ−２０８（ＨＬＢ１１．９）、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１０（ＨＬＢ１２．９）、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１３（ＨＬＢ１４．１）、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）３０６Ｐ（ＨＬＢ９．４）、エマルゲン（登録商標）３２０Ｐ（ＨＬＢ１３．９）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−２（ＨＬＢ８．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−４（ＨＬＢ９．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−２０（ＨＬＢ１８）、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０６（ＨＬＢ１０．１）、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０７（ＨＬＢ１０．７）、ノニオン（登録商標）Ｓ−２１５（ＨＬＢ１４．２）、ノニオン（登録商標）Ｓ−２２０（ＨＬＢ１５．３）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）４０４（ＨＬＢ８．８）、エマルゲン（登録商標）４０８（ＨＬＢ１０．０）、エマルゲン（登録商標）４０９Ｐ（ＨＬＢ１２．０）、エマルゲン（登録商標）４２０（ＨＬＢ１３．６）、エマルゲン（登録商標）４３０（ＨＬＢ１６．２）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−２（ＨＬＢ７．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−７（ＨＬＢ１０．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−１０ＴＸ（ＨＬＢ１４．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−２０（ＨＬＢ１７．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−５０（ＨＬＢ１８．０）、ノニオン（登録商標）Ｅ−２０６（ＨＬＢ９．５）、ノニオン（登録商標）Ｅ−２１５（ＨＬＢ１４．２）、ノニオン（登録商標）Ｅ−２３０（ＨＬＢ１６．６）、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−５（ＨＬＢ７．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−１０（ＨＬＢ１０．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−２０（ＨＬＢ１６．５）ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−３０（ＨＬＢ１８）等が挙げられる。
【００１０】
これらの界面活性剤は単独または２種以上または他の界面活性剤と組み合わせて用いることができる。また、各界面活性剤のＨＬＢは特に限定されず、リパーゼの反応性を考慮し選択されるべきであるが、好ましくは単独でのＨＬＢが１５以下、さらには１４以下がリパーゼの反応性への影響が少ない点で好ましい。中でも１２〜１３が好ましい。また、ポリオキシエチレン部分の重合度は好ましくは３０以下であり、さらには２０以下がリパーゼの反応性への影響が少ない点で好ましい。中でも７〜１０が好ましい。また、リパーゼを含む溶液中の濃度としては特に限定するものではないが、好ましくは０．０１％〜０．５％の範囲であり、さらには０．０２％〜０．２％がリパーゼの反応性への影響が少ない点で好ましい。中でも０．０５％〜０．１５％が好ましい。
【００１１】
本発明は、更にリパーゼ活性化剤と組み合わせて用いることが出来る。本発明に用いるリパーゼ活性化剤としては、リパーゼの反応性を向上させる物質であればよく、特に限定されない。好ましくはポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルとリパーゼが共存する反応混液において、該物質の添加によりリパーゼの反応性が向上するものである。このような活性化剤として例えばポリオキシエチレン２級アルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル、脂肪酸が挙げられる。ポリオキシエチレン２級アルキルエーテルとしては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−９、アデカトール（登録商標）ＳＯ−８０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１０５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１２０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１３５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１４５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１６０、エマルゲン（登録商標）７０５、エマルゲン（登録商標）７０７、エマルゲン（登録商標）７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルとしてはエマルゲン（登録商標）Ａ６０、エマルゲン（登録商標）Ａ９０、が挙げられる。脂肪酸としてはコール酸が挙げられる。
【００１２】
これらリパーゼ活性化剤は単独または２種以上の活性化剤を組み合わせて用いられる。本発明のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを含むリパーゼ安定化組成物に対する混合方法は特に限定されず、リパーゼ反応の直前に混合してもよいし、あらかじめ混合し保存して使用できる。また、該活性化剤のリパーゼ溶液中の濃度は特に限定するものではないが、本発明のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを含むリパーゼ安定化組成物にあらかじめ混合して保存する場合は、ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルに対する活性化剤の相対濃度を好ましくは約５０倍以下（さらに好ましくは２０倍以下、中でも好ましくは１０倍以下）にし安定化効果を考慮して用いることができる。該活性化剤が非イオン性界面活性剤の場合は各界面活性剤の（ＨＬＢ）×（添加量）を界面活性剤の添加量の総和で割った総ＨＬＢが１２〜１４であるのが好ましい。さらには１２．５〜１３．５が好ましい。中でも約１３が好ましい。
【００１３】
また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。該緩衝液のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには６〜８が好ましい。中でも６．５〜７．５が好ましい。
【００１４】
本発明のリパーゼとはＥＣ３．１．１．３４に分類される以下の反応を触媒する酵素も含まれる。
トリグリセライド＋Ｏ2→モノグリセリド（またはジグリセリド）＋脂肪酸
上記酵素はシュードモナス属、リゾプス属などの微生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものを含有する。また、これら酵素の特異性、安定性を向上させる目的または反応セルに吸着する性質を改変する目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものも用いられる。
【００１５】
リパーゼを含む溶液中のリパーゼの濃度は、酵素の起源によっても異なるが、通常０．１〜２０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。さらには１〜５Ｕ／ｍＬが好ましい。中でも１〜３Ｕ／ｍＬが好ましい。
【００１６】
本発明において、リパーゼ溶液には、さらに防腐剤などをリパーゼの反応に特に悪い影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
【００１７】
また、該リパーゼ溶液中には診断用試薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。中性脂肪測定試薬としては、一般にリパーゼの他、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色源体が含有される。
【００１８】
リパーゼの活性測定は以下の測定条件で行うのが好ましい。
〈測定試薬〉
（１）基質液
オリーブ油エマルジョン液
（２）発色液
５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５
０．１％ トリトンＸ−１００溶液
０．２ｍＬ／Ｌ Ｎ，Ｎ-ジエチル−ｍ−トルイジン
０．０２ｇ／Ｌ ４-アミノアンチピリン
０．１２１ｇ／Ｌ ＡＴＰ・２Ｎａ・３Ｈ2Ｏ
０．２０４ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム・６水和物
１ＫＵ／Ｌ グリセロールキナーゼ
２．５ＫＵ／Ｌ グリセロリン酸オキシダーゼ
１．５ＫＵ／Ｌ ペルオキシダーゼ
〈測定条件〉
（１）オリーブ油エマルジョン液２ｍＬを試験管にとり、３７℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．２ｍＬを加え、反応を開始する。
（３）３７℃で正確に１５分間反応させた後、０．２Ｍ トリクロロ酢酸溶液２．０ｍＬを加えて反応を停止する。
（４）生成する不要物を濾紙濾過で除く。
（５）濾液の０．０５ｍＬを試験管にとり、発色試液３．０ｍＬを加えて混合した後、３７℃にて１５分間加温し、５４５ｎｍにおける吸光度を測定する。
（６）盲検はオリーブ油エマルジョン液２．０ｍＬを３７℃で１５分間放置後、トリクロロ酢酸溶液２．０ｍＬを加えて調製し、以下上記同様に操作して吸光度を測定する。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
リパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１４）２Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加した下記の中性脂肪測定試薬 第二試液に添加溶解し３５℃で１４日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２０】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第二試薬をそれぞれ調製した。
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
塩化マグネシウム・６水和物 ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｇ／Ｌ
ＡＤＰＳ ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２．９Ｕ／ｍＬ
リパーゼ（東洋紡社製ＬＰＬ−３１４） ２Ｕ／ｍＬ
各種界面活性剤 名称・ＨＬＢ・濃度は表に記載
【００２１】
【表１】
【００２２】
結果 表１に示す。比較例では６０％未満まで活性が低下するのに対し、実施例では保存後も良好な安定性を示す。
【００２３】
（実施例２）リパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１４）２Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加した実施例１の中性脂肪測定試薬 第二試液にエマルゲン（登録商標）４２０を濃度を変えて添加溶解し３５℃で１４日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２４】
【表２】
【００２５】
結果 表２に示す。少なくとも０．０１％で良好な安定性を示す。
【００２６】
（実施例３）リパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１４）２Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加した実施例１の中性脂肪測定試薬 第二試液にエマルゲン（登録商標）４２０およびエマルゲン（登録商標）Ａ６０の各濃度を組み合わせて添加溶解し３５℃で１４日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２７】
【表３】
【００２８】
結果 表３に示す。エマルゲン（登録商標）４２０と、リパーゼの安定化効果を示さない界面活性剤エマルゲン（登録商標）Ａ６０との組み合わせにおいても良好な安定性が確認された。
【００２９】
（実施例４）リパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１４）２Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加した実施例１の中性脂肪測定試薬にエマルゲン（登録商標）１０８、またはエマルゲン（登録商標）４３０を濃度を変えて添加した第二試液に対し、第一試薬として下記試薬を組み合わせて下記測定法にて濃度既知の血清を測定し中性脂肪濃度を求めた。
【００３０】
（試薬の調製）下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬 ＰＩＰＥＳ ５０ｍＭ ｐＨ７．０ ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ／Ｌ アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 １．２ｇ／Ｌ エマルゲン（登録商標）Ａ６０ ４ｇ／Ｌ トリトンＸ−１００（ＨＬＢ１３．５） ２ｇ／Ｌ ４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
【００３１】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求めた。
【００３２】
【表４】
【００３３】
結果 表４に示す。実施例ではいずれも界面活性剤無添加の測定値をほぼ回収する。
【００３４】
【発明の効果】
本発明においては、リパーゼを含有する組成物中にポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることで、長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有し、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持したリパーゼを提供できる。
【発明の属する技術分野】
本発明はリパーゼの安定化方法およびその組成物に関する。特に臨床診断に用いられる生体成分中の中性脂肪（以下トリグリセライドとも称する）測定試薬に用いられるリパーゼの安定化方法およびその組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リパーゼは中性脂肪測定試薬の主反応酵素として診断用試薬に使用され重要視されている。リパーゼを用いる中性脂肪測定法は種々報告されているが、リパーゼの作用により生成したグリセロールを更にグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼを用いて測定する方法、グリセロールをグリセロールデヒドロゲナーゼを用いて測定する方法、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸デヒドロゲナーゼを用いて測定する方法、グリセロールキナーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼを用いて測定する方法がある。これらリパーゼを用いる試薬の正確性はこれら酵素の反応性、安定性が寄与しており、益々反応性、安定性に対する要求が高まっている。
【０００３】
リパーゼの安定性を維持するために、安定化剤としてグリセロール、グリシン（Methods Enzymol．129,691(1986)）、メルカプトエタノール(J.Biol.Chem.,247,6212(1972))、トリトンＸ−１００(Enzyme Handbook,3,Springer-Verlag(1991))、トリトンＮ−１０１、デオキシコール酸(Methods Enzymol.129,716(1986))、Ｍｇ2+、ＢＳＡ（東洋紡績（株）酵素カタログ）、塩類（特開昭６４−６０３８１）等の添加が知られているが、試薬溶液中で求められる安定性を維持するには不十分であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
近年、臨床検査においては益々精度管理の重要性が高まっている。その中で中性脂肪測定試薬においては、測定試薬によりトリオレイン水溶液、患者検体、管理血清等各試料に対するリパーゼの反応性が異なることから測定値が変動する点が問題視されている。また、診断用試薬では液状試薬が主流になっているが、中性脂肪測定試薬ではこのようなリパーゼの反応性を液状状態で長期間維持する必要性から益々液状安定性に対する要求が強くなっている。
このことから、本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有し、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持したリパーゼを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、リパーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることにより、リパーゼを液状状態で長期間安定に保ち、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）
リパーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることを特徴とする、リパーゼの安定化方法。
（２）
さらに、十分な反応性が維持されている、（１）記載のリパーゼの安定化方法。（３）
ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルの濃度が０．０１〜０．５％である（２）記載のリパーゼの安定化方法。
（４）
ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルのＨＬＢが１５以下である（２）記載のリパーゼの安定化方法。
（５）
リパーゼがさらにエステラーゼ活性を有する（１）〜（４）記載のリパーゼの安定化方法。
（６）
リパーゼにポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることを特徴とするリパーゼの安定化組成物。
（７）
ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルの濃度が０．０１〜０．５％である（６）記載のリパーゼの安定化組成物。
（８）
更にリパーゼ活性化剤と組み合わせて用いられる（６）、（７）記載のリパーゼの安定化組成物。
（９）
リパーゼ活性化剤がポリオキシエチレン２級アルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルから選ばれた少なくとも１種の界面活性剤である（８）記載のリパーゼの安定化組成物。
（１０）
ＨＬＢが１５以下のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルと、リパーゼ活性化剤の総ＨＬＢが１２〜１４である（８）、（９）記載のリパーゼの安定化組成物。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において「安定」とは、加温処理に対しても酵素活性が維持されていることを意味し、具体的には、ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを、５0mM HEPES (pH7.5)緩衝液中に、２Ｕ／ｍＬのリパーゼと共存させたとき、３５℃１４日間保存後の残存酵素活性が加温処理していないものと比較して、６０％以上（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）維持されていることをいう。
【０００７】
本発明において「十分な反応性」とは、中性脂肪をリパーゼによりグリセロール、および脂肪酸に分解し、生成したグリセロールの量を追随反応を介して求めることにより中性脂肪を測定する際に、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン溶液の測定吸光度を対照とし算出した中性脂肪濃度が、３０００ｍｇ／ｄＬ以下の範囲において理論値を回収することを意味し、具体的には測定値が理論値の９５％を下回らないことを意味する。
【０００８】
本発明の一実施態様として、第一試薬としてグリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、リパーゼ活性化剤等を含有し、第二試薬としてリパーゼ、ペルオキシダーゼ等を含有する２試薬系からなる中性脂肪測定試薬において、リパーゼを含む試薬にポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることを特徴とするリパーゼの安定化方法がある。
【０００９】
本発明で用いるポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル類としてエマルゲン（登録商標）１０４Ｐ（ＨＬＢ９．６）、エマルゲン（登録商標）１０５（ＨＬＢ９．７）、エマルゲン（登録商標）１０６（ＨＬＢ１０．５）、エマルゲン（登録商標）１０８（ＨＬＢ１２．１）、エマルゲン（登録商標）１０９Ｐ（ＨＬＢ１３．６）、エマルゲン（登録商標）１２０（ＨＬＢ１５．３）、エマルゲン（登録商標）１２３Ｐ（ＨＬＢ１６．９）、エマルゲン（登録商標）１４７（ＨＬＢ１６．３）、エマルゲン（登録商標）１３０Ｋ（ＨＬＢ１８．１）、ノニオン（登録商標）Ｋ−２０４（ＨＬＢ９．２）、ノニオン（登録商標）Ｋ−２１５（ＨＬＢ１５．２）、ノニオン（登録商標）Ｋ−２２０（ＨＬＢ１６．２）、ノニオン（登録商標）Ｋ−２３０（ＨＬＢ１７．３）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２（ＨＬＢ９．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−４．２（ＨＬＢ１１．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−９ＥＸ（ＨＬＢ１４．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２１（ＨＬＢ１９）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２５（ＨＬＢ１９．５）、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）２１０（ＨＬＢ１０．７）、エマルゲン（登録商標）２２０（ＨＬＢ１４．２）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２（ＨＬＢ８．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−５．５（ＨＬＢ１０．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−７（ＨＬＢ１１．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−１０ＴＸ（ＨＬＢ１３．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−１５ＴＸ（ＨＬＢ１５．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２０ＴＸ（ＨＬＢ１７）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２３（ＨＬＢ１８）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２５ＴＸ（ＨＬＢ１８．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−３０ＴＸ（ＨＬＢ１９．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−４０ＴＸ（ＨＬＢ２０）、ノニオン（登録商標）Ｐ−２０８（ＨＬＢ１１．９）、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１０（ＨＬＢ１２．９）、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１３（ＨＬＢ１４．１）、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）３０６Ｐ（ＨＬＢ９．４）、エマルゲン（登録商標）３２０Ｐ（ＨＬＢ１３．９）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−２（ＨＬＢ８．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−４（ＨＬＢ９．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−２０（ＨＬＢ１８）、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０６（ＨＬＢ１０．１）、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０７（ＨＬＢ１０．７）、ノニオン（登録商標）Ｓ−２１５（ＨＬＢ１４．２）、ノニオン（登録商標）Ｓ−２２０（ＨＬＢ１５．３）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）４０４（ＨＬＢ８．８）、エマルゲン（登録商標）４０８（ＨＬＢ１０．０）、エマルゲン（登録商標）４０９Ｐ（ＨＬＢ１２．０）、エマルゲン（登録商標）４２０（ＨＬＢ１３．６）、エマルゲン（登録商標）４３０（ＨＬＢ１６．２）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−２（ＨＬＢ７．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−７（ＨＬＢ１０．５）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−１０ＴＸ（ＨＬＢ１４．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−２０（ＨＬＢ１７．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−５０（ＨＬＢ１８．０）、ノニオン（登録商標）Ｅ−２０６（ＨＬＢ９．５）、ノニオン（登録商標）Ｅ−２１５（ＨＬＢ１４．２）、ノニオン（登録商標）Ｅ−２３０（ＨＬＢ１６．６）、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−５（ＨＬＢ７．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−１０（ＨＬＢ１０．０）、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−２０（ＨＬＢ１６．５）ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−３０（ＨＬＢ１８）等が挙げられる。
【００１０】
これらの界面活性剤は単独または２種以上または他の界面活性剤と組み合わせて用いることができる。また、各界面活性剤のＨＬＢは特に限定されず、リパーゼの反応性を考慮し選択されるべきであるが、好ましくは単独でのＨＬＢが１５以下、さらには１４以下がリパーゼの反応性への影響が少ない点で好ましい。中でも１２〜１３が好ましい。また、ポリオキシエチレン部分の重合度は好ましくは３０以下であり、さらには２０以下がリパーゼの反応性への影響が少ない点で好ましい。中でも７〜１０が好ましい。また、リパーゼを含む溶液中の濃度としては特に限定するものではないが、好ましくは０．０１％〜０．５％の範囲であり、さらには０．０２％〜０．２％がリパーゼの反応性への影響が少ない点で好ましい。中でも０．０５％〜０．１５％が好ましい。
【００１１】
本発明は、更にリパーゼ活性化剤と組み合わせて用いることが出来る。本発明に用いるリパーゼ活性化剤としては、リパーゼの反応性を向上させる物質であればよく、特に限定されない。好ましくはポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルとリパーゼが共存する反応混液において、該物質の添加によりリパーゼの反応性が向上するものである。このような活性化剤として例えばポリオキシエチレン２級アルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル、脂肪酸が挙げられる。ポリオキシエチレン２級アルキルエーテルとしては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−９、アデカトール（登録商標）ＳＯ−８０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１０５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１２０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１３５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１４５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１６０、エマルゲン（登録商標）７０５、エマルゲン（登録商標）７０７、エマルゲン（登録商標）７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルとしてはエマルゲン（登録商標）Ａ６０、エマルゲン（登録商標）Ａ９０、が挙げられる。脂肪酸としてはコール酸が挙げられる。
【００１２】
これらリパーゼ活性化剤は単独または２種以上の活性化剤を組み合わせて用いられる。本発明のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを含むリパーゼ安定化組成物に対する混合方法は特に限定されず、リパーゼ反応の直前に混合してもよいし、あらかじめ混合し保存して使用できる。また、該活性化剤のリパーゼ溶液中の濃度は特に限定するものではないが、本発明のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを含むリパーゼ安定化組成物にあらかじめ混合して保存する場合は、ポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルに対する活性化剤の相対濃度を好ましくは約５０倍以下（さらに好ましくは２０倍以下、中でも好ましくは１０倍以下）にし安定化効果を考慮して用いることができる。該活性化剤が非イオン性界面活性剤の場合は各界面活性剤の（ＨＬＢ）×（添加量）を界面活性剤の添加量の総和で割った総ＨＬＢが１２〜１４であるのが好ましい。さらには１２．５〜１３．５が好ましい。中でも約１３が好ましい。
【００１３】
また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。該緩衝液のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには６〜８が好ましい。中でも６．５〜７．５が好ましい。
【００１４】
本発明のリパーゼとはＥＣ３．１．１．３４に分類される以下の反応を触媒する酵素も含まれる。
トリグリセライド＋Ｏ2→モノグリセリド（またはジグリセリド）＋脂肪酸
上記酵素はシュードモナス属、リゾプス属などの微生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものを含有する。また、これら酵素の特異性、安定性を向上させる目的または反応セルに吸着する性質を改変する目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものも用いられる。
【００１５】
リパーゼを含む溶液中のリパーゼの濃度は、酵素の起源によっても異なるが、通常０．１〜２０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。さらには１〜５Ｕ／ｍＬが好ましい。中でも１〜３Ｕ／ｍＬが好ましい。
【００１６】
本発明において、リパーゼ溶液には、さらに防腐剤などをリパーゼの反応に特に悪い影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
【００１７】
また、該リパーゼ溶液中には診断用試薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。中性脂肪測定試薬としては、一般にリパーゼの他、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色源体が含有される。
【００１８】
リパーゼの活性測定は以下の測定条件で行うのが好ましい。
〈測定試薬〉
（１）基質液
オリーブ油エマルジョン液
（２）発色液
５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５
０．１％ トリトンＸ−１００溶液
０．２ｍＬ／Ｌ Ｎ，Ｎ-ジエチル−ｍ−トルイジン
０．０２ｇ／Ｌ ４-アミノアンチピリン
０．１２１ｇ／Ｌ ＡＴＰ・２Ｎａ・３Ｈ2Ｏ
０．２０４ｇ／Ｌ 塩化マグネシウム・６水和物
１ＫＵ／Ｌ グリセロールキナーゼ
２．５ＫＵ／Ｌ グリセロリン酸オキシダーゼ
１．５ＫＵ／Ｌ ペルオキシダーゼ
〈測定条件〉
（１）オリーブ油エマルジョン液２ｍＬを試験管にとり、３７℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．２ｍＬを加え、反応を開始する。
（３）３７℃で正確に１５分間反応させた後、０．２Ｍ トリクロロ酢酸溶液２．０ｍＬを加えて反応を停止する。
（４）生成する不要物を濾紙濾過で除く。
（５）濾液の０．０５ｍＬを試験管にとり、発色試液３．０ｍＬを加えて混合した後、３７℃にて１５分間加温し、５４５ｎｍにおける吸光度を測定する。
（６）盲検はオリーブ油エマルジョン液２．０ｍＬを３７℃で１５分間放置後、トリクロロ酢酸溶液２．０ｍＬを加えて調製し、以下上記同様に操作して吸光度を測定する。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
リパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１４）２Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加した下記の中性脂肪測定試薬 第二試液に添加溶解し３５℃で１４日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２０】
（試薬の調製）
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第二試薬をそれぞれ調製した。
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
塩化マグネシウム・６水和物 ０．２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｇ／Ｌ
ＡＤＰＳ ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２．９Ｕ／ｍＬ
リパーゼ（東洋紡社製ＬＰＬ−３１４） ２Ｕ／ｍＬ
各種界面活性剤 名称・ＨＬＢ・濃度は表に記載
【００２１】
【表１】
結果 表１に示す。比較例では６０％未満まで活性が低下するのに対し、実施例では保存後も良好な安定性を示す。
【００２３】
（実施例２）リパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１４）２Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加した実施例１の中性脂肪測定試薬 第二試液にエマルゲン（登録商標）４２０を濃度を変えて添加溶解し３５℃で１４日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２４】
【表２】
結果 表２に示す。少なくとも０．０１％で良好な安定性を示す。
【００２６】
（実施例３）リパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１４）２Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加した実施例１の中性脂肪測定試薬 第二試液にエマルゲン（登録商標）４２０およびエマルゲン（登録商標）Ａ６０の各濃度を組み合わせて添加溶解し３５℃で１４日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００２７】
【表３】
結果 表３に示す。エマルゲン（登録商標）４２０と、リパーゼの安定化効果を示さない界面活性剤エマルゲン（登録商標）Ａ６０との組み合わせにおいても良好な安定性が確認された。
【００２９】
（実施例４）リパーゼ（東洋紡績製ＬＰＬ−３１４）２Ｕ／ｍＬを各種界面活性剤を添加した実施例１の中性脂肪測定試薬にエマルゲン（登録商標）１０８、またはエマルゲン（登録商標）４３０を濃度を変えて添加した第二試液に対し、第一試薬として下記試薬を組み合わせて下記測定法にて濃度既知の血清を測定し中性脂肪濃度を求めた。
【００３０】
（試薬の調製）下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬 ＰＩＰＥＳ ５０ｍＭ ｐＨ７．０ ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ／Ｌ アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 １．２ｇ／Ｌ エマルゲン（登録商標）Ａ６０ ４ｇ／Ｌ トリトンＸ−１００（ＨＬＢ１３．５） ２ｇ／Ｌ ４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ グリセロリン酸オキシダーゼ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ
【００３１】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．１μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求めた。
【００３２】
【表４】
結果 表４に示す。実施例ではいずれも界面活性剤無添加の測定値をほぼ回収する。
【００３４】
【発明の効果】
本発明においては、リパーゼを含有する組成物中にポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることで、長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有し、かつ各種試料に対し良好な反応性を維持したリパーゼを提供できる。
Claims (5)
- リパーゼに、濃度が０．０１〜０．５％の、ポリオキシエチレンラウリルエーテルまたはポリオキシエチレンオレイルエーテルであって、ＨＬＢが１５以下のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることを特徴とする、中性脂肪測定試薬中のリパーゼの安定化方法。
- 更にポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルと組み合わせて用いられる請求項１記載の中性脂肪測定試薬中のリパーゼの安定化方法。
- 中性脂肪をリパーゼによりグリセロール、および脂肪酸に分解し、生成したグリセロールの量を追随反応を介して求めることにより中性脂肪を測定する際に、精製水および２００ｍｇ／ｄＬトリオレイン溶液の測定吸光度を対照とし算出した中性脂肪濃度が、３０００ｍｇ／ｄＬ以下の範囲において測定値が理論値の９５％を下回らない反応性が維持されている、請求項１記載の中性脂肪測定試薬中のリパーゼの安定化方法。
- リパーゼに、濃度が０．０１〜０．５％の、ポリオキシエチレンラウリルエーテルまたはポリオキシエチレンオレイルエーテルであって、ＨＬＢが１５以下のポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルを共存させることを特徴とする、リパーゼが安定化した中性脂肪測定試薬組成物。
- 更にポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルと組み合わせて用いられる請求項４記載のリパーゼが安定化した中性脂肪測定試薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001180549A JP4013108B2 (ja) | 2001-06-14 | 2001-06-14 | リパーゼの安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001180549A JP4013108B2 (ja) | 2001-06-14 | 2001-06-14 | リパーゼの安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002369681A JP2002369681A (ja) | 2002-12-24 |
| JP4013108B2 true JP4013108B2 (ja) | 2007-11-28 |
Family
ID=19020953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001180549A Expired - Lifetime JP4013108B2 (ja) | 2001-06-14 | 2001-06-14 | リパーゼの安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4013108B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011126067A1 (ja) * | 2010-04-09 | 2011-10-13 | 東洋紡績株式会社 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
| US9121016B2 (en) * | 2011-09-09 | 2015-09-01 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains |
| US8911986B2 (en) * | 2011-04-29 | 2014-12-16 | Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. | Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains |
| JP6603961B2 (ja) | 2014-08-12 | 2019-11-13 | 株式会社シノテスト | リパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び製造の簡略化方法 |
| DE102017104480A1 (de) * | 2017-03-03 | 2018-09-06 | Nordmark Arzneimittel Gmbh & Co. Kg | Wässrige Lösung von Burlulipase umfassend Kalziumionen |
-
2001
- 2001-06-14 JP JP2001180549A patent/JP4013108B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002369681A (ja) | 2002-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4543326A (en) | Stabilization of oxidase | |
| EP1813680B1 (en) | Compositions for lipase activity determination and method of determining activity | |
| Noma et al. | Polarographic method for rapid microdetermination of cholesterol with cholesterol esterase and cholesterol oxidase. | |
| US4503146A (en) | Method for eliminating turbidity in a biological fluid and reagent therefor | |
| JP4013108B2 (ja) | リパーゼの安定化方法 | |
| JP4639287B2 (ja) | 酵素的測定試薬の安定化方法 | |
| JPH01108997A (ja) | 血液又は血液から導出した試料中の血清のフルクトスアミン含量を特異的に測定する方法及び試薬、及び非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去する方法 | |
| JP6582369B2 (ja) | コレステロールエステラーゼの安定化方法およびその試薬 | |
| US4868139A (en) | Aqueous cholesterol standard solution and process for its preparation | |
| JP2885453B2 (ja) | ビリルビン影響を回避したリパーゼ活性測定用試薬組成物 | |
| US4816411A (en) | Method for eliminating turbidity in a biological fluid and reagent therefor | |
| JPH0443640B2 (ja) | ||
| JP4130724B2 (ja) | キレート物質を含む測定試薬 | |
| JP4022799B2 (ja) | 電解質測定用試薬組成物 | |
| JPH07155196A (ja) | 生体成分の測定法 | |
| JP2003000236A (ja) | エステラーゼの安定化方法 | |
| GB2084726A (en) | Reagent for reducing turbidity in a biological fluid | |
| US4007091A (en) | Method for measuring the activity of lecithin cholesterol acyl transferase and lecithin substrate solution useful therefor | |
| JP4018237B2 (ja) | 酵素活性測定用リパーゼ基質溶液およびリパーゼ活性測定用試薬キット | |
| JP3760250B2 (ja) | 硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びそのキット | |
| JPH0815430B2 (ja) | アスコルビン酸オキシダ−ゼの安定化法 | |
| EP0418940B1 (en) | Stabilization of glucose oxidase enzyme in liquid reagent | |
| JP4288559B2 (ja) | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法および安定化組成物 | |
| JPS59159798A (ja) | 生体体液成分の測定法 | |
| JPH09224697A (ja) | 生体成分の測定方法および測定用組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20030821 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060803 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061002 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070405 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070604 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070816 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070829 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100921 Year of fee payment: 3 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 4013108 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100921 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100921 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110921 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120921 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130921 Year of fee payment: 6 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |