JPS58216700A - レシチン：コレステロールアシルトランスフエラーゼを用いる全コレステロール分析 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

技術分野 本発明はコレステロールエステル及びｉｔ　Ｍｌｔコレ
ステロールを含む液体中の全コレステし？−ルを分析す
るのに有用な方法及び組成物に関する。 従来技術 （２） 」レスラーロールは、血清又は＋Ｉｎ　漿のような生体
水性液体中に、一部遊離の形で一部コレスチロールエス
テルの形で存在している。全コレステロ−）Ｉｙ　（Ｔ
ｉ１ｌ　’１３　、Ｍ　Ｍｌｔ　及ヒエステル化コレス
テロールからの二ｌレステし１−ル寄与和）の公知の定
量分析は、腐蝕性化学薬剤、例えばＫ　ＯＩＩを使用し
てコレステＩ：Ｉ−ルエステルを遊離コレステロールに
加水分解し、次いで溶液中で全ｉｉｉ離コレステロール
を分析する方法を含む。 最近、コレステし１−ル及びコレステロールエステルを
検知可能な生成物に転化するのに酵素が使用されている
。これらの方法では、通常、コレステｌ」−ルエステル
ヒドラーゼ酵素とも呼ばれる、コレステロールエステラ
ーゼ酵素を使用して最初にコレステロールエステルを遊
離のコレステロールに転化−ｕしめている。この方法に
おけるコレステロールエステラーゼ酵素の使用は１９７
５年３月　４０のグツドヒユー等の米国特許第３１３６
９３４９号及び１９７６年９月２８日のグツドヒユー等
の米国特許第３９８３００５号に記載されている。これ
らの酵素はコレ（３） ステロールエステルに対して水性媒質に於りるコレステ
ロールエステルのコレステロールハ・の加水分解を促進
する特別の活性を示す。「エステラーゼ」及び［エステ
ルヒドラーゼ」なる用語は、酵素の存在下に水分子がコ
レステｌコールエステル分子のエステル部分と反応する
加水分解反応を触媒する酵素を意味する。 」レスチロールエステルのエステラーゼ１亢進加水分解
の間又は後、遊離コレステロールはニルステロン及び過
酸化水素に転化し、そして過酸化水素をパーオキシダー
ゼの存在下に色素前駆体とカップリングさせるごとによ
り検知する。 λ吸Δ亘肛 本発明の第一の目的は、コレステロールエステルを遊Ａ
ｌｌコレステロールに転化せしめる別の方法を利用して
、コレステロールエステル及び’ｒＷ　％ＩＩｌコレス
テロール含有水性液体（又は流体）中の全コレステロー
ルを分析する別の方法を提（Ｊ（することにある。 本発明の第二の目的は、前記方法を実施するた（４） めの組成物を提供Ｊることにある。 全一１！！Ｊ−（７）朋膚 本発明に従えば、前記第一の目的は、コレステ１、Ｊ−
ルエステル及び遊離コレステし】−ル含有水性液体中の
全コレステロールを分析するに当り、（ａ）前記液体の
試料中の実質」二すべでのコレステ１コールエステル類
をコレステロールに転化せしめるのに十分な量のりゾレ
シヂン及びレシチン：コレステロールアシルトランスフ
ェラーセ（ＬＣＡＴ）活性を示す酵素を含む組成物と前
記液体試料とを接触せしめ、 （ｂ）コレステロールエステル類への転化以外の手段に
より前記試料からコレステロールを除去し、そして （Ｃ）前記除去コレステロールの量を分析する工程を含
んで成ることを特徴とするコレステロールエステル及び
′ｔｆ離コレステロール含有水性液体中の全コレステロ
ールの分析方法を提供することにより達成される。 本発明に従えば、前記第二の目的は、 （５） （ａ）コレステＩ」−ルエステル及び遊離コレステロー
ル含自水性液体の試料中の実質」二すべでのコレステロ
ールエステル類をコレステロールに転化−已しめるのに
十分な量のレシチン：コレステｌ」−ルアジルトランス
フェラーゼ（Ｌ（ＪＴ）活性を示す酵素及びリヅレシヂ
ンを含む試薬組成物並びに（ｂ）コレステロールニスう
一ル類への転化以外の手段により前記試料から」レステ
１」−ルを除去する手段 を含んで成るコレステロールエステル及び遊Ｍｌｔ　ｍ
ｌレスチロール含有水性液体中の全コレステ１」−ル分
析用組成物を提供することによって達成される。 光調の具体的温調− 前記工程（ｂ）に於りるコレステ１」−ルの除去は、例
えばコレステロールとコレステｌ」−ルオキシダーゼと
の反応により過酸化水素を生成−１しめるなどの各種の
方法によって実施される。全コレステロールの測定は、
例えば前記過酸化水素をパーオキシダーゼ−色素カップ
ル試薬との相互反応により着色色素に転化−ｕしめるこ
とによって実施（６） される。 本発明の好ましい態様においては、リゾレシチンはレシ
チン及びレシチンのりゾレンチンへの転化を触媒するこ
とのできる酵素により補助又は置換される。レシチンは
、追加試薬成分又は人間の血ｌＩ′＃のようなある種の
液体サンプル中にお＆Ｊる自然的存在のいずれによって
も供給される。 前述の方法において、十分量のＬＣＡＴ及びリゾレシチ
ンと試料との接触は試＄４からのコレステロールの除去
を伴っておこなわれる。後者の工程が不存在の、場合、
又はＬＣＩ’ｌＴもしくはりゾレシチンの存在量が不充
分の場合には、コレステロールエステルの遊８１［コレ
ステｌ」−ルへの転化があまり進行しない。従って、全
コレステロール定量分析工程において、得られる結果は
全コレステロールの真のレベルより小さくなる。 全コレステロールの上に規定したＬＣＡＴによる定量方
法は、溶液中においＣ１又は実質」二乾式（即し非液体
含有）型の臨床分析素子内において、実施する。 （７） 本発明に係る全」レステＵ−ルの定量方法は、いくつか
の好ましい特長を呈する。コレステ１」−ルエステラー
肴又は」レステＩ−ノールエステルヒドラーゼを包含す
る公知の酵素的アブｌ、フーチに対する経済的に魅力あ
る代替法である。この方法は、また、コレステロールコ
ースチルのコレステＬＪ−）レー・の実質」二完全な転
化を供し、それによって全コレステロールの正確且つ高
制度の分析が可能となり、分析結果か迅速に得られ、そ
して溶液分析及び１旨触乾燥状態の臨床分析素子への適
合性が良好になる。 本発明の実施に際しては、コレステロールエステル及び
リゾレシチン源の存在下に、レシチン：コレステロール
アシルトランスフェラーゼ活性を呈する酵素を使用する
。ＬＣＡＴ酵素はよく知うしたコレステロールエステラ
ーゼ又はコレステロールエステルヒドラーセ＾ゲ素とは
いくつかの点で異なる。コレステロールエステラーゼ又
はコレステロールエステルヒドラーゼは、水が前記反応
の間に放出されるアシル基のアクセプター分子と（８） して作用する水性媒質中において、コレステロールコー
スチルを加水分解するのに機械学的に作用する。−・方
、１、ＣＡＴはニルステロール分１’１％！　シない。 ＬＣＡＴは、本発明において使用するように、アシル基
のアクセプターとしーζ水よりむしろリゾレシチンの存
在を必要とする。ＩＣＡＴを含有するニルステロールエ
ステル水溶液中にリヅレシ（−ンが存在しない場合には
、水の存在にも拘わらず、コレステ１」−ルへの転化は
起らない。 ＬＣ八へｌ’ｉゲ素源は人の血清又は血漿などである。 血　　１／ＮＬＣＡＴは、グし！ムセノトＪ．Ａ．の，
ｊ，Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ＋　　９巻。 １５５−１６７頁（１９６８）　　；ガストウＥ．等の
Ｓｃａｎｄ．Ｊ．ＣＩｉｎ。 ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．＋３８巻，　Ｓｕｐｐｌ　、　
１５０＋　１５頁（１９７８）　　、Ｋ。 キタハクケ等の旧ｏｃｌ＋．ｅＬ　Ｂｉｏｐｈｙ，Ａｃ
ｔａ，５７３ｔ４４５−１５４頁（　１９７９）及びフ
ィールディングＣ．Ｊ．＋　Ｓｃａｎｄ。 Ｊ．ＣＩｉｎ．　　Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．＋３３巻，
Ｓｕｐｐｌ．１３７．１５−１７頁（　１９７４）に開
示のように、単１ｉ１１１され、精製され、性化される
。 好ましいＬＣＡＴは微生物の培養」二層液から得られる
ものであり、特に、ビプリオナセエｆ１、並びに　　２
（９） マソクインティレ，Ｓ．，１〜ラス１〜，Ｔ．Ｊ．、ハ
ックレイ、、１。 Ｔ，のＪ．Ｂａｃｔｅｒｊｏ屓，　１３９巻，　１３２
−　１３６頁（１９７９）　に開示され一ζいるよ・）
なスタフィロニ１ノカス・アラレ久ん又はに、バーＩー
レソＩ−　、　Ｍ．Ｊ．キード及びＥ．＾．マーザー，
　　Ｐｌ＋ｏＬｏ轄ｃｍ−ｉｓＬｒｙ＋　　１３Ｑ＋１
１０７−１１１３頁（１．９７４）に開示されているよ
うなフィコマイヒスＬス■次ノＪニゴ貞不ノーからの微
生物が好ましい微生物源である。最も々ｒましいＬ　Ｃ
　Ａ　ＴはＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．　（米　　　　゛国メリー
ランド用ロックウィル）から供給される二ど一□壬（、
−史モナス・ハイーＹ男Ｚ／−艷≧□へＴ（、Ｃ９０７
１の培養」二ＩＰｉ液から痔られるものである。 微生物からの血清ＬＣＡＴに関する、及びＧＣ／ＩＴに
関する上記文献は、」レステし１−ルのコレステロール
エステルへの転化についてのｊｊ適用可能であるという
これらの酵素の機構を引用している。これ　　・らの引
用文献には、これらの酵素が逆様式、即しコレステｌ：
ｌ　−　／レニＩーステルのＪレスチロールへの転化に
使用して全コレステロールの定量分析を容易にすること
ができることは報告されていないし、示唆もされていな
い。 （１０） 血清中のＬＣＡＴの屋は英国特許第１５０１５６１号に
従って測定される。この反応組成物は、コレステロール
及び血清試料からのＬＣＡＴと共に、界面活性剤及びレ
シチンを含む。しかしなから、試料中のコレステし１−
ル１ステルは、存在していたとしても、Ｊ分別の一ルス
テ

【」−ルにはあまり転化されず、そしてそれらの全量
は未知のままである。この特許はｌ　ＣＡ　Ｔ及びリゾ
レシチンを全コレステロールを定けするのに十分な量で
使用することを教えてもいなりれば、示唆もしていない
。 リゾレシチンと共に試１′−１中の実質」−すべでのコ
レステ１２−ルエステルをコレステロールに転化−已し
めるのに十分なＬＣＡＴの量は幾つかの因子に依存する
。そのような量は、試薬−試料混合物（以下反応混合物
と言う）、即も溶液分＋Ｊｉ′におりる試料−＋−ａＡ
：薬溶液の全容債又は乾式分析素子で実施される分ＪＪ
ｉ’におりる試薬ゾーンに到達されるとＩ庄定される試
（゛」容積中のＬＣＡＴの濃度により好都合に規定され
る。従って、この基準に基づけば、ＬＣ；ＡＴの濃度は
例えば約３０〜５５国降車位（ＩＵ）／＃の範囲で変動
し、約２０単位／ｌの場合に血ｌＰｊ試料に於て好まし
い結果が得られる。乾式分ＪＪｉ素子に塗布する場合に
はＬ　ＣＡ　１’酵素は被覆中の起り得る活性の低下を
補うために可なり過剰の呈で使ｙ１目−るのが好ましい
。好ましい被ｒＲＮは２５０〜７５０１１’位／ｒＪテ
アル。（用イル１．ｃＡＴａ＆　ハ約２　Ｘ　１０−５
′単位／ｐの正’＋”Ｉ’＋゛の血清ＬＣＡＴＩＡ度で
シャープなコンＩ・ラス１−を示し、従って英国特許第
１５（］１５ＧＩＭの反応混合物の濃度より遥かに高い
濃度である。）本発明のコレステロールエステルのコレ
ステロールへの転化反応工程においてはりゾレシチンの
アシル受容体としての存在が必須である。リゾレシチン
はシグマケミカルカンパニー（米国ミズリー州センｌ−
ルイス）から市販の商品Ｌ−α−リソポスファチジルコ
リンのような市販品を使用することができる。或いは、
リゾレシチンはホスホリパーゼＡ−２のような加水分解
酵素の存在下にレシチンを酵素的に脱アシル化するごと
によっても得ることができる。かかる点からすれば、リ
ゾレシチンは高ｔｉｌｌｉな物質であるので、本発明に
従って使用される＝１−ステル試薬組成物はし・シチン
をレシチンのりヅレノチンへの加水分解を触媒する酵素
と絹め合わけ′Ｃ包含するごとがてきる。この組合上は
分）ハ“条（）１下において其の場でリゾレシチンを生
成−已しめる。更に、レシチンは：ルステロール二１−
スラールとり゛ゾレシチンとのコレステ１」−ル生成反
応の副へに物として生成するものであるから、生成レソ
ーｙ−ンはレシヂンー加水分解酵素の存在下にリゾレシ
チンに加水分解して戻すことができる。 （ト記反応式１参照）。従って、し・シチンー加水分解
酵素の使用による実用的特長は、レシチンの当初の必要
量を減少さ・ｌることであり、反応式Ｉの過程で十分な
雫のレシチンが形成される。 席１剣式」− １、、ＣＡ　Ｔ 」Ｊレスラ用−Ｉ　（リヅレシチンーーートレンチン−
÷−コレスチレンチン加水分Ｍ酵素　　　除去 所望なら、少量のりヅレシチンをＬＣＡＴ−促進反応（
ｌ　３） の開始を補助するためにレシチン及び加水分ｈ１：酵素
と一緒に使用することもできる。 反応混合物中の好ましいりゾレシチン濃度は、０．１〜
１．０ミリモル濃度である。リゾレシチンの別の源を使
用した場合には、上記濃度を供することのできるように
する。 好ましいレノチンー加水分解酵素はア一孔兄−千−尤ス
・ハ・イ１只汀う−の培養」二層液から回収されるよう
なボスポリパーＭＡ−２である。−レシチン−加水分）
Ｗ酵素のその他の例はレシチナーゼ及びホスファタイド
２−アシルヒ１ラーゼである。同一の上ｒｉｉｌｌνか
らＬＣＡＴも回収することができるので、アー１１コモ
ナス・ハイド１コフイラから回収した酵素製斉１肋り最
も々了まし２い。この内ゲ素はしＣＡＴの舟の１〜１０
倍量で存在するのが々ｒましい。 人の血清試料を分析する場合には、当該試料中に自然に
存在するレシチンで、ア活−ヒ汚ヲニス・ハ浜ｔどノン
ー之−の培養−上層液から回収されるホスホリパーゼＡ
−２のようなレシヂンー加水分解酵素の存在下にリゾレ
ノチンの１もの場での生成を開始（Ｉ４） するのに十分である。従って、本発明の方法は、（ａ）
：コレステ１」−ル、コレステロールエステル及びレシ
チンを含む人の血清のような水性の試料と、試料中の実
質−にすべてのコレステ１」−ルエステルをτルーステ
１コールに転化セしめるのに十分な量の１．ＣＡＴ酵素
及びレシチン加水分解酵素とを接触・ｕしめ、 （ｌ〕）コレステロールエステルへの転化以外の手段に
より前記試料からコレステロールを除去し、そして （Ｃ）前記除去二ｌレスチロールの量を分析することに
よっても実施される。 ＬＣＡＴ及びレシチン−加水分解酵素がともに微４１：
。 物ア弐ど汚ブス・ハイ−じ盟７−エラーに由来するもの
であるのが好ましく、このようにして回収された酵素製
剤は両方の酵素活性を有する。 ニルステｌ」−ルエソ、ヲールのコレステロールへのエ
ステル−刺激転化の場合には、全Ｊレスチロール分析中
の試料から」レステし１−ルを除去する工程が使用され
る。前述の如く、コレステ１コールエステルの化学ｍ論
的（即ち実質」一完全な）転化はコレステロール除去工
程の不存在下には行なえない。この目的のために、コレ
ステ［１−ルを除去スる任意の手段が、コレステロール
がレシチンと相互反応してコレステし！−ルを生成して
（前記反応式１０）逆反応）コレステロールを利用不可
１１とにしない限り、適当である。従って、例えばコレ
スプロールを適当な物質との錯体化によって物理的に除
去することができる。代表的な錯化剤は、例えば莢国ハ
ンプシャー州ハハント、ボームウェル（ＰＯ９１１ＥＦ
　）のインダストリアル　オボヂュニティー社刊行の［
リジ°−チディスクロージャー」１３７巻、項目１３７
３９に記載されているようなジギトニンである。錯化後
、錯体は例えば濾過によって試料から除去することがで
き、そしてコレステ１：ｌ　−ルは、脱１１（化して、
」レステ１」−ルの化学的除去に関連して）ｊ１１述し
たようにして定♀するが、或いは重量分析的に定量する
。 或イハ、そして好ましくは、コレステロ−ル心。１それ
をコレスプロールエステル以外の生成物に化？的に変化
さｕ′ることによって除去する。化学的除去の々ｆまし
い態様においては１．：Ｉレステに２−ルは、−Ｉレス
テ１：１−ルと反Ｌｉ；　シて前記生成物に生成−ｕし
めるのに必要な第」−の＾ゲ素及び試薬（例えば緩１子
ｊ剤、活性化剤等）からなる第二の試薬組成物でもって
＾ゲ素的に転化さ・Ｕることによって前記したような生
成物に変化せしめる。 ニルステＩ：Ｊ−ルの除去は、水性液体と液体及びリヅ
レノチンとの接触と同時に又は該接触に引き続き開始さ
れる。 一ルステロール除去工程において使用される好ましい第
二の酵素はコレステｌ」−ルオキンダー七である。この
酵素は以下の反応式に１７ｊって酸素の存在士にコレス
テ１−１−ルエステルの分解を触媒する。 唄司曳Ｄ− 」レスチロール＋酸素→コレステノン＋過酸化水素コレ
ステロール オキシダーセ 上記反応の結果として生成する反応生成物の−っ（ｌ　
７） である過酸化水素は第二の酵素の存在トに第二、の反応
試薬を各種の周知技術によって検知可能な生成物に転化
−１しめるのに使用される。前記した各種の周知技術と
しては、例えばＣ，Ｔ、グツトヒユー等の１９７６年９
月２８１Ｊ発ｊｊの米国特許第３９８３００５　’；３
に開示のカラー形成性物質をカラー指示系で着色物に転
化せしめるものがある。 本発明の好ましい態様に従えば、コレステし１−ル分析
はコレステ［１−ルの酵素的酸化によって生成する過酸
化水素の量を定量する指示組成物を使用して達成される
。酵素的に発生した過酸化水素を検知する有用な指示組
成物は当業界において、特にグルコース及び尿酸のｂゲ
素的検知におりる指示組成物として周知である。米国特
許第３０９２４６５号及び同第２９８１６０６号は本発
明の成功裡の実施に杓用な指示組成物を開示している。 過酸化水素指示組成物は、一般には、過酸化的活性を有
する物質、好ましくはパーオキソダーゼ、並びに過酸化
水素及び酸素の存在下に色形成又は色変化をする指示物
質を含む。 （１８） パーオキシダーゼは過酸化水素が他の物質を酸化するの
を触媒する酵素である。パーオキシダーゼは、一般に、
鉄ポルフィリンを含む複合蛋白質である。パーオキシダ
ーゼはわさび、ポテト、いもら′くの木の（Ａ（液及び
かぶら（１１ｕ物パーオキシダーゼ）、ミルク（ラクト
パーオキシダーゼ）、並びに自＋ｍ球（ベルｌ−パーオ
キシダーゼ）に存在する。或種の合成パーオキシダーゼ
、例えばセオレル及びマエリーの帖±す坤訓が９樵、４
巻、４２２−４３４頁（１！１５０）に開示の合成パー
オキシダーゼも有用である。更に、ヘミン、メトヘモグ
ロビン、オキソヘモグし】ビン、ヘモグロヒン、ヘモク
ｌ」モゲン、アルカリンヘマチン、ヘミン誘導体及び過
酸化作用又はパーオキシダーゼのような活性を示す、即
ら過酸化水素もしくは他の過酸化物による別の物質の酸
化を触媒する能力を有するその他の化合物も有用である
。 酵素ではないが、パーオキシダーゼのような活性を示す
その他の物質は、シリカゲルなどに吸収さ−Ｕたクロム
塩（例えば硫酸クロムカリウム）、鉄ノ、ルボソアネ−
１・、１失タンネート、フエ１：１シアン化第−鉄など
である。 或いは、指示組成物は、過酸化水素及びパーオキシダー
ゼのイｉ在下に酸化によって実質的に色変化は起さない
が、酸化された形でカラー形成１（１もしくは色変化性
物質と反応して化学反応の可視定量測定種を生じる、一
種もしくはそれ以上の物質を含む。そのようなカラー指
示組成物は特に米国特許第２９８１６０６号に詳細に記
載されている。後者のカラー形成性組成物、即し中間生
成物によって又はカラーカップリング反応によってカラ
ーを生成するものが本発明の実施に好ましい。 本発明のカラー指示組成物は、好ましくは、（ａ）その
酸化形態で自己カップリングする４−メトキシ−１−ナ
フトール、又は （ｂ）Ｉ、７−ジしドＵキソナフタレン及び４−アミノ
アンヂピリン（ＩＩｃＩ）の組合せを含む。 本発明は、溶液、即ｒ）試薬成分が試薬水溶液として供
される「湿式−化学」モー１−の分析に容易に適合する
。所定割合の試薬溶液を分析すべき血清の如き水性液体
試料と接触せしめる。しかしながら、好ましい態様では
、試薬成分は乾式素子中に絹み入れる。このような素子
は、分析すべき水性液体と接触するまでは、実質−１−
液体を含まない。 適当な素子は、一般的な吸収性のディップ−アンドーリ
−１′型の素子を含むが、拡散層、−もしくはそれ以上
の試薬層及び任意的な支持体を含んで成る分析素子が最
も好ましい。そのような分析素子は、例えばプルツィビ
ロウィノ等の米国特許第３９９２１５８号及びグツドヒ
ユー等の同第３９８３００５号に記載されている。 後記の例においては、以−トの物質を使用した。 レシチン；コレステロールアシル１−ランスフエラーナ
’ｆｆｉ　（ＬＣＡＴ）は八、ＴｙＣ，Ｃ，’　（米国
メリ、−ラント州ロノクヴイル）から入手したアエｒ：
２モナス・ハイ１゛ロフイラ＾ＴＣＣ９０７１から得た
。この酵素ば７２９１３５巻、　４０２−４０７頁（１
９７８）に記載の方法に従って精製し、部分的に特性化
した（分子量５０００００）。 （２１） アコニロモナス・ノ入イド１コフィラの培痒ハ、１％グ
ルコース、１％イーストエキス、０．１％に２１１ＰＯ
４゜１．５％アガール（寒天）及び１％（ｖ／ｖ）！恭
溶液からなる栄養斜面培地で実施した。前記塩／８液は
、０．ＩＮの塩酸中に０．１モルＭｇ５（１４，０，０
１モルＦｅＳＯ４，０，０１モルＮａＣｌ、　０．０１
モルトＩｎＳＯ４，０，４ミリモルＮａ２ＭｏＯ４，Ｏ
，１ミリモルＺｎＳＯ４，及び０．６ミリモルＣａＣｌ
２を溶解さ−Ｕて使用した。バクテリア培養培地成分は
米国ミシガン州デＩ・ロイドのディフコカンパニーより
購入し、アガール（ＡＢａｒ）は英国１ηントンのＡノ
クスフォードリミデノドより購入した。 コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＤ　＞　　はス１−
レプ１−マイセス・ビオラセンス及びノカルディア・コ
レステロールノ・力・らｔＱた。 パーオキシダーゼはポースラディシュ（わさび）タイプ
１１．１５２プルプロガリン単位／ｍｇ固体を使用した
。その他の成分はウシ血清アルブミン、１７−α−リソ
ポスファヂシルコリン（タイプ１卵黄からのりゾレシヂ
ン）及びＮ−２−ヒドロキシ（２２） コニチルピペリジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（１
汁円ｉｓ　）緩ｉ÷ｉ刑を含む。これらの成分はシグマ
ヶ＼カルカンパニー（米国ミズリー州センＩ・ルイス）
から得た。 その他のＪべての薬剤は米国ニューヨーク州ロチェスタ
ーのイースＩ−マンニ１ダノクプＪンパニーから供給さ
れているものである。 嵯−娑−人乞町−少４す■倶１１町」吠則裂（Δ）二Ｊ
レステｌ：ｌ　−）レエステルのＭ　ｌ１ｉｌ！のコレ
ステ１１−ルへの転化が完結するのに要する時間は以下
のようにして求めた。 ニルステ１：Ｊ−ルリル−トストノクｌ容〆／ｌ（６，
９３ミリモル１度）を１５％トライ１−ンＸ−１００□
からなる水溶液に調製して酵素レシチン；コレステｌ：
Ｉ　−）レアジルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の基
質として作用せしめた。この溶液から各種濃度の基質（
０，３５，０，０７，１，１及び１．４ミリモル濃度）
を調製した。各溶液のサンプルを試薬組成物を含む独立
のキュヘノ１〜に加え、得られた反応混合物（試薬−（
−サンプル）は１．５重量％トライトンＸ−１００，０
，４，６２ミリモルリヅレシチン、２２ ×１０単位１、ＣＡ１’（このｒＩｖ素の添加前にキュ
ヘットは３７℃で１０分間プレコンディショニングした
）及び全量１．Ｏｍｌにする０、８３ｍ１の緩衝剤試薬
を含んでいた。前記６ｔ　ｆｉｉ剤試薬は、ｐＨ７，０
で５０ミリモルＩＩＩミＰ　１４　Ｓの緩由液５０ｍ１
中に調製した、パーオキシダーゼ１．４　ｍｇ、０−ジ
アニシジン（指示薬）４ＩＴＩｌ？、コレステ１」−ル
オキシダーセ１２単位及びＣａｃｉ２１４　ｍｇを含む
ものであった。ＬＣＡＴを除く上記すべての成分を含む
ブランクは前記基質と同様に処理した。４３０　ｎｍで
の吸光度の変化を分光光度計において約４０分間監視し
た。反応は約３０分間で実質上完結した。このことは吸
光度の−に昇が認められないことにより確認された。 （Ｂ）全コレステロールの測定用標準曲線は以下のよう
にして作製した。 各サンプルのく３０分後の）全吸光度変化を測定してコ
レステリルリル−トの濃度の関数としてブロン］・シた
。これらの濃度はコレステロール６濃度と化学量論的に
関連しているので、３０分後の吸光度変化を濃度既知の
コレステロールエステルにグ・１し′ζプし１ノドして
得られた曲線は全コレステ１」−ル測定用標準曲線とし
て機能した。 大−施桝 例１−１４ 本発明方法と対１１＜４力法との比較（？ａ　ｌ＆分析
）」６記コレステリルリル−トの終点分析を血清サンプ
ル中の全コレステロ−ル分析に適用した。 対照分析としてはウメ−シントン・エンザイマティノク
・」レステ１：Ｊ−ル・キソｌ−（米国ニューシャーシ
ー州フリーポールｌ−のＷｏｒｔｈｉｎｇＬｏｎ　Ｂｉ
ｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）を使用した。この
分析はコレステロールオキシダーセ反応をパーオキシダ
ーゼ反応と結合さ−Ｖるものである。上記（Δ）におい
て述べた試薬組成物に記載した成分を含む１４本のキュ
ヘットを３７℃でＩＯ分間プレコンディシロニングした
。次に、血清サンプルを添加して各キュヘノ１−の最終
容積を１．Ｏｍｌとした。４３０　ｎｍでの３０分後の
吸光度の変化を、」二記（■３）の標準曲線の値と比較
して各サンプル中の全コレステロ（２５） −ル濃度（ｍｍ、ｏｌ）を求めた。結果（ｆＪ’Ｔ、−
位をｍｍｏ　Ｉからｍｇに変換した）を第１表に示す。 第１表の結果は本発明方法とり］照方法との間の優れた
相関関係を示している。 以下余白 （２６） 第１表 １［１１１青ニルステ１コール中のコレステロ］！駁４
！槌３の／！！１１−覆二−舌準男１イＵ＝で＼／りと
λ−１、ＣＡ　’ｒ絹合−Ｕ分析結果　タ１照分析結果
例　　　　　　（ｍｇ）　　　　　　　　　　　（＋＋
＋ｇ）１　　　　０．０２９’ｌ　　　　　Ｏ，０３０
（ｉ２　　　　０、０２８２　　　　０．０３０　Ｇ３
　　　　０、０３　Ｇ　３　　　　０．０３６０４　　
　　　（１，０３６６０，０３６０５０、０３９４０，
０４０４ Ｇ　　　　　Ｏ，０４０２０，０４０４７０、０５５７
０，０５４８ ８０、０５４９０，０５４８ ９０，０４０２０，０４１０ １００，０２２００，０２０５ １１０，０２０１０，０１８３ １２０、０３９４０，０３６５ １３０、０２９６０，０３０６ ］　４　　　　０．０２９３　　　　０．０３０６例１
５ 本発明のＬＣＡＴＣＡ相成物使用の乾式分析素子以下の
構造を自する乾式多層分）バ素子を製造した。 □厘□−１ｊ’ｊ　−−−−−、−−−−−−−一−分
−−−ｊｌＪ、ｐ−房／　ｎ（、、、−」二部　　１．
ＣＡＴア：にロモナス・試薬　　ハイ１１」フィシ　　
　　　　　５．１１１１’ｊ位コレステ【−１−ルオキ
シダーゼ　２４００単位トライトンＸ−１００　　　　
　　８ｇ肛Ｐ１シＳ緩衝剤　　　　　　　　　ｐｌ＋　
７．０拡散　　ＴｉＯ２５０ｇ 酢酸セノｌ／ｌ二７−ス　　　　　　　　　７ｇエスタ
Ｐ（ポリウレタン）　　　　　１．ｈ−ト塗　　ポリＮ
−イソプｌ−１ピル アクリルアミｔ”　　　　　　　　　　０．３２ｇゲル
　　ゼラチン　　　　　　　　　　　５．４゜パッド　
アルカノールＸ−Ｃ■　　　　　　　０．０５ｇＩＩ　
Ｅ　Ｐ　ＩＥ　Ｓ緩衝剤　　　　　　　　　ｐＨ７，０
（以下、次頁に続く） 屓　　　　　成　　−−−−−−−−一一一匁Ｘ−−−
−−−−−−−捗」１」／］（−下部　　４−イソプＩ
コボキシー１−ナフ１−−ル　０．９ｇｉ氏薬　　５，
５−ジメチル−１，３−ツクｌ：Ｉ−”、キザンジオン
　　　　　　０．２１ｇヒス（ヒニルスルポニルメチル
） Ｊニーチル　　　　　　　　　　　０．３２ｇヒス（ｎ
−ブチルメタクリレ−１−− ｍ１−−スチレン−：Ｉ　−２−アクリルアミ１−２−
メチルプロパン）スル ボン酸（５０：　４０：　１０重里）　　　　　　５．
２ｇパーオキソダーゼ　　　　　　１６０００単位Ｉｔ
　Ｅ　ｐＩシＳ緩（＋ｉ剤　　　　　　　　　　　　　
　　　ｐＨ７，０支持体　ポリ　（エチレン）テレフタ
レート以りの素子４よコレステロール及びコレステロー
ルエステルを含む血／Ｉ！？試料中の仝」レスチロール
を分ＪＪｉ’するのに使用した。ごれらの血清試料は、
更に、レシチン（血清成分中に自然に存在するものとし
て）を含ん７でおり、このレシチンはＬ　ＣＡ　Ｔ（ｊ
舌−１浜モナス・ハモ↓Ｐツｌプ）製剤に存在す（２９
） るレシチン加水分解酵素ホスホリパーゼΔ−２によって
其の場でリゾレシチンに加水分解された。 得られた結果は全ニルステし１−ルの標１１１４分）バ
ー値と相関していた。 特許出願人 イースＩ〜マン　コダノク　カンパニー特許出願代理人 弁理士　青　木　　　朗 弁理士西舘和之 弁理士　石　１」１　　　　敏 弁理士　山　Ｌｌ　　昭　之 （３０）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、コレステロールエステル及び遊離コレステし２一ル
   含有水性液体中の全コレステロールを分析するに当り、 （ａ）前記液体の試料中の実質上すべてのコレステロー
   ルエステル類をコレステ１コールに転化−已しめるのに
   十分な量のりヅレシチン及びレシチン：コレステロール
   アンルトランスフエラーセ（ＬＣＡＴ）活性を示す酵素
   を含む組成物と前記液体試料とを接触・ｌＬシめ、 （ｂ）コレステロールエステル類への転化以外の手段に
   より前記試料からコレステロールを除去し、そして （Ｃ）前記除去コレステロールの量を分析する工程を含
   んで成ることを特徴とするコレステロールエステル及び
   遊離コレステロール含有水性液体（１） 中の全コレステロールの分析力法。 ２、（ａ）コレステＬ】−ルエステル及び遊離コレステ
   ロール含有水性液体の試料中の実質」−すべてのニルス
   テロールエステル 転化・ｕしめるのにト分な量のレシチン；コレステロー
   ルアシル１−ランスフェラーゼ（１、ＣＡＴ）　活１ｉ
   ［−示す酵素及びリゾレシチンを含む試薬組成物並びに （ｂ）コレステｌ」−ルエステル類への転化以外の手段
   により前記試料からコレステ１コールを除去する手段 を含んで成るコレステロールエステル及び遊離コレステ
   ロール含有水性液体中の全コレステＩコール分析用組成
   物。