CN100343389C - 基因突变检出法 - Google Patents
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Abstract
在下列反应体系中依次进行DNA扩增和杂交,经亲和层析从反应液中检出杂交体。该反应体系包含用于DNA扩增的引物和杂交探针,用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记,杂交探针以第二标记物标记,并包含在进行DNA扩增的反应液中,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA扩增,通过亲和层析利用第一标记物和第二标记物可检出杂交体。
Description
技术领域
本发明涉及碱基序列的检出方法,具体涉及通过检出包括含点突变等突变部位的碱基序列的碱基序列来检出基因突变的方法。
背景技术
基因组中大量存在的基因多态性,一般认为与对疾病的易感性、药物代谢的个体差异等有深刻的关联性。这些基因多态性的检出对于所谓个性化(オ-ダ-メイド)医疗是必需的,被认为是基因组科学的临床应用的最重要研究课题之一。其中,作为基因多态性标记的SNP(单核苷酸多态性,由一个碱基取代而引起的基因多态性)最近忽然引入注目,国际上也投入了巨额的研究费用。另一方面,随着分子遗传学研究的进步,在数据库中开始贮存各种遗传疾病的基因突变。通过用它来筛选已明确是病因的已知基因突变,便可进行遗传病的论断和临床病型的预测。特别在特定群体内或超过人种高频度地存在基因突变的场合,其诊断价值很高。
在上述基因多态性和基因突变中,有碱基取代、缺失、插入、重复序列数的不同等,但其中占压倒多数的是一碱基取代的点突变。为将人基因组研究成果应用于临床领域,这种点突变的简便而快速的检出法是不可缺少的。
作为点突变的检出法,至今已提出了各种方法(参见Cotton RHG,MutationDetection,pp.1-198,Oxford Univesity Press,Oxford,1997)。代表性的方法可列举等位基因特异性寡核苷酸杂交法(ASO)、等位基因特异性扩增法、限制酶消化法、连接酶链反应、小序列法等。这些方法在DNA扩增后都必须进行杂交和电泳等繁杂的操作。另一方面,近年为适应人基因组分析研究而开发的TaqMan法、invader测定、DNA微阵列(NDA芯片)、用质谱仪的TOF-MASS法等,擅长于处理大量试样,但必须有昂贵的特殊专用设备,在临床检验室水平不容易实施。而作为基因突变的筛选法被广泛应用的SSCP法、化学切割法(Chemical cleavage)和DHPLC法在未知基因突变的初步筛选中可发挥威力,但不适合已知突变的确实检出。此外,用序列测定法检出点突变的操作复杂,成本又高,对已知突变的检出太过专业了。上述所有方法是目前在基因分析试验室中实施的特殊检查,其在鉴定现场(临床)中迅速实施是极为困难的。
作为ASO法使用的探针,以前是使用15~25mer(参见Saiki RK,Erlich HA.Dection of mutations by hybridization with sequence-specificoligonucleotide probes.In:Mutation Detection:A Practical Approach.pp.113~129,IRL Press,Oxford,1998)。有报道说,在杂交时使用与标记探针竞争的寡核苷酸可增强探针的特异性(参见Nozari G,Rahber S,Wallace RB.Discrimination among the transcripts of the alleic buman β-globin genesβA,βSandβcusing oligodeoxynucleotide hybridization probes.Gene 43:23-28,1986)。
发明的揭示
本发明的目的是提供简便而快速的基因突变检出法。
本发明者获知如果在特定条件下使用特定的引物和探针,则可在一个反应体系中进行核酸的扩增和杂交,而且杂交形成的杂交体容易被检出,根据这一发现,最终完成了本发明。
本发明提供以下各项技术内容。
(1)碱基序列的检测方法,具备用DNA聚合酶进行包括含突变部位的检出对象碱基序列的DNA的扩增的工序,使扩增的DNA和具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针杂交的工序,以及检出经杂交形成的杂交体的工序;
上述方法通过用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记,杂交探针以第二标记物标记,并包含在进行DNA扩增的反应液中,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA扩增,通过亲和层析利用第一标记物和第二标记物检出杂交体而实施。
(2)(1)所述的方法,突变部位是点突变,进行DNA扩增的反应液还含有足够量的具有在点突变的位置与标记的杂交探针的碱基序列有一个碱基不同的碱基序列、且未被标记的寡核苷酸,以提高扩增的DNA与标记的杂交探针的杂交特异性。
(3)(1)或(2)所述的方法,DNA扩增是通过PCR的扩增。
(4)试剂盒,包含用DNA聚合酶进行包括含突变部位的检出对象碱基序列的DNA的扩增所用的引物,具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针,以及亲和层析所用的试验片;
上述试剂盒是用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记,杂交探针以第二标记物标记,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA的扩增,试验片可利用第一标记物和第二标记物检出扩增的DNA和杂交探针的杂交体的试剂盒。
(5)(4)所述的试剂盒,突变部位是点突变,并且还包含具有在点突变的位置与标记的杂交探针的碱基序列有一个碱基不同的碱基序列、且未被标记的寡核苷酸。
(6)(4)或(5)所述的试剂盒,引物是PCR用引物。
附图的简单说明
图1是本发明检出法的原理(以正常DNA作试样时)的示意图。
图2是本发明检出法的原理(以突变DNA作试样时)的示意图。
图3是本发明的检出法的一例的操作示意图。
图4表示使用17mer的杂交探针时的检出结果(色谱照片)。
图5表示使用17mer的杂交探针、添加竞争探针时的检出结果(色谱照片)。
图6表示使用不同长度的杂交探针、添加竞争探针时的检出结果(色谱照片)。
图7表示使用12mer的杂交探针、添加竞争探针时的检出结果(色谱照片)。
图8表示涉及各种突变的检出结果(色谱照片)。
图9表示涉及各种突变的检出结果(色谱照片)。
实施发明的最佳方式
<1>本发明的检出法
本发明的检出法是具备用DNA聚合酶进行包括含突变部位的检出对象碱基序列的DNA的扩增的工序、使扩增的DNA和具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针杂交的工序、以及检出经杂交形成的杂交体的工序的碱基序列的检测方法;该方法的特征是,通过用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记,杂交探针以第二标记物标记,并包含在进行DNA扩增的反应液中,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA的扩增,通过亲和层析利用第一标记物和第二标记物检出杂交体而实施。以下对每一工序进行说明。
(1)DNA的扩增
DNA的扩增只要使用DNA聚合酶进行即可,没有特别限制,可采用包括用DNA聚合酶合成DNA的阶段的扩增方法。作为DNA扩增的方法的例子,可例举PCR法、TMA法、NASBA法、LAMP法等。
用DNA聚合酶合成DNA时,必需有引物。引物依赖扩增的方法和检出对象碱基序列,用公知的方法设定。本发明中,用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记。
例如,用PCR法进行扩增时,使用一对引物,通过标记其中至少一个,使扩增的DNA被标记。用NASBA法和TMA法进行时,通过标记在DNA合成阶段起作用的引物,用LAMP法时,通过标记至少一个内引物(inner primer),使扩增的DNA被标记。
进行引物的标记,应不抑制DNA的合成反应。这样的标记可按公知的方法进行,通常标记引物的5’末端。
用于标记的标记物,只要存在与其以生物特异性方式结合的物质即可。作为该标记物与对其能生物特异性结合的物质的组合,可列举抗原与抗体、酶与抑制剂、糖链与外源凝集素、激素与受体、金属结合蛋白与金属元素。具体可列举地高辛配体与抗地高辛配体抗体、生物素与链霉抗生物素蛋白等的组合。这样的组合中,任一个作标记物都可以,但通常用分子量小的一个作标记物。
所用的引物和DNA的扩增条件可根据所采用的扩增方法和检出对象序列适当确定。例如,PCR法可参照Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd ed.),Volume 2,Chapter 8,pp.8.1-8.126,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,2001,NASBA法可参照PCR Methods and Applications,1,25-33(1991),LAMP法可参照Nucleic Acids Research,Vol.28,No.12,pp.i-vii(2000)。
扩增时,作为模板的试样DNA可用通常的方法由检查试样调制。
检出对象序列可配合扩增方法适当选择,使包括突变部位的检出对象序列能特异地扩增。检出对象序列包括的突变部位通常是已知发生基因突变和基因多态性的部位。突变部位既可以是点突变,也可以是插入、缺失等突变。
作为本发明检出法的检出对象的基因突变和基因多态性的一般的例子,可列举糖原贮积病Ia型的日本人患者中高频度出现的g727t突变、中链酰基CoA脱氢酶缺乏症的白人患者中高频度出现的a985g突变(Lys329Glu突变)、高甘氨酸血症的芬兰人患者中高频度出现的GLDC基因的g1691t突变(Ser564Ile突变)、药物代谢酶基因CYP2C19中的基因多态性(CYP2C19*2,g681a)、决定乙醇代谢的个体差异的醛脱氢酶2的基因多态性(E487K)、囊性纤维化跨膜传导型调节蛋白基因的deltaF508缺失突变、泰-萨氏病(Tay-Sachs disease)的HEXA基因的1277insTATC插入突变、乳腺癌的BRCA1基因的5382insC插入突变、乳腺癌的BRCA2基因的6174delT缺失突变、血栓形成凝血第五因子基因的G1691A点突变等,本发明的检出法的检出对象并不限于这些例子。
糖原贮积病Ia型,由于糖原代谢途径中的葡萄糖-6-磷酸酶异常而发生,是主要在肝脏内贮积大量糖原的先天性糖代谢异常,采取常染色体隐性遗传的形式。可见低血糖、肝肿大、低身长、肾功能不全、高脂质血症、高尿酸血症等。该酶基因中的g727t突变是占日本人病例约90%病因突变的高频度突变,引起mRNA的剪接异常。直到最近,该病的诊断还用肝组织进行酶活性测定,由于基因论断的出现,就不需要肝活检了。该突变在日本人群体中的基因保持者数目约为200人中1人。
非酮体症型高甘氨酸血症因甘氨酸分解酶的异常而发生,是新生儿期出现痉挛等严重神经症状的先天性氨基酸代谢异常(常染色体隐性遗传)。芬兰人患者高频度(突变基因的约70%)出现甘氨酸分解酶中GLDC基因g1691突变。该突变引起氨基酸取代Ser564Ile。
中链酰基CoA脱氢酶缺乏症起因于脂肪酸β氧化途径中起重要作用的酶(Middle-chain acyl-CoA dehydrogenase,MCAD)的异常,是引起空腹、感染时低血糖、意识障碍的先天性有机酸代谢异常症(常染色体隐性遗传)。已知其常被误诊为婴幼儿猝死综合征和急性脑病(麻风综合征)。该酶基因中的a985g突变是占白人病例约90%病因突变的高频度突变,引起氨基酸取代Lys329Glu。该基因突变的基因保持者在白人群体中占高比率(英国为40人中1人)。在欧美,检查该a985g突变的基因诊断被广泛应用于该病的诊断。
CYP2C19基因对于奥美拉唑(胃酸分泌抑制剂)等的代谢起着重要作用。该基因上的SNP多态性的CYP2C19*2,通过外显子5的681G>A突变引起剪接异常,因而使这些药物的代谢活性下降。具有这样的多态性的人(弱代谢者),给药时必须减量,如能在给药前预先确定基因型,将对临床治疗有利。日本人群体中,发现基因的约23%是该基因多态性。
醛脱氢酶2的基因多态性(Glu487Lys)是日本人中较多出现的SNP,决定乙醇代谢的个体差异。具有基因多态性的酶活性低,由醇生成的乙醛的代谢慢,因此是“酒量低”的体质。日本人群体中约30%是该基因多态性的杂合子,约5%是纯合子。
(2)杂交
扩增的DNA和具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针的杂交,除了使用特定的杂交探针,可与通常的杂交同样进行。
本发明使用的杂交探针以第二标记物标记,并包含在进行DNA扩增的反应液中,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA的扩增。
第二标记物除了使用与第一标记物不同的物质之外,与对第一标记物说明的情况相同。杂交探针的标记可用公知的方法进行,使其不抑制杂交。杂交探针的标记较好是在3’末端进行,由此可防止DNA扩增反应中的寡核苷酸链长的伸长。链长伸长时,Tm值上升,即使有错配序列,也可能发生杂交。
将杂交探针的碱基序列设定成不抑制DNA的扩增,通常通过设计杂交探针的链长等使杂交探针的杂交在DNA扩增的条件下不会发生。
由于本发明使用的杂交探针的碱基序列被设定成不抑制DNA的扩增,可从最初即包含在进行DNA扩增的反应液中。因此,通过设定使扩增的DNA和杂交探针杂交的条件,可使DNA扩增结束后的反应液直接杂交。
杂交探针的链长和使其杂交时的条件可根据DNA扩增所用的方法适当确定。使用DNA聚合酶的DNA扩增,可在适于发挥DNA聚合酶活性的温度条件下进行扩增,可设定链长使该温度下不发生杂交。发生杂交的温度只要不抑制DNA扩增即可,没有特别的限制,较好是生成的杂交体在室温下不解离的温度。
作为确定碱基序列使之不抑制DNA扩增的条件,具体可列举设定成探针的Tm值与引物的Tm值相比要低25~40℃(较好为30~35℃)。
例如,如果考虑PCR法的通常的条件,探针通常是10mer~13mer。作为等位基因特异性寡核苷酸杂交法的探针,与以前用的15mer~25mer(参考非专利文献2)比较,是相当短的。在目前大多使用更长的链长的探针的背景中,存在着一种逻辑,即在整个基因组序列(30亿个碱基对)中,为通过4种碱基组合而制成具特异性的探针,至少必需有4的15次方种左右。然而,这是以整个基因组序列作对象进行杂交的场合,在以进行PCR扩增的数百个碱基的DNA片断作为靶的场合,考虑到不要求这样的长度和特异性,所以能充分维持杂交的特异性。
本发明的检出法用于检出任意的基因突变和多态性,所以必须使杂交探针具有最适的链长。这通过下列实施例所述的定型试验可确定。本发明的检出法,因为通常使用极短的探针,所以可发现由于一个碱基长度的差异引起的判定线形成的戏剧性的不同。看到假阳性出现或阳性反应微弱的场合,可制作比原来设计的探针短的探针或者长的探针,选择最合适的Tm值,这样较为理想。这时,正常碱基序列的探针和突变碱基序列的探针,即使链长相同,由于经碱基取代Tm值也不同,所以应分别独立地设计最适的链长。
杂交探针的碱基序列最好设计成突变部位在其中央附近。
杂交通常是使温度上升到双链DNA变性,然后慢慢降温而进行。因而可以只通过使DNA扩增已结束的反应液温度变化的操作来进行杂交而不需要其他操作。在用程序循环变温加热器进行DNA扩增的场合,除了DNA扩增必需的温度条件,通过对杂交的温度条件也设定程序,可在将试样安装在循环变温加热器中之后,作为一系列反应,进行扩增和杂交。
使用上述设计的短探针可得到以下的3个优点。1)与长探针比较,可增加出现一个碱基错配序列的场合和不出现的场合的Tm值之差,可相对地增加探针的特异性。2)探针的杂交温度以往为37~65℃,而本发明的检测方法中可设定为不到25℃,因此其后的一系列操作可在室温进行。3)短探针的Tm值低,PCR反应中不发生杂交,因此预先混合在PCR反应液中对PCR反应也不产生影响。由此不必在中途新增加试剂添加等操作,而使PCR→热变性→杂交作为一系列反应进行。这些优点即使在与PCR法同样利用DNA聚合酶的增长反应的其他DNA扩增法中也同样可以得到。
(3)杂交体的检出
通过杂交形成的杂交体有第一标记物和第二标记物两个标记物。杂交体的检出可利用第一标记物和第二标记物通过亲和层析进行。
亲和层析可用为此构成的试验片进行。利用两种标记物经亲和层析检出杂交体可按公知的方法进行,该方法中使用的试验片也可按通常的方法构成。
作为这种试验片的实例,可列举使结合有聚集时可见的标记物(如胶体金)的对第一标记物能特异性结合的物质与杂交体反应、在固定有对第二标记物能特异性结合的物质的层析载体上移动的试验片,可以观察在该固定部位上聚集的可见的标记物。这种试验片本身目前已用于简便地检出特定基因的方法等(J.Clin.Microbiol.38:2525-2529,2000)。
以下,以第一标记物为地高辛配体、第二标记物为生物素、聚集时可见的标记物为胶体金的场合为例说明具体的例子。层析载体条上在层析溶剂(通常是缓冲液)的移动方向依次设有浸渍层析溶剂而供给层析溶剂的浸渍部位、为使结合了胶体金的抗地高辛配体抗体可以游离而设置的保持该抗体(复合体)的垫片的复合体保持部位、含杂交体的反应液加样的试样加样部位、将链霉抗生物素蛋白垂直于层析溶剂移动方向以线状固定的链霉抗生物素蛋白固定部位、固定抗地高辛配体抗体的抗体的抗体固定部位及设置层析溶剂吸收垫片的吸收部位。以下对该例试验片的使用方法进行说明。将含杂交体的反应液在试样加样部位加样,在浸渍部位浸渍层析溶剂后,从层析溶剂中取出试验片静置。层析溶剂通过毛细现象在层析载体中移动,一达到复合体保持部位,含复合体的层析溶剂即发生移动。该层析溶剂如果到达试样加样部位,则加样的反应液中的杂交体存在的地高辛配体与复合体的抗地高辛配体抗体结合,形成具有胶体金的杂交体,通过层析介质进一步在层析载体上移动。杂交体如到达链霉抗生物素蛋白固定部位,由于生物素与链霉抗生物素蛋白结合,该杂交体聚集于链霉抗生物素蛋白固定部位,如有杂交体存在,便出现可见的信号。通过链霉抗生物素蛋白固定部位的复合体聚集于抗体固定部位,色谱出现显示正常进行的可见信号。进一步移动的层析溶剂被吸收、保持在吸收部位。
本发明的检出法中,突变部位是点突变的场合,为提高扩增的DNA与标记的杂交探针杂交的特异性,除了杂交探针之外最好在进行DNA扩增的反应液中还含有足够量的与标记的杂交探针的碱基序列在点突变的位置上有一个碱基不同的碱基序列并且未被标记的寡核苷酸(以下也称“竞争探针”)。
竞争探针除了与杂交探针在点突变的位置上有一个碱基不同之外,与杂交探针同样设计。竞争探针与杂交探针的长度可以不同。
为提高扩增的DNA与标记的杂交探针的杂交特异性,该足够的量随检出对象碱基序列、杂交探针的碱基序列等条件而变化,通常为杂交探针的等量~5倍量(摩尔比)基本可以。然而,阳性反应显著减弱时,在确认不出现假阳性反应时,有时省去竞争探针可得最佳结果。由于杂交探针的链长与竞争探针的有无对判定线的形成产生显著影响,一般认为较容易找出最佳反应条件。
杂交时加入非标记的竞争寡核苷酸,可增加杂交探针的特异性,抑制非特异性杂交。
本发明的检出法中,可使用用于检出正常碱基序列的杂交探针和用于检出突变碱基序列的杂交探针两者的标记不同的标记物,将用于检出正常碱基序列的反应体系与用于检出突变碱基序列的反应体系这两个反应体系合并为一个。即,对用于检出正常碱基序列的杂交探针与用于检出突变碱基序列的杂交探针进行不同的标记,以1∶1的比例混合,相互竞争可将反应体系合并成一个。反应后,用对各标记物特异结合的物质与聚集时可见的标记的复合体进行亲和层析,判定基因型。
本发明的检出法有如下优点。(1)广泛使用性:由于基于长年广泛用作检出法的等位基因特异性寡核苷酸杂交法,所以可对应检出点突变以及伴有插入、缺失等的碱基序列的广泛的突变。(2)快速性:自可用循环变温加热器实施的扩增和杂交的反应结束至判定基因型可在10分钟以内完成,通过使用毛细管型的PCR扩增装置进行核酸扩增,如果为DNA试样,则1小时以内所有工序能结束。(3)简便性:PCR反应后可用肉眼判定基因型,因而不必采用凝胶电泳装置和荧光检出装置等仪器。进行PCR的循环变温加热器是用于感染病检查等的广泛使用的临床检查装置,已被许多医院购置。反应操作简便,不需要特殊技能。在使用PCR以外的核酸扩增反应(TMA、NASBA、LAMP等)的场合,也可得到上述优点。
现以PCR为例,参照图1~3更详细地说明本发明的检出法的原理。
图1表示使用正常DNA作试样的场合的反应。反应体系1是添加了用于检出正常碱基序列的杂交探针的体系,反应体系2是添加了用于检出突变碱基序列的杂交探针的体系。图中黑圆圈表示正常碱基、黑三角表示突变碱,Dig表示的地高辛配体标记,B表示生物素标记,Gp表示金微粒。
首先,经PCR使含点突变位置的基因部位(检出对象序列)扩增。这时所用的一对PCR引物中的一个的5’端预先用地高辛配体标记。PCR反应液中,除了通常的成分之外,还加入2种寡核苷酸(杂交探针和竞争探针)混合。该寡核苷酸的组合中存在用于检出正常碱基序列的和用于检出突变碱基序列的2种。用于检出正常碱基序列的组合中,一个是在中央部具有正常碱基序列的点突变部位、并且3’端用生物素标记的寡核苷酸(正常探针),另一个是在中央部具有突变碱基序列的点突变部位的未标记的竞争寡核苷酸(突变探针)。用于检出突变碱基序列的组合中,一个是在中央部具有突变碱基序列的点突变部位、并且3’端用生物素标记的寡核苷酸(突变探针),另一个是在中央部具有正常碱基序列的点突变部位的未标记的竞争寡核苷酸(正常探针)。所有寡核苷酸都设计成与以地高辛配体标记的PCR引物为反向链。
PCR反应液的组成例如规定为试样DNA50~100ng、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、各为250μm的dNTP、1μMPCR正向引物(5’端以地高辛配体标记)、1μM PCR反向引物、600nM杂交探针(3’端以生物素标记)、3μM竞争的未标记寡核苷酸、1.25U Taq DNA聚合酶,反应液量定为20μl。PCR的条件例如设定为先于94℃加热2分钟,以98℃10秒-55℃30秒-72℃30秒的循环重复35次后,于72℃3分、98℃3份、65℃1分、55℃1分、45℃1分、35℃1分、25℃1分。重复循环后的该过程中,具有与以地高辛配体标记的PCR产物的碱基序列完全互补的碱基序列的寡核苷酸发生杂交。例如,对具有正常碱基序列的DNA组合用于检出正常碱基序列的寡核苷酸时,形成以地高辛配体标记的PCR产物和以生物素标记的寡核苷酸的杂交体(图1,反应体系1)。在DNA检出试验条(DNA Detection teststrip,ロシュ公司,#1-965-484)等的、固定有链霉抗生物素蛋白、保持胶体金标记的抗地高辛配体抗体可展开的亲和层析试验片的试样加样部位,取该溶剂5μl加样,将下端浸在缓冲液中5秒钟,并在室温中放置5分钟,使缓冲液展开,胶体金标记的抗地高辛配体抗体便结合于地高辛配体标记的PCR产物-生物素标记的寡核苷酸的杂交体,该杂交体进一步被固定于试验片的链霉抗生物素蛋白捕集,可由肉眼检出形成的红色线条。另一方面,对具正常碱基序列的DNA组合用于检出突变碱基序列的寡核苷酸组合的场合,形成以地高辛配体标记的PCR产物与未标记的寡核苷酸的杂交体。如果在试验片的试样加样部位取该溶液加样,以缓冲液展开,则胶体金标记的抗地高辛配体抗体便结合于地高辛配体的PCR产物-未标记的寡核苷酸的杂交体,但由于该杂交体不被试验片上的链霉抗生物素蛋白捕集,所以不形成红线(图1,反应体系2)。通过在上述2种反应体系中各自以肉眼观察红线的形成,可判定作为试样的DNA基因型。对具有突变碱基序列的DNA,也是同样的反应原理(图2)。
上述形式操作步骤示于图3。首先,将作为试样的DNA与反应试剂在PCR试管内混合,根据程序用循环变温加热器进行过热、冷却,进行DNA的扩增和杂交体的形成(步骤1)。取5μl反应液,在试验片的试样加样部位加样,将试验片的下端浸入缓冲液后,于室温放置(步骤2)。5分钟后根据基因型判定线的有无进行判定(步骤3)。根据对照线的有无可确认亲和层析是否正常结束。
本发明的检出法可迅速、简便、确实地判定基因突变的有无,且不使用特殊的装置,适合于医院进行门诊和临床的基因检查。即,可以护理目的进行基因诊断。具体来说,可判定以CYP2C19为代表的药物代谢酶的基因多态性、判定在该场合某药物对该患者是否适合、并对处方量的调整有用。这种情况下,在短时间内可得到检查结果是非常重要的优点。
<2>本发明的试剂盒
本发明的试剂盒是包含用DNA聚合酶进行包括含突变部位的检出对象碱基序列的DNA的扩增的引物、具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针及用于亲和层析的试验片的试剂盒;该试剂盒的特征在于,用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记使扩增的DNA被第一标记物标记,杂交探针以第二标记物标记,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA扩增,试验片利用第一标记物和第二标记物可检出扩增的DNA和杂交探针的杂交体。本发明的试剂盒可用于实施本发明的检出法。
引物、杂交探针和用于亲和层析的试验片的涉及本发明的检出法的说明如上所述。
本发明的试剂盒,在突变部位是点突变的场合,最好还包含具有与标记的杂交探针的碱基序列在点突变的位置有一个碱基不同的碱基序列、且未被标记的寡核苷酸(竞争探针)。该寡核苷酸的涉及本发明的检出法的说明如上所述。
实施例
以下列举实施例对本发明进行详细说明,但下述实施例仅为帮助具体认识本发明而列举,本发明的范围并不受其限制。
实施例1糖原贮积病Ia型g727t突变的检出
(1)反应体系和操作步骤
为了检出糖原贮积病Ia型g727t突变,根据突变部位的附近已知的碱基序列,制备表1所示的引物。
表1
用于糖原贮积病Ia型g727t突变检出用的引物和探针
PCR正向引物(G6P-E5-1F-Dig)
5’-Dig-CCCAAATCCTTCCTATCTCTCACAG-3’(序列编号1)
PCR反向引物(G6P-E5-1R(20))
5’-TGCTGGAGTTGAGAGCCAGC-3’(序列编号2)
此外,为了研究探针的链长,制备了表2所示的寡核苷酸作为杂交探针和竞争探针。
表2
1)用于检出正常碱基序列的生物素标记的寡核苷酸
17mer:5’-AAGCTGAACAGGAAGAA-Biotin-3’(序列编号3)
15mer:5’-AGCTGAACAGGAAGA-Biotin-3’(序列编号4)
13mer:5’-GCTGAACAGGAAG-Biotin-3’(序列编号5)
11mer:5’-CTGAACAGGAA-Biotin-3’(序列编号6)
2)用于检出正常碱基序列的未标记竞争寡核苷酸
17mer:5’-AAGCTGAAAAGGAAGAA-3’(序列编号7)
15mer:5’-AGCTGAAAAGGAAGA-3’(序列编号8)
13mer:5’-GCTGAAAAGGAAG-3’(序列编号9)
11mer:5’-CTGAAAAGGAA-3’(序列编号10)
3)用于检出突变碱基序列的生物素标记的寡核苷酸
17mer:5’-AAGCTGAAAAGGAAGAA-Biotin-3’(序列编号11)
15mer:5’-AGCTGAAAAGGAAGA-Biotin-3’(序列编号12)
13mer:5’-GCTGAAAAGGAAG-Biotin-3’(序列编号13)
11mer:5’-CTGAAAAGGAA-Biotin-3’(序列编号14)
4)用于检出突变碱基序列的未标记竞争寡核苷酸
17mer:5’-AAGCTGAACAGGAAGAA-3’(序列编号15)
15mer:5’-AGCTGAACAGGAAGA-3’(序列编号16)
13mer:5’-GCTGAACAGGAAG-3’(序列编号17)
11mer:5’-CTGAACAGGAA-3’(序列编号18)
PCR反应液的组成定为试样DNA 50~100ng、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、各为250μM的dNTP、1μM PCR正向引物、1μMPCR反向引物(5’端以地高辛配体标记)、600μM杂交探针(3’端以生物素标记)、规定浓度的竞争的未标记寡核苷酸、1.25U Taq DNA聚合酶,反应液量设定为20μl。PCR的条件设定为先于94℃加热2分钟,以98℃10秒-55℃30秒-72℃30秒的循环重复35次后,于72℃3分、98℃3分、65℃1分、55℃1分、45℃1分、35℃1分、25℃1分。
在试验片(DNA检出试验条,ロシュ公司,#1-965-484,固定有链霉抗生物素蛋白、保持胶体金标记的抗地高辛配体抗体可展开的亲和层析试验片)的试样加样部分,取上述溶液5μl加样,将下端浸入缓冲液5秒钟,于室温放置5分钟,使缓冲液展开。放置后以肉眼判定有无基因型判定线。
(2)对未标记的寡核苷酸竞争的研究
将标记的杂交探针设定为17mer,在反应液中不添加竞争探针进行检测。作为试样的DNA使用g727等位基因的纯合子(正常DNA)和t727等位基因的纯合子(突变DNA),采用用于检出正常碱基序列的探针和用于检出突变碱基序列的探针作为杂交探针。结果以图4表示。图中与DNA有关的Wt和Mut分别表示正常DNA和突变DNA,与杂交探针有关的Wt和Mut分别表示用于检出正常碱基和用于检出突变碱基序列(以下的图5~7同样如此)。
所有组合都出现假阳性,可见红色反应线,不能确定基因型(图4,1~4道)。
在反应液中添加杂交探针的5~50倍量(摩尔浓度)的竞争探针(17mer),同样进行实验。结果于图5表示。
通过添加竞争探针可使假阳性反应显著减少。即,在对正常DNA的用于检出突变碱基序列的探针的反应体系(图5,6~8道)中以及在对突变DNA的用于检出正常碱基序列的探针的反应体系(同上,10~12道)中,仅发现极弱的红色反应线。在所有添加量抑制假阳性反应的作用均未见差异,即使添加50倍量也不能完全抑制假阳性反应。另一方面,添加25~50倍量,可见抑制原来的阴性反应和反应线稍变弱的倾向(同上,3、4、15和16道)。
(3)杂交探针链长的研究
使用17mer、15mer、13mer、11mer作为杂交探针和竞争探针进行探讨。这里,将反应液中竞争探针的添加量固定为杂交探针的30倍。结果在图6中表示。
对应于正常DNA的用于检出突变碱基序列的探针的反应体系中,用15mer稍出现假阳性(图6,4道),用13mer和11mer时消失(同上,5及6道)。对应于突变DNA的用于检出正常碱基序列的探针的反应体系中,用15mer、13mer、11mer时假阳性均消失(同上,7~9道)。然而,用11mer时原来的阳性反应出现减弱的倾向(同上,3和12道)。
根据上述研究,将杂交探针和竞争探针的链长设定为12mer(表3)、竞争探针的添加量设定为5倍,以正常DNA(g727等位基因与t727等位基因的杂合子)、患者DNA(t727等位基因的纯合子)为对象,进行以上的检出。结果于图7表示。
得到与基因型完全一致的结果,观察到充分的阳性反应线(图7,1及4道,5及6道),另外,完全未发现假阳性(2及3道)。
表3
用于检出正常碱基序列的生物素标记的寡核苷酸(GSD727-ASO-W12-Bio)
5’-GCTGAACAGGAA-Biotin-3’(序列编号19)
用于检出正常碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸(GSD727-ASO-M12)
5’-GCTGAAAAGGAA-3’(序列编号20)
用于检出突变碱基序列的生物素标记的寡核苷酸(GSD727-ASO-M12-Bio)
5’-GCTGAAAAGGAA-Biotin-3’(序列编号21)
用于检出突变碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸(GSD727-ASO-W12)
5’-GCTGAACAGGAA-3’(序列编号22)
实施例2中链酰基CoA脱氢酶缺乏症的a985g突变、高甘氨酸血症GLDC基因的g1691t突变、药物代谢酶基因CYP2C19的g681a、醛脱氢酶2的Glu487Lys多态性的点突变的检出
用本发明的检出法进行下列点突变的检出,即,中链酰基CoA脱氢酶缺乏症的a985g突变、高甘氨酸血症GLDC基因的g1691t突变、药物代谢酶基因CYP2C19的g681a、醛脱氢酶2的Glu487Lys多态性的点突变。
对包含各点突变的存在部位的碱基序列进行扩增的PCR引物调节链长,在PCR反应时的退火温度为55℃时进行扩增。此外,将杂交探针设计成Tm为35~40℃。其结果是,链长为10mer~15mer。表4表示引物、杂交探针和竞争探针的碱基序列。
表4
1)用于检出中链酰基CoA脱氢酶缺乏症基因a985g突变的引物和探针
PCR正向引物(Dig-MCAD-F1):
5’-Dig-CTTTTTAATTCTAGCACCAAGCAATATC-3’(序列编号23)
PCR反向引物(Dig-MCAD-R1):
5’-Dig-TCCAAGTATCTGCACAGCAT-3’(序列编号24)
用于检出正常碱基序列的生物素标记的寡核苷酸(Bio-MCAD985-W13)
5’-GCAATGAAAGTTG-Biotin-3’(序列编号25)
用于检出正常碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸(MCAD985-M13)
5’-GCAATGGAAGTTG-3’(序列编号26)
用于检出突变碱基序列的生物素标记的寡核苷酸(Bio-MCAD985-M12)
5’-AACTTCCATTGC-Biotin-3’(序列编号27)
用于检出突变碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸(MCAD985-W12)
5’-AACTTTCATTGC-3’(序列编号28)
2)用于检出GLDC基因g1691t突变的引物和探针
PCR正向引物(Dig-GLDC-F)
5’-Dig-GTCTCTTGGTCCTACCTAATA-3’(序列编号29)
PCR反向引物(GLDC-R)
5’-TTAGTGAAGCTAGAACACTG-3’(序列编号30)
用于检出正常碱基序列的生物素标记的聚核苷酸(Bio-S564I-W13)
5’-GACGAACTGTTCA-Biotin-3’(序列编号31)
用于检出正常碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸(S564I-M13)
5’-GACGAAATGTTCA-3’(序列编号32)
用于检出突变碱基序列的生物素标记的寡核苷酸(Bio-S564I-M)
5’-GACGAAATGTTCA-Biotin-3’(序列编号33)
用于检出突变碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸(S564I-W)
5’-GACGAACTGTTCA-3’(序列编号34)
3)用于检出CYP2C19基因CYP2C19*2多态性的引物和探针
PCR正向引物(CYP2C19-P1)
5’-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3’(序列编号35)
PCR反向引物(Dig-CYP2C19-P2)
5’-Dig-AATATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3’(序列编号36)
用于检出正常碱基序列的生物素标记的寡核苷酸(Bio-CYP2C19-W)
5’-TCCCGGGAAC-Biotin-3’(序列编号37)
用于检出正常碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸(CYP2C19-M)
5’-TTCCCAGGAAC-3’(序列编号38)
用于检出多态性碱基序列的生物素标记的寡核苷酸(Bio-CYP2C19-M)
5’-TTCCCAGGAAC-Biotin-3’(序列编号39)
用于检出多态性碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸(CYP2C19-W)
5’-TCCCGGGAAC-3’(序列编号40)
4)用于检出醛脱氢酶2基因多态性的引物和探针
PCR正向引物(Dig-ALDH2-AF)
5’-Dig-CAAATTACAGGGTCAACTGCTATGA-3’(序列编号41)
PCR反向产物(Dig-ALDH2-AR2)
5’-Dig-AGCAGGTCCTGAACTTCCAGCAG-3’(序列编号42)
用于检出正常碱基序列的生物素标记的寡核苷酸(Bio-ALDH2-PW2)
5’-Biotin-ATACACTGAAGTGA-Biotin-3’(序列编号43)
用于检出正常碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸(ALDH2-CM2)
5’-ATACACTAAAGTGA-3’(序列编号44)
用于检出多态性碱基序列的生物素标记的寡核苷酸(Bio-ALDH2-PM2)
5’-Biotin-ATACACTAAAGTGAA-Biotin-3’(序列编号45)
用于检出多态性碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸(ALDH2-CW2)
5’-ATACACTGAAGTGAA-3’(序列编号46)
除使用上述引物和探针之外的PCR条件和探针浓度等条件,在检出上述所有突变时均与实施例1相同。
在这些条件下进行检出,在所有检出体系中均可正确地判定基因型(图8的a、b、c和d)。在检出醛脱氢酶2的Glu487Lys多态性时,在检出突变碱基序列的反应体系中,因为反应线淡,所以在反应体系中不混合竞争的未标记寡核苷酸,观察充分反应线的形成。所有反应中均未发现假阳性。
循环变温加热器中的反应结束后到判定基因型需要的时间在10分钟以内。此外,直接使该试验片干燥后在室温保存的场合,至少在2年后仍可由肉眼进行判定。
由以上结果表明,采用本发明的检出法,虽必须根据各个基因突变调整引物和杂交探针以及竞争探针的设计和反应条件,但可简便、迅速地检出5个基因的各种突变和多态性,确定试样DNA的基因型。因此认为本发明的检出法具有广泛使用性。
实施例3囊性纤维化跨膜传导型调节蛋白基因的delta F508缺失突变、泰-萨氏病的HEXA基因的1277insTATC插入突变、乳腺癌的BRCA1基因的5382insC插入突变、乳腺癌的BRCA2基因的6174delT缺失突变、血栓形成凝血第五因子基因的G1691A点突变的检出
用本发明的检出法,对囊性纤维化跨膜传导型调节蛋白基因的delta F508缺失突变、泰-萨氏病的HEXA基因的1277insTATC插入突变、乳腺癌的BRCA1基因的5382insC插入突变、乳腺癌的BRCA2基因的6174delT缺失突变、血栓形成凝血第五因子基因的G1691A点突变进行突变的检出。
对包含各突变的存在部位的碱基序列进行扩增的PCR引物调节链长,在PCR反应时的退火温度为55℃时进行扩增。此外,将杂交探针设计成Tm为35~40℃。其结果是,链长为10mer~15mer。表5表示引物、杂交探针和竞争探针的碱基序列。1)~4)都是碱基缺失或插入的突变,不使用竞争探针。3)~5)即使杂合子也显示症状,因此临床上不必检查有无具有正常碱基序列的基因,所以不使用用于检出正常碱基序列的探针。
表5
1)用于检出囊性纤维化跨膜传导型调节蛋白基因的deltaF508缺失突变的引物和探针
PCR正向引物
5’-ATTATGCCTGGCACCATTAAAG-3’(序列编号47)
PCR反向引物
5’-Dig-CATTCACAGTAGCTTACCCA-3’(序列编号48)
用于检出正常碱基序列的生物素标记的寡核苷酸
5’-AATATCATTGGTGTT-Biotin-3’(序列编号49)
用于检出突变碱基序列的生物素标记的寡核苷酸
5’-TATCATCTTTGGTG-Biotin-3’(序列编号50)
2)用于检出泰-萨氏病的HEXA基因的1277insTATC插入突变的引物和探针
PCR正向引物
5’-CCAGGAATCTCCTCAGCTTTGTGT-3’(序列编号51)
PCR反向引物
5’-Dig-AGCCTCCTTTGGTTAGCAAGG-3’(序列编号52)
用于检出正常碱基序列的生物素标记的寡核苷酸
5’-TATATCTATCCTATG-Biotin-3’(序列编号53)
用于检出突变碱基序列的生物素标记的寡核苷酸
5’-GTATATCCTATGG-Biotin-3’(序列编号54)
3)用于检出乳腺癌的BRCA1基因的5382insC插入突变的引物和探针
PCR正向引物
5’-CTTTCAGCATGATTTTGAAGTC-3’(序列编号55)
PCR反向引物
5’-Dig-GGGAGTGGAATACAGAGTGG-3’(序列编号56)
用于检出突变碱基序列的生物素标记的寡核苷酸
5’-AGAATCCCCAGGA-Biotin-3’(序列编号57)
4)用于检出乳腺癌的BRCA2基因的6174delT缺失突变的引物和探针
PCR正向引物
5’-GATGAATGTAGCACGCATTC-3’(序列编号58)
PCR反向引物
5’-Dig-TCTTGTGAGCTGGTCTGAA-3’(序列编号59)
用于检出突变碱基序列的生物素标记的寡核苷酸
5’-ACAGCAAGGGAAAAT-Biotin-3’(序列编号60)
5)用于检出血栓形成凝血第五因子基因的G1691A突变的引物和探针
PCR正向引物
5’-GGTTCCAAGTAGAATATTTAAAGAA-3’(序列编号61)
PCR反向引物
5’-Dig-CCATTATTTAGCCAGGAGACCT-3’(序列编号62)
用于检出突变碱基序列的生物素标记的寡核苷酸
5’-ACAGGCAAGGAA-Biotin-3’(序列编号63)
用于检出突变碱基序列的未标记的竞争寡核苷酸
5’-ACAGGCGAGGAA-3’(序列编号64)
除使用上述引物和探针之外的PCR条件和探针浓度等条件,在检出上述所有突变时均与实施例1相同。
在这些条件下进行检出,在所有检出体系中均可正确地判定基因型(图9)。所有反应中均未发现假阳性。
循环变温加热器中的反应结束后到判定基因型需要的时间在10分钟以内。此外,直接使该试验片干燥后在室温保存的场合,至少在2年后仍可由肉眼进行判定。
由以上结果表明,用本发明的检出法,虽必须根据各个基因突变调整引物和杂交探针以及竞争探针的设计和反应条件,但可简便、迅速地检出包括插入、缺失突变在内的变异,能够确定试样DNA的基因型。因此认为本发明的检出法具有广泛使用性。
产业上利用的可能性
根据本发明,可不用通常的循环变温加热器以外的特殊仪器和装置而简便、迅速、准确地鉴定致病基因突变,以及检出疾病相关基因和药物代谢酶基因的多态性。本发明的检出法可认为是能在临床进行检定使个性化医疗变得容易的方法。
序列表
<110>松原洋-(Yoichi Matsubara)
吴繁夫(Shigeo Kure)
株式会社三菱化学生物临床实验室(Mitsubishi Kagaku Bio-ClinicalLaboratories,Inc.)
<120>基因突变检出法
<130>OP1675-PCT
<150>JP 2002-323419
<151>2002-11-07
<160>64
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
cccaaatcct tcctatctct cacag 25
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
tgctggagtt gagagccagc 20
<210>3
<211>17
<212>DNA
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<220>
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<400>3
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<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>4
agctgaacag gaaga 15
<210>5
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>5
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<210>6
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>6
ctgaacagga a 11
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>7
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<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>8
agctgaaaag gaaga 15
<210>9
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<210>10
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>10
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>12
agctgaaaag gaaga 15
<210>13
<211>13
<212>DNA
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<223>探针
<400>13
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<210>14
<211>11
<212>DNA
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<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>12
<212>DNA
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<220>
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<210>21
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>12
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<213>人工序列
<220>
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gctgaacagg aa 12
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<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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ctttttaatt ctagcaccaa gcaatatc 28
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
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<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>13
<212>DNA
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<210>27
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>27
aacttccatt gc 12
<210>28
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>28
aactttcatt gc 12
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
gtctcttggt cctacctaat a 21
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>30
ttagtgaagc tagaacactg 20
<210>31
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>31
gacgaactgt tca 13
<210>32
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>32
gacgaaatgt tca 13
<210>33
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acaggcgagg aa 12
Claims (6)
1.碱基序列的检测方法,具备用DNA聚合酶进行包括含突变部位的检出对象碱基序列的DNA的扩增的工序,使扩增的DNA和具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针杂交的工序,以及检出经杂交形成的杂交体的工序;其特征在于,上述方法通过用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记,杂交探针以第二标记物标记,并包含在进行DNA扩增的反应液中,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA扩增,通过亲和层析利用第一标记物和第二标记物检出杂交体而实施。
2.如权利要求1所述的方法,其特征还在于,突变部位是点突变,进行DNA扩增的反应液还含有足够量的具有在点突变的位置与标记的杂交探针的碱基序列有一个碱基不同的碱基序列、且未被标记的寡核苷酸,以提高扩增的DNA与标记的杂交探针的杂交特异性。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征还在于,DNA的扩增是通过PCR的扩增。
4.试剂盒,包含用DNA聚合酶进行包括含突变部位的检出对象碱基序列的DNA的扩增所用的引物,具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针,以及亲和层析用试验片;其特征在于,上述试剂盒是用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记,杂交探针以第二标记物标记,杂交探针碱基序列的设定使其不抑制DNA的扩增,试验片可利用第一标记物和第二标记物检出扩增的DNA和杂交探针的杂交体的试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征还在于,突变部位是点突变,并且还包含具有在点突变的位置与标记的杂交探针的碱基序列有一个碱基不同的碱基序列、且未被标记的寡核苷酸。
6.如权利要求4或5所述的试剂盒,其特征还在于,引物是PCR用引物。
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