JP2885453B2 - ビリルビン影響を回避したリパーゼ活性測定用試薬組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、血清中のリパーゼ活性を測定する臨床診断
用試薬組成物であり、主に膵疾患の診断または治療効果
の判定等に利用する際、測定系のビリルビンの影響を回
避した、基質として1,2−ジグリセリドを用いてなるリ
パーゼ活性測定用試薬組成物に関する。

＜従来の技術＞ 従来、生体成分の測定系における生成物である過酸化
水素を定量する方法は、エマーソン・トリンダー法が一
般的に用いられているが、この方法は酸化カップリング
反応において、還元性物質，中でも血清中に高濃度に存
在する可能性のあるビリルビンの反応系への影響が問題
となっており、ビリルビンの影響を回避する公知技術と
して、生体成分として例えば、尿酸，コレステロール，
トリグリセリドの測定系にフェロシアン化物イオンを含
有せしめた試薬組成物の報告がある（特開昭55−138656
号、特開昭56−155852号、特開昭59−28664号）。しか
しながら、上記の過酸化水素定量系におけるフェロシア
ン化物イオンによるビリルビン影響の回避効果が不充分
であることから、さらにフェロシアン化物イオンとアル
ブミンを共存せしめることによりビリルビンの影響を相
乗的に回避する方法が報告され（特開昭60−228963
号）、さらに過酸化水素定量系に鉄錯体を添加したビリ
ルビン影響の回避方法の報告（特開平１−109260号）が
ある。

＜発明が解決しようとする問題点＞ 上述のように、過酸化水素定量系を含む生体内成分で
ある例えば尿酸，コレステロール，トリグリセリド等の
測定系にビリルビン影響回避の目的でフェロシアン化物
イオンや鉄錯体を添加することが知られているものの、
その効果が不充分であることからさらに過酸化水素定量
系のビリルビン影響回避の効果を改善するに当たっては
アルブミンの共存が必要であることが知られているが、
本発明のように、生体内の主に膵疾患の診断等に有用で
ある1,2−ジグリセリド，非イオン性界面活性剤，モノ
グリセリドリパーゼ，グリセロールキナーゼ，グリセロ
リン酸オキシダーゼ等に基づくリパーゼ活性測定の目的
において、さらにこの測定系の中へビリルビン影響を回
避するための手段を組み込んだリパーゼ活性測定用の試
薬組成物は未だ報告されていない。

＜問題点を解決するための手段＞ 本発明者らは、リパーゼ活性測定用試薬系において、
まず天然または合成基質である1,2−ジグリセリドが非
イオン性界面活性剤を用いることにより水に可溶化し、
得られる組成物が安定に長期間保存でき、かつ水可溶化
の形態であるために分光学的な測定方法にも使用でき、
再現性の良好なリパーゼ活性測定用としての基質組成物
であることを見出し（特開昭59−91898号）、さらに1,2
−ジグリセリドの分解物であるモノグリセリドからグリ
セロールへの分解反応が律速である点を解消して迅速な
測定をする目的で、モノグリセリドに特に強く作用する
モノグリセリドリパーゼを見出した（特開昭63−245672
号）。次いで本発明に至っては、基質である1,2−ジグ
リセリドにこれら非イオン性界面活性剤，モノグリセリ
ドリパーゼやグリセロールキナーゼ，グリセロリン酸オ
キシダーゼ，水素供与体とそのカプラー，パーオキシダ
ーゼ等を添加せしめ、さらに測定系における過酸化水素
定量系でのビリルビン影響を回避するために鉄錯体であ
る例えばフェロシアン化物イオンやエチレンジアミン四
酢酸鉄（EDTA−Fe）イオンを添加した組成物を作製する
ことにより、アルブミンの共存によるビリルビン影響回
避の改善効果を何ら必要とすることなく、この鉄錯体に
より測定系における生体内ビリルビン影響を良好に回避
することを可能とした有用なリパーゼ活性測定用試薬組
成物（以下、本発明組成物ということがある）を見出し
た。

本発明は以上の知見に基づいて完成されたものであ
り、少なくとも1,2−ジグリセリド，モノグリセリドリ
パーゼ，非イオン性界面活性剤，グリセロールキナー
ゼ，グリセロリン酸オキシダーゼ，水素供与体とそのカ
プラー，パーオキシダーゼ，鉄錯体を含有するリパーゼ
活性測定用試薬組成物を提供するものであり、その目的
はリパーゼ活性系におけるビリルビン影響を効率良く回
避せしめる組成物を提供することである。

すなわち本発明の測定系の概略は次のとうりである。
まず測定対象成分である検体中のリパーゼは、非イオン
性界面活性剤により水に可溶化され種々の点で好ましい
状態の天然または合成基質である1,2−ジグリセリドに
作用してモノグリセリドを遊離し、これをモノグリセリ
ドに特に強く作用するモノグリセリドリパーゼにより迅
速にグリセロールと脂肪酸に分離し、このグリセロール
をグリセロールキナーゼでリン酸化し、さらにグリセロ
リン酸からグリセロリン酸オキシダーゼの作用により過
酸化水素を生成する。このようにして生成された過酸化
水素を水素供与体とそのカプラーである例えばフェノー
ル類またはアニリン誘導体と４−アミノアンチピリン、
及びパーオキシダーゼを用いて比色定量するが、この反
応系において生体成分中のビリルビンの影響のために正
確な測定が行われないことを回避する目的で、鉄錯体で
あるフェロシアン化物イオン等あるいはEDTA−Feイオン
等を含有せしめたリパーゼ活性測定用試薬を提供するも
のである。

以下に、本発明は試薬組成物を構成する物質とその使
用濃度について詳細に説明する。

まず、本発明に用いる鉄錯体として、フェロシアン化
物イオンを用いるのが好ましく、例えばフェロシアン化
ナトリウム、またはフェロシアン化カリウムのようなア
ルカリ金属塩、並びにフェロシアン化物イオンを含有ま
たは放出することのできるその他の塩等のフェシアン化
物イオン源が挙げられる。またその他の鉄錯体として、
例えばEDTA−Feイオンについては、EDTA−Feナトリウム
やEDTA−FeカリウムのようなEDTA−Feイオンを含有また
は放出することができるその他の塩等のEDTA−Feイオン
源が挙げられる。またその他にもニトリロ三酢酸，エチ
レンジアミン二酢酸，エチレンジアミン二プロピロン
酸，ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸，ジアミ
ノプロパン四酢酸，グリコールエーテルジアミン四酢
酸，ヒドロキシエチルイミノ二酢酸，イミノ二酢酸，ニ
トリロ二酢酸プロピオン酸，エチレンジアミンスルホン
酸，グリコン酸エチレンジアミン，ジヒドロキシエチル
グリシン，トランス−シクロヘキサンジアミン四酢酸等
の鉄錯体を挙げることができ、またこれらの例示した化
合物に限らず、鉄と錯体を形成しうるものであれば本発
明に有効に用いることができる。

尚、本発明に用いる鉄錯体として特に好ましいフェロ
シアン化物イオンを用いる場合の濃度は、1nmole/ml未
満であるとビリルビン影響を完全に回避することができ
ず、また15nmol/mlを越える濃度であると試薬ブランク
値が上昇するために正誤差の原因となり試薬性能を損な
い測定感度が低下するので、これらの好ましい使用濃度
は1nmole/ml〜15nmole/mlの範囲となる。同様に鉄錯体
としてEDTA−Feイオン等を用いる場合の濃度は、10nmol
e/ml〜250nmole/mlの範囲である。

次に、本発明に用いる基質である1,2−ジグリセリド
としては、下記一般式〔Ｉ〕 （ただし、R₁およびR₂は同一または異なって炭素数12以
上の高級脂肪酸基を示す）で表される天然または合成の
化合物である。

一般式〔Ｉ〕で表される化合物のR₁およびR₂における
高級脂肪酸基としての構成因子である高級脂肪酸は炭素
数12以上の高級脂肪酸であればよく、例えば、ラウリン
酸（Ｃ_12:0）、トリデシレン酸（Ｃ_13:0）、ミリスチン
酸（Ｃ_14:0）、ペンタデシレン酸（Ｃ_15:0）、パルミチ
ン酸（Ｃ_16:0）、マーガリン酸（Ｃ_17:0）、ステアリン
酸（Ｃ_18:0）、ノナデシレン酸（Ｃ_19:0）、アラキン酸
（Ｃ_20:0）、ベヘニン酸（Ｃ_21:0）、リグノセリン（Ｃ
_22:0）等の飽和高級脂肪酸やパルミトオレイン酸（Ｃ
_16:1）、９−オクタデセン酸（Ｃ_18:1；オレイン酸）、
11−オクタデセン酸（Ｃ_18:1；バクセン酸）、1,2−オ
クタデセン酸（Ｃ_18:1）、９−アイコセン酸
（Ｃ_20:1）、11−ドコセン酸（Ｃ_22:1）、13−ドコセン
酸（Ｃ_22:1；エルカ酸）、リノール酸（Ｃ_18:2）、リノ
レン酸（Ｃ_18:3）、11,14−エイコサジエン酸
（Ｃ_20:2）、8,11,14−エイコサトリエン酸
（Ｃ_20:3）、5,8,11,14−エイコサトラエン酸
（Ｃ_20:4；アラキドン酸）等の不飽和高級脂肪酸が挙げ
られる。このR₁およびR₂の構成因子である高級脂肪酸に
おいては、不飽和高級脂肪酸となすことにより得られる
組成物の透明度がよく、好ましいもので炭素数16以上の
不飽和高級脂肪酸を構成因子とする1,2−ジグリセリド
が好ましい。従って、また1,2−ジグリセリドにおいて
そのR₁またはR₂のいずれか一方が不飽和高級脂肪酸，他
方が飽和高級脂肪酸の残基である化合物であってもよ
く、さらにR₁,R₂がラジール基であってもよい。特に好
ましくはR₁が不飽和高級脂肪酸（Ｃ_16:1,C_18:1,C_20:1,C
_22:1,C_18:2,C_18:3,C_20:2,C_20:3,C_20:4）残基、R₂が飽和
高級脂肪酸（Ｃ_12:0,C_14:0,C_16:0,C_18:0,C_20:0）残基ま
たは不飽和高級脂肪酸（Ｃ_16:1,C_18:1,C_20:1,C_22:1,C
_18:2,C_18:3,C_20:2,C_20:3,C_20:4）残基である1,2−ジグ
リセリドであり、例えば、１−パルミトオレオイル−２
−ラウロイル−グリセロール、１−パルミトオレオイル
−２−パルミトイル−グリセロール、１−オレオイル−
２−パルミトイル−グリセロール、１−リノレオイル−
２−ラウロイル−グリセロール、１−リノレオイル−２
−ミリストイル−グリセロール−１−リノレオイル−２
−パルミトイル−グリセロール、１−リノレオイル−ス
テアロイル−グリセロール、１−リノレノイル−ラウロ
イル−グリセロール、１−リノレノイル−２−ミリスト
イル−グリセロール、１−リノレノイル−２−パルミト
イル−グリセロール、１−リノレノイル−２−ステアロ
イル−グリセロール、１−（11,14−エイコセノイル）
−２−ミリストイル−グリセロール、１−（11,14−エ
イコセノイル）−２−パルミトイル−グリセロール、１
−（8,11,14,17−エイコサテトラエノイル）−２−ラウ
ロイル−グリセロール、１−（8,11,14,17−エイコサテ
トラエノイル）−２−パルミトイル−グリセロール、1,
2−ジリノレオイル−グリセロール、1,2−ジパルミトイ
ル−グリセロール、1,2−ジリノレノイル−グリセロー
ル等が挙げられる。また、簡便な1,2−ジグリセリドを
得るに当たっては、ホスホリパーゼＣとレシチンとの反
応によって生成される1,2−ジグリセリド、ホスファチ
ジン酸ホスファターゼとホスファチジン酸との反応によ
って生成される1,2−ジグリセリド、ホスホリパーゼD,
ホスファチジン酸ホスファターゼとレシチンとの反応に
よって生成される1,2−ジグリセリドを用いてもよい。
さらに、これらの1,2−ジグリセリドは単離、精製する
ことなく反応前のホスホリパーゼＣとレシチンからなる
含有物、ホスファチジン酸ホスファターゼとホスファチ
ジン酸からなる含有物、ホスホリパーゼD,ホスファチジ
酸ホスファターゼとレシチンからなる含有物を1,2−ジ
グリセリドの代わりに用いてもよい。

以上例示した基質である1,2−ジグリセリドの本発明
組成物への含有量は、0.3mM〜1.0mMの範囲で使用するの
が好ましい。

次に、本発明組成物に用いる界面活性剤としては、例
えばポリオキシエチレン（POE）樹脂アルコールエーテ
ルとしては、例えば花王アトラス社製のEMULGEN106（PO
Eラウリルアルコールエーテル:HLB10.5）,EMULGEN108
（POEラウリルアルコールエーテル:HLB12.1）,EMULGEN2
20（POEセチルアルコールエーテル:HLB14.2）,EMULGEN4
08（POEオレイルアルコールエーテル:HLB10.0）,Brij35
（poe（23）ラウリルアルコールエーテル:HLB16.9）,Br
ij78（POE（20）アテアリルアルコールエーテル:HLB15.
3）,Brij98（POE120）オレイルアルコールエーテル:HLB
15.3）,EMULGEN340（POEステアリルエーテル:HLB17.
3）、共栄社油脂社製のノニオライトAL−11（POEラウリ
ルエーテル:HLB14.0），ノニオライトAO−20（POEオレ
イルエーテル:HLB15.4）、日光ケミカルズ社製のNIKKOL
BB−20（POEベヘニルエーテル:HLB17.0）,NIKKOL BL−
9EX,NIKKOL BO−10TX,NIKKOL BC15TX,NIKKOL BH5、日本
エマルジョン社製のエマレックスBA10（POEブチルアル
コールエーテル:HLB16.9），エマレックスBA15（POEブ
チルアルコールエーテル:HLB18.7），エマレックス130
（POEセチルアルコールエーテル:HLB16.0），エマレッ
クス100（POEセチルアルコールエーテル:HLB14.5），エ
マレックス550（POEオレイルアルコールエーテル:HLB1
8.2），エマレックス700（POEラウリルアルコールエー
テル:HLB16.7）、日本油脂社製のノニオンＥ−213（POE
オレイルアルコールエーテル:HLB13.6），ノニオンＥ−
220（POEオレイルアルコールエーテル:HLB15.3），ノニ
オンＰ−225（POEセチルアルコールエーテル:HLB16.
4），ノニオンＳ−215（POEステアリルアルコールエー
テル:HLB14.2），ノニオンＴ−208.5（POEトリデシルア
ルコールエーテル:HLB13.0）、ライオン油脂社製リポノ
ックスOCS（POEアルキルエーテル:HLB15.0），リポノッ
クスLCR（POEアルキルエーテル:HLB16.2），リポノック
スＯ（POEアルキルエーテル;HLB14.3）等が使用でき
る。

アルコールエーテルとしては、例えば旭電化工業社製
のAdekatol（アデカトール）SO−120（第２級直鎖アル
コールエトキシレート:HLB12.0），アデカトールSO−14
5（第２級直鎖アルコールエトキシレート:HLB14.5），
アデカトールLO−９（第１級直鎖アルコールエトキシレ
ート:HLB13.0），アデカトールLO−12（第１級直鎖アル
コールエトキシレート:HLB14.0），アデカトールLO−15
（第１級アルコールエトキシレート:15.0），アデカト
ールNP−720（ノニルフェノールエトキシレート:HLB14.
0），アデカトールNP−695（ノニルフェノールエトキシ
レート:HLB13.0）等が使用できる。

POEアルキルアリールエーテルとしては、例えば花王
アトラス社製のEMULGEN810（POEオクチルフェニールエ
ーテル:HLB13.1）,EMULGEN911（POEエノルフェニールエ
ーテル:HLB13.7）,EMULGEN930（POEノニルフェニールエ
ーテル:HLB15.1）,EMULGEN950（POEノニルフェニールエ
ーテル:HLB18.2）、共栄社油脂社製のノニオライトPO−
９（POEオクチルフェニールエーテル:HLB13.2），ノニ
オライトPA−15（POEアルキルフェニールエーテル:HLB1
4.3）、日本エマルジョン社製のエマレックスNP−15（P
OEアルキルフェノールエーテル:HLB13.2），エマレック
スOP−25（POEアルキルフェノールエーテル:HLB15.
8）、日本油脂社製のノニオンNS−215（POEノニルフェ
ノールエーテル:HLB15.0），ノニオンNS−220（POEノニ
ルフェノールエーテル:HLB16.0），ノニオンHS−220（P
OEノニルフェノールエーテル:HLB16.2）、ライオン油脂
社製のリポノックスNCM（POEアルキルフェノールエーテ
ル:HLB14.5），リポノックスNCN（POEアルキルフェノー
ルエーテル:HLB14.8），リポノックスNCO（POEアルキル
フェノールエーテル:HLB15.0）、シエル社製のNonidet
−40（POEアルキルアリールエーテル）、ロームアンド
ハス社製のTtritonX−100（poeアルキルアリールエーテ
ル）、日光ケミカルズ社製のNIKKOL NP−18TX,NIKKOL N
P−20,NIKKOL OP−40等が使用できる。

POE脂肪酸エステルとしては、例えば花王アトラス社
製のEMANON1112（POEモノラウレート:HLB13.7）,EMANON
4115（POEモノオレイト:HLB13.4）,Myrj45（POE（８）
ステアレート:HLB11.1）,Myri52（POE（40）ステアレー
ト:HLB16.9）,Myri53（POE（50）ステアレート:HLB17.
9）、共栄社油脂社製のノニオライトＳ−100（POEステ
アレート:HLB15.6），ノニオライトＴ−40（POEトール
油脂肪酸エステル:HLB11.5）、日本エマルジョン社製の
エマレックス202（POEオレート:HLB15.1），エマレック
ス203（POEオレート:HLB17.6），エマレックス800（POE
モノラウレート:HLB15.8），ノニオンＰ−10（POEモノ
パルミテート:HLB15.7），ノニオンＳ−10（POEモノス
テアート:HLB15.2），ノニオンＳ−40（POEモノステア
レート:HLB18.2）、日光ケミカルズ社製のMYL−10,MYO
−10等が使用できる。

POEソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば花王
アトラス社製のEMASOL1130（POEソルビタンモノラウレ
ート:HLB16.3）,EMASOL3130（POEソルビタンモノステア
レート:HLB14.9）,Tween20（POE（20）ソルビタンモノ
ラウレート:HLB16.7）,Tween40（POE（20）ソルビタン
モノパルミテート:HLB15.6）,Tween80（POE（20）ソル
ビタンモノオレイト:HLB15.0）、共栄社油脂社製のノニ
オライトTWL−20（POE（20）ソルビタンモノラウレー
ト:HLB16.2），ノニオライトTWS−13（POE（13）ソルビ
タンモノステアレート:HLB12.5）、第一工業製薬社製の
SOLGEN TW20（POEソルビタンモノラウレート:HLB16.
7）,SOLGEN TW80（POEソルビタンモノオレート:HLB15.
0）、日光ケミカルズ社製のNIKKOL TSDL−2020L（POEソ
ルビタンオリーブ脂肪酸:HLB16.5）,NIKKOL TL−10,NIK
KOL TO−106、日本エマルジョン社製のエマレックスET
−2000（POEソルビタンラウリレート:HLB16.6）、日本
油脂社製のノニオンLT−221（POEソルビタンラウリレー
ト:HLB16.7），ノニオンST221（POEソルビタンステアレ
ート:HLB14.9），ノニオンOT−221（POEソルビタンオレ
ート:HLB15.0）、東邦化学工業社製のSorbon T−20（PO
Eソルビタンモノラウレート:HLB16.7）,Sorbon T−40
（POEソルビタンモノパルミテート:HLB15.7）,Sorbon T
−80（POEソルビタンモノオレート:HLB15.0）等が使用
できる。

POEソルビトール脂肪酸エステルとしては、例えば花
王アトラス社製のAtlox1045A（POEソルビトールオレイ
トラウレート:HLB13.2）,Atlox1196（POEソルビトール
オレイト:HLB11.4）,G−1045（POEソルビタールラウレ
ート:HLB11.5）,G−1441（POEソルビトールラノリン誘
導体:HLB14）、日光ケミカルズ社製のNIKKOL TSOL−102
0L（POEソルビトールオリーブ脂肪酸エステル;HLB16.
0）,NIKKOL GL−１等が使用できる。

POEヒマシ油誘導体やPOE硬化ヒマシ油誘導体として
は、例えば花王アトラス社製のＧ−1288（ヒマシ油酸化
エチレン付加物:HLB16.0）,G−1295（POE硬化ヒマシ油
酸化エチレン付加物:HLB17.5）,G−1292（硬化ヒマシ油
酸化エチレン付加物:HLB10.8）、日光ケミカルズ社製の
NIKKOL CO−60TX（POE（60）ヒマシ油:HLB14.1）等が使
用できる。

POEグリセリン脂肪酸エステルとしては、例えば日光
ケミカルズ社製のNIKKOL TGSO215（POEグリセリン植物
油脂肪酸エステル:HLB14.0）,NIKKOLTGSO220（POEグリ
セリン植物油脂肪酸エステル:HLB15.5）,NIKKOL TDSOL
−2010（POEジグリセリンオリーブ油:HLB12.5）が使用
できる。

POEラウリン誘導体としては、例えば花王アトラス社
製のＧ−1790,G−1795、日光ケミカルズ社製のBWA−５
等が使用できる。

POEアルキルチオエーテル,POEプロピレングリコール
モノ脂肪酸エステル等のPOE系非イオン性界面活性剤，
ポリオキシプロピレンブロックとPOEブロックを有する
ブロック系非イオン性界面活性剤としては、例えば旭電
化工業社製のPluronic（プルロニック）L121,プルロニ
ック（Pluronic）L122等が使用できる。

その他にもソルビタン，マンニトール，ソルビトー
ル，ショ糖等の炭素数６以上の多価アルコールと、天然
油脂であるラウリン酸，パルミチン酸，ステアリン酸，
イソステアリン酸等の脂肪酸炭素数12以上の高級脂肪酸
とのエステルである多価アルコール系非イオン性界面活
性剤等が使用できる。

これらの非イオン性界面活性剤は、特に1,2−ジグリ
セリドとPOEアルキルアリールエーテル系界面活性剤や
アルコールエトキシレート系界面活性剤またはブロック
形界面活性剤との組合せが好ましく、本発明にこれら非
イオン性界面活性剤を用いることにより、基質である1,
2−ジグリセリドを水に可溶化せしめることから、安定
に長期間保存でき、かつ水可溶化の形態であるために分
光学的な測定方法に有効に使用でき、再現性の良好なリ
パーゼ活性測定用試薬組成物を提供できる。

以上例示した非イオン性界面活性剤は、通常HLB10程
度以上、好ましくはHLB11程度以上のものを用いること
が好ましく、二種以上の非イオン性界面活性剤を併用し
てHLB10程度以上に調製して用いてもよい。さらに、本
発明組成物への含有量は、0.05％〜0.2％の範囲で使用
するのが好ましい。

次に、本発明で用いるモノグリセリドリパーゼは、基
質として1,2−ジグリセリドから分解されたモノグリセ
リドに対して強く作用しうる酵素であれば何れでもよ
く、特に好ましくはバチルス ステアロサーモフィラス
Ｈ−165（FERM BP−1673）由来のモノグリセリドリパー
ゼ（特開昭63−245672号）を用いればよい。さらに、本
発明組成物への含有量は、04U/ml〜2.5U/mlの範囲で使
用するのが好ましい。

次に、本発明に用いるグリセロキナーゼは、例えばマ
グネシウムイオン共存下、グリセロールとアデノシン三
リン酸（ATP）に作用し、グリセロリン酸とADPを生成す
る酵素であり、例えばストレプトマイセス属，キャンジ
ダ属，バチルス属に由来するもの等がある。これらの本
発明組成物への含有量としては、0.05U/ml〜3U/mlの範
囲で使用するのが好ましい。

次に、本発明に用いるグリセロリン酸オキシダーゼ
は、酵素存在下、グリセロリン酸に作用し、ジヒドロキ
シアセトンリン酸と過酸化水素を生成する酵素であり、
例えば、ストレプトコッカス属，ペディオコッカス属，
アエロコッカス属に由来するもの等である。これらの本
発明組成物への含有量としては、15U/ml〜150U/mlの範
囲で使用するのが好ましい。

次に、本発明に用いるパーオキシダーゼは、過酸化水
素と色原体に作用し、酸化カップリングを起こし、発色
物質と水を生成する酵素であり、例えば、ホースラディ
ッシュに由来するもの等がある。これらの本発明組成物
への含有量としては、0.25U/ml〜3U/mlの範囲で使用す
るのが好ましい。

次に、本発明に用いる水素供与体としては、そのカプ
ラーとともに色原体としてパーオキシダーゼと過酸化水
素の共存下酸化カップリングを起こし、発色物質に変換
するものであればよく、例えばフェノール類として例え
ばフェノール、2,4−ジクロロフェノール、3,5ジクロロ
−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、ｐ−ヒドロキシ
ベンゾエート等、また例えばアニリン誘導体として例え
ばＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−ｍ−トルイジン（TOOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−3,5−ジメトキシアニリン等が好まし
い。これら水素供与体として例示したフェノール類また
はアニリン誘導体の本発明組成物への含有量としては、
0.02％〜0.1％の範囲で使用するのが好ましい。

次に、本発明に用いる水素供与体に対するカプラーと
しては、好ましくは水素供与体としてフェノール類また
はアニリン誘導体を用いる場合の組み合わせとして４−
アミノインチピリンであり、その他３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリンヒドラジン、ジアミノアンチピリン、１
−（ｐ−ジエチルアミノ−フェニル）−2,3−ジエチル
−４−アミノ−ピラゾン−５、１−（ｐ−アミノ−フェ
ニル）−2,3−ジメチル−４−アミノ−ピラゾロン−
５、１−（ｐ−アセトアミノ−フェニル）−2,3−ジエ
チル−４−アミノ−ピラゾロン−５等を使用することが
でき、これらの本発明組成物への含有量としては、0.01
％〜0.1％の範囲で使用するのが好ましい。

その他、リパーゼの活性を安定かつ感度良く測定せし
めるための添加物として、必要に応じ、酵素、活性化
剤、保存剤、安定化剤等を適宜用いることが好ましく、
例えば塩化カルシウムを組成物全量に対し0.5mM〜4mM、
塩化マグネシウムを0.5mM〜4mM、塩化アンモニウムを0.
5mM〜60mM、コリパーゼを5U/ml〜75U/ml、デオキシコー
ル酸を6mM〜15mM、ATPを0.05mM〜1mM等を適宜用いれば
よい。

以上、本発明組成物を用いたリパーゼ活性測定への使
用にあたっては、上述した本発明組成物を構成する物質
を組成として1mlの試薬とし、これを検体を含む被検液
に通常５〜20μを用い、全体量を50μ〜1000μと
した後、好ましくは37℃で１〜10分間反応せしめ、吸光
度を測定すればよい。

さらに、本発明の組成物は、リパーゼ活性を測定する
に当り、１液で用いても、あるいは２液以上の組成に分
けて用いても適用が可能であるが、２液に分けて測定す
るのがより好ましく、また２液以上に分けて測定する場
合、発色前液あるいは発色時液ならいずれの液に鉄錯体
を添加してもよい。尚、本発明組成物は１液で用いる場
合その系はpH8〜９であり特に好ましくはpH8.2である。

次いで、本発明の実施例を挙げて詳しく述べるが、本
発明は何らこれらによって限定されるものではない。

＜実施例＞ 実施例１ フェロシアン化カリウムの添加濃度によるビリルビン影
響回避への効果 上記第一試薬にフェロシアン化カリウム（和光純薬社
製）の濃度が０〜30nmole/mlとなるように調製した。

上記の第一試薬300μに検体（Ａ），（Ｂ）をそれ
ぞれ５μ加え、37℃で５分間反応せしめた後、第二試
薬100μを加え第一試薬と第二試薬の混合比率を3:1と
し、さらに37℃で反応せしめ、546nmの波長（日立7050
自動分析機）で３分目から５分目までの１分間当りの吸
光度変化を測定し、リパーゼ活性を求めた。

その結果、ビリルビン無添加の検体（Ａ）の場合第１
図に示すとうり、フェロシアン化カリウムを添加するこ
とにより多少測定感度が変動するが、フェロシアン化カ
リウムの添加濃度による影響はみられなかった。

これに対しビリルビン添加の検体（Ｂ）の場合は、第
２図に示すとうり、フェロシアン化カリウム無添加の場
合には測定値に負の影響を与えているが、0.5nmole/ml
以上のフェロシアン化カリウムの添加によって負誤差は
改善され、特に1nmole/ml以上のフェロシアン化カリウ
ムの添加により良好に改善された。このように、フェロ
シアン化カリウムの添加が少量ではリパーゼ活性測定に
対して充分な改善効果がみられず、多量すぎると測定値
に変化はないが、ブランク値が上昇したため、好ましい
フェロシアン化合物イオンの添加濃度は、1nmole/ml〜1
5nmole/mlであった。

実施例２ フェロシアン化カリウムの添加有無のそれぞれの系での
ビリルビン影響回避に対する効果 〔試薬〕 実施例１と同様の第一試薬，第二試薬を用い、フェロ
シアン化カリウムを無添加の場合と、第一試薬へフェロ
シアン化カリウムを最終濃度が5nmole/mlとなるように
添加した場合とに各試薬を調製した。

〔検体〕

ビリルビン添加血清（血清：ビリルビン＝9:1） ビリルビン濃度は０〜20mg/dlに調製（ビリルビン：
“干渉チェックA"（国際試薬社製）） 上記の試薬および検体を用い、実施例１と同様の測定
法にてリパーゼ活性測定を行った。その結果を、フェロ
シアン化カリウム無添加の場合を…○…○…、5nmole/m
lの添加の場合を−●−●−とし、第３図に示した。こ
の結果から、フェロシアン化カリウム無添加の場合は、
検体中のビリルビン濃度を増加していくと測定値への負
の影響は大きくなったが、測定系にフェロシアン化カリ
ウムを5nmole/ml添加させた場合は、ビリルビンの負影
響が回避され、測定値も回復した。

実施例３ ビリルビン影響回避に対するフェロシアン化カリウムと
アルブミンの相互作用 〔試薬〕 実施例１と同様の第一試薬，第二試薬を用い、第一試
薬にフェロシアン化カリウムおよびアルブミンを下記の
濃度になるように調製した。

（Ａ）フェロシアン化カリウム 無添加 アルブミン 無添加 （Ｂ）フェロシアン化カリウム 5nmole/ml アルブミン 無添加 （Ｃ）フェロシアン化カリウム 5nmole/ml アルブミン 0.27％ 〔検体〕 実施例２と同様の検体を用いた。

上記の試薬および検体を用い、実施例１と同様の測定
法にてリパーゼ活性測定を行った。その結果、試薬
（Ａ）の場合を…○…○…、試薬（Ｂ）の場合を−●−
●−、試薬（Ｃ）の場合を−○−○−とし、第４図に示
した。この結果から、アルブミンの添加によるビリルビ
ン影響回避の効果に差はみうけられず、アルブミンとフ
ェロシアン化カリウムとの間に相互作用はみられなかっ
た。

実施例４ 鉄錯体（EDTA−Fe）の添加によるビリルビン影響回避に
対する効果 〔試薬〕 実施例１と同様の第一試薬，第二試薬を用い、鉄錯体
としてEDTA−Fe（和光純薬社製）を無添加の場合と、第
一試薬へEDTA−Feを最終濃度が100nmole/mlとなるよう
に添加した場合の各試薬を調製した。

〔検体〕

検体は、実施例１と同様の検体を用いた。

上記の試薬および検体を用い、リパーゼ活性測定を行
った。

その結果、各々におけるリパーゼ活性は第１表に示す
とうりであった。

この結果から、鉄錯体の添加によるビリルビン影響回
避の効果は、測定値が100％は回復しないものの、フェ
ロシアン化物イオンを添加した場合と同様の効果が認め
られた。すなわち、鉄錯体の濃度が増加すると、ブラン
ク値の上昇，測定感度の低下等があるので、添加濃度
は、10nmole/ml〜250nmole/mlが好ましいと認められ
た。

＜発明の効果＞ 上記の通り、本発明は、基質として1,2−ジグリセリ
ド，非イオン性界面活性剤，モノグリセリドリパーゼ，
グリセロールキナーゼ，グリセロリン酸オキシダーゼ，
水素供与体とそのカプラー，パーオキシダーゼ，鉄錯体
等を含有するリパーゼ活性測定用試薬組成物であり、測
定系におけるビリルビン影響を回避するために鉄錯体で
ある例えばフェロシアン化物イオンまたはEDTA−Feイオ
ンを添加することにより、アルブミンの共存によるビリ
ルビン影響回避の効果改善を何ら必要とすることなく、
この鉄錯体により測定系における生体内ビリルビン影響
を良好に回避することを可能とした有用なリパーゼ活性
測定用試薬組成物を提供する。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１でのビリルリン無添加検体におけるフ
ェロシアン化カリウム添加によるビリルビン影響回避効
果を示し、第２図は同様に実施例１でのビルリビン添加
検体におけるフェロシアン化カリウム添加による効果を
示す。第３図は実施例２でのフェロシアン化カリウムの
添加有無による効果を示し、第４図は実施例３でのビリ
ルビン影響回避に対するフェロシアン化カリウムとアル
ブミンの相互作用を示す。

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少なくとも1,2−ジグリセリド，非イオン
   性界面活性剤，モノグリセリドリパーゼ，グリセロール
   キナーゼ，グリセロリン酸オキシダーゼ，水素供与体と
   そのカプラー，パーオキシダーゼ，鉄錯体を含有するこ
   とを特徴とするリパーゼ活性測定用試薬組成物。
2. 【請求項２】鉄錯体として、フェロシアン化物イオンを
   1nmole/ml〜15nmole/ml含有する請求項第１項記載の試
   薬組成物。
3. 【請求項３】鉄錯体として、エチレンジアミン四酢酸鉄
   イオンを10nmole/ml〜250nmol/ml含有する請求項第１項
   記載の試薬組成物。
4. 【請求項４】水素供与体とそのカプラーが、フェノール
   類またはアニリン誘導体と４−アミノアンチピリンの組
   み合わせである請求項第１項記載の試薬組成物。
5. 【請求項５】少なくとも組成物全量に対し1,2−ジグリ
   セリドの含量が0.3mM〜1.0mM、非イオン性界面活性剤の
   含量が0.05％〜0.2％、モノグリセリドリパーゼの含量
   が0.4U/ml〜2.5U/ml、グリセロールキナーゼの含量が0.
   05U/ml〜3U/ml、グリセロリン酸オキシダーゼの含量
   が15U/ml〜150U/ml、フェノール類またはアニリン誘導
   体の含量が0.02％〜0.1％、４−アミノアンチピリンの
   含量が0.01％〜0.1％、パーオキシダーゼの含量が0.25U
   /ml〜3U/mlである請求項第１項記載の試薬組成物。