JP4861005B2 - リパーゼ活性測定用組成物および活性測定法 - Google Patents
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Description
[1]少なくとも両イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを基質として用いることを特徴とするリパーゼ活性測定用組成物。
[2]少なくとも両イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを基質として用いアポリポ蛋白CIIを含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用組成物。
[3]アポリポ蛋白CIIがヒトまたは動物血清由来である前記[2]記載のリパーゼ活性測定用組成物。
[4]アポリポ蛋白CIIがヒト又は動物血清由来のアルブミン、グロブリンを実質的に含有しないものである前記[2]記載のリパーゼ活性測定用組成物。
[5]両イオン性界面活性剤が酢酸ベタイン型である前記[1]又は[2]記載のリパーゼ活性測定用組成物
[6]少なくとも前記[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物、モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、還元型NAD、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、及びラクテートデヒドロゲナーゼを含有するリパーゼ活性測定用組成物。
[7]少なくとも前記[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物、モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、酸化型NAD又は酸化型NADP、グルコース、ADP−ヘキソキナーゼ、及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼを含有するリパーゼ活性測定用組成物。
[8]少なくとも前記[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物、モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、グリセロ−3−リン酸オキシダーゼ、及びペルオキシダーゼと過酸化水素発色試薬を含有するリパーゼ活性測定用組成物。
[9]試薬1と試薬2との組合せキットとして用いる前記[14]〜[16]のいずれかに記載のリパーゼ活性測定用組成物。
[10]試薬1及び/又は試薬2が液状である、前記[9]記載のリパーゼ活性測定用組成物。
[11]モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、還元型NAD、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、及び緩衝液を含有する試薬1と、還元型NADと緩衝液を含有する試薬2とからなるリパーゼ活性測定用キットであって、前記[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物を試薬1及び/又は試薬2に含有するリパーゼ活性測定用キット。
[12]モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、グルコース、ADP−ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、及び緩衝剤を含有する試薬1と、酸化型NAD又は酸化型NADPと緩衝剤を含有する試薬2とからなるリパーゼ活性測定用キットであって、前記[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物を試薬1及び/又は試薬2に含有するリパーゼ活性測定用キット。
[13]モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、グリセロ−3−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、及び緩衝剤を含有する試薬1と、カップラーと緩衝剤とを含有する試薬2とからなるリパーゼ活性測定用キットであって、前記[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物を試薬1及び/又は試薬2に含有するリパーゼ活性測定用キット。
[14]少なくとも両イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを基質に用いてリパーゼ反応により生成されるモノグリセリドを酵素的に測定するリパーゼ活性測定方法。
[15]少なくとも両イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドを基質としアポリポ蛋白CIIを含有する試薬を用いてリパーゼ反応により生成されるモノグリセリドを酵素的に測定するリパーゼ活性測定方法。
[16]アポリポ蛋白CIIがヒト又は動物血清由来である前記[15]記載のリパーゼ活性測定方法。
[17]アポリポ蛋白CIIがヒト又は動物血清由来のアルブミン、グロブリンを実質的に含有しないものである前記[15]記載のリパーゼ活性測定方法。
[18]両イオン性界面活性剤が酢酸ベタイン型である前記[14]又は[15]記載のリパーゼ活性測定方法
[19]前記[6]に記載のリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをATP存在下にグリセロールキナーゼによりADPに変換し、次いでホスフォエノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型NAD存在下にラクテートデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型NADの340nm付近の波長における吸光度の減少速度を測定するリパーゼ活性測定方法。
[20]前記[7]に記載のリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをATP存在下にグリセロールキナーゼによりADPに変換し、次いでグルコース存在下にADP−へキソキナーゼでグルコース−6−リン酸に変換し、更に酸化型NAD又はNADP存在下にグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、還元型NAD又は還元型NADPの340nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定するリパーゼ活性測定方法。
[21]前記[8]に記載のリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール−3−リン酸に変換し、次いでグリセロール−3−リン酸オキシダーゼを作用させ過酸化水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルオキシダーゼを作用させ発色反応を行い、540〜700nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定するリパーゼ活性測定方法。
[22]アポリポ蛋白CIIと両イオン性界面活性剤を含有するリパーゼ活性測定試薬を用いて得られるリパーゼ活性値からアポリポ蛋白を含有せず両イオン性界面活性剤を含有するリパーゼ活性測定試薬を用いて得られるリパーゼ活性値を差し引いて算出することを特徴とするリポプロテインリパーゼの活性測定方法。
[23]アポリポ蛋白CIIと両イオン性界面活性剤を含有するリパーゼ活性測定試薬を用いて得られるリパーゼ活性値からアポリポ蛋白を含有せず非イオン性界面活性剤を含有するリパーゼ活性測定試薬を用いて得られるリパーゼ活性値を差し引いて算出することを特徴とするリポプロテインリパーゼの活性測定方法。
本発明のリパーゼ活性測定用組成物、リパーゼ活性測定試薬、リパーゼ活性測定用キット、及びリパーゼ活性測定方法はヘパリン投与後の活性の低い検体中のHTGLやLPL活性を正確且つ簡便に行うために有用である。
本発明のリパーゼ活性測定方法は、この基質にLPLあるいはHTGLが作用して遊離するモノグリセリドを酵素的に検出することを特徴とする。
HTGL活性測定、LPL活性測定に用いる上記のジグリセリド濃度は0.1〜2mMの範囲で使用できるが、好ましくは0.2〜0.8mM特に好ましくは0.3〜0.7mMである。
下記反応式中MGLPはモノグリセリドリパーゼ、GKはグリセロールキナーゼ、ATPはアデノシン−3−リン酸、ADPはアデノシン−2−リン酸、PEPはホスフォエノールピルビン酸、PKはピルビン酸キナーゼ、NADHは還元型βジホスフォピリジンヌクレオチド、NADは酸化型βジホスフォピリジンヌクレオチド、ADP−HKはADP依存性のヘキソキナーゼ、G6PDHはグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼである。GPOはグリセロ−3−リン酸オキシダーゼ、PODはペルオキシダーゼ、4−AAは4−アミノアンチピリン、TOOSはエチル−N−(2−ヒドロオキシ−3−スルフォプロピル)−m−トルイジンナトリウムである。
本発明で用いるモノグリセリドリパーゼとしては、ジグリセリドに作用せずモノグリセリドに特異的に作用する酵素であれば特に起源は問わないが、安定供給の点で微生物由来酵素が好ましい。中でもバチルス属由来酵素が好ましい。リパーゼ反応における共役酵素として使用する濃度の下限値としては、0.5U/ml以上が好ましく、0.6U/ml以上がより好ましく、0.7U/ml以上がさらに好ましく、0.72U/ml以上が特に好ましく、0.74U/ml以上が大変に好ましい。上限値としては、5U/ml程度あれば充分であり、3U/ml以下が好ましく、1.13U/ml以下がより好ましく、1U/ml以下がさらに好ましく、0.8U/ml以下が特に好ましく、0.78U/ml以下が大変に好ましく、0.76U/ml以下が特に大変に好ましい。最も好ましいのは0.75U/ml付近である。
反応式2を用いるリパーゼの測定試薬組成の中で緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼおよびATPは前記反応式1の内容と同一である。グリセロールキナーゼの生成物のひとつであるADPはグルコース存在下ADP依存性へキソキナーゼ(ADP-HK)によりグルコース−6−リン酸に変換できる。
ADP-HKは特にその起源は問わないが、安定供給の点で微生物由来が好ましい。中でも保存安定性に優れたパイロコッカス属やサーモコッカス属等の高度好温菌由来酵素が特に好ましい。
ADP-HKの基質であるグルコースは2〜50mMの範囲で使用することができるが中でも10〜30mM特に15〜25mMが特に好ましい。リパーゼ反応の共役酵素としての本酵素の濃度は0.2〜3U/mlの範囲で使用できるが0.4〜1U/mlが特に好ましい。
本酵素の生成物であるグルコース−6−リン酸は酸化型NADまたはNADP存在下でグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼによって還元型NADまたはNADPに変換できる。グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼは特にその起源は問わないが安定供給の点で微生物由来酵素が好ましい。なかでもロイコノストック属由来酵素が特に好ましい。リパーゼ反応の共役酵素としての本酵素の濃度は0.2〜3U/mlの範囲で使用できるが0.4〜1U/mlが特に好ましい。
反応式3を用いるリパーゼの測定試薬組成の中で緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼおよびATPは前記反応式1の内容と同一である。グリセロールキナーゼの生成物のひとつであるグリセロール−3−リン酸はこれを特異的に酸化するグリセロ−3−リン酸オキシダーゼにより過酸化水素に変換することができる。
グリセロ−3−リン酸オキシダーゼは特にその起源は問わないが、安定供給の点で微生物由来が好ましい。中でも乳酸菌由来酵素が特に好ましい。膵臓由来リパーゼ反応の共役酵素としての本酵素の濃度は2〜50U/mlの範囲で使用できるが5〜20U/mlが特に好ましい。
グリセロ−3−リン酸オキシダーゼ反応で生成される過酸化水素はペルオキシダーゼとトリンダー試薬の色原体とカップラーとの酸化縮合により色素を生成する。
膵臓由来リパーゼ活性測定試薬中での濃度は0.02〜0.5%の範囲で使用することができるが0.05〜0.1%の範囲が特に好ましい。
その場合、両イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド、あるいは両イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドとアポリポ蛋白CIIとは、試薬1に加えること、試薬2に加えること、試薬1と試薬2との両方に加えることが可能であるが、試薬1あるいは試薬2の何れか一方に加える方が経済上好ましい。
還元型NADの吸光度を測定する際の波長としては、試料中の膵臓由来リパーゼ活性を正確に測定できる波長であれば何を用いてもよい(ある1波長でもよいし、ある範囲の波長の積算でもよい)が、例えば、300〜400nmから選択することが好ましく、320〜360nmから選択することがより好ましく、330〜350nmから選択することがさらに好ましく、340nm付近を選択することが大変に好ましい。340nm付近とは例えば、340nmに設定し、その誤差範囲が10nm以下であることが好適な例として挙げられ、その誤差範囲が5nm以下であることがより好適な例として挙げられ、その誤差範囲が3nm以下であることがさらに好適な例として挙げられ、その誤差範囲が1nm以下であることが大変に好適な例として挙げられる。
還元型NADの吸光度を測定する際の波長としては、試料中の膵臓由来リパーゼ活性を正確に測定できる波長であれば何を用いてもよい(ある1波長でもよいし、ある範囲の波長の積算でもよい)が、例えば、300〜400nmから選択することが好ましく、320〜360nmから選択することがより好ましく、330〜350nmから選択することがさらに好ましく、340nm付近を選択することが大変に好ましい。340nm付近とは例えば、340nmに設定し、その誤差範囲が10nm以下であることが好適な例として挙げられ、その誤差範囲が5nm以下であることがより好適な例として挙げられ、その誤差範囲が3nm以下であることがさらに好適な例として挙げられ、その誤差範囲が1nm以下であることが大変に好適な例として挙げられる。
[実施例]
5mlのヘパリンセファロースカラムを準備し、精製水で十分洗浄を行った。ヘパリンナトリウム溶液(1000単位/ml)をヒト体重Kgあたり30単位を静脈注射し15分後採血した血液を遠心分離(3000回転、10分)した血漿10mlに0.3Mになるよう塩化ナトリウム粉末を添加溶解した。本血漿を上記のカラムに通し酵素を吸着させた。
0.3M塩化ナトリウム液でカラムを洗浄した後、0.8M塩化ナトリウムを含む10mMPIPES-NaOH緩衝液(pH7.0)でHTGLを溶出した。次いで1.6M塩化ナトリウムを含む10mMPIPES-NaOH緩衝液(pH7.0)でLPLを溶出した。各画分を分子量30Kの限外濾過膜を用いて酵素を濃縮し、以下に示す試験に供した。
実施例1で得たHTGL画分とLPL画分を用い、ジグリセリドを溶解する界面活性剤の種類(表1記載)を変えて実施例3に示したリパーゼ活性測定用組成の試薬(LPL活性を測定する際にはブタ血清由来の精製アポリポ蛋白CIIを添加)を用いてリパーゼ活性を測定した結果を表1に示した。HTGL、LPL活性共に界面活性剤としてCHAPSを用いたときの活性を100%として各々相対活性で表したものであるが、この結果からわかるようにHTGLは非イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤に溶解した基質を用いても同じリパーゼ活性を示したが、LPL活性は非イオン性界面活性剤を使用した反応液組成では全く活性が発現しなかった。LPL活性は両イオン性界面活性剤を使用したときに活性を発現した。
[実施例3−1]HTGL、LPL活性測定用基質ジグリセリドの調製
ジオレイルレシチン(日本精化社製)1.5gを10mlのクロロホルムに溶解した。400UnitのホスフォリパーゼC(旭化成ファーマ社製)を溶解した5mlの0.5M PIPES−NaOH緩衝液(pH7.5)を加え37℃で攪拌しながら加水分解反応を行った。2時間後、溶媒層と水層とを分離し溶媒層を集め、予めクロロホルムに懸濁して調製した湿式のシリカゲルカラム(3ml)にチャージし、クロロホルムで展開して、標題のジグリセリド画分を得た。
実施例3−1で得たジグリセリドのクロロホルム溶液を一定量とり、減圧下で溶媒を完全に溜去した。3.5mMのジオレインになるように2.5mMのMES-NaOH緩衝液、pH5.5を含有した3%POE−ノニルフェニルエーテルまたは2.5mMのMES-NaOH緩衝液、pH5.5を含有した1.8%ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインを加え、37℃で1時間加温しながら攪拌して標題の基質溶液を得た。本基質溶液は冷蔵(約4℃)で保存した。
(1)HTGL活性測定用組成物の調製
標題のHTGL活性測定用組成物として、試薬1(R1)と試薬2(R2)からなる試薬を調製した。
1)試薬1(R1)の調製
100mM トリスー塩酸緩衝液(pH8.6)、前記3−2に示したHTGL活性測定用基質(0.3mM)、3mM硫酸マグネシウム、アデノシン−3−リン酸3mM、モノグリセリドリパーゼ(旭化成ファーマ社製)1125U/L、グリセロールキナーゼ(旭化成ファーマ社製)300U/L、ADP
アデノシン−3−リン酸3mM、ホスフォエノールピルビン酸1.5mM、ピルビン酸キナーゼ(オリエンタル酵母社製)3000U/L、ラクテートデヒドロゲナーゼ(オリエンタル酵母社製)600U/Lから構成される試薬を調製した。
2)試薬2(R2)の調製
10mM トリスー塩酸緩衝液(pH8.6)、1mM還元型NADで構成される試薬を調製した。
(2)HTGL活性測定
(1)に示した組成の試薬1(R1)800マイクロリットルに実施例1で得たHTGL検体30マイクロリットルを加え37℃で5分経過した後、2)に記載した試薬2(R2)400マイクロリットルを添加し37℃で反応を行い340nmにおける吸光度(Abs)の減少を連続的に測定した。
R2添加後3分から5分の吸光度減少量から次式によりHTGL活性を求めた結果、158U/Lであった。
HTGL活性(U/L)=340nmにおける1分間あたりの吸光度変化x1/6.3x1230/30x1000
(1)HTGL活性測定用組成物の調製
標題のHTGL活性測定用組成物として、試薬1(R1)と試薬2(R2)からなる試薬を調製した。
1)試薬1(R1)の調製
100mM トリスー塩酸緩衝液(pH8.6)、前記3−2に示したHTGL活性測定用基質(0.3mM)、3mM硫酸マグネシウム、アデノシン−3−リン酸3mM、グルコース3mM、モノグリセリドリパーゼ(旭化成ファーマ社製)1125U/L、グリセロールキナーゼ(旭化成ファーマ社製)300U/L、ADP依存性ヘキソキナーゼ(旭化成ファーマ社製)300U/L、グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ300U/L(東洋紡社製)、から構成される試薬を調製した。
2)試薬2(R2)の調製
10mM トリスー塩酸緩衝液(pH7.2)、1mM酸化型NADPで構成される試薬を調製した。
(2)HTGL活性測定
1)に示した組成の試薬1(R1)800マイクロリットルに実施例1で得たHTGL検体30マイクロリットルを加え37℃で5分経過した後、2)に記載した試薬2(R2)400マイクロリットルを添加し37℃で反応を行い340nmにおける吸光度(Abs)の増加を連続的に測定した。
R2添加後3分から5分の吸光度増加量から次式によりHTGL活性を求めた結果、156U/Lであった。
HTGL活性(U/L)=340nmにおける1分間あたりの吸光度変化x1/6.3x1230/30x1000
(1)LPL活性測定用組成物の調製
標題のLPL活性測定用組成物として、試薬1(R1)と試薬2(R2)からなる試薬を調製した。
1)試薬1(R1)の調製
100mM トリスー塩酸緩衝液(pH8.6),3.5mMのジオレインになるように2.5mMのMES-NaOH緩衝液、pH5.5を含有した1.8%ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインを加え、37℃で1時間加温しながら攪拌して調製した基質、3mM硫酸マグネシウム、アデノシン−3−リン酸3mM、モノグリセリドリパーゼ(旭化成ファーマ社製)1125U/L、グリセロールキナーゼ(旭化成ファーマ社製)300U/L、グリセロリン酸オキシダーゼ(旭化成ファーマ社製)15U/ml、ペルオキシダーゼ(シグマ社)1500U/L、0.2%TOOSから構成される試薬を調製した。
2)試薬2(R2)の調製
10mM トリス塩酸緩衝液(pH8.6)、0.1mg/mlのヒト血清由来の精製したアポリポ蛋白CII、0.2%4−アミノアンチピリンで構成される試薬を調製した。
(2)LPL活性測定
前記3)に示した組成の試薬1(R1)800マイクロリットルに実施例1で得たLPL検体50マイクロリットルを加え、37℃で3分間反応を行った後、前記4)に記載した組成の試薬2(R2)400マイクロリットルを添加し37℃で正確に5分間発色反応を行い0.5%SDS(ラウリル硫酸ナトリウム)500マイクロリットルを添加し反応を止めた後、550nmにおける吸光度を測定した結果、86U/Lであった。活性は次の計算式により算出した。
LPL活性(U/L)=550nmにおける1分間あたりの吸光度変化x1/16.5x1750/50x1000
ブタの血清50mlにエチルアルコール150mlをゆっくり攪拌しながら添加した。血清中のアルブミン、グロブリン等の蛋白成分は沈殿した。遠心分離(3000回転、10分間)して生じた沈殿物は除去し、上清液145mlを得た。この溶液に430mlのアセトンを加え生じた沈殿物を3000回転、10分間遠心分離して回収し、これに15mlの精製水を加えて溶解した。4℃で5mMトリスー塩酸緩衝液(pH7.2)500mlに対して透析を行いアポリポ蛋白CIIを含有する溶液を得た。この溶液をマイナス20℃に保存し、実施例3に記載したLPL活性測定用組成物の原料に供した。
実施例3―4に示したHTGL活性測定用試薬(アポリポ蛋白CII無添加の反応試薬を使用)、及び実施例3−4に示したHTGL活性測定用試薬の試薬2に実施例4で製造したアポリポ蛋白CIIを添加してLPL活性測定用試薬を用いて実施例1に記載したヘパリン投与後の血清検体を用いてHTGLとLPL活性を測定した。具体的にはR1800マイクロリットルに実施例1で得たHTGL検体30マイクロリットルを加え37℃で5分経過した後、R2 400マイクロリットルを添加し37℃で反応を行い340nmにおける吸光度(Abs)の増加を連続的に測定した。
R2添加後3分から5分の吸光度増加量から次式によりHTGL活性を求めた。
アポCII添加した反応液を使用したときのリパーゼ活性は252U/L、アポCII無添加の反応液を使用したときのHTGL活性は165U/Lであった。活性値の差はLPL活性であり87U/Lであった。
Claims (20)
- 少なくとも3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]−1−プロパンスルフォネート(CHAPS)又はラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインとジグリセリドとを含有するリポプロテインリパーゼ活性測定用基質組成物。
- リポプロテインリパーゼがヒト由来である請求項1に記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用基質組成物。
- 少なくとも3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]−1−プロパンスルフォネート(CHAPS)又はラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインとジグリセリド及びアポリポ蛋白CIIを含有するリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物。
- リポプロテインリパーゼがヒト由来である請求項3に記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物。
- アポリポ蛋白CIIがヒト又は動物血清由来である請求項3又は4に記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物。
- モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、還元型NAD、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、及びラクテートデヒドロゲナーゼを含有する請求項3〜5のいずれかに記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物。
- モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、酸化型NAD又は酸化型NADP、グルコース、ADP−ヘキソキナーゼ、及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼを含有する請求項3〜5のいずれかに記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物。
- モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、グリセロ−3−リン酸オキシダーゼ、及びペルオキシダーゼと過酸化水素発色試薬を含有する請求項3〜5のいずれかに記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物。
- モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、還元型NAD、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、及び緩衝液を含有する試薬1と、還元型NADと緩衝液を含有する試薬2とからなるリポプロテインリパーゼ活性測定用キットであって、請求項3〜5のいずれかに記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物を試薬1及び/又は試薬2に含有するリポプロテインリパーゼ活性測定用キット。
- モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、グルコース、ADP−ヘキソキナーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、及び緩衝剤を含有する試薬1と、酸化型NAD又は酸化型NADPと緩衝剤を含有する試薬2とからなるリポプロテインリパーゼ活性測定用キットであって、請求項3〜5のいずれかに記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物を試薬1及び/又は試薬2に含有するリポプロテインリパーゼ活性測定用キット。
- モノグリセリドリパーゼ、ATP、グリセロキナーゼ、グリセロ−3−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、及び緩衝剤を含有する試薬1と、カップラーと緩衝剤とを含有する試薬2とからなるリポプロテインリパーゼ活性測定用キットであって、請求項3〜5のいずれかに記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物を試薬1及び/又は試薬2に含有するリポプロテインリパーゼ活性測定用キット。
- 少なくとも3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]−1−プロパンスルフォネート(CHAPS)又はラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインとジグリセリドを含有する基質を用いてリパーゼ反応により生成されるモノグリセリドを酵素的に測定するリポプロテインリパーゼ活性測定方法。
- リポプロテインリパーゼがヒト由来である請求項12に記載のリポプロテインリパーゼ活性測定方法。
- 少なくとも3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]−1−プロパンスルフォネート(CHAPS)又はラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインとジグリセリドを含有する基質にさらにアポリポ蛋白CIIを含有する試薬を用いてリパーゼ反応により生成されるモノグリセリドを酵素的に測定する請求項12又は13に記載のリポプロテインリパーゼ活性測定方法。
- アポリポ蛋白CIIがヒト又は動物血清由来である請求項14に記載のリポプロテインリパーゼ活性測定方法。
- 請求項6に記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをATP存在下にグリセロールキナーゼによりADPに変換し、次いでホスフォエノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型NAD存在下にラクテートデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型NADの340nm付近の波長における吸光度の減少速度を測定するリポプロテインリパーゼ活性測定方法。
- 請求項7に記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをATP存在下にグリセロールキナーゼによりADPに変換し、次いでグルコース存在下にADP−へキソキナーゼでグルコース−6−リン酸に変換し、更に酸化型NAD又はNADP存在下にグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、還元型NAD又は還元型NADPの340nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定するリポプロテインリパーゼ活性測定方法。
- 請求項8に記載のリポプロテインリパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これをATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール−3−リン酸に変換し、次いでグリセロール−3−リン酸オキシダーゼを作用させ過酸化水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルオキシダーゼを作用させ発色反応を行い、540〜700nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定するリポプロテインリパーゼ活性測定方法。
- 3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]−1−プロパンスルフォネート(CHAPS)又はラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインとジグリセリド及びアポリポ蛋白CIIを含有するリパーゼ活性測定試薬を用いて得られるリパーゼ活性値から、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]−1−プロパンスルフォネート(CHAPS)又はラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインとジグリセリドを含有しアポリポ蛋白を含有しないリパーゼ活性測定試薬を用いて得られるリパーゼ活性値を差し引いて算出することを特徴とするリポプロテインリパーゼの活性測定方法。
- 3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンミニオ]−1−プロパンスルフォネート(CHAPS)又はラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインとジグリセリド及びアポリポ蛋白CIIを含有するリパーゼ活性測定試薬を用いて得られるリパーゼ活性値から、非イオン性界面活性剤とジグリセリドを含有しアポリポ蛋白を含有しないリパーゼ活性測定試薬を用いて得られるリパーゼ活性値を差し引いて算出することを特徴とするリポプロテインリパーゼの活性測定方法。
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