KR20050071588A - 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법 및 시약 - Google Patents

고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법 및 시약 Download PDF

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Abstract

검체와, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 담즙산 유도체를 함유하는 수성 매체 중에서 반응시켜, 생성된 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법 및 그것에 사용하는 시약.

Description

고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법 및 시약{METHOD AND REAGENT FOR MEASURING CHOLESTEROL IN HIGH-DENSITY LIPOPROTEINS}
본 발명은 검체 중의 고밀도 리포 단백질 (이하, HDL 이라 약기한다) 중의 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약, 측정용 키트, 신규 담즙산 유도체 및 신규 담즙산 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
생체내 리포 단백질은 그 비중에 따라 고밀도 리포 단백질 (HDL), 저밀도 리포 단백질 (이하, LDL 이라 약기한다), 초저밀도 리포 단백질 (이하, VLDL 이라 약기한다), 카이로 마이크론 (이하, CM 이라 약기한다) 으로 분류되어 있고, 각각 주로 아포 단백질의 종류의 차이에 따라서 생체내에서의 기능이 크게 다르고, 지질 조성도 여러 가지이다. 그 중에서, HDL 은 동맥벽을 포함한 각 조직으로부터 콜레스테롤을 받아들이기 위해서 세포 내에 축적된 콜레스테롤의 제거 작용에 관계하여, 관동맥 경화증을 비롯한 각종 동맥 경화증의 위험 예방 인자이고, 그 혈중 레벨은 동맥 경화성 질환의 발증 예지의 유용한 지침이 되는 것으로 알려져 있다.
종래의 HDL 중의 콜레스테롤 (이하, HDL 콜레스테롤이라 약기한다) 의 측정법은 초원심법, 면역 화학적 방법, 전기 영동법, 침전법 등에 의한 분획 조작과 콜레스테롤 정량 조작의 2단계로 이루어진다. 그러나, 분획 조작은 조작이 번잡하고, 장시간을 요하고, 또한 안전성의 점에서도 문제가 있었다. 따라서, 이들의 분리 조작을 동반하는 측정법은 매우 효율이 나빠, 실용화에 알맞지 않은 방법이었다.
최근, 상기 문제를 해결하기 위한 여러 가지의 측정법이 개발되어 있다. 예를 들어, HDL 이외의 리포 단백질을 응집시키는 측정법으로서, 덱스트란황산 등의 HDL 이외의 리포 단백질을 응집시키는 시약, 2가의 금속염, 및 화학적으로 수식(修飾)된 효소를 사용하는 측정법 (일본 공개특허공보 평8-131197호), 폴리음이온 등의 HDL 이외의 리포 단백질과 복합체를 형성하는 시약과, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물 등의 리포 단백질을 용해하지 않는 계면 활성제를 사용하는 측정법 (일본 공개특허공보 평8-201393호), 덱스트란황산 등의 폴리음이온, 2가의 금속염, 특정 비이온성 계면 활성제 및 시료 유래의 알부민과는 다른 알부민을 사용하는 측정법 (일본 공개특허공보 평9-285298호) 등이 알려져 있다. 또한, 혈청 또는 혈장을 리포 단백질 분획제 (덱스트란황산 등의 폴리음이온과 마그네슘이온 등의 2가 양이온의 조합) 를 포함하는 용액으로 처리하고, 얻어진 혼합액을 고체 및 액체의 분리 처리를 하지 않고, 음이온성 계면 활성제 (알킬술폰산 또는 담즙산 또는 그 유도체) 의 존재 하에, 콜레스테롤에스테라제 및 콜레스테롤옥시다제와 반응시켜, 생성된 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 혈청 또는 혈장 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하는 방법 (일본 공개특허공보 평8-116996호) 도 알려져 있다.
그러나, 이들 HDL 이외의 리포 단백질을 응집시키는 HDL 콜레스테롤 측정법에 있어서는 종래의 기준법과 양호한 상관성이 있지만, 반응에 의해 생성되는 응집물로 인한 탁함에 기인하는 부정확성, 반응 셀의 알칼리 세정시에, 반응액 중의 금속염과의 반응에 의해 생성되는 금속수산화물의 석출로 인한 자동 분석 장치에 대한 과도한 부하의 문제가 있다.
또한, HDL 이외의 리포 단백질을 응집시키지 않는 측정법으로서, 아실폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르에 의해 HDL 이외의 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 우선적으로 과산화수소로 변환시켜, 생성된 과산화수소를 소거한 후, 폴리옥시에틸렌알킬에테르의 첨가에 의해, HDL 콜레스테롤을 효소적으로 측정하는 방법 (일본 공개특허공보 평9-299호), 생체 시료와, 췌장 유래의 콜레스테롤에스테라제와, 콜레스테롤옥시다제와, 콜산 등의 담즙산을, 알부민이 존재하는 조건 하에서 접촉시켜, HDL 콜레스테롤과 당해 효소의 반응에 의해 소비되는 화합물 또는 생성되는 화합물을 측정하는 것을 특징으로 하는 HDL 콜레스테롤의 측정 방법 (국제 공개 제97/40376호 팜플렛) 등이 알려져 있다.
그러나, 이들 HDL 이외의 리포 단백질을 응집시키지 않는 HDL 콜레스테롤 측정법에 있어서는 HDL 이외의 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 불완전한 소거나, HDL 이외의 리포 단백질 중의 콜레스테롤에 대한 비특이 반응에 기인하는 측정치의 부정확성이 문제가 되는 경우가 있다.
담즙산류를 사용하는 HDL 콜레스테롤 측정법으로서는 상기 일본 공개특허공보 평8-116996호나 국제 공개 제97/40376호 팜플렛에 기재된 방법 외에, 예를 들어 혈청 또는 혈장을, 콜레스테롤에스테라제, 콜레스테롤옥시다제, 및 담즙산염 또는 담즙산 유도체 또는 디옥틸술포숙시네이트를 함유하는 완충액 속에서 당해 효소와 반응시켜, VLDL 및 LDL 중의 콜레스테롤을 HDL 콜레스테롤에 앞서 반응시켜, 생성된 과산화수소를 측정한 후, 비이온계 폴리옥시에틸렌옥시드기 함유 계면 활성제를 반응액에 첨가하여 HDL 콜레스테롤과 당해 효소를 반응시켜, HDL 콜레스테롤을 특이적으로 분별 정량하는 방법 (일본 공개특허공보 소62-69999호), 혈청을, 특정 pH 및 특정 온도 하, 췌장 유래의 콜레스테롤에스테라제, 콜레스테롤옥시다제, 담즙산군의 계면 활성제, 및 비이온계 계면 활성제를 함유하는 완충액 속에서 당해 효소와 반응시킴으로써 HDL 콜레스테롤을 측정하는 방법 (일본 공개특허공보 소63-126498호), 생체 시료를, 알부민 및 담즙산 또는 그 염의 존재 하에, 췌장 유래의 콜레스테롤에스테라제와 콜레스테롤옥시다제에 접촉시켜, HDL 콜레스테롤을 당해 효소와 반응시킨 후, 처리된 생체 시료를 미생물 유래의 콜레스테롤에스테라제와 접촉시켜, LDL 콜레스테롤을 당해 효소 (미생물 유래의 콜레스테롤에스테라제와 콜레스테롤옥시다제) 와 반응시킴으로써, HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤을 측정하는 방법 (일본 공개특허공보 평11-9300호), 리포 단백질을 함유하는 시료를, 담즙산 유도체 및/또는 양성 계면 활성제의 존재 하에 효소 (콜레스테롤에스테라제 및 콜레스테롤옥시다제) 와 반응시켜, HDL 콜레스테롤을 선택적으로 반응시킨 후, 폴리옥시에틸렌쇄를 갖는 비이온성 계면 활성제를 반응액에 첨가하여 HDL 콜레스테롤을 선택적으로 반응시킴으로써, HDL 콜레스테롤 및/또는 LDL 콜레스테롤을 측정하는 방법 (일본 공개특허공보 2000-325097호) 등이 알려져 있다. 그러나, 이들 측정법은 측정에 장시간을 요하는 경우가 있고, 또한 반드시 HDL 콜레스테롤에 특이적인 측정법은 아니었다.
옥시에틸렌기를 에스테르 부분에 갖는 콜산의 에스테르는 공지이지만 (일본 공개특허공보 평5-221941호), 당해 에스테르를 사용한 HDL 콜레스테롤의 측정법은 알려져 있지 않다.
에스테르 화합물의 합성 방법으로서는 일반적으로, 카르복시산과 알코올의 축합 반응에 의해 합성하는 방법이 간편하고, 특히 산촉매를 사용하는 공비 에스테르화법이 흔히 이용되고 있다. 그러나, 부피가 큰 치환기나 수용성기를 갖는 화합물에서는 수율이 낮은 경우가 있다 (씨 케이 인골드 (C. K. Ingold) 저, 「스트럭처 앤드 매커니즘 인 오가닉 케미스트리 (Structure and Mechanism in Organic Chemistry」 (영국), 제2판, 벨 (Bell) 1969년, 15장, p. 1128-1178). 예를 들어, 상기 일본 공개특허공보 평5-221941호에는 산촉매로서 p-톨루엔술폰산을 사용한 콜산과 디에틸렌글리콜모노메틸에테르의 반응에 의한 콜산에스테르의 합성 방법이 기재되어 있지만, 72시간이라는 장시간의 가열 환류를 행하더라도, 콜산에스테르의 수율은 23% 로 매우 낮고, 또한 후처리 조작도 복잡하고 번잡하다.
또한, 분자 내에 수산기를 갖는 카르복시산에서는 자기 에스테르화도 진행되기 때문에, 분자 내의 수산기를 보호하여 알코올과의 에스테르화를 행하는 방법도 이용되고 있다. 예를 들어, 우르소데콜산과 2-히드록시에틸옥시글리코시드를 사용한 우르소데콜산에스테르의 합성 방법이 알려져 있지만 (일본 공개특허공보 평11-199598호), 본 방법은 1) 우르소데콜산의 수산기를 TBDMS (t-부틸디메틸실릴) 기로 보호하는 공정, 2) 에스테르화 공정, 및 3) 탈보호 (TBDMS 기의 제거) 공정을 포함하는 방법이기 때문에 간편한 합성법이라고는 하기 어렵다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 검체 중의 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 간편하고 또한 정확히 측정하기 위한 방법, 그리고 그 방법에 사용하는 측정 시약 및 측정 키트를 제공하는 데에 있다.
본 발명은 하기 [1]∼[42] 에 관한 것이다.
[1] 검체와, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 담즙산 유도체를 함유하는 수성 매체 중에서 반응시켜, 생성된 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 측정하는 방법.
[2] 수성 매체가, 추가로 알부민을 함유하는 [1] 기재의 방법.
[3] 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 [1] 또는 [2] 기재의 방법.
[4] 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 및 킬레이트 기능을 갖는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 [3] 기재의 방법.
[5] 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 [3] 기재의 방법.
[6] 담즙산 유도체가, 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[7] 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 콜산 또는 그 염, 타우로콜산 또는 그 염, 글리코콜산 또는 그 염, 리토콜산 또는 그 염, 데옥시콜산 또는 그 염, 케노데옥시콜산 또는 그 염, 우르소데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소케노데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소데옥시콜산 또는 그 염, 히오콜산 또는 그 염, 히오데옥시콜산 또는 그 염, 및 데히드로콜산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 담즙산 유도체인 [6] 기재의 방법.
[8] 담즙산 유도체가, 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[9] 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (I)
R 1 -CH 2 -CH(R 2 )-CH 2 -SO 3 - (I)
[식 중, R1 은 3-(3-코라미드프로필)디메틸암모니아기이고, R2 는 수소 원자 또는 수산기이다] 로 표현되는 화합물인 [8] 기재의 방법.
[10] 담즙산 유도체가, 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[11] 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (II)
(X 는 수소 원자 또는 수산기를 나타내고, R3 및 R4 는 동일하거나 상이하고, 치환 또는 비치환의 알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 알카노일기를 나타낸다) 로 표현되는 화합물, 또는 일반식 (III)
{식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
[식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다] 로 표현되는 기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다} 으로 표현되는 화합물인 [10] 기재의 방법.
[12] 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
[13] 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체 및 산화형 보효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
[14] 추가로, 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 [13] 기재의 시약.
[15] 추가로, 알부민을 함유하는 [12]∼[14] 중 어느 하나에 기재된 시약.
[16] 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 [12]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 시약.
[17] 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 및 킬레이트 기능을 갖는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 [16] 기재의 시약.
[18] 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 [16] 기재의 시약.
[19] 담즙산 유도체가, 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 [12]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 시약.
[20] 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 콜산 또는 그 염, 타우로콜산 또는 그 염, 글리코콜산 또는 그 염, 리토콜산 또는 그 염, 데옥시콜산 또는 그 염, 케노데옥시콜산 또는 그 염, 우르소데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소케노데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소데옥시콜산 또는 그 염, 히오콜산 또는 그 염, 히오데옥시콜산 또는 그 염, 및 데히드로콜산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 담즙산 유도체인 [19] 기재의 시약.
[21] 담즙산 유도체가, 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 [12]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 시약.
[22] 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (I)
R 1 -CH 2 -CH(R 2 )-CH 2 -SO 3 - (I)
[식 중, R1 은 3-(3-코라미드프로필)디메틸암모니아기이고, R2 는 수소 원자 또는 수산기이다] 로 표현되는 화합물인 [21] 기재의 시약.
[23] 담즙산 유도체가, 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 [12]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 시약.
[24] 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (II)
(X 는 수소 원자 또는 수산기를 나타내고, R3 및 R4 는 동일하거나 상이하고, 치환 또는 비치환의 알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 알카노일기를 나타낸다) 로 표현되는 화합물, 또는 일반식 (III)
{식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
[식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다] 로 표현되는 기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다} 로 표현되는 화합물인 [23] 기재의 시약.
[25] 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하여, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
[26] 담즙산 유도체를 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하여, 과산화수소 측정용 시약을 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
[27] 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하여, 담즙산 유도체를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
[28] 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하여, 담즙산 유도체 및 산화형 보효소를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
[29] 담즙산 유도체를 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하여, 산화형 보효소를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
[30] 추가로, 환원형 보효소 측정용 시약을, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유하는 [28] 또는 [29] 기재의 키트.
[31] 추가로, 알부민을, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유하는 [25]∼[30] 중 어느 하나에 기재된 키트.
[32] 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 [25]∼[31] 중 어느 하나에 기재된 키트.
[33] 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 및 킬레이트 기능을 갖는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 [32] 기재의 키트.
[34] 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 [32] 기재의 키트.
[35] 담즙산 유도체가, 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 [25]∼[34] 중 어느 하나에 기재된 키트.
[36] 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 콜산 또는 그 염, 타우로콜산 또는 그 염, 글리코콜산 또는 그 염, 리토콜산 또는 그 염, 데옥시콜산 또는 그 염, 케노데옥시콜산 또는 그 염, 우르소데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소케노데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소데옥시콜산 또는 그 염, 히오콜산 또는 그 염, 히오데옥시콜산 또는 그 염, 및 데히드로콜산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 담즙산 유도체인 [35] 기재의 키트.
[37] 담즙산 유도체가, 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 [25]∼[34] 중 어느 하나에 기재된 키트.
[38] 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (I)
R 1 -CH 2 -CH(R 2 )-CH 2 -SO 3 - (I)
[식 중, R1 은 3-(3-코라미드프로필)디메틸암모니아기이고, R2 는 수소 원자 또는 수산기이다] 로 표현되는 화합물인 [37] 기재의 키트.
[39] 담즙산 유도체가, 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 [25]∼[34] 중 어느 하나에 기재된 키트.
[40] 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (II)
(X 는 수소 원자 또는 수산기를 나타내고, R3 및 R4 는 동일하거나 상이하고, 치환 또는 비치환의 알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 알카노일기를 나타낸다) 로 표현되는 화합물, 또는 일반식 (III)
{식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
[식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다] 로 표현되는 기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다} 으로 표현되는 화합물인 [39] 기재의 키트.
[41] 일반식 (III)
{식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
[식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다] 로 표현되는 기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다} 로 표현되는 화합물.
[42] 일반식 (V)
[식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타낸다] 로 표현되는 화합물과, 일반식 (VI)
(식 중, W' 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 또는 치환 또는 비치환의 아릴기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다) 로 표현되는 화합물, 또는 일반식 (VII)
(식 중, T 는 치환 또는 비치환의 아미노알킬기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다) 로 표현되는 화합물을, 축합제의 존재 하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 일반식 (III)
{식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
[식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다] 로 표현되는 기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다} 으로 표현되는 화합물의 제조 방법.
본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법은 HDL 이외의 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 소거하지 않고, HDL 콜레스테롤을 측정하는 방법이다.
본 발명의 측정 방법에 사용되는 검체로서는 예를 들어 전혈, 혈장, 혈청, 수액, 타액, 양수, 뇨, 땀, 췌액 등을 들 수 있지만, 혈장 및 혈청이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로서는 콜레스테롤에스테르를 가수 분해하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤에스테라제, 리포프로테인리파아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤에스테라제, 리포프로테인리파아제 등도 사용할 수 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로서는 무수식(無修飾)의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소도, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소도 사용할 수 있다. 또한, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로서는 시판품을 사용할 수도 있다.
시판되고 있는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로서는 콜레스테롤에스테라제 “Amano” 2 (CHE 2 ; 아마노 엔자임사 제), 콜레스테롤에스테라제 “Amano” 3 (CHE 3; 아마노 엔자임사 제), 리포프로테인리파아제 (LPL 311; 토요보세키사 제), 리포프로테인리파아제 “Amano” 6 (LPL6; 아마노 엔자임사 제), 콜레스테롤에스테라제 [COE 313 (화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테라제); 툐요보세키사 제] 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에서는 2종류 이상의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 조합하여 사용할 수도 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 화학 수식에 있어서 당해 효소를 수식하는 기 (화학 수식기) 로서는 예를 들어 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 킬레이트 기능을 갖는 기 등을 들 수 있지만, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기가 바람직하다. 수용성 다당류로서는 예를 들어 덱스트란, 풀루란, 가용성 전분 등을 들 수 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 화학적으로 수식하기 위한 시약 (화학 수식제) 으로서는 상기 화학 수식기와, 효소의 아미노기, 카르복시기, 술프히드릴기 등과 반응할 수 있는 관능기 또는 구조를 겸비하는 화합물 등을 들 수 있다. 효소 중의 아미노기와 반응할 수 있는 관능기 또는 구조로서는 예를 들어 카르복시기, 활성 에스테르기 (N-히드록시석신이미드기 등), 산무수물, 산염화물, 알데히드, 에폭시드기, 1,3-프로판술톤, 1,4-부탄술톤 등을 들 수 있다. 효소 중의 카르복시기와 반응할 수 있는 관능기 또는 구조로서는 예를 들어 아미노기 등을 들 수 있다. 효소 중의 술프히드릴기와 반응성이 있는 기 또는 구조로서는 예를 들어 말레이미드기, 디술피드, α-할로에스테르(α-요오드에스테르 등) 등을 들 수 있다.
화학 수식제로서, 시판품을 사용할 수도 있다. 시판 중인 화학 수식제로서는 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 N-히드록시석신이미드기를 갖는 선브라이트 VFM-4101, 선브라이트 MEAC-50 HS, 선브라이트 MEC-50 HS (모두 닛폰 유지사 제), 폴리알킬렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 산무수물 구조를 갖는 선브라이트 AKM 시리즈 (예를 들어, 선브라이트 AKM-1510 등), 선브라이트 ADM 시리즈, 선브라이트 ACM 시리즈 (모두 닛폰 유지사 제), 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 에폭시드기를 갖는 EPOX-3400, M-EPOX-5000 (모두 Sheawater Polymers 사 제), 킬레이트 기능을 갖는 기와 산무수물 구조를 갖는 디에틸렌트리아민-N,N,N',N",N"-펜타무수아세트산 (DTPA anhydride; 도닌 화학사 제) 등을 들 수 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 화학 수식은 예를 들어 이하의 방법으로 행할 수 있지만, 본 방법에 한정되는 것은 아니다. 우선, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 pH 8.0 이상의 완충액 (예를 들어 HEPES 완충액) 에 용해하고, 0∼55℃ 에서 0.01∼500배 몰량의 화학 수식제를 첨가하여 5분간∼5시간 교반한다. 실제의 효소 반응에 있어서는 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로서, 이 반응액 자체 뿐만 아니라, 필요에 따라 한외여과막 등에 의해 미반응의 화학 수식제 등을 제거한 것도 사용할 수 있다.
본 반응의 방법에 사용되는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 농도로서는 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 반응액 속에서 0.01∼200U/mL 의 농도인 것이 바람직하고, 0.02∼100U/mL 인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 콜레스테롤 산화 효소로서는 콜레스테롤을 산화하여 과산화수소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤옥시다제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤옥시다제 등도 사용할 수 있고, 콜레스테롤옥시다제 “Amano” 1 (CHOD1; 아마노 엔자임사 제), 콜레스테롤옥시다제 (CO-PE; 킥코만사 제), 콜레스테롤옥시다제 (COO 321; 토요보세키사 제) 등의 시판품을 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명에 있어서는 2종류 이상의 콜레스테롤 산화 효소를 조합하여 사용할 수도 있다.
콜레스테롤 산화 효소는 무수식의 효소이어도 되고, 화학적으로 수식된 효소이어도 된다. 화학적으로 수식된 콜레스테롤 산화 효소는 예를 들어 전술한 화학 수식제를 사용하여 전술한 화학 수식 방법에 의해 제작할 수 있다.
본 반응의 방법에 사용되는 콜레스테롤 산화 효소의 농도로서는 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 반응액 속에서 0.01∼200U/mL 의 농도인 것이 바람직하고, 0.02∼100U/mL 의 농도인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 콜레스테롤 탈수소 효소로서는 산화형 보효소의 존재 하에 콜레스테롤을 산화시켜 환원형 보효소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤데히드로게나제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤데히드로게나제도 사용할 수 있다. 콜레스테롤데히드로게나제 “Amano” 5 (CHDH5; 아마노 엔자임사 제) 등의 시판품을 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명에 있어서는 2종류 이상의 콜레스테롤 탈수소 효소를 조합하여 사용할 수도 있다. 콜레스테롤 탈수소 효소는 무수식의 효소이어도 되고, 화학적으로 수식된 효소이어도 된다. 화학적으로 수식된 콜레스테롤 탈수소 효소는 예를 들어 전술한 화학 수식제를 사용하여, 전술한 화학 수식 방법에 의해 제작할 수 있다.
본 반응 방법에 사용되는 콜레스테롤 탈수소 효소의 농도로서는 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 반응액 속에서 0.01∼200U/mL 의 농도인 것이 바람직하고, 0.02∼100U/mL 의 농도인 것이보다 바람직하다.
본 발명의 콜레스테롤 탈수소 효소를 사용한 측정법에 있어서는 산화형 보효소가 사용된다. 산화형 보효소로서는 예를 들어 NAD, NADP, 티오-NAD, 티오-NADP 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 알부민으로서는 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 알부민이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 소, 말, 양, 인간 유래의 알부민 등을 들 수 있지만, 소 혈청 알부민 (BSA) 을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 알부민도 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는 유래가 다른 2종류 이상의 알부민을 조합하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정에 있어서의 알부민의 농도로서는 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 반응액 중의 농도가 0.001∼10% 인 것이 바람직하고, 0.01∼1% 가 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 담즙산 유도체로서는 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 담즙산 유도체이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체, 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체, 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체 등을 들 수 있다.
본 발명의 담즙산 유도체로서는 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 등의 콜레스테롤 측정 효소를 사용한 HDL 콜레스테롤의 측정의 정확성 또는 재현성의 점, 또는 콜레스테롤 측정 효소의 보존 안정성의 점 등에서 특히 바람직하다.
음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체로서는 예를 들어 콜산 또는 그 염, 타우로콜산 또는 그 염, 글리코콜산 또는 그 염, 리토콜산 또는 그 염, 데옥시콜산 또는 그 염, 케노데옥시콜산 또는 그 염, 우르소데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소케노데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소데옥시콜산 또는 그 염, 히오콜산 또는 그 염, 히오데옥시콜산 또는 그 염, 데히드로콜산 또는 그 염 등을 들 수 있다. 염으로서는 예를 들어 암모늄염, 리튬염, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염 등을 들 수 있다. 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체의 농도로서는 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 반응액 중의 농도가 0.001∼30% 인 것이 바람직하고, 0.01∼3% 가 보다 바람직하다.
양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체로서는 예를 들어 일반식 (I)
R 1 -CH 2 -CH(R 2 )-CH 2 -SO 3 - (I)
[식 중, R1 은 3-(3-코라미드프로필)디메틸암모니아기이고, R2 는 수소 원자 또는 수산기이다] 로 표현되는 화합물 [이하, 화합물 (I) 이라고 한다] 등을 들 수 있다. 이하, R2 가 수소 원자인 화합물 (I) 을 CHAPS 와, R2 가 수산기인 화합물 (I) 을 CHAPSO 라고 부른다. 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체의 농도로서는 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 반응액 중의 농도가 0.001∼30% 인 것이 바람직하고, 0.01∼3% 가 보다 바람직하다.
비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체로서는 예를 들어 일반식 (II)
(X 는 수소 원자 또는 수산기를 나타내고, R3 및 R4 는 동일하거나 상이하고, 치환 또는 비치환의 알킬, 또는 치환 또는 비치환의 알카노일을 나타낸다) 로 표현되는 화합물 [이하, 화합물 (II) 이라고 함] 등을 들 수 있다. 화합물 (II) 에 있어서의 알킬기, 알카노일기에 공통의 알킬로서는 직쇄 또는 분지상의 탄소수 1∼10 의, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 들 수 있다. 화합물 (II) 중의 치환 알킬기 및 치환 알카노일기에 있어서의 치환기로서는 예를 들어 수산기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 할로겐 원자는 불소, 염소, 브롬, 요오드의 각 원자를 의미한다. 화합물 (II) 중, R3 및 R4 가 모두,
COCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH 2 OH
(이하, 치환기 A 라고 함) 인 화합물이 바람직하다. 이하, X, R3 및 R4 가 각각, 수소 원자, 치환기 A 및 치환기 A 인 화합물을 deoxy-BIGCHAP, 수산기, 치환기 A 및 치환기 A 인 화합물을 BIGCHAP 라고 한다.
또한, 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체로서는 예를 들어 일반식 (III)
{식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
[식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다] 로 표현되는 기 [이하, 치환기 (IV) 라고 함] 를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다} 으로 표현되는 화합물 [이하, 화합물 (III) 이라고 함] 도 들 수 있다.
화합물 (III) 은 예를 들어 일반식 (V)
[식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타낸다] 로 표현되는 화합물 [이하, 화합물 (V) 라고 함] 과, 일반식 (VI)
(식 중, W' 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 또는 치환 또는 비치환의 아릴기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다) 로 표현되는 화합물 [이하, 화합물 (VI) 이라고 함], 또는 일반식 (VII)
(식 중, T 는 치환 또는 비치환의 아미노알킬기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다) 로 표현되는 화합물 [이하, 화합물 (VII) 이라고 함] 을, 축합제의 존재 하, 용매 속에서 반응시킴으로써 제조 (합성) 할 수 있다. 본 반응에 있어서는 필요에 따라 염기를 공존시킬 수도 있다.
X, Y 및 Z 는 수소 원자, 수산기 또는 옥소기를 나타내지만, X, Y, Z 중 적어도 1개는 수산기인 것이 바람직하다. X', Y' 및 Z' 는 수소 원자, 수산기 또는 옥소기를 나타내지만, X', Y', Z' 중 적어도 1개는 수산기인 것이 바람직하다.
화합물 (III) 및 화합물 (VI) 에 있어서의 알킬기, 알카노일기에 공통의 알킬기로서는 직쇄 또는 분기상의 탄소수 1∼18 의, 예를 들어 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 네오펜틸기, 헥실기, 이소헥실기, 헵틸기, 이소헵틸기, 옥틸기, 이소옥틸기, 노닐기, 이소노닐기, 데실기, 이소데실기, 운데실기, 이소운데실기, 도데실기, 이소도데실기, 트리데실기, 이소트리데실기, 테트라데실기, 이소테트라데실기, 펜타데실기, 이소펜타데실기, 헥사데카실기, 이소헥사데카실기, 헵타데실기, 이소헵타데실기, 옥타데카실기, 이소옥타데카실기 등을 들 수 있고, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 노닐기, 도데실기 등이 바람직하다.
화합물 (III) 및 화합물 (VI) 에 있어서의 알케닐기, 알케노일기에 공통의 알케닐기로서는 직쇄 또는 분기상의 탄소수 2∼8 의, 예를 들어 비닐기, 프로페닐기, 이소프로페닐기, 알릴기, 부테닐기, 펜테닐기, 헥세닐기, 헵테닐기, 옥테닐기 등을 들 수 있다.
화합물 (III) 및 화합물 (VI) 에 있어서의 알키닐기, 알키노일기에 공통의 알키닐기로서는 직쇄 또는 분기상의 탄소수 2∼8 의, 예를 들어 에티닐기, 프로피닐기, 프로파길기, 부티닐기, 펜티닐기, 헥시닐기, 헵티닐기, 옥티닐기 등을 들 수 있다.
화합물 (III) 및 화합물 (VI) 에 있어서의 시클로알킬기로서는 탄소수 3∼8 의, 예를 들어 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기, 시클로옥틸기 등을 들 수 있다.
화합물 (III) 및 화합물 (VI) 에 있어서의 시클로알케닐기로서는 탄소수 4∼8 의, 예를 들어 시클로프로페닐기, 시클로부테닐기, 시클로펜테닐기, 시클로헥세닐기, 시클로헵테닐기, 시클로옥테닐기 등을 들 수 있다.
화합물 (III) 및 화합물 (VI) 에 있어서의 아릴기로서는 탄소수 6∼15 의, 예를 들어 페닐기, 나프틸기, 안트릴기, 페난트릴기, 비페닐기 등을 들 수 있다. 화합물 (III) 에 있어서의 치환 아릴기의 치환기로서는 예를 들어 알킬기 등을 들 수 있다. 그 알킬기로서는 예를 들어 전술한 알킬기를 들 수 있다.
화합물 (III) 및 화합물 (VII) 에 있어서의 치환 아미노알킬기로서는 예를 들어 N-1치환 아미노알킬기, N,N-2치환 아미노알킬기 등을 들 수 있다. N,N-2치환 아미노알킬기에 있어서의 질소 원자 상의 2개의 치환기는 동일하거나 상이해도 된다. N-1치환 아미노알킬기 및 N,N-2치환 아미노알킬기에 있어서의 질소 원자 상의 치환기로서는 예를 들어 전술한 알킬기 등을 들 수 있다. N-1치환 아미노알킬기로서는 예를 들어 2-(N-메틸아미노)에틸기, 2-(N-에틸아미노)에틸기, 2-(N-프로필아미노)에틸기, 2-(N-부틸아미노)에틸기, 3-(N-메틸아미노)프로필기, 3-(N-에틸아미노)프로필기, 3-(N-프로필아미노)프로필기, 3-(N-부틸아미노)프로필기, 4-(N-메틸아미노)부틸기, 4-(N-에틸아미노)부틸기, 4-(N-프로필아미노)부틸기, 4-(N-부틸아미노)부틸기 등을 구체적으로 들 수 있다. N,N-2치환 아미노알킬기로서는 예를 들어 2-(N,N-디메틸아미노)에틸기, 3-(N,N-디메틸아미노)프로필기, 4-(N,N-디메틸아미노)부틸기 등을 구체적으로 들 수 있다. 화합물 (III) 및 화합물 (VII) 에 있어서의 비치환 아미노알킬기로서는 2-아미노에틸기, 3-아미노프로필기, 4-아미노부틸기 등을 구체적으로 들 수 있다.
n 은 에스테르 부분에 있어서의 옥시에틸렌기의 평균 중합도를 나타낸다. 평균 중합도는 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 범위이면 특별히 제한되지 않지만, 3∼400 이 바람직하고, 8∼300 이 보다 바람직하고, 15∼200 이 특히 바람직하다.
화합물 (V) 로서는 예를 들어 콜산, 리토콜산, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산, 우르소데옥시콜산, 7-옥소리토콜산, 12-옥소리토콜산, 12-옥소케노데옥시콜산, 7-옥소데옥시콜산, 히오콜산, 히오데옥시콜산, 데히드로콜산 등을 들 수 있다.
W 가, 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기 및 치환 또는 비치환의 아미노알킬기로 이루어지는 군에서 선택되는 기인 화합물 (III) [이하, 화합물 (IIIa) 라고 함] 을 합성하는 경우에는 화합물 (VI) 또는 화합물 (VII) 의 화합물 (V) 에 대한 당량비는 0.5∼1.5 가 바람직하고, 1∼1.2 가 보다 바람직하다. W 가, 일반식 (IV) 로 표현되는 기인 화합물 (III) [이하, 화합물 (IIIb) 라고 함] 을 합성하는 경우에는 화합물 (V) 의 화합물 (VI) 또는 화합물 (VII) 에 대한 당량비는 1.3∼4.1 이 바람직하고, 1.7∼2.2 가 보다 바람직하다.
화합물 (III) 을 합성할 때의 반응 온도로서는 10∼40℃ 가 바람직하고, 20∼35℃ 가 보다 바람직하다. 화합물 (III) 을 합성할 때의 반응 용매로서는 화합물 (V) 과 화합물 (VI) 의 축합 반응을 방해하지 않는 용매이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 유기 용매를 들 수 있다. 그 유기 용매로서는 예를 들어 톨루엔, 자일렌 등의 방향족 탄화수소계 용매, 아세트산에틸 등의 지방족 에스테르계 용매, 디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄 등의 할로겐화탄화수소계 용매 등을 들 수 있다.
화합물 (III) 를 합성할 때에 사용하는 축합제로서는 화합물 (V) 와 화합물 (VI) 또는 화합물 (VII) 과의 축합 반응을 진행시키는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 카르보디이미드류, 피리디늄염, (벤조)티아졸륨염, (벤조)옥사졸륨염, 이소시아네이트류, 카르보닐 시약 등을 들 수 있지만, 카르보디이미드류가 바람직하다. 카르보디이미드류로서는 예를 들어 1,3-디시클로헥실카르보디이미드, 1,3-디(tert-부틸)카르보디이미드, 1,3-디이소프로필카르보디이미드, 수용성 카르보디이미드 등을 들 수 있지만, 수세정 제거가 간편하다는 점에서 특히 수용성 카르보디이미드가 바람직하다. 수용성 카르보디이미드로서는 예를 들어 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 또는 그 염 등을 들 수 있다. 그 염으로서는 예를 들어 염산염, 요오드화메틸염 등을 들 수 있다. 피리디늄염으로서는 예를 들어 2-클로로메틸피리디늄요오드염, 2-브로모메틸피리디늄요오드염 등을 들 수 있다. (벤조)옥사졸륨염으로서는 예를 들어 2-클로로벤조옥사졸륨플루오르화붕소염 등을 들 수 있다. (벤조)티아졸륨염으로서는 예를 들어 2-클로로벤조티아졸륨플루오르화붕소염 등을 들 수 있다. 이소시아네이트류로서는 예를 들어 클로로술포닐이소시아네이트 등을 들 수 있다. 카르보닐 시약으로서는 예를 들어 1,1-카르보닐디이미다졸 등을 들 수 있다.
축합 반응에 있어서의 축합제의 당량수로서는 화합물 (IIIa) 을 합성하는 경우에는 화합물 (V) 에 대하여 1.0∼5.0당량이 바람직하고, 1.1∼2.5당량이 보다 바람직하고, 화합물 (IIIb) 를 합성하는 경우에는 화합물 (VI) 또는 화합물 (VII) 에 대하여 1.0∼5.0당량이 바람직하고, 1.1∼2.5당량이 보다 바람직하다.
화합물 (III) 을 합성할 때에 필요에 따라 사용하는 염기로서는 예를 들어 피리딘 유연체를 들 수 있다. 그 피리딘 유연체로서는 예를 들어 피리딘, 2-피콜린, 3-피콜린, 4-피콜린, 2-에틸피리딘, 3-에틸피리딘, 4-에틸피리딘, 2-프로필피리딘, 3-프로필피리딘, 4-프로필피리딘, 2,6-루티딘, 2,3-루티딘, 2,4-루티딘, 2,5-루티딘, 3, 4-루티딘, 3,5-루티딘, 2,4,6-콜리딘, 2,3,5-콜리딘, 2-디메틸아미노피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 4-피롤리디노피리딘, 4-피페리디노피리딘 등을 들 수 있고, 특히 4-디메틸아미노피리딘, 4-피롤리디노피리딘, 4-피페리디노피리딘이 바람직하다. 피리딘 유연체의 당량으로서는 화합물 (V) 에 대하여 0.01∼2.5당량이 바람직하고, 0.7∼1.2당량이 보다 바람직하다.
화합물 (V) 과 화합물 (VI) 또는 화합물 (VII) 과의 축합 반응의 후처리로서는 예를 들어 물 또는 물과 유기 용매의 혼합 용매를 반응 용액에 첨가하고, 생성된 반응 혼합물로부터 화합물 (III) [화합물 (IIIa) 또는 화합물 (IIIb)] 을 유기 용매로 추출하고, 추출된 용액에 함유되는 물을 건조제로 제거한 후, 그 건조제를 여과하고, 얻어진 여과액 중의 용매를 상압 하 또는 감압 하에서 증류 제거하는 일련의 조작을 들 수 있다. 또한, 화합물 (III) 을 함유하는 추출 용액을 산으로 세정하고, 그 추출 용액 중의 염기성 물질 (축합제, 축합제 유래 물질, 염기) 을 제거해도 된다. 산으로 세정된 추출 용액은 추가로 물 또는 식염수로 세정되는 것이 바람직하다. 반응 용액 중에 첨가되는 유기 용매는 반응에 사용되는 유기 용매와 동일해도 되고 상이해도 되지만, 동일한 것이 바람직하다. 또한, 반응 용액 중에 첨가되는 유기 용매와 추출에 사용되는 유기 용매는 동일해도 되고 상이해도 된다. 반응 용액 중에 첨가되는 유기 용매나 추출에 사용되는 유기 용매로서는 예를 들어 전술한 유기 용매를 들 수 있고, 그 중에서도 디클로로메탄, 아세트산에틸 등이 바람직하다.
화합물 (V) 과 화합물 (VI) 또는 화합물 (VII) 과의 축합 반응의 후처리에 의해 얻어지는 화합물 (III) 을 함유하는 반응 혼합물은 그대로도 HDL 콜레스테롤의 측정에 사용할 수 있지만, 적절히, 분리ㆍ정제 조작에 의해 정제된 것도 사용할 수 있다. 그 분리ㆍ정제 방법으로서는 예를 들어 실리카겔 칼럼 크로마토그래피, HPLC, 증류, 분류, 재결정 등을 들 수 있다.
비이온성 계면 활성을 갖는 담즙산 유도체의 농도로서는 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 반응액 중의 농도가 0.001∼30% 인 것이 바람직하고, 0.01∼3%가 보다 바람직하다.
본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정법에 있어서 사용되는 수성 매체로서는 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있지만, 완충액이 바람직하다. 완충액에 사용하는 완충제로서는 예를 들어 트리스 (히드록시메틸)아미노메탄 완충제, 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿(good) 완충제 등을 들 수 있다. 굿 완충제로서는 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노2아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-〔트리스(히드록시메틸)메틸〕-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-〔4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐〕에탄술폰산 (HEPES), 3-〔N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노〕-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-〔트리스(히드록시메틸)메틸〕-2-히드록시-3-아미노프로판술폰산 (TAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판술폰산) (POPSO), 3-〔4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐〕-2-히드록시프로판술폰산 (HEPPSO), 3-〔4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐〕프로판술폰산〔(H)EPPS〕, N-〔트리스(히드록시메틸)메틸〕글리신 (Tricine), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-히드록시프로판술폰산 (CAPSO), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 등을 들 수 있다. 완충액의 농도는 측정에 알맞은 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 0.001∼2.0㏖/L 가 바람직하고, 0.005∼1.0㏖/L 가 보다 바람직하다.
이하에, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트를 구체적으로 설명한다.
(HDL 콜레스테롤의 측정 방법)
본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법으로서는 예를 들어 이하의 태양의 방법을 들 수 있다.
측정 방법 1
(1) 검체와, 무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 담즙산 유도체를 함유하는 수성 매체 중에서 반응시키고,
(2) 생성된 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정하고,
(3) (2) 에서 측정한 값과, 미리 작성한 검량선으로부터, 검체 중의 HDL 콜레스테롤 농도를 산출함으로써, 검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정할 수 있다.
측정 방법 2
(1) 검체와, 무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 담즙산 유도체 및 알부민을 함유하는 수성 매체 중에서 반응시키고,
(2) 생성된 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정하고,
(3) (2) 에서 측정한 값과, 미리 작성한 검량선으로부터, 검체 중의 HDL 콜레스테롤 농도를 산출함으로써, 검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정할 수 있다.
측정 방법 3
(1) 검체와, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 담즙산 유도체를 함유하는 수성 매체 중에서 반응시키고,
(2) 생성된 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정하고,
(3) (2) 에서 측정한 값과, 미리 작성한 검량선으로부터, 검체 중의 HDL 콜레스테롤 농도를 산출함으로써, 검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정할 수 있다.
측정 방법 4
(1) 검체와, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 담즙산 유도체 및 알부민을 함유하는 수성 매체 중에서 반응시키고,
(2) 생성된 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정하고,
(3) (2) 에서 측정한 값과, 미리 작성한 검량선으로부터, 검체 중의 HDL 콜레스테롤 농도를 산출함으로써, 검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정할 수 있다.
본 측정법에 있어서는 (1) 의 반응은 예를 들어 10∼50℃ 에서, 바람직하게는 20∼40℃ 에서, 1∼60분간, 바람직하게는 2∼30분간 반응시킨다.
생성된 과산화수소의 양은 예를 들어 과산화수소 측정용 시약에 의해 측정할 수 있다. 과산화수소 측정용 시약은 생성된 과산화수소를 검출가능한 물질로 변환시키기 위한 시약이다. 검출가능한 물질로서는 예를 들어 색소, 발광 등을 들 수 있지만, 색소가 바람직하다. 검출가능한 물질이 색소인 경우에는 과산화수소 측정용 시약은 산화 발색형 색원체 및 퍼옥시다제 등의 과산화 활성 물질을 함유한다. 산화 발색형 색원체로서는 예를 들어 후술하는 산화 발색형 색원체를 들 수 있다. 검출가능한 물질이 발광인 경우에는 과산화수소 측정용 시약은 화학 발광 물질을 함유한다. 화학 발광 물질로서는 예를 들어 루미놀, 이소루미놀, 루시게닌, 아크리디늄에스테르 등을 들 수 있다.
과산화수소 측정용 시약으로서, 산화 발색형 색원체 및 퍼옥시다제 등의 과산화 활성 물질을 함유하는 시약을 사용하는 경우에는 과산화수소는 과산화 활성 물질의 존재 하에 산화 발색형 색원체와 반응하여 색소를 생성하고, 생성된 색소를 정량함으로써, 과산화수소를 정량할 수 있다. 또한, 화학 발광 물질을 함유하는 과산화수소 측정용 시약을 사용하는 경우에는 과산화수소는 화학 발광 물질과 반응하여 포톤을 생성하고, 생성된 포톤을 정량함으로써, 과산화수소를 정량할 수 있다.
산화 발색형 색원체로서는 예를 들어 로이코형 색원체, 산화 커플링 발색형 색원체 등을 들 수 있다. 로이코형 색원체는 과산화수소 및 퍼옥시다제 등의 과산화 활성 물질의 존재 하, 단독으로 색소로 변환되는 물질이다. 구체적으로는 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스〔3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐〕아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.
산화 커플링 발색형 색원체는 과산화수소 및 퍼옥시다제 등의 과산화 활성 물질의 존재 하, 2개의 화합물이 산화적 커플링하여 색소를 생성하는 물질이다. 2개의 화합물의 조합으로는 커플러와 아닐린류의 조합, 커플러와 페놀류의 조합 등을 들 수 있다. 커플러로서는 예를 들어 4-아미노안티피린 (4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라진 등을 들 수 있다. 아닐린류로서는 N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-디(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-석시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 등을 들 수 있다. 페놀류로서는 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-히드록시-2,4,6-트리요오드벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.
과산화수소의 측정에 있어서, 과산화 활성 물질의 농도는 측정에 알맞은 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 과산화 활성 물질로서 퍼옥시다제를 사용하는 경우에는 1∼100kU/L 이 바람직하다. 또한, 산화 발색형 색원체의 농도는 측정에 알맞은 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 0.01∼10g/L 이 바람직하다.
환원형 보효소의 측정 방법으로서는 예를 들어 생성된 환원형 보효소의 흡광도를 측정하는 방법, 환원형 보효소 측정용 시약을 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 환원형 보효소의 흡광도를 측정하는 방법에 있어서의 흡광도로서는 300∼500nm 가 바람직하고, 330∼400nm 가 보다 바람직하고, 340nm 부근이 특히 바람직하다. 환원형 보효소 측정용 시약은 생성된 환원형 보효소를 검출가능한 물질로 변환시키기 위한 시약이다. 검출가능한 물질로서는 예를 들어 색소 등을 들 수 있다. 검출가능한 물질이 색소인 경우의 환원형 보효소 측정용 시약으로서는 예를 들어 디아포라제, 전자 캐리어 및 환원 발색형 색원체를 함유하는 시약을 들 수 있다. 전자 캐리어로서는 예를 들어 1-메톡시-5-메틸페나듐메틸설페이트 등을 들 수 있다. 환원형 보효소 측정용 시약으로서, 디아포라제, 전자 캐리어 및 환원 발색형 색원체를 함유하는 시약을 사용하는 경우에는 환원 발색형 색원체가 변환되어 생성된 색소를 정량함으로써, 환원형 보효소를 정량할 수 있다.
환원 발색형 색원체로서는 예를 들어 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로미드 (MTT), 2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포닐)-2H-테트라졸륨모노나트륨염 (WST-1), 2-(4-요오드페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨모노나트륨염 (WST-3) 등을 들 수 있다.
(HDL 콜레스테롤 측정용 시약)
본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약으로서는 예를 들어 이하의 태양의 시약을 들 수 있다.
시약 1
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
시약 2
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체, 알부민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
시약 3
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
시약 4
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체, 알부민 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
시약 5
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
시약 6
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체, 알부민, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
시약 7
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
시약 8
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체, 알부민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
시약 9
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
시약 10
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체, 알부민 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
시약 11
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
시약 12
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체, 알부민, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약에 있어서는 전술한 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법에 있어서 예로 든 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체, 알부민, 과산화수소 측정용 시약, 산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약을 사용할 수 있다.
(HDL 콜레스테롤 측정용 키트)
본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약은 키트의 형태로 보존, 유통 및 사용될 수도 있다. 키트의 형태로서는 특별히 제한되지 않고, 2시약계, 3시약계 등의 어느 것이나 사용할 수 있지만, 2시약계가 바람직하다.
제 1 시약과 제 2 시약으로 이루어지는 2시약계의 HDL 콜레스테롤 측정용 키트에 있어서는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소와, 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소는, 제 1 시약과 제 2 시약에 따로따로 함유되어도 되고, 제 2 시약에 함께 함유되어도 되지만, 제 1 시약과 제 2 시약에 따로따로 함유되는 경우에는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가 제 1 시약에, 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소가 제 2 시약에 함유되는 태양이 바람직하다. 담즙산 유도체는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유되어도 된다. 콜레스테롤 탈수소 효소를 사용한 측정법에 있어서 사용되는 산화형 보효소는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유되어도 된다. 과산화수소 측정용 시약은 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유되어도 되지만, 당해 시약이 산화 커플링형 색원체를 함유하는 경우에는 산화 커플링형 색원체의 각각의 화합물은 각각의 시약에 함유되는 태양이 바람직하다. 환원형 보효소 측정용 시약은 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유되어도 된다. 또한, 알부민은 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양방에 함유되어도 된다.
구체적으로는 예를 들어 이하의 태양의 키트를 들 수 있다.
키트 1
제 1 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 2
제 1 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 담즙산 유도체, 알부민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 3
제 1 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 4
제 1 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 담즙산 유도체, 알부민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 5
제 1 시약
과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 6
제 1 시약
알부민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 7
제 1 시약
과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 8
제 1 시약
알부민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 9
제 1 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 담즙산 유도체를 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
키트 10
제 1 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 담즙산 유도체 및 알부민을 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
키트 11
제 1 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 담즙산 유도체를 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 12
제 1 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 담즙산 유도체 및 알부민을 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 13
제 1 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 담즙산 유도체를 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
키트 14
제 1 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 담즙산 유도체 및 알부민을 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
키트 15
제 1 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 담즙산 유도체를 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 16
제 1 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 담즙산 유도체 및 알부민을 함유하는 시약.
제 2 시약
콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 17
제 1 시약
담즙산 유도체를 함유하는 시약.
제 2 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
키트 18
제 1 시약
담즙산 유도체 및 알부민을 함유하는 시약.
제 2 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
키트 19
제 1 시약
담즙산 유도체를 함유하는 시약.
제 2 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 20
제 1 시약
담즙산 유도체 및 알부민을 함유하는 시약.
제 2 시약
무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 21
제 1 시약
담즙산 유도체를 함유하는 시약.
제 2 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
키트 22
제 1 시약
담즙산 유도체 및 알부민을 함유하는 시약.
제 2 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 보효소를 함유하는 시약.
키트 23
제 1 시약
담즙산 유도체를 함유하는 시약.
제 2 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
키트 24
제 1 시약
담즙산 유도체 및 알부민을 함유하는 시약.
제 2 시약
화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 보효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 키트에 있어서는 전술한 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법에 있어서 예로 든 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체, 알부민, 과산화수소 측정용 시약, 산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약을 사용할 수 있다.
본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트에는 필요에 따라, 수성 매체, 안정화제, 방부제, 영향 물질 소거제, 반응 촉진제 등이 함유되어도 된다. 수성 매체로서는 예를 들어 전술한 수성 매체 등을 들 수 있다. 안정화제로서는 예를 들어 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA), 수크로오스, 염화칼슘 등을 들 수 있다. 방부제로서는 예를 들어 아지화나트륨, 항생 물질 등을 들 수 있다. 영향 물질 소거제로서는 예를 들어 아스코르브산의 영향을 소거하기 위한 아스코르브산옥시다제 등을 들 수 있다. 반응 촉진제로서는 예를 들어 콜리파제, 포스폴리파제 등의 효소, 황산나트륨, 염화나트륨 등의 염류 같은 것을 들 수 있다. 본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트는 동결 건조된 상태이어도 되고, 수성 매체에 용해된 상태이어도 된다. 동결 건조된 상태의 시약을 사용하여 검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하는 경우에는 당해 시약은 수성 매체에 용해하여 사용된다.
본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소의 함량으로서는 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 0.01∼800U/mL 이 되는 함량이 바람직하고, 0.02∼400U/mL 가 되는 함량이 보다 바람직하다. 본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트에 있어서의 담즙산 유도체의 함량으로서는 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 0.001∼30% 가 되는 함량이 바람직하고, 0.01∼10% 가 되는 함량이 보다 바람직하다. 본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트에 있어서의 알부민의 함량으로서는 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 0.001∼10% 가 되는 함량이 바람직하고, 0.01∼5% 가 되는 함량이 보다 바람직하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하겠지만, 이들은 본 발명의 범위를 조금도 한정하는 것이 아니다. 한편, 본 실시예에서는 하기 시약 및 효소를 사용하였다.
HEPES (BDH Laboratory 사 제), EMSE (다이토케믹스사 제), 소 혈청 알부민 (BSA; 오리엔탈사 제), 4-아미노안티피린 (사이쿄카세이사 제), 퍼옥시다제 (토요보세키사 제), LPL 311 (콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소; 토요보세키사 제), LPL6 (콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소; 아마노 엔자임사 제), CHE2 (콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소; 아마노 엔자임사 제), COE 313 (화학 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소; 토요보세키사 제), COO 321 (콜레스테롤옥시다제; 토요보세키사 제), 콜산나트륨 (ACROS 사 제), 타우로콜산나트륨 (토쿄 화성사 제), BIGCHAP (도징 화학사 제), CHAPS (도징 화학사 제), 덱스트란황산나트륨 (분자량 50만; 파르마시아사 제).
또한, 본 실시예에 있어서, 담즙산 유도체의 동정에 있어서, 하기 분석 기기를 사용하여 각종 데이터를 취득하였다.
핵자기 공명 스펙트럼 (1H-NMR, 13C-NMR): JEOL GSX-400 (닛폰덴시사 제)
1H-NMR 스펙트럼 측정에 있어서는 테트라메틸실란을 내부 표준으로서 사용하여, 테트라메틸실란을 기준으로 한 화학 시프트 (δ) 를 나타낸다. 13C-NMR 스펙트럼 측정에 있어서는 CDCl3 유래의 3개의 피크 중심의 피크를 77.0ppm 으로 하였을 때의 각 피크의 화학 시프트 (δ) 를 나타낸다.
적외 흡수 스펙트럼 (IR): Nicolet NEXUS470 (니코레사 제)
겔 투과 크로마토그래피 (GPC):
시스템: TOSOH HLC-8120 GPC (토소사 제)
GPC 칼럼: TSKgel Super H-RC (저분자 분석용) (토소사 제) 2개를 직렬 접속하였다.
칼럼 유지 온도: 40℃
전개 용매: 테트라히드로푸란
유속: 0.5mL/분
검출기: RI (굴절률)
검량선 작성용 표준 물질: 폴리에틸렌글리콜
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
참고예 1 화학 수식 LPL 311 (화학적으로 수식된 LPL 311) 의 조제
HEPES 완충액 (pH 8.5, 0.15 ㏖/L) 에, LPL 311를 33g/L 가 되도록 첨가하여 5℃ 로 냉각한 후, 선브라이트 VFM-4101 또는 선브라이트 AKM-1510 또는 선브라이트 MEAC-50 HS (모두 닛폰 유지사 제) 를 330g/L 가 되도록 첨가하고, 추가로 3시간 반응시켰다. 얻어진 수식 효소 용액을 정제 분리하지 않고 그대로 화학 수식 LPL 311 로서 사용하였다.
참고예 2 화학 수식 CHE2 (화학적으로 수식된 CHE2) 의 조제
HEPES 완충액 (pH 8.5, 0.15㏖/L) 에, CHE2 를 50g/L 가 되도록 첨가하여 5℃ 로 냉각한 후, 선브라이트 VFM-4101 (닛폰 유지사 제) 를 200g/L 가 되도록 첨가하고, 추가로 3시간 반응시켰다. 얻어진 수식 효소 용액을 정제 분리하지 않고 그대로 화학 수식 CHE2 로서 사용하였다.
실시예 1 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식한 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
콜산나트륨 6.0g/L
실시예 2 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식한 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
콜산나트륨 6.0g/L
실시예 3 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식한 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
타우로콜산나트륨 7.0g/L
실시예 4 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식한 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
타우로콜산나트륨 7.0g/L
실시예 5 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식한 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
BIGCHAP 4.5g/L
실시예 6 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식한 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
BIGCHAP 4.5g/L
실시예 7 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식한 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
CHAPS 6.0g/L
실시예 8 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식된 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
CHAPS 6.0g/L
비교예 1 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식한 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
비교예 2 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식한 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
실시예 9 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO 321 3.0kU/L
콜산나트륨 6.0g/L
실시예 10 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO 321 3.0kU/L
콜산나트륨 6.0g/L
실시예 11 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO 321 3.0kU/L
타우로콜산나트륨 7.0g/L
실시예 12 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO 321 3.0kU/L
타우로콜산나트륨 7.0g/L
실시예 13 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO 321 3.0kU/L
BIGCHAP 4.5g/L
실시예 14 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO 321 3.0kU/L
BIGCHAP 4.5g/L
실시예 15 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO 321 3.0kU/L
CHAPS 6.0g/L
실시예 16 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO 321 3.0kU/L
CHAPS 6.0g/L
비교예 3 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO 321 3.0kU/L
비교예 4 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO 321 3.0kU/L
실시예 17 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 CHE2 (VFM-4101 로 수식한 것) 0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
콜산나트륨 6.0g/L
실시예 18 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (MEAC-50 HS 로 수식한 것)
0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
콜산나트륨 6.0g/L
실시예 19 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (AKM-1510 으로 수식한 것)
0.2kU/L
COO 321 3.0kU/L
콜산나트륨 6.0g/L
실시예 20 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
COE 313 1.0kU/L
COO 321 3.0kU/L
콜산나트륨 6.0g/L
실시예 21 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트를 사용하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
(1) 검량선의 작성
표준액으로서, 생리 식염수 (HDL 콜레스테롤 농도: 0.0mg/dL) 및 혈청 (HDL 콜레스테롤 농도: 60.0mg/dL) 를, 키트로서 실시예 1 의 키트를 사용하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해, HDL 콜레스테롤 농도와 「흡광도」 사이의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다.
여기서의 「흡광도」 라는 것은 이하의 반응에 의해 측정된 2개의 흡광도 (E1 및 E 2) 를 기초로, E2 에서 E1 을 뺌으로써 얻어진 값을 나타낸다.
반응 셀에 표준액 (3μL) 과 제 1 시약 (0.24mL) 을 첨가하여 37℃ 에서 5분간 가온하고, 반응액의 흡광도 (E1) 를 주파장 600nm, 부파장 700nm 에서 측정하고, 이어서 이 반응액에 제 2 시약 (0.08mL) 을 첨가하고 추가로 37℃ 에서 5분간 가온하고, 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 600nm, 부파장 700nm 에서 측정하였다.
(2) 인간 혈청 검체와 실시예 1 의 키트와의 반응에 의한 당해 검체에 있어서의 「흡광도」의 산출
(1) 의 검량선의 작성에 있어서 사용한 표준액 대신에 인간 혈청 검체를 사용하는 것 이외에는 (1) 의 「흡광도」 의 산출 방법과 동일한 방법에 의해, 당해 검체에 있어서의 「흡광도」 를 산출하였다.
(3) 인간 혈청 검체 중의 HDL 콜레스테롤 농도의 측정
(2) 에서 산출한 「흡광도」 와, (1) 에서 작성한 검량선으로부터, 각 검체 중의 HDL 콜레스테롤 농도를 측정하였다.
실시예 22 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 2 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 23 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 3 의 키트를 사용하는 것 이외는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 24 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 4 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 25 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 5 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 26 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 6 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 27 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 7 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 28 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 8 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
비교예 5 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 비교예 1 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
비교예 6 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 비교예 2 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 29 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 9 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 30 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 10 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 31 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 11 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 32 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 12 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 33 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 13 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 34 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 14 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 35 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 15 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 36 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 16 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
비교예 7 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 비교예 3 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
비교예 8 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 비교예 4 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 37 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 17 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 38 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 18 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 39 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 19 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 40 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 20 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 30검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
한편, 실시예 21∼40 및 비교예 5∼8 의 측정에 사용한 인간 혈청 30검체를 사용하여, 클리니컬 케미스트리 제45권, 10호 (1999년) 에 기재된 DCM 법 (Designated Comparison Method) 에 의해 당해 검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하여 각 측정법과 비교하였다.
실시예 21∼40 및 비교예 5∼8 각각의 측정법과, DCM 법에 의한 측정법의 상관 계수를 표 1 에 나타낸다.
측정 키트 담즙산 유도체 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 BSA 상관 계수
실시예 21 실시예 1 콜산나트륨 VFM-4101 로 수식한 LPL 311 － 0.934
실시예 22 실시예 2 콜산나트륨 VFM-4101 로 수식한 LPL 311 ＋ 0.928
실시예 23 실시예 3 타우로콜산나트륨 VFM-4101 로 수식한 LPL 311 － 0.889
실시예 24 실시예 4 타우로콜산나트륨 VFM-4101 로 수식한 LPL 311 ＋ 0.869
실시예 25 실시예 5 BIGCHAP VFM-4101 로 수식한 LPL 311 － 0.991
실시예 26 실시예 6 BIGCHAP VFM-4101 로 수식한 LPL 311 ＋ 0.983
실시예 27 실시예 7 CHAPS VFM-4101 로 수식한 LPL 311 － 0.986
실시예 28 실시예 8 CHAPS VFM-4101 로 수식한 LPL 311 ＋ 0.984
비교예 5 비교예 1 - VFM-4101 로 수식한 LPL 311 － 0.013
비교예 6 비교예 2 - VFM-4101 로 수식한 LPL 311 ＋ 0.008
실시예 29 실시예 9 콜산나트륨 LPL6 (무수식) ＋ 0.981
실시예 30 실시예 10 콜산나트륨 LPL6 (무수식) － 0.774
실시예 31 실시예 11 타우로콜산나트륨 LPL6 (무수식) ＋ 0.983
실시예 32 실시예 12 타우로콜산나트륨 LPL6 (무수식) － 0.726
실시예 33 실시예 13 BIGCHAP LPL6 (무수식) － 0.968
실시예 34 실시예 14 BIGCHAP LPL6 (무수식) ＋ 0.991
실시예 35 실시예 15 CHAPS LPL6 (무수식) － 0.977
실시예 36 실시예 16 CHAPS LPL6 (무수식) ＋ 0.994
비교예 7 비교예 3 - LPL6 (무수식) － 0.414
비교예 8 비교예 4 - LPL6 (무수식) ＋ 0.462
실시예 37 실시예 17 콜산나트륨 VFM-4101 로 수식한 CHE2 － 0.948
실시예 38 실시예 18 콜산나트륨 MEAC-50HS 로 수식한 LPL 311 － 0.960
실시예 39 실시예 19 콜산나트륨 AKM-1510 으로 수식한 LPL 311 － 0.935
실시예 40 실시예 20 콜산나트륨 COE 313 － 0.916
실시예 21∼28 의 결과를 통해 알 수 있는 바와 같이, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로서 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 사용한 경우에는 알부민의 유무에 관계 없이, 콜산, 타우로콜산, BIGCHAP, CHAPS 의 어느쪽의 담즙산 유도체의 존재 하에서도, DCM 법에 의한 측정과의 사이에 좋은 상관 관계가 인정되었지만, 비교예 5 및 6 에 나타나 있는 바와 같이, 담즙산 유도체의 비존재 하에서는 알부민의 유무에 관계 없이, DCM 법에 의한 측정과의 사이에 좋은 상관 관계가 인정되지 않았다.
한편, 실시예 29 와 실시예 30, 실시예 31 과 실시예 32, 실시예 33 과 실시예 34, 실시예 35 와 실시예 36 의 비교로부터, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로서 무수식의 효소를 사용한 경우에, 담즙산 유도체로서 콜산 또는 타우로콜산을 존재시킨 조건 하에서는 알부민을 첨가한 쪽이 DCM 법에 의한 측정과의 사이의 상관 관계가 양호하였지만, 담즙산 유도체로서 BIGCHAP 또는 CHAPS 를 존재시킨 조건 하에서는 알부민의 유무에 관계 없이, DCM 법에 의한 측정과의 사이에 좋은 상관 관계가 얻어지는 것이 판명되었다.
또한, 실시예 21 과 실시예 37 의 비교로부터, 화학 수식 LPL 311 이외의 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 사용한 측정에 있어서도, DCM 법에 의한 측정과의 사이에 좋은 상관 관계가 얻어지는 것이 판명되었다. 또한, 실시예 21 과 실시예 38 의 비교, 및 실시예 21 과 실시예 39 의 비교로부터, 화학 수식제로서, VFM-4101 이외의 수식제를 사용하여 조제한 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 사용한 경우에 있어서도, DCM 법에 의한 측정과의 사이에 좋은 상관 관계가 얻어지는 것이 판명되었다. 또한, 실시예 21 과 실시예 40 의 비교로부터, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로서 시판품을 사용한 경우에 있어서도, DCM 법에 의한 측정과의 사이에 좋은 상관 관계가 얻어지는 것이 판명되었다.
실시예 41 콜산에스테르 [화합물 (IIIa-1)] 의 합성
적하 장치, 교반 장치, 온도계, 냉각관 및 질소 가스 도입관을 구비한 플라스크 내에, 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르 (평균 분자량 2000, 알드리치사 제) 110g (55m㏖), 디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 6.7g (55m㏖) 및 디클로로메탄 100mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 콜산 (미쿠니 화학 산업사 제) 20.4g (50m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 10.5g (55m㏖) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 200mL, 물 300mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 200mL 로 세정하고, 10% 식염수 300mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 500mL 를 첨가하고, 10% 식염수 300mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 로터리 증발기를 사용하여 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIa-1) 115g (수율 96%) 을 백색의 왁스 형상 고체로서 얻었다.
실시예 42 콜산에스테르 [화합물 (IIIa-2)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르 (평균 분자량 400, 닛폰 유지사 제 유니옥스 M-400) 4.8g (12m㏖), 디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 1.46g (12m㏖) 및 디클로로메탄 30mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 콜산 (미쿠니 화학 산업사 제) 4.08g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 2.3g (12m㏖) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 20mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 50mL 로 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 100mL 를 첨가하고, 10% 식염수 100mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 로터리 증발기를 사용하여 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIa-2) 7.8g (수율 95%) 을 무색 유상 물질로서 얻었다.
실시예 43 콜산에스테르 [화합물 (IIIa-3)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르 (평균 분자량 1000, 닛폰 유지사 제 유니옥스 M-1000) 12g (12m㏖), 디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 1.46g (12m㏖) 및 디클로로메탄 50mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 콜산 (미쿠니 화학 산업사 제) 4.08g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 2.3g (12m㏖) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 30mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 50mL 로 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 200mL 를 첨가하고, 10% 식염수 200mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 로터리 증발기를 사용하여 여과액을 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIa-3) 13.2g (수율 95%) 을 백색의 왁스 형상 고체로서 얻었다.
실시예 44 콜산에스테르 [화합물(IIIa-4)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르 (평균 분자량 5000, 알드리치사 제) 55g (약 11m㏖), 디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 1.46g (12m㏖) 및 디클로로메탄 100mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 콜산 (미쿠니 화학 산업사 제) 4.08g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 2.3g (12mmol) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 50mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 50mL 로 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 300mL 를 첨가하고, 10% 식염수 300mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 로터리 증발기를 사용하여 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIa-4) 48.5g (수율 90%) 을 백색의 왁스 형상 고체로서 얻었다.
실시예 45 데옥시콜산에스테르 [화합물 (IIIa-5)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르 (평균 분자량 2000, 알드리치사 제) 22g (11m㏖), 디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 1.34g (11m㏖) 및 디클로로메탄 50mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 데옥시콜산 3.93g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 2.3g (12m㏖) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 50mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 50mL 로 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 200mL 를 첨가하고, 10% 식염수 300mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 로터리 증발기를 사용하여 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIa-5) 24.2g (수율 99%) 을 백색의 왁스 형상 고체로서 얻었다.
실시예 46 우르소데옥시콜산에스테르 [화합물 (IIIa-6)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리에틸렌글리콜메틸 에테르 (평균 분자량 2000, 알드리치사 제) 22g (11m㏖), 디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 1.34g (11m㏖) 및 디클로로메탄 50mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 우르소데옥시콜산 3.93g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 2.3g (12mmol) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 50mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 50mL 로 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 200mL 를 첨가하고, 10% 식염수 300mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIa-6) 23.7g (수율 99%) 을 백색의 왁스 형상 고체로서 얻었다.
실시예 47 케노데옥시콜산에스테르 [화합물 (IIIa-7)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르 (평균 분자량 2000, 알드리치사 제) 22g (11m㏖), 디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 1.34g (11m㏖) 및 디클로로메탄 50mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 케노데옥시콜산 3.93g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 2.3g (12m㏖) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 50mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 50mL 로 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 200mL 를 첨가하고, 10% 식염수 300mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIa-7) 23.2g (수율97%) 을 백색의 왁스 형상 고체로서 얻었다.
실시예 48 리토콜산에스테르 [화합물 (IIIa-8)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리에틸렌글리콜메틸 에테르 (평균 분자량 2000, 알드리치사 제) 22g (11m㏖), 디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 1.34g (11mmol) 및 디클로로메탄 50mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 리토콜산 3.77g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 2.3g (12m㏖) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 50mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 50mL 로 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 200mL 를 첨가하고, 10% 식염수 300mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIa-8) 23.3g (수율 98%) 을 백색의 왁스 형상 고체로서 얻었다.
실시예 49 양 말단 콜산에스테르 [화합물 (IIIb-1)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리에틸렌글리콜 (다이이치 공업 제약사 제, PEG 2000) 10g (5m㏖), 디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 2.68g (22m㏖) 및 디클로로메탄 50mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 콜산 4.08g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 4.6g (24m㏖) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 50mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 50mL 로 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 200mL 를 첨가하고, 10% 식염수 300mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIb-1) 13.2g (수율 94%) 을 백색의 왁스 형상 고체로서 얻었다.
실시예 50 콜산에스테르 [화합물 (IIIa-9)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리에틸렌글리콜 (다이이치 공업 제약사 제, PEG 600) 12g (20m㏖), 디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 1.5g (12mmol) 및 디클로로메탄 50mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 콜산 4.08g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 2.3g (12m㏖) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 50mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 50mL 로 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 200mL 를 첨가하고, 10% 식염수 300mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIa-9) 7.7g (수율 90%) 을 백색의 왁스 형상 고체로서 얻었다.
실시예 51 콜산아미드 [화합물 (IIIb-2)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리옥시에틸렌디아민 (평균 분자량 2000, 카와켄 파인케미컬사 제 PEO 아민 #2000) 10g (5m㏖), 4-디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 2.56g (21m㏖) 및 디클로로메탄 50mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 콜산 (미쿠니 화학 산업사 제) 4.08g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 4.6g (24mmol) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 50mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 유기층을 0.2㏖/L 의 염산 50mL 로 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 세정하였다. 그 후, 분리된 유기층에 아세트산에틸 200mL 를 첨가하고, 10% 식염수 300mL 로 3회 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIb-2) 12.4g (수율88%) 을 백색의 왁스 형상 고체로서 얻었다.
실시예 52 콜산아미드 [화합물 (IIIa-10)] 의 합성
플라스크 내에, 폴리옥시에틸렌디아민 (평균 분자량 1000, 카와켄 파인케미컬사 제 PEO 아민 #1000) 15g (15m㏖), 4-디메틸아미노피리딘 (코에이 화학 공업사 제) 1.46g (12m㏖) 및 디클로로메탄 50mL 를 첨가하여 용해하였다. 그 용해액에 콜산 (미쿠니 화학 산업사 제) 4.08g (10m㏖), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 염산염 (아이바이츠사 제) 2.3g (12m㏖) 을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 12시간 실온 교반하고, 디클로로메탄 50mL, 물 50mL 를 첨가하여 추출하였다. 분리된 유기층에 1㏖/L 염산 22mL 및 물 50mL 를 첨가하여 세정하고, 10% 식염수 50mL 로 2회 더 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 로터리 증발기를 사용하여 농축시켰다. 또한, 진공 펌프를 사용하여 80℃ 에서 2시간 감압 건조시켜, 화합물 (IIIa-10) 11.9g (수율 86%) 을 엷은 황색의 점조한 액체로서 얻었다.
실시예 53 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
화합물 (IIIa-1) 6.0g/L
실시예 54 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
화합물 (IIIa-2) 0.15g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
실시예 55 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
화합물 (IIIa-3) 1.5g/L
실시예 56 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
화합물 (IIIb-2) 1.0g/L
실시예 57 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
화합물 (IIIa-5) 0.5g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
실시예58 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
화합물 (IIIa-1) 6.0g/L
실시예 59 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
화합물 (IIIa-1) 6.0g/L
실시예 60 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
화합물 (IIIb-2) 1.0g/L
실시예 61 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/L
화합물 (IIIa-2) 0.15g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
실시예 62 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
화합물 (IIIa-3) 1.5g/L
실시예 63 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
화합물 (IIIa-1) 6.0g/L
실시예 64 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
화합물 (IIIb-2) 1.0g/L
실시예 65 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
화합물 (IIIa-3) 1.5g/L
비교예 9 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
비교예 10 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
비교예 11 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
비교예 12 HDL 콜레스테롤 측정용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.
ㆍ제 1 시약
HEPES (pH 7.5) 10m㏖/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/L
ㆍ제 2 시약
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
화학 수식 LPL 311 (VFM-4101 로 수식) 0.2kU/L
COO 321 5.0kU/L
실시예 66 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 53 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 67 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 54 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 68 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 55 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 69 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 56 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 70 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 57 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 71 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 58 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 72 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 59 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 73 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 60 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 74 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 61 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 75 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 62 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 76 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 63 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 77 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 64 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
실시예 78 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 65 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
비교예 13 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 비교예 9 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
비교예 14 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 비교예 10 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
비교예 15 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 비교예 11 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.
비교예 16 HDL 콜레스테롤의 측정
실시예 1 의 키트 대신에 비교예 12 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 21 의 측정법과 동일하게 하여, 히타치 7170형 자동 분석 장치에 의해 인간 혈청 35검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다. 한편, 실시예 66∼78 및 비교예 13∼16 의 측정에 있어서 사용한 인간 혈청 35검체를 사용하여, DCM 법에 의해 당해 검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하여, 각 측정법과 비교하였다. 실시예 66∼78 및 비교예 13∼16 각각의 측정법과, DCM 법에 의한 측정법의 상관 계수를 표 2 에 나타낸다.
측정 키트 담즙산 유도체 BSA 덱스트란 황산 상관 계수
실시예 66 실시예 53 화합물 (IIIa-1) － － 0.983
실시예 67 실시예 54 화합물 (IIIa-2) － － 0.882
실시예 68 실시예 55 화합물 (IIIa-3) － － 0.967
실시예 69 실시예 56 화합물 (IIIb-2) － － 0.984
실시예 70 실시예 57 화합물 (IIIa-5) － － 0.985
실시예 71 실시예 58 화합물 (IIIa-1) ＋ － 0.989
실시예 72 실시예 59 화합물 (IIIa-1) － ＋ 0.987
실시예 73 실시예 60 화합물 (IIIb-2) － ＋ 0.996
실시예 74 실시예 61 화합물 (IIIa-2) － ＋ 0.962
실시예 75 실시예 62 화합물 (IIIa-3) － ＋ 0.977
실시예 76 실시예 63 화합물 (IIIa-1) ＋ ＋ 0.990
실시예 77 실시예 64 화합물 (IIIb-2) ＋ ＋ 0.991
실시예 78 실시예 65 화합물 (IIIa-3) ＋ ＋ 0.990
비교예 13 비교예 9 － － 0.020
비교예 14 비교예 10 ＋ － 0.429
비교예 15 비교예 11 － ＋ 0.006
비교예 16 비교예 12 ＋ ＋ 0.451
실시예 66∼70 과 비교예 13 으로부터, 담즙산 유도체로서 담즙산에스테르류 또는 담즙산아미드류를 사용한 경우에 있어서, DCM 법에 의한 측정과의 사이에 양호한 상관 관계가 얻어졌다. 또한, 실시예 71 과 비교예 14, 실시예 72∼75 와 비교예 15, 실시예 76∼78 과 비교예 16 의 대비로부터, BSA 또는 덱스트란황산을 첨가한 조건 하, 또는 양 화합물을 첨가한 조건 하에서도, 담즙산 유도체로서 담즙산에스테르류 또는 담즙산아미드류를 사용한 경우에 있어서 DCM 법에 의한 측정과의 사이에 양호한 상관 계수가 얻어지는 것이 판명되었다.
시험예 1 각종 담즙산 유도체 (음이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제, 비이온성 계면 활성제) 가 콜레스테롤 측정 효소의 안정성에 미치는 영향
HDL 콜레스테롤 측정용 키트의 제 2 시약으로서 사용되는 하기 조성 1∼8 로 이루어지는 시약을 조제하여, 각각 40℃ 에서 48시간 (2일), 120시간 (5일) 보존하였다. 조제 직후의 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약, 40℃ 에서 2일간 저장한 각 시약 및 40℃ 에서 5일간 저장한 각 시약에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 (LPL 311) 및 콜레스테롤 산화 효소 (COO 321) 각각의 효소 활성을 측정하여, 조제 직후의 각 시약에 있어서의 효소 활성에 대한 보존 후의 각 시약에 있어서의 효소 활성의 비율 (효소 활성 잔존율) (%) 을 구하였다.
효소 활성은 이하의 방법에 의해 구하였다.
(1) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 활성 측정법
측정 시약
0.15 ㏖/L 인산칼륨 버퍼 (pH 7.2)
트리톤 X-100 2g/L
페놀 0.15g/L
퍼옥시다제 20kU/L
콜레스테롤 산화 효소 5kU/L
4-아미노안티피린 0.2g/L
측정 기질 용액
콜레스테롤리놀레이트 이소프로판올 용액 (6g/L)
조작법
측정 시약 3mL 를 석영 셀에 첨가하고, 조제 직후의 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약을 각각 0.05mL 첨가한다. 37℃ 에서 5 분 가온 후, 반응액에 측정 기질 용액을 0.1mL 첨가하여 37℃ 에서 더 가온한다. 측정 기질 용액을 첨가하여 5분 후 및 6분 후의 각각의 반응액의 500nm 에서의 흡광도를 측정하고, 당해 양 흡광도로부터, 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약에 있어서의 500nm 에서의 1분당 흡광도 변화량 (ΔAbs/min) 을 산출한다. 한편, 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약 대신에 정제수를 사용하여 동일한 측정을 하여, 정제수에 있어서의 500nm 에서의 1분당 흡광도 변화량 (ΔAbs/min) 을 산출한다. 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약에 있어서의 500nm 에서의 1분당 흡광도 변화량 (ΔAbs/min) 으로부터 정제수에 있어서의 500nm 에서의 1분당 흡광도 변화량 (ΔAbs/min) 을 빼어 산출된 값 (ΔΔAbs/min) 을, 콜레스테롤 가수 분해 효소의 안정화의 지표로 한다.
동일한 일련의 조작을, 조제 직후의 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약 대신에, 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약을 40℃ 에서 2일간 보존한 각 시약, 및 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약을 40℃ 에서 5일간 보존한 각 시약을 사용하여 측정하여, 각 시약에 있어서의 흡광도 변화량 (ΔΔAbs/min) 을 산출한다.
(2) 콜레스테롤 산화 효소 활성 측정법
측정 시약
0.15 ㏖/L 인산칼륨 버퍼 (pH 7.2)
트리톤 X-100 2g/L
페놀 0.15g/L
퍼옥시다제 20kU/L
4-아미노안티피린 0.2g/L
측정 기질 용액
콜레스테롤 이소프로판올 용액 (5g/L)
조작법
측정 시약 3mL 를 석영 셀에 첨가하고, 조제 직후의 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약을 정제수로 6배 희석한 용액을 각각 0.05mL 첨가한다. 37℃ 에서 5분 가온 후, 반응액에 측정 기질 용액을 0.1mL 첨가하고, 추가로 37℃ 에서 가온한다. 측정 기질 용액을 첨가하여 5분 후 및 6분 후의 각각의 반응액의 500nm 에서의 흡광도를 측정하고, 당해 양 흡광도로부터, 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약에 있어서의 500nm 에서의 1분당 흡광도 변화량 (ΔAbs/min) 를 산출한다. 한편, 조성 1∼8 로 이루어지는 시약 대신에 정제수를 사용하여 동일한 측정을 하여, 정제수에 있어서의 500nm 에서의 1분당 흡광도 변화량 (ΔAbs/min) 을 산출한다. 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약에 있어서의 500nm 에서의 1분당 흡광도 변화량 (ΔAbs/min) 으로부터 정제수에 있어서의 500nm 에서의 1분당 흡광도 변화량 (ΔAbs/min) 을 빼어 산출된 값 (ΔΔAbs/min) 을, 콜레스테롤 산화 효소의 안정화의 지표로 한다.
동일한 일련의 조작을, 조제 직후의 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약 대신에, 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약을 40℃ 에서 2일간 저장한 각 시약, 및 조성 1∼8 로 이루어지는 각 시약을 40℃ 에서 5일간 보존한 각 시약을 사용하여 측정하여, 각 시약에 있어서의 흡광도 변화량 (ΔΔAbs/min) 을 산출한다.
조성 1
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
염화칼슘2수화물 0.1g/L
화학 수식 LPL 311 (VFM4101 로 수식) 0.2kU/L
조성 2
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
염화칼슘2수화물 0.1g/L
화학 수식 LPL 311 (VFM4101 로 수식) 0.2kU/L
콜산나트륨 6.0g/L
조성 3
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
염화칼슘2수화물 0.1g/L
화학 수식 LPL 311 (VFM4101 로 수식) 0.2kU/L
CHAPS 6.0g/L
조성 4
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
염화칼슘2수화물 0.1g/L
화학 수식 LPL 311 (VFM4101 로 수식) 0.2kU/L
BIGCHAP 4.5g/L
조성 5
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
염화칼슘2수화물 0.1g/L
화학 수식 LPL 311 (VFM4101 로 수식) 0.2kU/L
화합물 (IIIa-1) 6.0g/L
조성 6
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
염화칼슘2수화물 0.1g/L
화학 수식 LPL 311 (VFM4101 로 수식) 0.2kU/L
화합물 (IIIa-2) 0.45g/L
조성 7
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
염화칼슘2수화물 0.1g/L
화학 수식 LPL 311 (VFM4101 로 수식) 0.2kU/L
화합물 (IIIa-3) 4.5g/L
조성 8
HEPES (pH 7.0) 10m㏖/L
4-아미노안티피린 0.3g/L
퍼옥시다제 20kU/L
염화칼슘2수화물 0.1g/L
화학 수식 LPL 311 (VFM4 4101 로 측정) 0.2kU/L
화합물 (IIIb-2) 1.0g/L
측정 결과를 표 3 에 나타낸다.
조성 담즙산 유도체 효소 효소 활성 잔존율 (%)
40℃ 2일 40℃ 5일
1 무첨가 LPL 311 95.1 92.3
2 콜산 LPL 311 81.6 73.9
3 CHAPS LPL 311 72.3 59.6
4 BIGCHAP LPL 311 90.1 82.4
5 화합물 (IIIa-1) LPL 311 91.4 82.3
6 화합물 (IIIa-2) LPL 311 94.4 89.1
7 화합물 (IIIa-3) LPL 311 93.6 85.3
8 화합물 (IIIa-2) LPL 311 93.2 86.7
1 무첨가 COO 321 100.3 100.0
2 콜산 COO 321 0 0
3 CHAPS COO 321 79.8 62.0
4 BIGCHAP COO 321 100.0 92.3
5 화합물 (IIIa-1) COO 321 94.9 81.5
6 화합물 (IIIa-2) COO 321 100.7 96.3
7 화합물 (IIIa-3) COO 321 100.6 96.4
8 화합물 (IIIb-2) COO 321 100.4 94.0
표 3 을 통해 알 수 있는 바와 같이, 담즙산 유도체로서, 음이온성형 담즙산 유도체 (구체적으로는 콜산) 및 양성형 담즙산 유도체 (구체적으로는 CHAPS) 를 함유하는 시약에 비하여, 비이온성형 담즙산 유도체 [구체적으로는 BIGCHAP, 화합물 (IIIa-1), 화합물 (IIIa-2), 화합물 (IIIa-3) 및 화합물 (IIIb-2)] 를 함유하는 시약이, 콜레스테롤 측정용 효소 (구체적으로는 LPL 311 및 COO 321) 의 안정성이 양호하였다. 일반적으로, 효소 등의 40℃ 등의 고온에서의 보존 안정성은 4℃ 또는 실온 등의 보존 안정성을 반영하는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법 및 측정 시약 또는 키트에 있어서, 담즙산 유도체로서, 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체를 사용함으로써, 장기간 보존된 시약을 사용한 경우이더라도, 또한 보존 온도가 40℃ 에 노출되었을 우려가 있는 시약을 사용한 경우이더라도, 보다 정확히 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 측정할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 의해, 검체 중의 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 간편하고 또한 정확히 측정하는 방법 및 그 방법에 사용하는 시약, 그리고 장기간의 보존에 있어서도 효소 활성이 안정적으로 유지되는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 측정하기 위한 시약 및 키트가 제공된다.

Claims (42)

  1. 검체와, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 담즙산 유도체를 함유하는 수성 매체 중에서 반응시켜 생성된 과산화수소 또는 환원형 보효소를 측정하는 것을 특징으로 하는, 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 측정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 수성 매체가 추가로 알부민을 함유하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가 화학적으로 수식(修飾)된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 및 킬레이트 기능을 갖는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 담즙산 유도체가 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 콜산 또는 그 염, 타우로콜산 또는 그 염, 글리코콜산 또는 그 염, 리토콜산 또는 그 염, 데옥시콜산 또는 그 염, 케노데옥시콜산 또는 그 염, 우르소데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소케노데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소데옥시콜산 또는 그 염, 히오콜산 또는 그 염, 히오데옥시콜산 또는 그 염, 및 데히드로콜산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 담즙산 유도체인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 담즙산 유도체가 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (I)
    R 1 -CH 2 -CH(R 2 )-CH 2 -SO 3 - (I)
    [식 중, R1 은 3-(3-코라미드프로필)디메틸암모니아기이고, R2 는 수소 원자 또는 수산기이다] 로 표현되는 화합물인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 담즙산 유도체가 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (II)
    [X 는 수소 원자 또는 수산기를 나타내고, R3 및 R4 는 동일하거나 상이하고, 치환 또는 비치환의 알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 알카노일기를 나타낸다] 로 표현되는 화합물, 또는 일반식 (III)
    [식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
    {식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다} 로 표현되는 기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다] 으로 표현되는 화합물인 방법.
  12. 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  13. 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체 및 산화형 보효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  14. 제 13 항에 있어서, 추가로 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 알부민을 함유하는 시약.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 시약.
  17. 제 16 항에 있어서, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 및 킬레이트 기능을 갖는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 시약.
  18. 제 16 항에 있어서, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 시약.
  19. 제 12 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 담즙산 유도체가 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 시약.
  20. 제 19 항에 있어서, 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 콜산 또는 그 염, 타우로콜산 또는 그 염, 글리코콜산 또는 그 염, 리토콜산 또는 그 염, 데옥시콜산 또는 그 염, 케노데옥시콜산 또는 그 염, 우르소데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소케노데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소데옥시콜산 또는 그 염, 히오콜산 또는 그 염, 히오데옥시콜산 또는 그 염, 및 데히드로콜산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 담즙산 유도체인 시약.
  21. 제 12 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 담즙산 유도체가 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 시약.
  22. 제 21 항에 있어서, 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (I)
    R 1 -CH 2 -CH(R 2 )-CH 2 -SO 3 - (I)
    [식 중, R1 은 3-(3-코라미드프로필)디메틸암모니아기이고, R2 는 수소 원자 또는 수산기이다] 로 표현되는 화합물인 시약.
  23. 제 12 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 담즙산 유도체가 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 시약.
  24. 제 23 항에 있어서, 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (II)
    [X 는 수소 원자 또는 수산기를 나타내고, R3 및 R4 는 동일하거나 상이하고, 치환 또는 비치환의 알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 알카노일기를 나타낸다] 로 표현되는 화합물, 또는 일반식 (III)
    [식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
    {식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다} 로 표현되는 기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다] 로 표현되는 화합물인 시약.
  25. 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  26. 담즙산 유도체를 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 과산화수소 측정용 시약을 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  27. 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 담즙산 유도체를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  28. 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 담즙산 유도체 및 산화형 보효소를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  29. 담즙산 유도체를 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 산화형 보효소를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 추가로 환원형 보효소 측정용 시약을, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 키트.
  31. 제 25 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 알부민을, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 키트.
  32. 제 25 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 키트.
  33. 제 32 항에 있어서, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 및 킬레이트 기능을 갖는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 키트.
  34. 제 32 항에 있어서, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소가, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기에 의해 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소인 키트.
  35. 제 25 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 담즙산 유도체가 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 키트.
  36. 제 35 항에 있어서, 음이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 콜산 또는 그 염, 타우로콜산 또는 그 염, 글리코콜산 또는 그 염, 리토콜산 또는 그 염, 데옥시콜산 또는 그 염, 케노데옥시콜산 또는 그 염, 우르소데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소리토콜산 또는 그 염, 12-옥소케노데옥시콜산 또는 그 염, 7-옥소데옥시콜산 또는 그 염, 히오콜산 또는 그 염, 히오데옥시콜산 또는 그 염, 및 데히드로콜산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 담즙산 유도체인 키트.
  37. 제 25 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 담즙산 유도체가 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 키트.
  38. 제 37 항에 있어서, 양성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (I)
    R 1 -CH 2 -CH(R 2 )-CH 2 -SO 3 - (I)
    [식 중, R1 은 3-(3-코라미드프로필)디메틸암모니아기이고, R2 는 수소 원자 또는 수산기이다] 로 표현되는 화합물인 키트.
  39. 제 25 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 담즙산 유도체가 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체인 키트.
  40. 제 39 항에 있어서, 비이온성 계면 활성 작용을 갖는 담즙산 유도체가, 일반식 (II)
    [X 는 수소 원자 또는 수산기를 나타내고, R3 및 R4 는 동일하거나 상이하고, 치환 또는 비치환의 알킬기, 또는 치환 또는 비치환의 알카노일기를 나타낸다] 로 표현되는 화합물, 또는 일반식 (III)
    [식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
    {식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다} 로 표현되는 기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다] 으로 표현되는 화합물인 키트.
  41. 일반식 (III)
    [식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
    {식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다} 로 표현되는 기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다] 로 표현되는 화합물.
  42. 일반식 (V)
    [식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타낸다] 로 표현되는 화합물과, 일반식 (VI)
    [식 중, W' 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 또는 치환 또는 비치환의 아릴기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다] 로 표현되는 화합물, 또는 일반식 (VII)
    [식 중, T 는 치환 또는 비치환의 아미노알킬기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다] 로 표현되는 화합물을, 축합제의 존재 하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 일반식 (III)
    [식 중, X, Y 및 Z 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, Q 는 산소 원자 또는 NH 를 나타내고, W 는 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 알카노일기, 알케노일기, 알키노일기, 치환 또는 비치환의 아릴기, 치환 또는 비치환의 아미노알킬기, 또는 일반식 (IV)
    {식 중, X', Y' 및 Z' 는 동일하거나 상이하고, 수소 원자, 수산기 또는 옥소 (=O) 기를 나타내고, m 은 0 또는 1 을 나타낸다} 로 표현되는 기를 나타내고, n 은 3∼400 의 정수를 나타낸다] 으로 표현되는 화합물의 제조 방법.
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