CN1694964A - 高密度脂蛋白中的胆固醇的检测方法及试剂 - Google Patents

高密度脂蛋白中的胆固醇的检测方法及试剂 Download PDF

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Abstract

高密度脂蛋白中胆固醇的检测方法以及此方法所用的试剂，其特征在于检测样本与胆固醇酯水解酶以及胆固醇氧化酶，或与胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶以及胆固醇脱氢酶，在含有胆汁酸衍生物的水性介质中反应，然后测定生成的过氧化氢或还原型辅酶。

Description

高密度脂蛋白中的胆固醇的检测方法及试剂
技术领域
本发明涉及检测样本中高密度脂蛋白(以下简称为HDL)中胆固醇的检测方法、检测试剂、检测试剂盒、新的胆汁酸衍生物以及新的胆汁酸衍生物的制备方法。
背景技术
机体中的脂蛋白根据其比重的不同，可分为高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(以下简称为LDL)、极低密度脂蛋白(以下简称为VLDL)、乳糜微粒(以下简称为CM)，他们主要由于脱辅基蛋白种类的不同而在机体中的作用大不一样，脂质组成也各不相同。其中，HDL与消除为了从包括动脉壁的各组织获取胆固醇而在细胞内积聚的胆固醇的作用有关，是冠状动脉硬化症以及其他各种动脉硬化症的危险预防因子，它在血中的含量水平被认为是判断动脉硬化疾病发病先兆的有效指标。
以往HDL中胆固醇(以下简称为HDL胆固醇)的检测方法是由超离心法、免疫化学方法、电泳法、沉淀法等进行和级分和胆固醇定量这两个步骤组成。但是，级分这一步骤，操作繁琐费时，安全性也无法保证。因此，与这些分离一起进行的检测方法效率极低，不够实用。
近年来，人们开发了各种检测方法以求解决上述问题。比如使HDL以外的脂蛋白凝聚的检测方法，其中包括用使硫酸葡聚糖等使HDL以外的脂蛋白凝聚的试剂、2价金属盐以及经过化学修饰的酶的检测方法(特开平8-131197公报)，还有使用聚阴离子等与HDL以外的脂蛋白形成络合物的试剂、不能溶解聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物等脂蛋白的表面活性剂的检测方法(特开平8-201393号公报)，以及使用硫酸葡聚糖等聚阴离子、2价金属盐、特殊的非离子性表面活性剂以及不同于样品中白蛋白的其他白蛋白的检测方法(特开平9-285298号公报)等。另外还有，将血清或血浆用含有脂蛋白分离剂(硫酸葡聚糖等聚阴离子和镁离子的组合物)的溶液进行处理，得到的混合液不经固体和液体分离处理，在有阴离子性表面活性剂(烷基磺酸或胆汁酸或其衍生物)存在的条件下，与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应，测定生成的过氧化氢，以此过程为特征的血清或血浆中HDL胆固醇的检测方法(特开平8-116996号公报)。
但是，这些使HDL以外的脂蛋白凝聚的HDL胆固醇测定法尽管与以往的标准法有良好的相关性，但会产生一些问题，如反应生成的凝聚物形成的混浊会导致无法准确测定，反应池进行碱清洗时和反应液中的金属盐反应生成金属氢氧化物，它的析出使自动分析装置超负荷。
另外也有不使HDL以外的脂蛋白凝聚的测定法，如用酰基聚氧乙烯山梨糖醇酐酯将HDL以外的脂蛋白优先转换成过氧化氢、除去生成的过氧化氢后加入聚氧乙烯烷基醚、然后对HDL胆固醇进行酶测定的方法(特开平9-299号公报)，还有将机体样本、来源于胰脏的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆酸等胆汁酸在有白蛋白存在的条件下进行接触、然后测定HDL胆固醇和该酶反应所消耗或生成的化合物，以此过程为特征的HDL胆固醇测定方法(国际公开第97/40376号文件)等。
但是，采用这些不使HDL以外的脂蛋白凝聚的HDL胆固醇测定法，会由于HDL以外脂蛋白中的胆固醇未完全除去、或是发生对HDL以外的脂蛋白中胆固醇的非特异反应而导致测定值不准确的问题。
采用胆汁酸类的HDL胆固醇测定法除了如上述特开平8-116996号公报和国际公开97/40376号文件中记载的方法外，另外还有的方法是将血清或血浆置于含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆汁酸或胆汁酸衍生物或磺基琥珀酸二辛酯的缓冲液中与该酶反应，将VLDL和LDL中的胆固醇先行反应成为HDL胆固醇，测定生成的过氧化氢，然后在反应液中添加含非离子性聚氧乙烯氧化物基团的表面活性剂，使HDL胆固醇与该酶反应，特异性地单独定量HDL胆固醇(特开昭62-69999号公报)，有的方法是将血清在特定的pH值和特定的温度下、在含有来源于胰脏的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸类表面活性剂和非离子性表面活性剂的缓冲液中与该酶反应，从而来测定HDL胆固醇(特开昭63-126498号公报)；有的方法是将机体样本在白蛋白和胆汁酸或其盐存在的条件下与来源于胰脏的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶接触，使HDL胆固醇与该酶反应，处理后的机体样本再与微生物来源的胆固醇酯酶接触，使LDL胆固醇与该酶(微生物来源的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶)反应，从而来测定HDL胆固醇和LDL胆固醇(特开平11-9300号公报)；还有的方法是将含有脂蛋白的样本在胆汁酸衍生物和/或两性表面活性剂存在的条件下与酶(胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶)反应，使其选择性地与HDL胆固醇反应，再在反应液中加入含有聚氧乙烯链的非离子型表面活性剂，使其选择性地与LDL胆固醇反应，从而来测定HDL胆固醇和/或LDL胆固醇(特开2000-325097号公报)，等等。但是，这些测定法有时测定时间很长，而且也并不一定能特异性地检测HDL胆固醇。
在酯的部位具有氧化乙烯基的酯以前已有发表(特开平5-221941号公报)，但还没有人发现用该酯进行HDL胆固醇测定的方法。
酯化合物的合成方法，一般比较简便的方法是通过羧酸和醇的缩合反应进行合成，尤其常用的是利用酸催化剂的共沸酯化法。但是，由于化合物具有体积大的取代基或水溶性基团，从而造成收率低的结果(C.K.Ingold著，《有机化学的结构和机理(Structure andMechanism in Organic Chemistry)》(英国)，第2版，Bell 1969年，15章，1128-1178页)。比如在上述的特开平5-221941号公报中记载的合成方法是用对甲苯磺酸作为酸催化剂、使胆酸和二甘醇一甲醚发生反应得到胆酸酯，但是即使经过72小时的长时间加热回流，胆汁酸酯的收率还是非常低，只有23％，而且后处理操作还非常繁琐复杂。
另外，如果用分子内带有羟基的羧酸则也会不断进行自我酯化，因此也有的方法是将分子内的羟基保护起来，与醇进行酯化反应。比如，有的方法用熊脱氧胆酸和2-羟基乙氧基葡萄糖苷进行熊脱氧胆酸酯的合成(特开平11-199598号公报)，但此方法因为包含1)熊脱氧胆酸的羟基用TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷)保护的步骤、2)酯化步骤以及3)脱保护基(脱TBDMS基)步骤，所以不能说是一种简便的合成方法。
发明的公开
本发明的目的在于提供简便准确地检测样本中高密度脂蛋白中的胆固醇的方法以及此检测方法所用的检测试剂和试剂盒。
本发明涉及以下[1]～[42]。
[1]高密度脂蛋白中胆固醇的检测方法，其特征在于检测样本与胆固醇酯水解酶及胆固醇氧化酶，或是与胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶，在含有胆汁酸衍生物的水性介质中反应，测定生成的过氧化氢或还原性辅酶。
[2]如[1]记载的方法，其中水性介质还含有白蛋白。
[3]如[1]或[2]记载的方法，其中胆固醇酯水解酶表示经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。
[4]如[3]记载的方法，其中化学修饰过的胆固醇酯水解酶表示胆固醇酯水解酶经过选自主要成分为聚乙二醇的基团、主要成分为聚丙二醇的基团、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基团中的基团的修饰。
[5]如[3]记载的方法，其中化学修饰过的胆固醇酯水解酶是胆固醇酯水解酶经过以聚乙二醇为主要成分的基团的修饰。
[6]如[1]～[5]任何一项记载的方法，其中胆汁酸衍生物是具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
[7]如[6]记载的方法，其中具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是选自胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐以及脱氢胆酸或其盐中的胆汁酸衍生物。
[8]如[1]～[5]任何一项记载的方法，其中胆汁酸衍生物是具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
[9]如[8]记载的方法，其中具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物是指用下列通式(I)
      R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3 -          (I)
[通式中，R1表示3-(3-胆胺丙基)二甲铵基，R2表示氢原子或羟基]表示的化合物。
[10]如[1]～[5]任何一项记载的方法，其中胆汁酸衍生物是具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
[11]如[10]记载的方法，其中具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物：
(X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者是如下列通式(III)所示的化合物：
Figure A20038010077500152
{通式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或是如下列通式(IV)所示的取代基
[通式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之间的整数}。
[12]高密度脂蛋白中胆固醇检测试剂，其特征是含有胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸衍生物以及过氧化氢检测试剂。
[13]高密度脂蛋白中胆固醇检测试剂，其特征是含有胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物以及氧化型辅酶。
[14]如[13]记载的试剂，其中还含有还原型辅酶检测试剂。
[15]如[12]～[14]中任何一项记载的试剂，其中还含有白蛋白。
[16]如[12]～[15]中任何一项记载的试剂，其中胆固醇酯水解酶是经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。
[17]如[16]记载的试剂，其中经过化学修饰的胆固醇酯水解酶是经过选自以聚乙二醇为主要成分的基团、以聚丙二醇为主要成分的基团、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基团中的基团修饰的胆固醇酯水解酶。
[18]如[16]记载的试剂，其中经过化学修饰的胆固醇酯水解酶是经过以聚乙二醇为主要成分的基团修饰的胆固醇酯水解酶。
[19]如[12]～[18]中任何一项记载的试剂，其中胆汁酸衍生物是具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
[20]如[19]记载的试剂，其中具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是选自胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐以及脱氢胆酸或其盐中的胆汁酸衍生物。
[21]如[12]～[18]中任何一项记载的试剂，其中胆汁酸衍生物是具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
[22]如[21]记载的试剂，其中具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物是指如下列通式(I)表示的化合物：
     R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3 -       (I)
[式中，R1表示3-(3-胆胺丙基)二甲铵基，R2表示氢原子或羟基]。
[23]如[12]～[18]中任何一项记载的试剂，其中胆汁酸衍生物是具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
[24]如[23]记载的试剂，其中具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物：
Figure A20038010077500171
(X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者是如下列通式(III)所示的化合物：
Figure A20038010077500172
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之间的整数}。
[25]高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂盒，其特征是包括含有胆固醇酯水解酶的第一试剂以及含有胆固醇氧化酶的第二试剂、第一和第二试剂中的任何之一或二者中含有胆汁酸衍生物和过氧化氢检测试剂。
[26]高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂盒，其特征是包括含有胆汁酸衍生物的第一试剂以及含有胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的第二试剂、第一和第二试剂中的任何之一或二者中含有过氧化氢检测试剂。
[27]高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂盒，其特征是包括含有过氧化氢检测试剂的第一试剂以及含有胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的第二试剂、第一和第二试剂中的任何之一或二者中含有胆汁酸衍生物。
[28]高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂盒，其特征是包括含有胆固醇酯水解酶的第一试剂以及含有胆固醇脱氢酶的第二试剂、第一和第二试剂中的任何之一或二者中含有胆汁酸衍生物以及氧化型辅酶。
[29]高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂盒，其特征是包括含有胆汁酸衍生物的第一试剂以及含有胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶的第二试剂、第一和第二试剂中的任何之一或二者中含有氧化型辅酶。
[30]如[28]或[29]记载的试剂盒，其中第一和第二试剂中的任何之一或二者中还含有还原型辅酶检测试剂。
[31]如[25]～[30]中任何一项记载的试剂盒，其中第一和第二试剂中的任何之一或二者中还含有白蛋白。
[32]如[25]～[31]中任何一项记载的试剂盒，其中胆固醇酯水解酶是经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。
[33]如[32]记载的试剂盒，其中经过化学修饰的胆固醇酯水解酶是指经过选自以聚乙二醇为主要成分的基团、以聚丙二醇为主要成分的基团、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基团中的基团修饰的胆固醇酯水解酶。
[34]如[32]记载的试剂盒，其中经过化学修饰的胆固醇酯水解酶是指经过以聚乙二醇为主要成分的基团修饰的胆固醇酯水解酶。
[35]如[25]～[34]中任何一项记载的试剂盒，其中胆汁酸衍生物表示具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
[36]如[35]记载的试剂，其中具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是选自胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐以及脱氢胆酸或其盐中的胆汁酸衍生物。
[37]如[25]～[34]中任何一项记载的试剂盒，其中胆汁酸衍生物表示具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
[38]如[37]记载的试剂盒，其中具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物是指如下列通式(I)表示的化合物：
    R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3 -      (I)
[式中，R1表示3-(3-胆胺丙基)二甲铵基，R2表示氢原子或羟基]。
[39]如[25]～[34]中任何一项记载的试剂盒，其中胆汁酸衍生物表示具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
[40]如[39]记载的试剂盒，其中具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物：
(X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者表示如下列通式(III)所示的化合物：
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基
Figure A20038010077500203
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之间的整数}。
[41]如下列通式(III)所示的化合物：
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基
Figure A20038010077500212
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之间的整数}。
[42]通式(III)所示的化合物的制备方法：
Figure A20038010077500213
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或如下列通式(V)所示的取代基
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之间的整数}，是使如通式(V)表示的化合物
[式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，]
与如通式(VI)表示的化合物
Figure A20038010077500223
(式中，W’表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基，n表示3～400之间的整数)，
或是如通式(VII)表示的化合物，在缩合剂存在下反应
Figure A20038010077500224
(式中，T表示取代或未取代氨基烷基，n表示3～400之间的整数)。
本发明的HDL胆固醇检测方法是一种不除去HDL以外的脂蛋白中的胆固醇而测定HDL胆固醇的方法。
本发明的检测方法中所用的检测样本可以举出如全血、血浆、血清、脑脊髓液、唾液、羊水、尿液、汗液、胰液等等，优选血浆和血清。
本发明中的胆固醇酯水解酶只要是具有水解胆固醇酯的能力的酶即可，并没有特别的限制，比如除了动物、植物或微生物来源的胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶以外，还可以使用基因工程学方法制备而来的胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等。
胆固醇酯水解酶可以使用未经修饰的胆固醇酯水解酶，也可以使用经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。另外，胆固醇酯水解酶还可以使用市售产品。
市售的胆固醇酯水解酶可以举出如胆固醇脂酶“Amano”2号(CHE2，天野酶公司生产)、胆固醇脂酶“Amano”3号(CHE 3，天野酶公司生产)、脂蛋白脂肪酶(LPL311，东洋纺绩社生产)、脂蛋白脂肪酶“Amano”6号(LPL6，天野酶公司生产)、胆固醇酯酶[COE313(经过化学修饰的胆固醇酯酶)，东洋纺绩社生产]等。还有，本发明中还可以将2种以上的胆固醇酯水解酶组合起来使用。
胆固醇酯水解酶的化学修饰中用来修饰该酶的基团(化学修饰基团)可以举出如以聚乙二醇为主要成分的基团、以聚丙二醇为主要成分的基团、含有聚乙二醇和聚丙二醇共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺丙基、磺丁基、聚氨酯基、具有螯合作用的基团等，优选以聚乙二醇为主要成分的基团。作为水溶性多糖类，可以举出如葡聚糖、支链淀粉、可溶性淀粉等。
对胆固醇酯水解酶进行化学修饰时所用的试剂(化学修饰剂)可以举出如具有上述化学修饰基团以及能够与酶的氨基、羧基、巯基等反应的官能团或结构的化合物等。能够与酶中的氨基反应的官能团或结构，可以举出如羧基、活性酯基(N-羟基琥珀酰亚胺基等)、酸酐、酰基氯、醛、环氧基、1，3-丙烷磺内酯、1，4-丁烷磺内酯等。能够与酶中的羧基反应的官能团或结构可以举出如氨基等。能够与酶中的巯基发生反应的基团或结构可以举出如马来酰亚胺、二硫化物、α-卤代酯(α-碘代酯等)。
化学修饰剂也可以使用市售的化学修饰剂。市售的化学修饰剂可以举出如具有以聚乙二醇为主要成分的基团和N-琥珀酰亚胺基的SUNBRIDE VFM-4101、SUNBIRDE MEAC-50HS、SUNBRIDE MEC-50HS(均为日本油脂公司生产)、含有主要成分为聚亚烷基二醇的基团以及酸酐结构的SUNBRIDE AKM系列(如SUNBRIDE AKM-1510等)、SUNBRIDEADM系列、SUNBRIDE ACM系列(均为日本油脂公司生产)、具有以聚乙二醇为主要成分的基团以及环氧化物基的EPOX-3400、M-EPOX-5000(均为Sheawater Polymers公司生产)、含有具有螯合作用的基团以及酸酐结构的二乙三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酸酐(DTPA酸酐，同仁化学公司生产)等。
胆固醇酯水解酶的化学修饰可以通过以下方法进行，但并不仅限于本方法。首先，将胆固醇酯水解酶溶于pH8.0以上的缓冲液(如HEPES缓冲液)中，再在0～55℃条件下加入0.01～500倍摩尔当量的化学修饰剂，搅拌5分钟～5小时。在实际的酶反应中，不仅可以直接使用此反应液作为经过化学修饰的胆固醇酯水解酶，还可以根据需要用超滤膜等将未反应的化学修饰剂除去后余下部分作为经过化学修饰的胆固醇酯水解酶使用。
本反应的方法中所用的胆固醇酯水解酶的浓度只要是可以用来检测本发明的HDL胆固醇的范围即可，并没有特别的限制，但优选在反应液中的浓度为0.01～200U/mL，特别优选0.02～100U/mL。
本发明中的胆固醇氧化酶，只要是具有使胆固醇氧化并产生过氧化氢的能力的酶即可，没有特别的限制，比如除了动物、植物、微生物来源的胆固醇氧化酶，也可以使用基因工程学方法制备的胆固醇氧化酶等，还可以使用如胆固醇氧化酶“Amano”1号(CHOD 1，天野酶公司生产)、胆固醇氧化酶(CO-PE，キツコ一マン公司生产)、胆固醇氧化酶(COO321，东洋纺绩社生产)等市售产品。而且，本发明中也可以将2种以上的胆固醇氧化酶组合起来使用。
胆固醇氧化酶可以是未经修饰的酶，也可以是经过化学修饰的酶。经过化学修饰的胆固醇氧化酶例如可以用前面所述的化学修饰剂、通过前面所述的化学修饰方法制备得到。
本反应的方法中所用的胆固醇氧化酶的浓度，只要是可以用来检测到本发明的HDL胆固醇的浓度即可，并没有特别的限制，但是优选在反应液中的浓度为0.01～200U/mL，尤其优选0.02～100U/mL。
本发明中的胆固醇脱氢酶只要是具有在氧化型辅酶存在下使胆固醇氧化后生成还原型辅酶能力的酶即可，并没有特别的限制，比如除了动物、植物、微生物来源的胆固醇脱氢酶，也可以使用通过遗传工程学方法制备而得的胆固醇脱氢酶等。另外也可以使用胆固醇脱氢酶“Amano”5号(CHDH5，天野酶公司生产)等市售产品。而且，本发明中也可以将2种以上的胆固醇脱氢酶组合起来使用。胆固醇脱氢酶可以是未经修饰的酶，也可以是经过化学修饰的酶。经过化学修饰的胆固醇脱氢酶例如可以用前面所述的化学修饰剂、通过前面所述的化学修饰方法制作得到。
本反应的方法中所用的胆固醇脱氢酶的浓度，只要是能够用来检测本发明的HDL胆固醇的浓度即可，并没有特别的限制，但优选在反应液中浓度为0.01～200U/mL，尤其优选0.02～100U/mL。
采用胆固醇脱氢酶的本发明检测方法中要用到氧化型辅酶。氧化型辅酶可以举出如NAD、NADP、硫代NAD、硫代NADP等。
本发明中所用的白蛋白，只要是能够用来检测本发明的HDL胆固醇即可，并没有特别的限制，比如可以举出牛、马、羊、人来源的白蛋白等，但优选牛血清白蛋白(BSA)。另外也可以使用通过基因工程学方法制备而来的白蛋白。本发明中还可以将来源不同的2种以上白蛋白组合起来使用。本发明的HDL胆固醇检测时的白蛋白浓度，只要是能够用来检测本发明的HDL胆固醇即可，并没有特别的限制，但优选在反应液中的浓度为0.001～10％，尤为优选0.01～1％。
本发明中的胆汁酸衍生物，只要是能够检测本发明的HDL胆固醇的胆汁酸衍生物即可，并没有特别的限制，比如可以举出具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物、具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物、具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物等。
本发明的胆汁酸衍生物特别优选具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物，由于采用的是胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶以及胆固醇酯水解酶等胆固醇检测酶，因此具有HDL胆固醇检测的准确性或再现性、同时胆固醇检测酶具有保存稳定性。
具有阴离子表面活性作用的胆汁酸衍生物，可以举出如胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐以及脱氢胆酸或其盐。盐可以举出铵盐、锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等。具有阴离子表面活性作用的胆汁酸衍生物的浓度只要能够用来检测本发明的HDL胆固醇的浓度即可，并没有特别的限制，但优选在反应液中的浓度为0.001～30％，尤其优选0.01～3％。
具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物可以举出如下列通式(I)表示的化合物[以下称为化合物(I)]
    R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3 -         (I)
[式中，R1表示3-(3-胆胺丙基)二甲铵基，R2表示氢原子或羟基]等。以下，将R2为氢原子的化合物(I)称为CHAPS，R2为羟基的化合物(I)称为CHAPSO。具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物的浓度只要是能够检测本发明的HDL胆固醇的浓度即可，并没有特别的限制，但优选在反应液中的浓度为0.001～30％，尤其优选0.01～3％。
非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物可以举出如下列通式(II)所表示的化合物[以下称为化合物(II)]
(X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷醇基)等。化合物(II)中烷基、烷酰基中都有的烷基可以举出直链或支链状的碳原子数1～10的烷基等，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。化合物(II)中取代烷基以及取代烷酰基中的取代基可以举出如羟基、卤原子等。卤原子就是氟、氯、溴、碘等原子。化合物(II)中的R3和R4均为
        COCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2OH
(以下称为取代基A)的化合物为优选。以下将X、R3和R4分别为氢原子、取代基A和取代基A的化合物称为脱氧BIGCHAP，分别为羟基、取代基A和取代基A的化合物称为BIGCHAP。
具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物，可以举出如下列通式(III)表示的化合物[以下称为化合物(III)]：
Figure A20038010077500272
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基：
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1][以下称为取代基(IV)]，N表示3～400之间的整数}。
化合物(III)可以通过如下列通式(V)：
Figure A20038010077500282
[式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基]表示的化合物[以下称为化合物(V)]，与如下列通式(VI)
(式中、W’表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基，n表示3～400之间的整数)表示的化合物[以下称为化合物(VI)]、或如下列通式(VII)
Figure A20038010077500284
(式中，T表示取代或未取代氨基烷基，n表示3～400之间的整数)所表示的化合物[以下称为化合物(VII)]，在缩合剂存在下在溶剂中反应而制备(合成)得到。本反应还可以根据需要在有碱共存的条件下进行。
X、Y和Z表示氢原子、羟基或氧代基，但优选X、Y、Z中至少有一个为羟基。X’、Y’和Z’表示氢原子、羟基或氧代基，但优选X’、Y’和Z’中至少有一个为羟基。
化合物(III)和化合物(VI)中的烷基、烷酰基所共同的烷基可以为直链或支链状的碳原子数1～18的烷基，比如可以举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、庚基、异庚基、辛基、异辛基、壬基、异壬基、癸基、异癸基、十一烷基、异十一烷基、十二烷基、异十二烷基、十三烷基、异十三烷基、十四烷基、异十四烷基、十五烷基、异十五烷基、十六烷基、异十六烷基、十七烷基、异十七烷基、十八烷基、异十八烷基等，优选甲基、乙基、丙基、壬基、十二烷基等。
化合物(III)和化合物(VI)中的烯基、烯酰基所共同的烯基为直链或支链状的碳原子数2～8的烯基，比如可以举出乙烯基、丙烯基、异丙烯基、芳基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基等。
化合物(III)和化合物(VI)中的炔基、炔酰基所共同的炔基可以为直链或支链状的碳原子数2～8的炔基，比如可以举出乙炔基、丙炔基、炔丙基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基等。
化合物(III)和化合物(VI)中的环烷基可以是碳原子数3～8的环烷基，比如可以举出环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。
化合物(III)和化合物(VI)中的环烯基可以是碳原子数4～8的环烯基，比如可以举出环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基等。
化合物(III)和化合物(VI)中的芳基可以是碳原子数6～15的芳基，比如可以举出苯基、萘基、蒽基、菲基、联苯基等。环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基等。化合物(III)中取代芳基的取代基可以举出如烷基等。该烷基可以举出如前面所述的烷基。
化合物(III)和化合物(VII)中的氨基烷基可以举出如N-一取代氨基烷基、N，N-二取代氨基烷基等。N，N-二取代氨基烷基中氮原子上的两个取代基可以相同也可以不同。N-一取代氨基烷基与N，N-二取代氨基烷基中氮原子上的取代基可以举出如前所述的烷基等。N-一取代氨基烷基具体可以举出如2-(N-甲基氨基)乙基、2-(N-乙基氨基)乙基、2-(N-丙基氨基)乙基、2-(N-丁基氨基)乙基、3-(N-甲基氨基)丙基、3-(N-乙基氨基)丙基、3-(N-丙基氨基)丙基、3-(N-丁基氨基)丙基、4-(N-甲基氨基)丁基、4-(N-乙基氨基)丁基、4-(N-丙基氨基)丁基、4-(N-丁基氨基)丁基等。N，N-二取代氨基烷基具体可以举出如2-(N，N-二甲基氨基)乙基、3-(N，N-二甲基氨基)丙基、4-(N，N-二甲基氨基)丁基等。化合物(III)和化合物(VII)中未取代氨基烷基具体可以举出2-氨基乙基、3-氨基丙基、4-氨基丁基等。
n表示酯的部分中氧乙烯基的平均聚合度。平均聚合度只要是能够测定本发明的HDL胆固醇的范围内即可，并没有特别的限制，但优选3～400，更优选8～300，特别优选15～200。
化合物(V)可以举出如胆酸、石胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、7-氧代石胆酸、12-氧代石胆酸、12-氧代鹅脱氧胆酸、7-氧代脱氧胆酸、猪胆酸、猪脱氧胆酸以及脱氢胆酸等。
在合成W为氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基和取代或未取代氨基烷基中的任何基团的化合物(III)[以下称为化合物(IIIa)]时，化合物(VI)或化合物(VII)与化合物(V)的当量比优选0.5～1.5，更优选1～1.2。在合成W为如通式(IV)所示的基团的化合物(III)[以下称为化合物(IIIb)]时，化合物(VI)或化合物(VII)与化合物(V)的当量比优选1.3～4.1，尤为优选1.7～2.2。
合成化合物(III)时的反应温度优选10～40℃，尤为优选20～35℃。合成化合物(III)时的反应溶剂，只要是不影响化合物(V)和化合物(VI)的缩合反应的溶剂即可，并没有特别的限制，比如可以举出有机溶剂等。该有机溶剂可以举出如甲苯、二甲苯等芳香烃类溶剂、乙酸乙酯等脂肪族酯类溶剂、二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷等卤代烃类溶剂等等。
化合物(III)合成时所用的缩合剂只要是可以使化合物(V)与化合物(VI)的缩合反应进行的缩合剂即可，并没有特别的限制，比如可以举出碳化二亚胺类、吡啶鎓盐、苯并噻唑鎓盐、苯并噁唑鎓盐、异氰酸酯类、羰基试剂等，优选碳化二亚胺类。碳化二亚胺类可以举出如1，3-二环己基碳化二亚胺、1，3-二(叔丁基)碳化二亚胺、1，3-二异丙基碳化二亚胺、水溶性碳化二亚胺等，但从用水清洗除去方便的角度考虑，特别优选水溶性碳化二亚胺。水溶性碳化二亚胺可以举出如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺或其盐等。该盐可以举出如盐酸盐、甲基碘盐等。吡啶鎓盐可以举出如碘化2-氯甲基吡啶鎓盐、碘化2-溴甲基吡啶鎓盐等。苯并噁唑鎓盐可以举出如2-氯苯并噁唑鎓氟化硼盐等。苯并噻唑鎓盐可以举出如2-氯苯并噻唑氟化硼盐等。异氰酸酯类可以举出如氯磺酰基异氰酸酯等。羰基试剂可以举出如1，1-羰基二咪唑等。
缩合反应中缩合剂的当量数，如果是合成化合物(IIIa)则优选相对于化合物(V)为1.0～5.0当量，尤其优选1.1～2.5当量；如果是合成化合物(IIIb)则优选相对于化合物(VI)或化合物(VII)为1.0～5.0当量，尤其优选1.1～2.5当量。
合成化合物(III)时根据需要使用的碱可以举出如吡啶类似物。该吡啶类似物比如可以举出吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2-乙基吡啶、3-乙基吡啶、4-乙基吡啶、2-丙基吡啶、3-丙基吡啶、4-丙基吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，3-二甲基吡啶、2，4-二甲基吡啶、2，5-二甲基吡啶、3，4-二甲基吡啶、3，5-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、2，3，5-二甲基吡啶、2-二甲基氨基吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-吡咯烷基吡啶、4-哌啶基吡啶等，特别优选4-二甲基氨基吡啶、4-吡咯烷基吡啶、4-哌啶基吡啶。吡啶类似物的当量优选相对于化合物(V)为0.01～2.5当量，尤其优选0.7～1.2当量。
化合物(V)与化合物(VI)或化合物(VII)的缩合反应的后处理，可以采取如下的一系列操作，即将水或水和有机溶剂的混合物加入反应溶液中，用有机溶剂将化合物(III)[化合物(IIIa)或化合物(IIIb)]从生成的反应混合物中提取出来，提取液中所含的水用干燥剂除去，然后将该干燥剂过滤，将得到的滤液中的溶剂常压或减压条件下蒸去。还有，也可以将含有化合物(III)的提取液用酸清洗，除去该提取液中的碱性物质(缩合剂、来源于缩合剂的物质、碱)。用酸清洗后的溶液再进一步用水或食盐水清洗优选。加入反应溶液中的有机溶剂与反应所用的有机溶剂可以相同，也可以不同，但优选其与反应所用溶剂相同。另外，加入反应溶液中的有机溶剂与用于提取的有机溶剂可以相同也可以不同。加入反应溶液中的有机溶剂或用于提取的有机溶剂可以举出如前面所述的有机溶剂，优选其中的二氯甲烷、乙酸乙酯等。
化合物(V)与化合物(VI)或化合物(VII)的缩合反应后处理所得到的含有化合物(III)的反应混合物可以直接用来检测HDL胆固醇，也可以将其经过适当的分离精制处理进行精制后再来检测。该分离精制处理的方法可以举出如硅胶柱色谱法、HPLC、蒸馏、分馏、重结晶等。
具有非离子性表面活性的胆汁酸衍生物的浓度只要是能够测定本发明的HDL胆固醇的浓度即可，并没有特别的限制，但优选在反应液中的浓度为0.001～30％，尤其优选0.01～3％。
本发明的HDL胆固醇测定法中所用的水性介质可以举出如去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。缓冲液中所用的缓冲剂可以举出如三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good’s缓冲剂等。Good’s缓冲剂比如有2-吗啉代乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N，N’-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N，N-二(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N，N’-二(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]氨基乙酸(Tricine)、N，N-二(2-羟乙基)氨基乙酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。缓冲液的浓度只要是适用于测定的浓度即可，并没有特别的限制，但优选0.001～2.0mol/L，尤其优选0.005～1.0mol/L。
以下具体说明本发明的HDL胆固醇的检测方法、检测试剂以及检测试剂盒。
(HDL胆固醇的检测方法)
本发明的HDL胆固醇的检测方法可以举出如下所述的方法。
检测方法1
(1)检测样本与未经修饰的胆固醇酯水解酶及胆固醇氧化酶、或是与未经修饰的胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶，在含有胆汁酸衍生物的水性介质中反应；
(2)测定生成的过氧化氢或还原型辅酶；
(3)由(2)得到的测定值与预先做好的标准曲线计算出检测样本中HDL胆固醇的浓度，由此即可测定样本中的HDL胆固醇。
检测方法2
(1)检测样本与未经修饰的胆固醇酯水解酶及胆固醇氧化酶、或是与未经修饰的胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶，在含有胆汁酸衍生物以及白蛋白的水性介质中反应；
(2)测定生成的过氧化氢或还原型辅酶；
(3)由(2)得到的测定值与预先做好的标准曲线计算出检测样本中HDL胆固醇的浓度，由此即可检测样本中的HDL胆固醇。
检测方法3
(1)检测样本与经过化学修饰的胆固醇酯水解酶及胆固醇氧化酶、或是与经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶，在含有胆汁酸衍生物的水性介质中反应；
(2)测定生成的过氧化氢或还原型辅酶；
(3)由(2)得到的测定值与预先做好的标准曲线计算出检测样本中HDL胆固醇的浓度，由此即可检测样本中的HDL胆固醇。
检测方法4
(1)检测样本与经过化学修饰的胆固醇酯水解酶及胆固醇氧化酶、或是与经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶，在含有胆汁酸衍生物以及白蛋白的水性介质中反应；
(2)测定生成的过氧化氢或还原型辅酶；
(3)由(2)得到的测定值与预先做好的标准曲线计算出检测样本中HDL胆固醇的浓度，由此即可检测样本中的HDL胆固醇。
本检测方法中，第(1)步反应可以在10～50℃进行，优选在20～40℃进行，反应可以进行1～60分钟，优选2～30分钟。
生成的过氧化氢的量可以通过如过氧化氢检测试剂等进行测定。过氧化氢检测试剂就是用来将生成的过氧化氢转换成可以检验出来的物质的试剂。可以检验出来的物质比如可以举出色素、发光物质等，优选色素。可以检验出来的物质为色素时，则过氧化氢检测试剂含有氧化发色型色原体以及过氧化物酶等过氧化活性物质。氧化发色型色原体可以举出如后面所述的氧化发色型色原体。可以检验出来的物质为发光物质时，则过氧化氢检测试剂含有化学发光物质。化学发光物质可以举出如氨基苯二酰肼、异氨基苯二酰肼、光泽精、吖啶鎓酯等。
过氧化氢检测试剂如果是含有氧化发色型色原体以及过氧化物酶等过氧化活性物质的试剂，则过氧化氢在有过氧化活性物质存在的条件下与氧化发色型色原体反应生成色素，定量分析生成的色素，由此就可以对过氧化氢进行定量。而如果是用含有化学发光物质的过氧化氢检测试剂，过氧化氢与化学发光物质反应产生光子，定量分析产生的光子，由此即可对过氧化氢进行定量。
氧化发色型色原体可以举出如无色型色原体、氧化偶合发色型色原体等。无色型色原体就是在有过氧化氢以及过氧化物酶等过氧化活性物质存在时可以自己转变成色素的物质。具体可以举出如10-N-羧甲基氨基甲酰基-3，7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、4，4’-双(二甲基氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)等。
氧化偶合发色型色原体就是在有过氧化氢以及过氧化物酶等过氧化活性物质存在时，两个化合物会发生氧化偶合从而生成色素的物质。两个化合物的组合可以举出如偶合剂与苯胺类的组合、偶合剂与苯酚类的组合等。偶合剂可以举出如4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑酮肼等。苯胺类可以举出如N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基-3-甲基苯胺、N，N-二(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。苯酚类可以举出如苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
测定过氧化氢时过氧化活性物质的浓度只要是适于测定的浓度即可，并没有特别的限制，如果过氧化活性物质用的是过氧化物酶，则浓度优选1～100kU/L。氧化发色型色原体的浓度只要是适于测定的浓度即可，没有特别的限制，但优选0.01～10g/L。
还原型辅酶的测定方法可以举出如测定生成的还原型辅酶的吸光度的方法、采用还原型辅酶检测试剂来测定的方法。测定还原型辅酶吸光度的方法中吸光度优选300～500nm，更加优选330～400nm，特别优选340nm左右。还原型辅酶检测试剂就是将生成的还原型辅酶转换成可以检验出来的物质的试剂。可以检验出来的物质可以举出如色素等。可以检验出来的物质为色素时的还原型辅酶检测试剂可以举出如含有心肌黄酶、电子导体以及还原发色型色原体的试剂。电子导体可以举出如1-甲氧基-5-甲基フエナジウム甲基硫酸等。用含有心肌黄酶、电子载体以及还原发色型色原体的试剂作为还原型辅酶检测试剂时，还原发色型色原体转换成为色素，通过定量分析此色素，就可以对还原型辅酶进行定量。
还原发色型色原体可以举出如溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5(2，4-二磺苯基)-2H-四氮唑一钠盐(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四氮唑一钠盐等(WST-3)。
(HDL胆固醇检测试剂)
本发明的HDL胆固醇检测试剂可以举出如下所述的试剂。
试剂1
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸衍生物以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂2
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸衍生物、白蛋白以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂3
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物以及氧化型辅酶的试剂。
试剂4
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物、白蛋白以及氧化型辅酶的试剂。
试剂5
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
试剂6
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物、白蛋白、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
试剂7
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸衍生物以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂8
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸衍生物、白蛋白以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂9
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物以及氧化型辅酶的试剂。
试剂10
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物、白蛋白以及氧化型辅酶的试剂。
试剂11
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
试剂12
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物、白蛋白、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
本发明的HDL胆固醇检测试剂可以采用如前所述本发明的HDL胆固醇检测方法中所举出的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物、白蛋白、氧化型辅酶、还原型辅酶检测试剂。
(HDL胆固醇检测试剂盒)
本发明的HDL胆固醇检测试剂也可以采用试剂盒的形式进行保存、流通和使用。试剂盒的形式没有特别的限制，可以是二试剂型、三试剂型等的任何形式，但优选二试剂型。
第一试剂和第二试剂组成的二试剂型HDL胆固醇检测试剂盒中，胆固醇酯水解酶与胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶可以是分别包含于第一试剂与第二试剂中，也可以是一起包含在第二试剂中；如果是分别包含于第一试剂与第二试剂中，则优选的试剂盒形式为胆固醇酯水解酶含于第一试剂中、而胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶含于第二试剂中。胆汁酸衍生物可以是包含在第一试剂、第二试剂的任何一个之中，也可以两者中都包含。采用胆固醇脱氢酶的检测方法中所用的氧化型辅酶可以包含在第一试剂、第二试剂的任何一个之中，也可以两者中都包含。过氧化氢检测试剂可以包含在第一试剂、第二试剂的任何一个之中，也可以两者中都包含，但如果该检测试剂含有氧化偶合型色原体，则优选氧化偶合型色原体的各个化合物分别包含在各个试剂中。还原型辅酶检测试剂可以包含在第一试剂、第二试剂的任何一个之中，也可以两者中都包含。还有白蛋白可以包含在第一试剂、第二试剂的任何一个之中，也可以两者中都包含。
试剂盒具体可以举出以下的组合形式。
试剂盒1
第一试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆汁酸衍生物以及过氧化氢检测试剂的试剂。
第二试剂
含有胆固醇氧化酶以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂盒2
第一试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆汁酸衍生物、白蛋白以及过氧化氢检测试剂的试剂。
第二试剂
含有胆固醇氧化酶以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂盒3
第一试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆汁酸衍生物以及过氧化氢检测试剂的试剂。
第二试剂
含有胆固醇氧化酶以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂盒4
第一试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆汁酸衍生物、白蛋白以及过氧化氢检测试剂的试剂。
第二试剂
含有胆固醇氧化酶以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂盒5
第一试剂
含有过氧化氢检测试剂的试剂。
第二试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸衍生物以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂盒6
第一试剂
含有白蛋白以及过氧化氢检测试剂的试剂。
第二试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸衍生物以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂盒7
第一试剂
含有过氧化氢检测试剂的试剂。
第二试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸衍生物以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂盒8
第一试剂
含有白蛋白以及过氧化氢检测试剂的试剂。
第二试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸衍生物以及过氧化氢检测试剂的试剂。
试剂盒9
第一试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶以及胆汁酸衍生物的试剂。
第二试剂
含有胆固醇脱氢酶以及氧化型辅酶的试剂。
试剂盒10
第一试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆汁酸衍生物以及白蛋白的试剂。
第二试剂
含有胆固醇脱氢酶以及氧化型辅酶的试剂。
试剂盒11
第一试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶以及胆汁酸衍生物的试剂。
第二试剂
含有胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
试剂盒12
第一试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆汁酸衍生物以及白蛋白的试剂。
第二试剂
含有胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
试剂盒13
第一试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶以及胆汁酸衍生物的试剂。
第二试剂
含有胆固醇脱氢酶以及氧化型辅酶的试剂。
试剂盒14
第一试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆汁酸衍生物以及白蛋白的试剂。
第二试剂
含有胆固醇脱氢酶以及氧化型辅酶的试剂。
试剂盒15
第一试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶以及胆汁酸衍生物的试剂。
第二试剂
含有胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
试剂盒16
第一试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆汁酸衍生物以及白蛋白的试剂。
第二试剂
含有胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
试剂盒17
第一试剂
含有胆汁酸衍生物的试剂。
第二试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶以及氧化型辅酶的试剂。
试剂盒18
第一试剂
含有胆汁酸衍生物以及白蛋白的试剂。
第二试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶以及氧化型辅酶的试剂。
试剂盒 19
第一试剂
含有胆汁酸衍生物的试剂。
第二试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
试剂盒 20
第一试剂
含有胆汁酸衍生物以及白蛋白的试剂。
第二试剂
含有未经修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
试剂盒21
第一试剂
含有胆汁酸衍生物的试剂。
第二试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶以及氧化型辅酶的试剂。
试剂盒22
第一试剂
含有胆汁酸衍生物以及白蛋白的试剂。
第二试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶以及氧化型辅酶的试剂。
试剂盒23
第一试剂
含有胆汁酸衍生物的试剂。
第二试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
试剂盒24
第一试剂
含有胆汁酸衍生物以及白蛋白的试剂。
第二试剂
含有经过化学修饰的胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、氧化型辅酶以及还原型辅酶检测试剂的试剂。
本发明的HDL胆固醇检测试剂盒可以采用前面所述的本发明HDL胆固醇检测方法中所举出的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物、白蛋白、过氧化氢检测试剂、氧化型辅酶、还原型辅酶检测试剂。
本发明的HDL胆固醇检测试剂以及检测试剂盒也可以根据需要包含水性介质、稳定剂、防腐剂、妨碍物质消除剂、反应促进剂等。水性介质可以举出前面所述的水性介质等。稳定剂可以举出如乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙等。防腐剂可以举出如叠氮化钠、抗生素等。妨碍物质消除剂可以举出如消除抗坏血酸的影响的抗坏血酸氧化酶等。反应促进剂可以举出如辅脂肪酶、磷脂酶等酶类、硫酸钠、氯化钠等盐类物质。本发明的HDL胆固醇检测试剂以及检测试剂盒可以是冷冻干燥品的状态，也可以是溶解于水性介质中的状态。采用冷冻干燥状态的试剂检测样本中HDL胆固醇时，先将该试剂溶于水性介质中后再行使用。
本发明的HDL胆固醇检测试剂以及检测试剂盒中的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶的含量优选其溶于水性介质后的浓度达到0.01～800U/mL的含量，尤为优选0.02～400U/mL。本发明的HDL胆固醇检测试剂以及检测试剂盒中的胆汁酸衍生物的含量优选其溶于水性介质后的浓度达到0.001～30％的含量，尤为优选0.01～10％。本发明的HDL胆固醇检测试剂以及检测试剂盒中的白蛋白的含量优选其溶于水性介质后的浓度达到0.001～10％的含量，尤为优选0.01～5％。
以下用实施例进一步详细说明，但本发明并不仅限于这些实施例。本发明中使用了以下试剂以及酶。
HEPES(BDH Laboratory公司生产)、EMSE(Daito Chemics公司生产)、牛血清白蛋白(BSA；Oriental公司生产)、4-氨基安替比林(埼京化成公司生产)、过氧化物酶(东洋纺绩社生产)、LPL311(胆固醇酯水解酶；东洋纺绩社生产)、LPL6(胆固醇酯水解酶；天野酶公司生产)、CHE2(胆固醇酯水解酶；天野酶公司生产)、COE313(经过化学修饰的胆固醇酯水解酶；东洋纺绩社生产)、COO321(胆固醇氧化酶；东洋纺绩社生产)、胆酸钠(ACROS公司生产)、牛磺胆酸钠(东京化成公司生产)、BIGCHAP(同仁化学公司生产)、CHAPS(同仁化学公司生产)、硫酸葡聚糖钠(分子量50万；法玛西亚公司生产)。
另外，本实施例中进行胆汁酸衍生物的鉴定时，是用下列分析仪器取得各种数据的。
核磁共振波谱仪(1H-NMR，13C-NMR)：JEOL GSX-400(日本电子公司生产)
1H-NMR波谱测定是用四甲硅烷作为内标，标示基于四甲硅烷的化学位移(δ)。13C-NMR波谱测定就是标示当来源于CDCl3的3个峰的中心峰设为77.0PPm时各峰的化学位移(δ)。
红外吸收光谱(IR)：Nicolet NEXUS470(Nicole公司生产)
凝胶渗透色谱(GPC)：
系统：TOSOH HLC-8120GPC(东曹公司生产)
GPC柱：TSKgel Super H-RC(低分子分析用)(东曹公司生产)2根串连。
柱保持温度：40℃
展开溶剂：四氢呋喃
流速：0.5mL/分钟
检测器：RI(折射率)
标准曲线制作用标准物质：聚乙二醇
实施发明的最佳方式
参考例1  化学修饰LPL311(经过化学修饰的LPL311)的制备
在HEPES缓冲液(pH8.5，0.15mol/L)中加入LPL311使其浓度达到33g/L，冷却至5℃，然后加入SUNBRIDE VFM-4101或SUNBRIDEAKM-1510或SUNBRIDE MEAC-50HS(均为日本油脂公司生产)使其浓度达到330g/L，再反应3小时。得到的修饰酶溶液不经精制分离而直接作为化学修饰LPL311使用。
参考例2  化学修饰CHE2(经过化学修饰的CHE2)的制备
在HEPES缓冲液(pH8.5，0.15mol/L)中加入CHE2使其浓度达到50g/L，冷却至5℃，然后加入SUNBRIDE VFM-4101(日本油脂公司生产)使其浓度达到200g/L，再反应3小时。得到的修饰酶溶液不经精制分离而直接作为化学修饰CHE2使用。
实施例1 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                        10mmol/L
EMSE                                0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                      10mmol/L
4-氨基安替比林                    0.3g/L
过氧化物酶                        20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                  0.2kU/L
COO321                            3.0kU/L
胆酸钠                            6.0g/L
实施例2 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                      10mmol/L
EMSE                              0.3g/L
BSA                               2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                      10mmol/L
4-氨基安替比林                    0.3g/L
过氧化物酶                        20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                  0.2kU/L
COO321                            3.0kU/L
胆酸钠                            6.0g/L
实施例2 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                      10mmol/L
EMSE                              0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                    10mmol/L
4-氨基安替比林                  0.3g/L
过氧化物酶                      20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                0.2U/L
COO321                          3.0kU/L
牛磺胆酸钠                      7.0g/L
实施例4 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                    10mmol/L
EMSE                            0.3g/L
BSA                             2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                    10mmol/L
4-氨基安替比林                  0.3g/L
过氧化物酶                      20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                0.2kU/L
COO321                          3.0kU/L
牛磺胆酸钠                      7.0g/L
实施例5 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                    10mmol/L
EMSE                            0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                    10mmol/L
4-氨基安替比林                  0.3g/L
过氧化物酶                      20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                0.2kU/L
COO321                          3.0kU/L
BIGCHAP                         4.5g/L
实施例6 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                    10mmol/L
EMSE                            0.3g/L
BSA                             2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                    10mmol/L
4-氨基安替比林                  0.3g/L
过氧化物酶                      20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                0.2kU/L
COO321                          3.0kU/L
BIGCHAP                         4.5g/L
实施例7 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                    10mmol/L
EMSE                            0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                        10mmol/L
4-氨基安替比林                      0.3g/L
过氧化物酶                          20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                    0.2kU/L
COO321                              3.0kU/L
CHAPS                               6.0g/L
实施例8 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                        10mmol/L
EMSE                                0.3g/L
BSA                                 2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                        10mmol/L
4-氨基安替比林                      0.3g/L
过氧化物酶                          20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                    0.2kU/L
COO321                              3.0kU/L
CHAPS                               6.0g/L
比较例1 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                        10mmol/L
EMSE                                0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                         10mmol/L
4-氨基安替比林                       0.3g/L
过氧化物酶                           20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                     0.2kU/L
COO321                               3.0kU/L
比较例2 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                         10mmol/L
EMSE                                 0.3g/L
BSA                                  2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                         10mmol/L
4-氨基安替比林                       0.3g/L
过氧化物酶                           20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                     0.2kU/L
COO321                               3.0kU/L
实施例9 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                         10mmol/L
EMSE                                 0.3g/L
BSA                                  2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                         10mmol/L
4-氨基安替比林                        0.3g/L
过氧化物酶                            20kU/L
LPL6                                  0.05kU/L
COO321                                3.0kU/L
胆酸钠                                6.0g/L
实施例10 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                          10mmol/L
EMSE                                  0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                          10mmol/L
4-氨基安替比林                        0.3g/L
过氧化物酶                            20kU/L
LPL6                                  0.05kU/L
COO321                                3.0kU/L
胆酸钠                                6.0g/L
实施例11 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                          10mmol/L
EMSE                                  0.3g/L
BSA                                   2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                          10mmol/L
4-氨基安替比林                        0.3g/L
过氧化物酶                            20kU/L
LPL6                            0.05kU/L
COO321                          3.0kU/L
牛磺胆酸钠                      7.0g/L
实施例12 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                    10mmol/L
EMSE                            0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                    10mmol/L
4-氨基安替比林                  0.3g/L
过氧化物酶                      20kU/L
LPL6                            0.05kU/L
COO321                          3.0kU/L
牛磺胆酸钠                      7.0g/L
实施例13 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                    10mmol/L
EMSE                            0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                    10mmol/L
4-氨基安替比林                  0.3g/L
过氧化物酶                      20kU/L
LPL6                            0.05kU/L
COO321                          3.0kU/L
BIGCHAP                         4.5g/L
实施例14 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                      10mmol/L
EMSE                              0.3g/L
BSA                               2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                      10mmol/L
4-氨基安替比林                    0.3g/L
过氧化物酶                        20kU/L
LPL6                              0.05kU/L
COO321                            3.0kU/L
BIGCHAP                           4.5g/L
实施例15 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                      10mmol/L
EMSE                              0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                      10mmol/L
4-氨基安提比林                    0.3g/L
过氧化物酶                        20kU/L
LPL6                              0.05kU/L
COO321                            3.0kU/L
CHAPS                             6.0g/L
实施例16 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                          10mmol/L
EMSE                                  0.3g/L
BSA                                   2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                          10mmol/L
4-氨基安替比林                        0.3g/L
过氧化物酶                            20kU/L
LPL6                                  0.05kU/L
COO321                                3.0kU/L
CHAPS                                 6.0g/L
比较例3 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                          10mmol/L
EMSE                                  0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                          10mmol/L
4-氨基安替比林                        0.3g/L
过氧化物酶                            20kU/L
LPL6                                  0.05kU/L
COO321                                3.0kU/L
比较例4 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                          10mmol/L
EMSE                                0.3g/L
BSA                                 2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                        10mmol/L
4-氨基安替比林                      0.3g/L
过氧化物酶                          20kU/L
LPL6                                0.05kU/L
COO321                              3.0kU/L
实施例17 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                        10mmol/L
EMSE                                0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                        10mmol/L
4-氨基安替比林                      0.3g/L
过氧化物酶                          20kU/L
化学修饰CHE2(用VFM-4101修饰过的)
                                    0.2kU/L
COO321                              3.0kU/L
胆酸钠                              6.0g/L
实施例18 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                        10mmol/L
EMSE                                0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                        10mmol/L
4-氨基安替比林                      0.3g/L
过氧化物酶                          20kU/L
化学修饰LPL311(用MEAC-50HS修饰过的)
                                    0.2kU/L
COO321                              3.0kU/L
胆酸钠                              6.0g/L
实施例19 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                        10mmol/L
EMSE                                0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                        10mmol/L
4-氨基安替比林                      0.3g/L
过氧化物酶                          20kU/L
化学修饰LPL311(用AKM-1510修饰过的)
                                    0.2kU/L
COO321                              3.0kU/L
胆酸钠                              6.0g/L
实施例20 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                        10mmol/L
EMSE                                0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                        10mmol/L
4-氨基安替比林                    0.3g/L
过氧化物酶                        20kU/L
COE313                            1.0kU/L
COO321                            3.0kU/L
胆酸钠                            6.0g/L
实施例21 HDL胆固醇的测定
用实施例1的试剂盒，通过日立7170型自动分析装置测定了30个血清样本中的HDL胆固醇。
(1)标准曲线的绘制
用生理盐水(HDL胆固醇浓度：0.0mg/DL)以及血清(HDL胆固醇浓度：60.0mg/DL)作为标准液，用实施例1的试剂盒作为检测试剂盒，利用日立7170型自动分析装置绘制表示HDL胆固醇浓度和“吸光度”之间关系的标准曲线。
此处的“吸光度”是指由以下反应测得两个吸光度(E1以及E2)、再用E2减去E1得到的值。
反应容器中加入标准液(3μL)和第一试剂(0.24mL)，在37℃下孵育5分钟，在主波长600nm、副波长700nm下测定反应液的吸光度(E1)，接着在此反应液中加入第二试剂(0.08mL)，再在37℃下孵育5分钟，在主波长600nm、副波长700nm下测定反应液的吸光度(E2)。
(2)通过人体血清样本和实施例1的试剂盒的反应计算出该样本的“吸光度”
除了用人体血清样本代替绘制(1)的标准曲线时所用的标准液以外，其它操作相同，用(1)的“吸光度”计算方法同样计算出该样本的“吸光度”。
(3)人体血清样本中HDL胆固醇浓度的测定
用(2)中计算出的“吸光度”以及(1)中绘制的标准曲线来测定各样本中HDL胆固醇的浓度。
实施例22 HDL胆固醇的测定
除了用实施例2的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例23 HDL胆固醇的测定
除了用实施例3的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例24 HDL胆固醇的测定
除了用实施例4的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例25 HDL胆固醇的测定
除了用实施例5的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例26 HDL胆固醇的测定
除了用实施例6的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例27 HDL胆固醇的测定
除了用实施例7的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例28 HDL胆固醇的测定
除了用实施例8的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
比较例5 HDL胆固醇的测定
除了用比较例1的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
比较例6 HDL胆固醇的测定
除了用比较例2的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例29 HDL胆固醇的测定
除了用实施例9的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例30 HDL胆固醇的测定
除了用实施例10的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例31 HDL胆固醇的测定
除了用实施例11的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例32 HDL胆固醇的测定
除了用实施例12的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例33 HDL胆固醇的测定
除了用实施例13的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例34 HDL胆固醇的测定
除了用实施例14的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例35 HDL胆固醇的测定
除了用实施例15的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例36 HDL胆固醇的测定
除了用实施例16的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
比较例7 HDL胆固醇的测定
除了用比较例3的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
比较例8 HDL胆固醇的测定
除了用比较例4的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例37 HDL胆固醇的测定
除了用实施例17的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例38 HDL胆固醇的测定
除了用实施例18的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例39 HDL胆固醇的测定
除了用实施例19的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
实施例40 HDL胆固醇的测定
除了用实施例20的试剂盒代替实施例1的试剂盒以外，其它均与实施例21的测定方法相同，由此通过日立7170型自动分析装置检测人体血清的30个样本中的HDL胆固醇。
另外，实施例21～40以及比较例5～8的测定中所用的人体血清样本用临床化学(Clinical Chemistry)第45卷10号(1999年)中记载的DCM法(指定性比较法，Designated Comparison Method)来测定该样本中的HDL胆固醇，对各种检测方法进行比较。
实施例21～40以及比较例5～8的各个测定方法与通过DCM法进行的测定方法之间的相关系数如表1所示。
表1
  测定   试剂盒   胆汁酸衍生物   胆固醇酯水解酶   BSA   相关系数
  实施例21   实施例1   胆酸钠   经过VFM-4101修饰的LPL311   -   0.934
  实施例22   实施例2   胆酸钠   经过VFM-4101修饰的LPL311   +   0.928
  实施例23   实施例3   牛磺胆酸钠   经过VFM-4101修饰的LPL311   -   0.889
  实施例24   实施例4   牛磺胆酸钠   经过VFM-4101修饰的LPL311   +   0.869
  实施例25   实施例5   BIGCHAP   经过VFM-4101修饰的LPL311   -   0.991
  实施例26   实施例6   BIGCHAP   经过VFM-4101修饰的LPL311   +   0.983
  实施例27   实施例7   CHAPS   经过VFM-4101修饰的LPL311   -   0.986
  实施例28   实施例8   CHAPS   经过VFM-4101修饰的LPL311   +   0.984
  比较例5   比较例1   -   经过VFM-4101修饰的LPL311   -   0.013
  比较例6   比較例2   -   经过VFM-4101修饰的LPL311   +   0.008
  实施例29   实施例9   胆酸钠   LPL6(未修饰)   +   0.981
  实施例30   实施例10   胆酸钠   LPL6(未修饰)   -   0.774
  实施例31   实施例11   牛磺胆酸钠   LPL6(未修饰)   +   0.983
  实施例32   实施例12   牛磺胆酸钠   LPL6(未修饰)   -   0.726
  实施例33   实施例13   BIGCHAP   LPL6(未修饰)   -   0.968
  实施例34   实施例14   BIGCHAP   LPL6(未修饰)   +   0.991
  实施例35   实施例15   CHAPS   LPL6(未修饰)   -   0.977
  实施例36   实施例16   CHAPS   LPL6(未修饰)   +   0.994
  比较例7   比较例3   -   LPL6(未修饰)   -   0.414
  比较例8   比较例4   -   LPL6(未修饰)   +   0.462
  实施例37   实施例17   胆酸钠   经过VFM-4101修饰的CHE2   -   0.948
  实施例38   实施例18   胆酸钠   经过MEAC-50HS修饰的LPL311   -   0.960
  实施例39   实施例19   胆酸钠   经过AKM-1510修饰的LPL311   -   0.935
  实施例40   实施例20   胆酸钠   COE313   -   0.916
由实施例21～28的结果可知，如果是用经过化学修饰的胆固醇酯水解酶，则不管有无白蛋白，即使有胆酸、牛磺胆酸、BIGCHAP、CHAPS中任何一种胆汁酸衍生物存在，它们与DCM法测定均具有良好的相关性，而比较例5以及6的结果显示，在不存在胆汁酸衍生物的情况下，不管有无白蛋白，它们与DCM法测定都不具有良好的相关性。
另外，通过实施例29和实施例30、实施例31和实施例32、实施例33和实施例34、实施例35和实施例36的比较可知，胆固醇酯水解酶如果用的是未经修饰的酶，则在有胆酸或牛磺胆酸作为胆汁酸衍生物存在的条件下，加入白蛋白时的结果与DCM法测定的相关性要比不加白蛋白时的更好；而在有BIGCHAP或CHAPS作为胆汁酸衍生物存在的条件下，不管有无白蛋白，结果均与DCM法测定之间具有良好的相关性。
另外，比较实施例21和实施例37可知，即使采用除化学修饰LPL311以外的经过化学修饰的胆固醇酯水解酶进行测定，结果与DCM法测定之间也具有良好的相关性。再对实施例21和实施例38、实施例21和实施例39进行比较可知，即使是用除VFM-4101以外的修饰剂作为化学修饰剂配制后得到经过化学修饰的胆固醇酯水解酶，结果与DCM法测定之间也具有良好的相关性。比较实施例21和实施例40可知，即使经过化学修饰的胆固醇酯水解酶是采用市售产品，结果与DCM法测定之间也具有良好的相关性。
实施例41 胆酸酯[化合物(IIIa-1)]的合成
在装配好滴液装置、搅拌装置、温度计、冷凝管以及氮气导入管的烧瓶之中，加入聚乙二醇甲醚(平均分子量2000，Aldrich公司生产)110g(55mmol)、二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)6.7g(55mmol)以及二氯甲烷100mL，使其溶解。在此溶解液中加入胆酸(Mikuni化学产业公司生产)20.4g(50mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)10.5g(55mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，再加入二氯乙烷200mL、水300mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸200mL清洗，再用10％食盐水300mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯500mL，用10％食盐水300mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到白色蜡状固体的化合物(IIIa-1)115g(收率96％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.69(s，3H)，0.90(s，3H)，0.98(d，J＝6.0Hz，3H)，0.98-2.40(m，27H)，3.38(s，3H)，3.64(bs，179H)，3.97(s，2H)，4.22(m，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.5，17.3，22.5，23.2，26.4，27.5，28.3，30.4，30.8，31.1，34.7，35.2，35.3，39.5，39.6，41.5，41.7，46.4，47.0，59.0，63.4，68.2，69.1，70.5，70.9，71.7，71.9，72.9，174.2.IR(KBrDisk，cm-1)：2887，1734，1468，1343，1149，1111，1060，963，842.GPC(平均分子量)：Mw 2390(Mw/Mn1.05).
实施例42 胆酸酯[化合物(IIIa-2)]的合成
烧瓶内加入聚乙二醇甲醚(平均分子量400，日本油脂公司生产unioxM-400)4.8g(12mmol)、二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)1.46g(12mmol)以及二氯甲烷30mL，使其溶解。在此溶解液中加入胆酸(Mikuni化学产业公司生产)4.08g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)2.3g(12mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，再加入二氯乙烷20mL、水50mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯100mL，用10％食盐水100mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到无色油状物的化合物(IIIa-2)7.8g(收率95％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.68(s，3H)，0.89(s，3H)，0.98(d，J＝6.0Hz，3H)，0.98-2.31(m，27H)，3.38(s，3H)，3.45(bs，1H)，3.55(bs，2H)，3.65(bs，32H)，3.85(bs，1H)，3.96(bs，1H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.5，17.3，22.5，23.2，26.3，27.5，28.2，30.4，30.9，31.2，34.7，34.8，35.3，39.5，41.5，41.6，46.4，47.0，59.0，63.4，68.4，69.2，70.6，71.8，71.9，73.0，174.3.IR(KBrDisk，cm-1)：2931，2868，1734，1451，1375，1299，1251，1110，1111，1045，950，856.GPC(平均分子量)：Mw 820(Mw/Mn1.04).
实施例43 胆酸酯[化合物(IIIa-3)]的合成
烧瓶内加入聚乙二醇甲醚(平均分子量1000，日本油脂公司生产unioxM-1000)12g(12mmol)、二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)1.46g(12mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入胆酸(MikUni化学产业公司生产)4.08g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)2.3g(12mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，再加入二氯乙烷30mL、水50mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯200mL，用10％食盐水200mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到白色蜡状固体的化合物(IIIa-3)13.2g(收率95％)。
Figure A20038010077500651
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.68(s，3H)，0.89(s，3H)，0.98(d，J＝6.2Hz，3H)，0.98-2.45(m，27H)，3.38(s，3H)，3.46(bs，1H)，3.55(bs，2H)，3.64(bs，84H)，3.84(bs，1H)，3.96(bs，1H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.5，17.3，22.5，23.2，26.4，27.5，28.3，30.4，30.8，31.2，34.8，35.3，39.5，41.5，41.7，46.4，47.0，59.0，63.4，68.3，69.1，70.5，70.9，71.8，71.9，72.9，174.2.IR(KBr Disk，cm-1)：2870，1732，1466，1345，1112，950，844.GPC(平均分子量)：Mw 1430(Mw/Mn1.04).
实施例44 胆酸酯[化合物(IIIa-4)]的合成
烧瓶内加入聚乙二醇甲醚(平均分子量5000，Aldrich公司生产)55g(约11mmol)、二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)1.46g(12mmol)以及二氯甲烷100mL，使其溶解。在此溶解液中加入胆酸(MikUni化学产业公司生产)4.08g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)2.3g(12mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，再加入二氯乙烷50mL、水50mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯300mL，用10％食盐水300mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到白色蜡状固体的化合物(IIIa-4)48.5g(收率90％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.69(s，3H)，0.90(s，3H)，0.98(d，J＝6.2Hz，3H)，0.98-2.43(m，27H)，3.45(s，3H)，3.56(bs，473H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.5，17.2，22.5，23.1，26.4，27.4，28.3，30.4，30.8，31.0，34.6，34.7，35.1，35.3，39.5，39.6，41.5，41.6，46.3，46.8，58.9，59.0，61.4，63.3，67.9，69.0，69.6，70.2，70.5，70.7，71.0，71.3，71.5，71.8，72.5，174.0.IR(KBr Disk，cm-1)：2888，1734，1468，1343，1281，1112，963，842.GPC(平均分子量)：Mw 5370(Mw/Mn1.04).
实施例45 脱氧胆酸酯[化合物(IIIa-5)]的合成
烧瓶内加入聚乙二醇甲醚(平均分子量2000，Aldrich公司生产)22g(11mmol)、二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)1.34g(11mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入脱氧胆酸3.93g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)2.3g(12mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，加入二氯乙烷50mL、水50mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯200mL，用10％食盐水300mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到白色蜡状固体的化合物(IIIa-5)24.2g(收率99％)。
Figure A20038010077500671
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.68(s，3H)，0.91(s，3H)，0.98(d，J＝6.3Hz，3H)，0.98-2.45(m，28H)，3.38(s，3H)，3.47(bs，1H)，3.65(bs，178H)，3.80(bs，1H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.7，17.3，23.2，26.1，27.1，27.4，28.7，30.4，30.8，31.1，33.6，34.1，35.1，35.3，36.0，37.0，42.0，46.4，47.2，48.2，59.0，61.6，63.4，69.1，70.3，70.5，70.9，71.2，71.9，72.6，72.9，174.1.IR(KBr Disk，cm-1)：2889，1735，1468，1343，1281，1112，963，842.GPC(平均分子量)：Mw 2510(Mw/Mn1.08).
实施例46 熊脱氧胆酸酯[化合物(IIIa-6)]的合成
烧瓶内加入聚乙二醇甲醚(平均分子量2000，Aldrich公司生产)22g(11mmol)、二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)1.34g(11mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入熊脱氧胆酸3.93g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)2.3g(12mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，加入二氯乙烷50mL、水50mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯200mL，用10％食盐水300mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到白色蜡状固体的化合物(IIIa-6)23.7g(收率99％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.68(s，3H)，0.92(d，J＝6.3Hz，3H)，0.95(s，3H)，0.96-2.45(m，28H)，3.38(s，3H)，3.65(bs，180H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.1，18.4，23.4，26.9，28.5，30.3，30.9，31.1，34.0，35.0，35.2，37.1，37.3，39.1，40.1，42.4，43.7，54.9，55.8，59.0，61.6，63.3，69.1，70.3，70.5，70.8，71.0，71.1，71.9，72.5，174.0.IR(KBr Disk，cm-1)：2889，1736，1468，1343，1281，1112，963，842.GPC(平均分子量)：Mw 2530(Mw/Mn1.08).
实施例47 鹅脱氧胆酸酯[化合物(IIIa-7)]的合成
烧瓶内加入聚乙二醇甲醚(平均分子量2000，Aldrich公司生产)22g(11mmol)、二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)1.34g(11mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入鹅脱氧胆酸3.93g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)2.3g(12mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，加入二氯乙烷50mL、水50mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯200mL，用10％食盐水300mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到白色蜡状固体的化合物(IIIa-7)23.2g(收率97％)。
Figure A20038010077500691
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.66(s，3H)，0.91(s，3H)，0.92(d，J＝6.3Hz，3H)，0.92-2.43(m，28H)，3.38(s，3H)，3.64(bs，180H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：11.8，18.3，22.8，23.6，28.1，30.6，30.9，31.0，32.8，34.7，35.0，35.3，35.4，39.4，39.6，39.8，41.5，42.6，50.4，55.7，59.0，61.6，63.3，68.2，69.1，69.6，70.3，70.5，70.8，71.4，71.7，71.9，72.6，174.1.IR(KBr Disk，cm-1)：2889，1736，1468，1343，1281，1111，963，842.GPC(平均分子量)：Mw 2560(Mw/Mn1.09).
实施例48 石胆酸酯[化合物(IIIa-8)]的合成
烧瓶内加入聚乙二醇甲醚(平均分子量2000，Aldrich公司生产)22g(11mmol)、二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)1.34g(11mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入石胆酸3.77g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)2.3g(12mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，加入二氯乙烷50mL、水50mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯200mL，用10％食盐水300mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到白色蜡状固体的化合物(IIIa-8)23.3g(收率98％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.64(s，3H)，0.91(d，J＝6.3Hz，3H)，0.92(s，3H)，0.92-2.41(m，29H)，3.38(s，3H)，3.64(bs，179H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.0，18.3，20.8，23.4，24.2，26.4，27.2，28.1，30.5，30.9，31.1，34.5，35.3，35.4，35.8，36.4，40.1，40.4，42.0，42.7，55.9，56.4，59.0，61.6，63.3，69.1，69.7，70.3，70.5，70.6，70.7，70.8，71.1，71.5，71.9，72.6，174.1.IR(KBr Disk，cm-1)：2888，1736，1468，1343，1281，1111，963，842.GPC(平均分子量)：Mw 2640(Mw/Mn1.06).
实施例49 两末端胆酸酯[化合物(IIIb-1)]的合成
烧瓶内加入聚乙二醇(第一工业制药公司生产，PEG2000)10g(5mmol)、二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)2.68g(22mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入胆酸4.08g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)4.6g(24mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，加入二氯乙烷50mL、水50mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯200mL，用10％食盐水300mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到白色蜡状固体的化合物(IIIb-1)13.2g(收率94％)。
Figure A20038010077500711
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.68(s，6H)，0.90(s，6H)，0.99(d，J＝6.1Hz，6H)，0.92-2.67(m，54H)，3.65(bs，180H)，3.96(bs，2H)，4.22(bs，4H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.5，17.3，22.4，23.2，26.3，27.5，28.2，30.3，30.8，31.2，34.7，35.3，39.5，41.5，41.6，46.4，46.5，46.9，61.6，63.4，68.3，69.1，69.7，70.2，70.4，70.5，70.6，70.8，71.3，71.7，72.6，72.9，174.2.IR(KBr Disk，cm-1)：2885，1734，1468，1345，1281，1113，964，842.GPC(平均分子量)：Mw 2940(Mw/Mn1.05).
实施例50 胆酸酯[化合物(IIIa-9)]的合成
烧瓶内加入聚乙二醇(第一工业制药公司生产，PEG600)12g(20mmol)、二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)1.5g(12mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入胆酸4.08g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)2.3g(12mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，加入二氯乙烷50mL、水50mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯200mL，用10％食盐水300mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到白色蜡状固体的化合物(IIIa-9)7.7g(收率90％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.68(s，3H)，0.90(s，3H)，0.98(d，J＝6.1Hz，3H)，0.92-2.50(m，27H)，3.15(bs，1H)，3.44(bs，1H)，3.66(bs，54H)，3.84(bs，1H)，3.96(bs，1H)，4.23(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.5，17.3，22.5，23.2，26.3，27.5，28.2，30.3，30.8，31.2，34.7，34.8，35.3，35.4，39.5，41.5，46.4，47.0，61.5，63.4，68.3，69.1，69.7，70.2，70.5，71.8，72.6，73.0，174.3.IR(KBr Disk，cm-1)：3404，2929，2868，1732，1453，1352，1251，1103，951.GPC(平均分子量)：Mw 1050(Mw/Mn1.05).
实施例51 胆酰胺[化合物(IIIb-2)]的合成
烧瓶内加入聚氧乙烯二胺(平均分子量2000，川研精细化工公司生产PEO胺#2000)10g(5mmol)、4-二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)2.56g(21mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入胆酸4.08g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)4.6g(24mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，加入二氯乙烷50mL、水50mL进行提取。有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。然后，分离得到的有机层中加入乙酸乙酯200mL，用10％食盐水300mL清洗三次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到白色蜡状固体的化合物(IIIb-2)12.4g(收率88％)。
Figure A20038010077500731
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.68(s，6H)，0.89(s，6H)，0.99(d，J＝6.1Hz，6H)，1.12-2.28(m，48H)，2.72(bs，6H)，3.31(bs，2H)，3.34(bs，4H)，3.65(m，176H)，3.96(bs，4H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.5，17.4，22.5，23.3，26.3，27.6，28.1，29.1，30.3，31.7，33.2，34.8，35.4，37.5，39.4，41.5，46.3，46.5，68.3，69.7，70.1，70.2，70.5，70.8，71.7，73.0，174.1.IR(KBr Disk，cm-1)：3442，2912，2871，1648，1456，1352，1251，1107，952.GPC(平均分子量)：Mw 2990(Mw/Mn1.07).
实施例52 胆酰胺[化合物(IIIa-10)]的合成
烧瓶内加入聚氧乙烯二胺(平均分子量1000，川研精细化工公司生产PEO胺#1000)15g(15mmol)、4-二甲基氨基吡啶(广荣化学工业公司生产)1.46g(12mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入胆酸4.08g(10mmol)，接着再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的盐酸盐(Aibaitsu公司生产)2.3g(12mmol)。在充氮条件下室温搅拌12小时，加入二氯乙烷50mL、水50mL进行提取。分离得到的有机层用0.2mol/L的盐酸50mL清洗，再用10％食盐水50mL清洗二次。有机层用硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液用旋转式蒸发器浓缩。再用真空泵在80℃下减压干燥2小时，得到淡黄色粘稠状液体的化合物(IIIa-10)11.9g(收率86％)。
Figure A20038010077500741
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)：0.68(s，3H)，0.89(s，3H)，0.99(d，J＝7.7Hz，3H)，0.98-2.28(m，24H)，2.89(bs，3H)，3.29(bt，J＝6.0Hz，2H)，3.31(bt，J＝6.0Hz，2H)，3.53(bs，1H)，3.64(bs，84H)，3.83(bs，2H)，3.96(bs，2H)，4.22(s，2H)，7.28(bs，1H)，7.85(bs，2H). 13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)：12.5，17.3，17.4，22.4，23.3，26.3，26.5，27.6，28.1，29.1，30.3，31.7，33.1，34.7，34.8，35.4，37.3，39.2，39.5，41.6，46.3，46.5，68.2，69.3，69.4，69.6，70.0，70.1，70.2，70.3，70.4，，70.8，71.7，73.0，174.1.IR(KBr Neat，cm-1)：3372，2867，1648，1464，1350，1298，1251，1110，950.GPC(平均分子量)：Mw 1400(Mw/Mn1.06).
实施例53 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                        10mmol/L
EMSE                                0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                        10mmol/L
4-氨基安替比林                      0.3g/L
过氧化物酶                          20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                    0.2kU/L
COO321                              5.0kU/L
化合物(IIIa-1)                          6.0g/L
实施例54 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                            10mmol/L
EMSE                                    0.3g/L
化合物(IIIa-2)                          0.15g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                            10mmol/L
4-氨基安替比林                          0.3g/L
过氧化物酶                              20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                        0.2kU/L
COO321                                  5.0kU/L
实施例55 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                            10mmol/L
EMSE                                    0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                            10mmol/L
4-氨基安替比林                          0.3g/L
过氧化物酶                              20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                        0.2kU/L
COO321                                  5.0kU/L
化合物(IIIa-3)                          1.5g/L
实施例56 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                          10mmol/L
EMSE                                  0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                          10mmol/L
4-氨基安替比林                        0.3g/L
过氧化物酶                            20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                      0.2kU/L
COO321                                5.0kU/L
化合物(IIIb-2)                        1.0g/L
实施例57 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                          10mmol/L
EMSE                                  0.3g/L
化合物(IIIa-5)                        0.5g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                          10mmol/L
4-氨基安替比林                        0.3g/L
过氧化物酶                            20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                      0.2kU/L
COO321                                5.0kU/L
实施例58 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                          10mmol/L
EMSE                                  0.3g/L
BSA                                   2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                          10mmol/L
4-氨基安替比林                        0.3g/L
过氧化物酶                            20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过)
                                      0.2kU/L
COO321                                5.0kU/L
化合物(IIIa-1)                        6.0g/L
实施例59 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                          10mmol/L
EMSE                                  0.3g/L
硫酸葡聚糖钠(分子量50万)              1.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                          10mmol/L
4-氨基安替比林                        0.3g/L
过氧化物酶                            20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                      0.2kU/L
COO321                                5.0kU/L
化合物(IIIa-1)                        6.0g/L
实施例60 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                         10mmol/L
EMSE                                 0.3g/L
硫酸葡聚糖钠(分子量50万)             1.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                         10mmol/L
4-氨基安替比林                       0.3g/L
过氧化物酶                           20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                     0.2kU/L
COO321                               5.0kU/L
化合物(IIIb-2)                       1.0g/L
实施例61 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                         10mmol/L
EMSE                                 0.3g/L
硫酸葡聚糖钠(分子量50万)             1.0g/L
化合物(IIIa-2)                       0.15g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                         10mmol/L
4-氨基安替比林                       0.3g/L
过氧化物酶                           20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                     0.2kU/L
COO321                               5.0kU/L
实施例62 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                         10mmol/L
EMSE                                 0.3g/L
硫酸葡聚糖钠(分子量50万)             1.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                         10mmol/L
4-氨基安替比林                       0.3g/L
过氧化物酶                           20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                     0.2kU/L
COO321                               5.0kU/L
化合物(IIIa-3)                       1.5g/L
实施例63 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                         10mmol/L
EMSE                                 0.3g/L
BSA                                  2.0g/L
硫酸葡聚糖钠(分子量50万)             1.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                         10mmol/L
4-氨基安替比林                       0.3g/L
过氧化物酶                           20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                        0.2kU/L
COO321                                  5.0kU/L
化合物(IIIa-1)                          6.0g/L
实施例64 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                            10mmol/L
EMSE                                    0.3g/L
BSA                                     2.0g/L
硫酸葡聚糖钠(分子量50万)                1.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                            10mmol/L
4-氨基安替比林                          0.3g/L
过氧化物酶                              20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                        0.2kU/L
COO321                                  5.0kU/L
化合物(IIIb-2)                          1.0g/L
实施例65 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                            10mmol/L
EMSE                                    0.3g/L
BSA                                     2.0g/L
硫酸葡聚糖钠(分子量50万)                1.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                            10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                          0.2kU/L
COO321                                    5.0kU/L
化合物(IIIa-3)                            1.5g/L
比较例9 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                              10mmol/L
EMSE                                      0.3g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                          0.2kU/L
COO321                                    5.0kU/L
比较例10 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                              10mmol/L
EMSE                                      0.3g/L
BSA                                       2.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                          0.2kU/L
COO321                                    5.0kU/L
比较例11 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                              10mmol/L
EMSE                                      0.3g/L
硫酸葡聚糖钠(分子量50万)                  1.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                          0.2kU/L
COO321                                    5.0kU/L
比较例12 HDL胆固醇检测试剂盒
配制由以下第一试剂以及第二试剂组成的HDL胆固醇检测试剂盒。
· 第一试剂
HEPES(pH7.5)                              10mmol/L
EMSE                                      0.3g/L
BSA                                       2.0g/L
硫酸葡聚糖钠(分子量50万)                  1.0g/L
· 第二试剂
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                            20kU/L
化学修饰LPL311(用VFM-4101修饰过的)
                                      0.2kU/L
COO321                                5.0kU/L
实施例66 HDL胆固醇的测定
用实施例53的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的胆固醇。
实施例67 HDL胆固醇的测定
用实施例54的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例68 HDL胆固醇的测定
用实施例55的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例69 HDL胆固醇的测定
用实施例56的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例70 HDL胆固醇的测定
用实施例57的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例71 HDL胆固醇的测定
用实施例58的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例72 HDL胆固醇的测定
用实施例59的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例73 HDL胆固醇的测定
用实施例60的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例74 HDL胆固醇的测定
用实施例61的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例75 HDL胆固醇的测定
用实施例62的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例76 HDL胆固醇的测定
用实施例63的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例77 HDL胆固醇的测定
用实施例64的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
实施例78 HDL胆固醇的测定
用实施例65的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
比较例13 HDL胆固醇的测定
用比较例9的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
比较例14 HDL胆固醇的测定
用比较例10的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
比较例15 HDL胆固醇的测定
用比较例11的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。
比较例16 HDL胆固醇的测定
用比较例12的试剂盒代替实施例1的试剂盒，其他操作均与实施例21的检测方法相同，通过日立7170型自动分析装置测定人体血清的35个样本中的HDL胆固醇。另外，对实施例66～78以及比较例13～16的检测时所用的人体血清的35个样本，用DCM法测定这些样本中的HDL胆固醇，比较各种检测方法。实施例66～78以及比较例13～16的各种测定方法与基于DCM法的测定方法的相关系数如表2所示。
表2
  测定   试剂盒   胆汁酸衍生物   BSA   硫酸葡聚糖   相关系数
  实施例66   实施例53   化合物(IIIa-1)   -   -   0.983
  实施例67   实施例54   化合物(IIIa-2)   -   -   0.882
  实施例68   实施例55   化合物(IIIa-3)   -   -   0.967
  实施例69   实施例56   化合物(IIIb-2)   -   -   0.984
  实施例70   实施例57   化合物(IIIa-5)   -   -   0.985
  实施例71   实施例58   化合物(IIIa-1)   +   -   0.989
  实施例72   实施例59   化合物(IIIa-1)   -   +   0.987
  实施例73   实施例60   化合物(IIIb-2)   -   +   0.996
  实施例74   实施例61   化合物(IIIa-2)   -   +   0.962
  实施例75   实施例62   化合物(IIIa-3)   -   +   0.977
  实施例76   实施例63   化合物(IIIa-1)   +   +   0.990
  实施例77   实施例64   化合物(IIIb-2)   +   +   0.991
  实施例78   实施例65   化合物(IIIa-3)   +   +   0.990
  比较例13   比较例9   -   -   0.020
  比较例14   比较例10   +   -   0.429
  比较例15   比较例11   -   +   0.006
  比较例16   比较例12   +   +   0.451
由实施例66～70和比较例13可知，如果胆汁酸衍生物使用的是胆汁酸酯类或胆汁酸胺类，则结果与DCM法的测定具有良好的相关性。由实施例71和比较例14、实施例72～75和比较例15、实施例76～78和比较例16的结果比较可知，即使是在加入BSA或硫酸葡聚糖、或是两者都加的条件下，如果用胆汁酸酯类或胆汁酸胺类作为胆汁酸衍生物，则结果与DCM法的测定也还是具有良好的相关性。
实验例1各种胆汁酸衍生物(阴离子性表面活性剂、两性表面活性剂、非离子性表面活性剂)给胆固醇检测酶的稳定性带来的影响
配制下列组合1～8形成的试剂作为HDL胆固醇检测试剂盒的第二试剂，分别在40℃下保存48小时(2天)、120小时(5天)。对刚配制不久的组合1～8形成的各试剂、在40℃下保存2天后的各试剂以及在40℃下保存5天后的各试剂分别测定其中的胆固醇酯水解酶(LPL311)以及胆固醇氧化酶(COO321)的酶活性，求出保存后的各试剂中酶活性相对于刚配制不久的各试剂中酶活性的比率(酶活性残存率)(％)。
酶活性用以下方法求得。
(1)胆固醇酯水解酶活性测定法
检测试剂
0.15mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.2)
TRITON X-100                               2g/L
苯酚                                       0.15g/L
过氧化物酶                                 20kU/L
胆固醇氧化酶                               5kU/L
4-氨基安替比林                             0.2g/L
检测底物溶液
胆固醇亚油酸酯异丙醇溶液(6g/L)
操作方法
在石英池中加入检测试剂3mL，分别加入刚配制不久的由组合1～8形成的各试剂0.05mL。在37℃下孵育5分钟后，反应液中加入检测底物溶液0.1mL，再在37℃下孵育。分别测定加入检测底物溶液5分钟后以及6分钟后的反应液在500nm下的吸光度，通过这两个吸光度，计算出组合1～8形成的各试剂在500nm下每一分钟的吸光度变化量(ΔAbs/min)。另外，用蒸馏水代替组合1～8形成的各试剂，再进行同样的测定，计算出蒸馏水在500nm下每一分钟的吸光度变化量(ΔAbs/min)。组合1～8形成的各试剂在500nm下每一分钟的吸光度变化量(ΔAbs/min)减去蒸馏水在500nm下每一分钟的吸光度变化量(ΔAbs/min)，计算出的值(ΔAbs/min)作为胆固醇酯水解酶稳定性的指标。
用在40℃下保存2天后的组合1～8形成的各试剂以及在40℃下保存5天后的组合1～8形成的各试剂代替刚配制不久的组合1～8形成的各试剂，通过同样的一系列的操作进行测定，计算出各试剂的吸光度变化量(ΔAbs/min)。
(2)胆固醇氧化酶活性测定法
检测试剂
0.15mol/磷酸钾缓冲液(pH7.2)
Triton X-100                              2g/L
苯酚                                      0.15g/L
过氧化物酶                                20kU/L
4-氨基安替比林                            0.2g/L
检测底物溶液
胆固醇异丙醇溶液(5g/L)
操作方法
在石英池中加入检测试剂3mL，分别加入刚配制不久由组合1～8形成的各试剂用蒸馏水稀释6倍后的溶液0.05mL，在37℃下孵育5分钟后，反应液中加入检测底物溶液0.1mL，再在37℃下孵育。分别测定加入检测底物溶液5分钟后以及6分钟后的反应液在500nm下的吸光度，通过这两个吸光度，计算出成分1～8组成的各试剂在500nm下每一分钟的吸光度变化量(ΔAbs/min)。另外，用蒸馏水代替组合1～8形成的各试剂，再进行同样的测定，计算出蒸馏水在500nm下每一分钟的吸光度变化量(ΔAbs/min)。组合1～8形成的各试剂在500nm下每一分钟的吸光度变化量(ΔAbs/min)减去蒸馏水在500nm下每一分钟的吸光度变化量(ΔAbs/min)，计算出的值(ΔΔAbs/min)作为胆固醇氧化酶稳定性的指标。
用在40℃下保存2天后的组合1～8形成的各试剂以及在40℃下保存5天后的组合1～8形成的各试剂代替刚配制不久的组合1～8形成的各试剂，通过同样的一系列的操作进行测定，计算出各试剂的吸光度变化量(ΔAbs/min)。
组合1
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
二水氯化钙                                0.1g/L
化学修饰LPL311(用VFM4101修饰过的)         0.2kU/L
组合2
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
二水氯化钙                                0.1g/L
化学修饰LPL311(用VFM4101修饰过的)         0.2kU/L
胆酸钠                                    6.0g/L
组合3
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
二水氯化钙                                0.1g/L
化学修饰LPL311(用VFM4101修饰过的)         0.2kU/L
CHAPS                                     6.0g/L
组合4
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
二水氯化钙                                0.1g/L
化学修饰LPL311(用VFM4101修饰过的)         0.2kU/L
BIGCHAP                                   4.5g/L
组合5
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
二水氯化钙                                0.1g/L
化学修饰LPL311(用VFM4101修饰过的)         0.2kU/L
化合物(IIIa-1)                            6.0g/L
组合6
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
二水氯化钙                                0.1g/L
化学修饰LPL311(用VFM4101修饰过的)         0.2kU/L
化合物(IIIa-2)                            0.45g/L
组合7
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
二水氯化钙                                0.1g/L
化学修饰LPL311(用VFM4101修饰过的)         0.2kU/L
化合物(IIIa-3)                            4.5g/L
组合8
HEPES(pH7.0)                              10mmol/L
4-氨基安替比林                            0.3g/L
过氧化物酶                                20kU/L
二水氯化钙                                0.1g/L
化学修饰LPL311(用VFM4101修饰过的)         0.2kU/L
化合物(IIIb-2)                            1.0g/L
检测结果如表3所示。
                                        表3
组合 胆汁酸衍生物 酶   酶活性残存率(％)
  40℃2日   40℃5日
  1   未添加   LPL311   95.1   92.3
  2   胆酸   LPL311   81.6   73.9
  3   CHAPS   LPL311   72.3   59.6
  4   BIGCHAP   LPL311   90.1   82.4
  5   化合物(IIIa-1)   LPL311   91.4   82.3
  6   化合物(IIIa-2)   LPL311   94.4   89.1
  7   化合物(IIIa-3)   LPL311   93.6   85.3
  8   化合物(IIIb-2)   LPL311   93.2   86.7
  1   未添加   COO321   100.3   100.0
  2   胆酸   COO321   0   0
  3   CHAPS   COO321   79.8   62.0
  4   BIGCHAP   COO321   100.0   92.3
  5   化合物(IIIa-1)   COO321   94.9   81.5
  6   化合物(IIIa-2)   COO321   100.7   96.3
  7   化合物(IIIa-3)   COO321   100.6   96.4
  8   化合物(IIIb-2)   COO321   100.4   94.0
由表3可知，与含有阴离子性胆汁酸衍生物(具体来说有胆酸)以及两性胆汁酸衍生物(具体来说有CHAPS)作为胆汁酸衍生物的试剂相比，含有非离子性胆汁酸衍生物[具体来说有BIGCHAP、化合物(IIIa-1)、化合物(IIIa-2)、化合物(IIIa-3)以及化合物(IIIb-2)]-2)]的试剂中的胆固醇检测酶(具体来说有LPL311以及COO321)的稳定性更好。一般情况下，酶类在40℃等温度的高温下的保存稳定性可以反映出其在4℃或室温等温度下的保存稳定性。由此可见，本发明的高密度脂蛋白中胆固醇的检测方法以及检测试剂或试剂盒中，用具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物作为其中的胆汁酸衍生物的情况下，即使是经过长期保存的试剂，或是保存的环境温度有可能达到40℃的试剂，也可以更加准确地测定高密度脂蛋白中的胆固醇。
工业实用性
本发明可以提供能够简便准确地检测样本中高密度脂蛋白中的胆固醇的方法以及此方法所用的试剂，而且提供即使经过长期保存也可以保持酶活性稳定的用于检测高密度脂蛋白中胆固醇的试剂以及试剂盒。

Claims (41)

1.高密度脂蛋白中胆固醇的检测方法，其特征在于检测样本与胆固醇酯水解酶及胆固醇氧化酶，或是与胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶，在含有胆汁酸衍生物的水性介质中反应，测定生成的过氧化氢或还原性辅酶。
2.如权利要求1记载的方法，其中水性介质还含有白蛋白。
3.如权利要求1或2记载的方法，其中胆固醇酯水解酶是经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。
4.如权利要求3记载的方法，其中经过化学修饰的胆固醇酯水解酶表示胆固醇酯水解酶经过选自以聚乙二醇为主要成分的基团、以聚丙二醇为主要成分的基团、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基团中的基团的修饰。
5.如权利要求3记载的方法，其中经过化学修饰的胆固醇酯水解酶表示胆固醇酯水解酶经过以聚乙二醇为主要成分的基团的修饰。
6.如权利要求1～5任何一项记载的方法，其中胆汁酸衍生物表示具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
7.如权利要求6记载的方法，其中具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是指选自胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐以及脱氢胆酸或其盐中的胆汁酸衍生物。
8.如权利要求1～5任何一项记载的方法，其中胆汁酸衍生物是具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
9.如权利要求8记载的方法，其中具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物是指用下列通式(I)
      R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3 -        (I)
[式中，R1表示3-(3-胆胺丙基)二甲铵基，R2表示氢原子或羟基]表示的化合物。
10.如权利要求1～5任何一项记载的方法，其中胆汁酸衍生物是具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
11.如权利要求10记载的方法，其中具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物：
(X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者表示如下列通式(III)所示的化合物：
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基
Figure A2003801007750004C1
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之间的整数}。
12.高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂，其特征是含有胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸衍生物以及过氧化氢检测试剂。
13.高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂，其特征是含有胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶、胆汁酸衍生物以及氧化型辅酶。
14.如权利要求13记载的试剂，其中还含有还原型辅酶检测试剂
15.如权利要求12～14中任何一项记载的试剂，其中还含有白蛋白。
16.如权利要求12～15中任何一项记载的试剂，其中胆固醇酯水解酶是经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。
17.如权利要求16记载的试剂，其中经过化学修饰的胆固醇酯水解酶是经过选自以聚乙二醇为主要成分的基团、以聚丙二醇为主要成分的基团、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基团中的基团修饰的胆固醇酯水解酶。
18.如权利要求16记载的试剂，其中经过化学修饰的胆固醇酯水解酶是经过以聚乙二醇为主要成分的基团修饰的胆固醇酯水解酶。
19.如权利要求12～18中任何一项记载的试剂，其中胆汁酸衍生物是具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
20.如权利要求19记载的试剂，其中具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐以及脱氢胆酸或其盐中的任何胆汁酸衍生物。
22.如权利要求21记载的试剂，其中具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物是指如下列通式(I)表示的化合物：
        R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-        (I)
[式中，R1表示3-(3-胆胺丙基)二甲铵基，R2表示氢原子或羟基]。
23.如权利要求12～18中任何一项记载的试剂，其中胆汁酸衍生物是具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
24.如权利要求23记载的试剂，其中具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物：
Figure A2003801007750005C1
(X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者表示如下列通式(III)所示的化合物：
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1]所示的取代基，n表示3～400之间的整数}。
25.高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂盒，其特征是包括含有胆固醇酯水解酶的第一试剂以及含有胆固醇氧化酶的第二试剂，第一和第二试剂中的任何之一或二者中含有胆汁酸衍生物和过氧化氢检测试剂。
26.高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂盒，其特征是包括含有胆汁酸衍生物的第一试剂以及含有胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的第二试剂，第一和第二试剂中的任何之一或二者中含有过氧化氢检测试剂。
27.高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂盒，其特征是包括含有过氧化氢检测试剂的第一试剂以及含有胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的第二试剂，第一和第二试剂中的任何之一或二者中含有胆汁酸衍生物。
28.高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂盒，其特征是包括含有胆固醇酯水解酶的第一试剂以及含有胆固醇脱氢酶的第二试剂，第一和第二试剂中的任何之一或二者中含有胆汁酸衍生物以及氧化型辅酶。
29.高密度脂蛋白中胆固醇的检测试剂盒，其特征是包括含有胆汁酸衍生物的第一试剂以及含有胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶的第二试剂，第一和第二试剂中的任何之一或二者中含有氧化型辅酶。
30.如权利要求28或29记载的试剂盒，其中第一和第二试剂中的任何之一或二者中还含有还原型辅酶检测试剂。
31.如权利要求25～30中任何一项记载的试剂盒，其中第一和第二试剂中的任何之一或二者中还含有白蛋白。
32.如权利要求25～31中任何一项记载的试剂盒，其中胆固醇酯水解酶是经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。
33.如权利要求32记载的试剂盒，其中经过化学修饰的胆固醇酯水解酶是指经过选自以聚乙二醇为主要成分的基团、以聚丙二醇为主要成分的基团、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基团中的基团修饰的胆固醇酯水解酶。
34.如权利要求32记载的试剂盒，其中经过化学修饰的胆固醇酯水解酶是指经过以聚乙二醇为主要成分的基团修饰的胆固醇酯水解酶。
35.如权利要求25～34中任何一项记载的试剂盒，其中胆汁酸衍生物是具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
36.如权利要求35记载的试剂，其中具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物表示胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐以及脱氢胆酸或其盐中的胆汁酸衍生物。
37.如权利要求25～34中任何一项记载的试剂盒，其中胆汁酸衍生物是具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
38.如权利要求37记载的试剂盒，其中具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物是指如下列通式(I)表示的化合物：
         R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3 -        (I)
[式中，R1表示3-(3-胆胺丙基)二甲铵基，R2表示氢原子或羟基]。
39.如权利要求25～34中任何一项记载的试剂盒，其中胆汁酸衍生物是具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物。
40.如权利要求39记载的试剂盒，其中具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物：
(X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者表示如下列通式(III)所示的化合物：
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之间的整数}。
41.如下列通式(III)所示的化合物：
Figure A2003801007750009C1
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基：
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之间的整数}。
42.通式(III)所示的化合物的制备方法：
Figure A2003801007750009C3
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或如下列通式(IV)所示的取代基
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之间的整数}，是使如通式(V)表示的化合物
[式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氢原子、羟基或氧代(＝O)基，]
与如通式(VI)表示的化合物
(式中，W’表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基，n表示3～400之间的整数)，
或是如通式(VII)表示的化合物，在缩合剂存在下反应
Figure A2003801007750010C4
(式中，T表示取代或未取代氨基烷基，n表示3～400之间的整数)。
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