CN104531883B - Pkd1基因突变的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
Pkd1基因突变的检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104531883B CN104531883B CN201510017500.0A CN201510017500A CN104531883B CN 104531883 B CN104531883 B CN 104531883B CN 201510017500 A CN201510017500 A CN 201510017500A CN 104531883 B CN104531883 B CN 104531883B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pkd1
- site
- pseudogene
- gene
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了用于通过长片段PCR和高通量测序技术检测PKD1基因突变的引物组、试剂盒和检测反应体系;用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法、用于非诊断目的的体外PKD1基因分析方法和检测PKD1基因上的新突变位点的方法,所述方法通过使用该引物组对样品的PKD1基因进行长片段PCR扩增并进行高通量测序来进行检测或分析。本发明的检测结果不仅可以辅助诊断常染色体显性遗传性多囊肾病(即成人多囊肾病),还可以获得多个PKD1真基因上的之前未知的新突变,并将其提供给医生或研究者以对这些突变与成人多囊肾病之间的关联性进行研究。
Description
技术领域
本发明涉及医学分子生物学检测技术领域,尤其涉及用于检测遗传性多囊肾病相关的PKD1基因突变的引物组、试剂盒以及使用该引物组和试剂盒检测PKD1基因突变的方法。
背景技术
1.疾病及基因背景
常染色体显性遗传性多囊肾病(adult polycystic kidney disease,APKD,又称成人多囊肾病)是一种常见的先天遗传疾病,成人多囊肾病常于青中年时期被发现,也可在任何年龄发病,为常见的遗传性多发性囊肿性肾病,发病率约为1/1,000-1/400,约占末期肾脏病的5%。该疾病于中年时期在肾脏会慢慢形成囊肿及肿大,最后导致肾衰竭。常染色体显性多囊肾的诊断主要依靠影像学或分子遗传学检测来明确。对于影像学检测,在年龄30岁以上的患者或PKD1突变的年轻患者,检测的敏感度接近100%;而在30岁以下的PKD2突变年轻患者,检查的敏感度仅有67%。婴儿或者儿童在影像学检查中没有看到明显的囊肿。常染色体显性多囊肾患者虽然在胎儿时期和/或出生时就已经发生基因突变,但却在以后的生活中才出现多囊肾病的表现,许多患者在30岁前常因B超结果表现正常而漏诊。因此,连锁分析或直接突变筛查等分子遗传检测有临床价值,通过基因检测提早诊断成人多囊肾病成为新的研究热点之一。此外,对胎儿的多囊肾病产前基因筛查还可以进行早期诊断,有助于早期处理并发症。
可能存在3种基因引起成人多囊肾病,按发现先后分别命名为PKD1、PKD2、PKD3,其中PKD1及PKD2基因已被克隆,成人多囊肾病基因突变后,引起多囊蛋白结构和功能异常,继而导致囊肿发生及进行性长大。PKD1是造成成人多囊肾的最主要病因,约占85%,且症状严重,而PKD2基因仅占10-15%,且症状较轻,基因外显子较少且无特殊结构,此处不做探讨。PKD1基因定位于16p13.3-p13.12,长52kb,含46个外显子,其中外显子1-34为多拷贝区,外显子35-46为单拷贝区,分别占基因70%和30%的区域,蛋白质产物由4302个氨基酸残基构成的一种糖蛋白,称为多囊蛋白-1。
到目前为止,全世界已发现的PKD1基因突变位点有868个[该数据源于PKDB数据库201405版本,网址http://pkdb.mayo.edu/],统计发现PKD1基因突变没有明显的热点区域,而且该数据库多为非中国人群突变,因此有大量中国人群特有的突变尚未发现,为了提高对成人多囊肾病的诊断并进一步研究PKD1基因突变与成人多囊肾病的关系,除了利用已知的PKD1基因突变位点辅助诊断之外,还需要尽可能找出PKD1基因上之前未知的基因突变,供医师和研究者研究这些突变与疾病之间的关联性。
PKD1基因中80%以上的突变均在占基因70%区域的多拷贝区,在染色体其它部位还存在6个PKD1基因的同源序列区,均为同源性高达97.8%的假基因,严重干扰PKD1真基因的检测。为了获得真基因特异的突变,避免把假基因上的差异位点误判为真基因上的致病突变,需要得到真基因的特异序列,因此在真基因与假基因序列有差异的位置设计真基因特异的引物,但由于假基因相似性太高,且假基因数量多,导致可供设计特异引物位置很少,距离远,因此需要进行5000bp甚至更长的长片段PCR。
长片段PCR是指扩增长度大于3kb的PCR,与一般的短片段PCR的区别在于,其受DNA模板的二级结构、引物的特异性和退火温度、以及不理想的循环条件等因素的影响远大于短片段扩增,导致其扩增难度大,特别是在长片段的PCR扩增中,常常会发生DNA脱嘌呤作用,而模板DNA上的一个单独的损害就足以使PCR酶反应停顿,导致反应失败,因此扩增稳定性很低,条件摸索非常困难,对于特定的引物和模板需要小心选择反应体系以使得能够稳定进行长片段PCR反应。在PKD1的长片段PCR中由于引物必须选择真假基因差异位点上,而且要求是尽量靠近引物3,末端才能提高扩增真基因特异性,因此引物设计受到非常大的限制,可选择的余地非常少,只能通过调整扩增体系及反应条件来提高扩增成功率,因此反应条件的优化至关重要。每个长片段PCR可能都有自己特异的扩增条件,目前国内外针对PKD1长片段扩增的文献中均用到至少三种以上的反应条件来才能完成PKD1所有长片段PCR,由于每个条件需要用到一台PCR仪,每进行一次长片段PCR都需要七到十个小时,因此需要大量的PCR仪同时进行,或者需要大量的时间来轮换进行,加上实验的不稳定性,因此需要耗费大量的人力物力和时间,效率低下,难以大规模的应用。
长片段PCR扩增完成后,传统的方案都是通过Sanger法进行测序,该方法被认为是测序的金标准,但在进行PKD1检测时有较大的局限性,即一次的测序长度小于800bp,因此需要先采用巢式PCR扩增出目的外显子,再进行Sanger法测序获取目标序列。但由于PKD1基因过长,外显子多达46个,因此进行巢式PCR的次数和测序的次数过多,成本高,且效率较低。虽然近年来开发出初筛方案,即巢式PCR产物先经过SSCP技术或DHPLC技术进行初筛,这两种技术能够降低成本,快速的检测出是否存在突变,再对存在突变的区域用Sanger法测序确认突变。但是由于技术本身原理所致,准确性不高,有较高的漏检率。而且由于无法分辨基因中的多态,因此需要进行Sanger法测序的数量也不少。因此效率和准确性仍然是局限应用范围的最大原因。
Adrian Y.Tan等的方法(参见Adrian Y.Tan et al.,Molecular diagnosis ofautosomal dominant polycystic kidney disease using next-generationsequencing,The Journal of Molecular Diagnostics,2014,Vol.16,No.2,pp216-228;以下称Adrian Y.Tan等的方法)公开了一种通过高通量测序对常染色体显性多囊肾病进行分子诊断的方法,其中采用长片段PCR结合高通量测序的方法检测PKD1基因整个外显子编码区,剪接位点区域及大部分5,和3,侧翼区的基因序列上的突变。但是,本申请人发现,在该文章公开的方法中,部分引物长片段扩增后仍不能有效排除假基因的干扰,且引物稳定性仍然不理想,而且需要经过3次PCR反应条件之后才能完成整个基因的扩增,用时较长,效率较低。该方法采用的是Illumina Miseq测序仪进行检测,该测序仪需要5到10天才能测序完成,效率较低。而且,由于PKD1基因1号外显子序列的GC含量大于85%,导致1号外显子测序质量较差。
因此,本领域仍然需要对PKD1基因突变进行更高效、准确的检测。
发明内容
本发明利用PKD1基因及其6个假基因的的序列比对的保守信息设计特异性引物,采用统一的扩增反应条件,进行长片段PCR扩增出PKD1基因的特异性片段产物,将扩增产物酶切打断后富集建库,并进行高通量测序,获得除外显子1之外的全部外显子及大部分内含子的全部序列,随后通过生物信息学分析排除假基因位点干扰,获得PKD1真基因的突变,并确保检测的特异性。
由于PKD1基因1号外显子序列的GC含量大于85%,而对于GC含量较高的区域进行高通量测序时,要达到理想测序质量仍然是目前的测序难题,利用目前可商购获得的两个主要平台Life Technology Ion torrent PGM/Proton和Illumina Hiseq/Miseq进行高通量测序也均无法准确检测。因此1号外显子高通量测序的质量较差,Adrian Y.Tan等的方法中对1号外显子的测序也并不理想(参见Adrian Y.Tan等的方法第227页左栏)。所以本发明中为了保证测序质量,并未对全部外显子进行长片段PCR扩增和高通量测序,在本发明中,通过长片段PCR扩增和高通量测序获得的外显子序列包括PKD1基因的2-46号外显子(即除1号外显子之外的全部外显子)。
本发明的目的是提供一种用于通过长片段PCR和高通量测序技术检测PKD1基因突变的引物组;包含该引物组的试剂盒;包含该引物组的检测反应体系;用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法,所述方法通过使用该引物组对PKD1基因进行长片段PCR扩增并进行高通量测序来进行检测;用于非诊断目的的体外PKD1基因分析方法,所述方法通过使用该引物组对PKD1基因进行长片段PCR扩增并进行高通量测序来进行分析;检测PKD1基因上的新突变位点的方法,所述方法通过使用该引物组对PKD1基因进行长片段PCR扩增并进行高通量测序来进行检测。
如本文所述的,“PKD1基因”和“PKD1真基因”可互换使用,指多囊肾病基因-1。本文中所述的“假基因”指染色体上存在的6个PKD1基因的同源序列区,均与PKD1基因同源性高达97.8%。
如本文所述的,术语“Long PCR”、“长片段PCR”可互换使用,指能扩增较长的,例如大于3kb、4kb、或甚至大于5kb的DNA片段的PCR。长片段PCR的扩增产物可以直接进行序列分析。
如本文所述的,术语“高通量测序技术”也被称为第二代测序技术,包括焦磷酸测序、合成测序及芯片测序。
根据本发明的一个方面,提供用于通过长片段PCR和高通量测序技术检测PKD1基因突变的引物组,包括下述引物:
用于扩增PKD1基因外显子2-7的引物,其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;
用于扩增PKD1基因外显子8-12的引物,其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;
用于扩增PKD1基因外显子13-21的引物,其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;
用于扩增PKD1基因外显子22-34的引物,其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;和
用于扩增PKD1基因外显子35-46的引物,其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
应当理解,“外显子区域”不仅仅包含外显子,还包含用相应引物扩增的与外显子相连的部分内含子,当提及某外显子区域时,则意味着包括用相应引物对PKD1基因进行长片段PCR扩增获得的片段的所有序列,即,当提及外显子2-7区域时,意味着包含用SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列对PKD1基因进行长片段PCR扩增获得的片段的所有序列,当提及外显子8-12区域时,意味着包含用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物序列对PKD1基因进行长片段PCR扩增获得的片段的所有序列,当提及外显子13-21区域时,意味着包含用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物序列对PKD1基因进行长片段PCR扩增获得的片段的所有序列,当提及外显子22-34区域时,意味着包含用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物序列对PKD1基因进行长片段PCR扩增获得的片段的所有序列,当提及外显子35-46区域时,意味着包含用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物序列对PKD1基因进行长片段PCR扩增获得的片段的所有序列。
根据本发明的另一个方面,提供用于通过长片段PCR和高通量测序技术检测PKD1基因突变的试剂盒,包含如上所述的引物组。
在一些实施方案中,试剂盒包含用于从所述样品提取基因组DNA的试剂。从组织样品中提取基因组DNA是本领域的常规技术,并且目前市场上有很多成熟完善的商品化试剂可供选择。
在一些实施方案中,试剂盒包含利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂。长片段PCR是本领域中已知的技术,主要的反应组分包括模板、引物、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液等。本申请的实施例中提供了示例性的长片段PCR方法。
在一些实施方案中,试剂盒包含用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。长片段PCR产物一般无法直接用于高通量测序,还需要进行处理,例如酶切打断、连接接头、扩增富集、纯化等。对于掌握高通量测序的普通技术人员而言,上述处理步骤和所需要的试剂是容易理解的。本申请的实施例也提供了示例性的处理方法。
在一些实施方案中,试剂盒包含用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的试剂。高通量测序通常是在微孔芯片上进行的。目前,商业化的芯片和反应试剂容易购得,例如可购自LifeTechnologies Inc.。
高通量测序可以选自Illumina Hiseq/MiSeq测序和Ion Torrent测序。优选地,高通量测序为Ion Torrent测序。Ion Torrent测序是利用可商购获得的平台LifeTechnology Ion torrentPGM/Proton进行的高通量测序。Ion Torrent测序是基于DNA合成过程所产生的化学变化。DNA聚合酶以单链DNA为模板,按碱基互补原理,合成互补的DNA链。DNA链每延伸一个碱基时,就会释放一个质子,导致局部pH变化。Ion Torrent半导体测序芯片的每个微孔里的微球表面含有约100万个DNA分子拷贝。测序时核苷酸分子连续流过芯片微孔。如果一个核苷酸与某个微孔中的DNA分子互补,则该核苷酸被合成到DNA分子中,并且释放质子,该微孔中溶液的pH发生变化。离子传感器检测到pH变化后,将该化学信息转变为数字电子信息。如果DNA链含有两个相同的碱基,则记录电压信号是双倍的。如果碱基不匹配,则无质子释放,也就没有电压信号的变化。IonTorrent测序技术属于直接检测DNA的合成,即,边合成边检测。另外,Ion Torrent测序技术不需要CCD扫描、荧光激发等环节,几秒钟就可检测合成插入的碱基,大大缩短了运行时间,从而提高了检测效率。Ion torrent测序完成PKD1的测序仅需约2-3小时,而采用Illumina Hiseq/Miseq测序需要5-10天。
在一些实施方案中,试剂盒包含PKD1基因参考序列。
在一些实施方案中,PKD1基因参考序列是来自NCBI build 37/hgl9(获自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的PKD1全长基因序列
根据本发明的又一方面,提供一种用于通过长片段PCR和高通量测序技术检测PKD1基因突变的检测反应体系,其包含如上所述的引物组中的任何一对引物。
在一些实施方案中,所述检测反应体系还包含模板DNA、DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物。
在优选的实施方案中,DNA聚合酶为TAKARA LA DNA聚合酶。
在最优选的实施方案中,所述检测反应体系包含≥100ng的DNA模板、上下游引物各2μl、TAKARA LA DNA聚合酶0.5μl、10X BufferⅡ5μl,dNTP混合物8μl,并加入灭菌双蒸水至总体积为50μl。
根据本发明的又一方面,提供一种用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法,包括以下步骤:
(1)使用如上所述的引物组或如上所述的试剂盒或如上所述的检测反应体系对样品的PKD1基因进行长片段PCR扩增;
(2)对步骤(1)获得的扩增序列进行高通量测序;
(3)将步骤(2)获得的测序结果与PKD1基因参考序列比对,确定突变位点;
(4)通过生物信息学分析排除假基因位点干扰,确定PKD1真基因突变位点。
根据本发明的又一方面,提供一种用于非诊断目的的体外PKD1基因分析方法,包括以下步骤:
(1)使用如上所述的引物组或如上所述的试剂盒或如上所述的检测反应体系对样品的PKD1基因进行长片段PCR扩增;
(2)对步骤(1)获得的扩增序列进行高通量测序;
(3)将步骤(2)获得的测序结果与PKD1基因参考序列比对,确定突变位点;
(4)通过生物信息学分析排除假基因位点干扰,确定真基因突变位点。
根据本发明的又一方面,提供一种检测PKD1基因上的新突变位点的方法,包括以下步骤:
(1)使用如上所述的引物组或如上所述的试剂盒或如上所述的检测反应体系对样品的PKD1基因进行长片段PCR扩增;
(2)对步骤(1)获得的扩增序列进行高通量测序;
(3)将步骤(2)获得的测序结果与PKD1基因参考序列比对,确定突变位点;
(4)通过生物信息学分析排除假基因位点干扰,确定真基因突变位点;
(5)将步骤(4)确定的真基因突变位点与已知的PKD1基因突变位点进行比较,确定PKD1基因上的新突变位点。
在一些实施方案中,所述的长片段PCR扩增的反应条件为98℃1min,然后进行10个循环,每个循环为98℃10s、68℃10min,然后进行20个循环,每个循环为98℃10s、68℃10min20s,随后72℃10min,然后置于4℃直至使用。
在一些实施方案中,在本发明所述的用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法、用于非诊断目的的体外PKD1基因分析方法、检测PKD1基因上的新突变位点的方法中,在步骤(1)之前还包括从样品获得长片段PCR扩增模板的步骤。在一些实施方案中,样品为受试者外周血样品,长片段PCR扩增模板为从受试者外周血提取的基因组DNA。
在一些实施方案中,在本发明所述的用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法、用于非诊断目的的体外PKD1基因分析方法、检测PKD1基因上的新突变位点的方法中,在进行步骤(2)的高通量测序之前,还包括对步骤(1)获得的扩增序列进行纯化回收的步骤。在一些实施方案中,通过琼脂糖凝胶对步骤(1)获得的扩增序列进行纯化回收。在一些实施方案中,琼脂糖凝胶的浓度为0.8%或1%。
在一些实施方案中,在本发明所述的用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法、用于非诊断目的的体外PKD1基因分析方法、检测PKD1基因上的新突变位点的方法的步骤(2)中,在测序之前,还包括对纯化回收的扩增产物采用NEB酶进行酶切,连接接头,PCR扩增富集,并纯化回收290-330bp大小的目的片段的文库构建步骤。
如本文所述的,“通过生物信息学分析排除假基因位点干扰”是指通过对测序结果的数据分析确定检测结果中的突变位点是PKD1真基因突变还是假基因序列或其突变的过程。如本文所述的,“假基因位点干扰”是指这样的情况,由于6条假基因序列与PKD1基因序列的同源性高达97.8%,因此很难设计能够完全扩增PKD1真基因序列,而不扩增假基因序列的长片段PCR引物,在这种情况下,由于假基因序列与PKD1基因在大部分位点上的碱基相同,在个别位点上的碱基不同,因此当对PKD1基因进行长片段PCR并通过高通量测序检测出在某一位点上具有突变时,仅根据检测结果则无法确定该突变是真基因上的突变,还是假基因野生型序列上的相应位点(当突变位点与假基因和真基因的差异位点重合时),亦或是假基因序列上的突变,对于后两种情况,称其为假基因位点干扰,在对PKD1基因突变的检测中,需要排除这样的假基因位点干扰,而找出真基因上的突变。
本发明的“生物信息学分析”是基于这样的原理:根据成人多囊肾病的发病率可知,成人多囊肾病基因中突变的发生率并不高,PKD1基因的突变率约在1:1000左右,因此,当对单个样本进行检测时,当通过与PKD1真基因序列进行序列比对获得突变位点信息时,对于突变位点与假基因和真基因的差异位点重合的那些突变,应当是大部分属于假基因干扰(其突变比例应当相近,且突变比例的绝对值与引物特异性有关,引物对PKD1真基因的特异性越高,则意味着扩增获得的假基因越少,该绝对值越小),而小部分属于真基因突变(由于所设计的引物对真基因的特异性相对较高,一般仅会扩增到较低比例的假基因,因此通过长片段PCR扩增和高通量测序测得的真基因突变比例将会与假基因干扰突变位点的突变比例差异较大),因此对于这些突变进行线性回归分析得到的平均值为假基因干扰的比例,在所有突变位点中相应于离群点的突变则相应于真基因突变。
在一些实施方案中,在本发明所述的用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法、用于非诊断目的的体外PKD1基因分析方法、检测PKD1基因上的新突变位点的方法的步骤(4)中,所述“生物信息学分析”包括:a)通过BLAST比对6个假基因序列与PKD1真基因序列,获得6个假基因序列相对于PKD1真基因序列的同源序列片段以及这些同源序列片段上假基因序列与PKD1真基因序列的差异位点,构建假基因参考序列数据库,该数据库中所包含的“假基因参考序列”为6个假基因序列上的PKD1基因同源片段与PKD1真基因序列相应片段的差异位点;b)将高通量测序结果与PKD1基因参考序列进行比对,获得样品相对于PKD1参考基因的原始突变位点信息,其中包括突变位置、参考碱基、突变碱基、突变比例的信息;c)将原始突变位点信息与假基因参考序列数据库进行比较,找出具有相应的假基因参考序列的原始突变位点,构成用于回归分析的原始突变位点集合,将该用于回归分析的原始突变位点集合中包含的突变位点按照扩增区域分组,其中每一组突变位点位于用一对引物扩增的区域中且包含所述用于回归分析的原始突变位点集合中位于该扩增的区域中的所有突变位点;对于每一组突变位点,针对该组中所有突变位点的突变比例进行线性回归分析,确定平均值,该平均值为该组所对应的扩增区域内的假基因扩增比例(即假基因污染比例),另外从步骤b)获得的原始突变位点找出位于该组所对应的扩增区域内的所有原始突变位点,从这些原始突变位点中找出突变比例相对于该组所对应的上述线性回归分析结果而言相当于高于该扩增区域内的平均值的离群点的突变位点,这些相当于突变位点所对应的突变被判定为PKD1真基因突变。
在一些实施方案中,所述“突变比例”由高通量测序结果中的突变碱基覆盖深度除以总覆盖深度获得,其中“突变”是指样品测序结果与PKD1参考基因相比的突变。
本发明的方法与以往的PKD1基因突变检测方法相比,具有以下优点:
1)扩增产物覆盖PKD1基因全长近80%,检测范围全面,可以检测PKD1基因的除外显子1之外的全外显子和大部分内含子,覆盖已报道的90%以上的致病位点,具体如下表所示:
2)巢式PCR由于引物多,有更大的可能在引物位置出现多态性,影响该片段的扩增效率,导致杂合性缺失而漏检,本发明不用进行大量巢式PCR,只需进行一次PCR,从而降低错配率,同时防止漏检的情况发生,效率更高。
3)反应体系和反应温度(特别是退火-延伸温度)变化对长片段PCR反应扩增结果的影响非常大,微小的温度差别,例如退火-延伸温度0.5-1℃的差别,都会影响长片段PCR反应的成败。Adrian Y.Tan等的方法(参见Adrian Y.Tan et al.,Molecular diagnosisof autosomal dominant polycystic kidney disease using next-generationsequencing,The Journal of Molecular Diagnostics,2014,Vol.16,No.2,pp216-228;以下称Adrian Y.Tan等的方法,通过引用将该文献全文合并入本文)虽然也是通过长片段PCR和高通量测序检测PKD1基因的突变,但是该方法中对外显子2-46区域进行扩增时,仍然需要进行2次反应条件不同的长片段PCR才能完成,而本发明的所有不同引物对可以采用相同的扩增反应条件,所有反应物可以置于一台PCR仪器中以相同反应条件同时进行反应,即可将所有片段均扩增完成,从而缩短检测时间,降低成本且效率更高。
4)现有的文献中长片段PCR均需采用两种或两种以上的酶,本发明仅使用单种酶完成长片段PCR,降低成本,且使得反应体系更为简单。
5)采用高通量测序,读长达300bp,准确度高(99.9%),具有更好的比对效果,平均覆盖深度>200X。采用Ion torrent测序,2到3个小时即能够完成测序检测,大幅提高时效。
6)本发明所采用的引物为双向特异引物,有效降低了覆盖到假基因的比例;后期再进行生物信息学处理,监控假基因的特异位点,进一步清除假基因的干扰。
本发明可以检测PKD1基因上2-46号外显子区域的全部突变,实验流程简单,快速高效,结果准确可靠,解决了临床上的难题,已可大规模产业化应用。其检测结果不仅可以辅助诊断成人多囊肾病,还可以获得多个PKD1真基因上的之前未知的新突变,并将其提供给医生或研究者以对这些突变与成人多囊肾病之间的关联性进行研究。
附图说明
图1是PKD1基因2-46号外显子区域长片段PCR扩增产物电泳图。其中2、8、14、20泳道为用E2引物扩增2-7号外显子区域的结果,大小为4041bp;3、9、15、21泳道为用T3引物扩增8-12号外显子区域的结果,大小为4200bp;4、10、16、22泳道为用K3引物扩增12-21号外显子区域的结果,大小为7800bp;5、11、17、23泳道为用R5引物扩增22-34号外显子区域的结果,大小为7503bp;6、13、18、24泳道为用K5引物扩增35-46号外显子区域的结果,大小为5200bp;1泳道M为15Kb Marker,片段长度至下而上依次为500bp、1000bp、1500bp、3000bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp。
图2是样本1的8-12号外显子区域突变线性回归分析图。
图3是样本2的8-12号外显子区域突变线性回归分析图。
图4是c.10420G>A突变位点高通量测序结果与Sanger法测序结果对比。其中左图为高通量测序结果,下方标识序列为PKD1基因参考序列;右图为Sanger法测序结果,上方标识序列为PKD1基因参考序列。
图5是c.10678C>T突变位点高通量测序结果与Sanger法测序结果对比。其中左图为高通量测序结果,下方标识序列为PKD1基因参考序列;右图为Sanger法测序结果,上方标识序列为PKD1基因参考序列。
图6是c.8087A>C突变位点高通量测序结果与Sanger法测序结果对比。其中左图为高通量测序结果,下方标识序列为PKD1基因参考序列;右图为Sanger法测序结果,上方标识序列为PKD1基因参考序列。
图7是c.9377G>A突变位点高通量测序结果与Sanger法测序结果对比。其中左图为高通量测序结果,下方标识序列为PKD1基因参考序列;右图为Sanger法测序结果,上方标识序列为PKD1基因参考序列。
图8是c.7165A>G突变位点高通量测序结果与Sanger法测序结果对比。其中左图为高通量测序结果,下方标识序列为PKD1基因参考序列;右图为Sanger法测序结果,上方标识序列为PKD1基因参考序列。
图9是显示用Adrian Y.Tan等方法的引物扩增PKD1基因2-34号外显子区域的假基因扩增比例的线性回归分析图。
图10是显示用E2、T3、K3、R5引物扩增PKD1基因2-34号外显子区域假基因扩增比例的线性回归分析图。
图11是显示Adrian Y.Tan等的方法扩增PKD1基因8-12号外显子区域假基因扩增比例的线性回归分析图,其中R2为0.0017,平均扩增比例为30.692%。
图12是显示T3引物扩增PKD1基因8-12号外显子区域假基因扩增比例的线性回归分析的图,其中R2为0.0119,平均扩增比例为9.5895%。
图13是Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_2-12F、PKD1_NGS_2-12R扩增测序结果与T3引物扩增测序结果比较图。
图14是Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_22-34F、PKD1_NGS_22-34R扩增测序结果与R5引物扩增测序结果比较图。
图15是Adrian Y.Tan等的方法的引物和E2、T3引物对2-12号外显子区域扩增稳定性比较。其中1-8泳道为采用Adrian Y.Tan等的方法扩增的2-12号外显子区域结果(使用PKD1_NGS_2-12F、PKD1_NGS_2-12R引物),扩增产物大小应为8700bp;10-17泳道为用E2引物扩增2-7号外显子区域结果,扩增产物大小为4041bp;18-25泳道为用T3引物扩增8-12号外显子区域结果,扩增产物大小为4200bp;9泳道M为15Kb Marker;片段长度至下而上依次为500bp、1000bp、1500bp、3000bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp。
图16是Adrian Y.Tan等的方法的引物和R5引物对PKD1基因22-34号外显子区域扩增稳定性比较。其中1-8泳道为采用Adrian Y.Tan等的方法扩增22-34号外显子区域结果(使用PKD1_NGS_22-34F、PKD1_NGS_22-34R引物),扩增产物大小应为7800bp;10-17泳道为用R5引物扩增22-34号外显子区域结果,扩增产物大小为7503bp;9泳道M为15Kb Marker,片段长度至下而上依次为500bp、1000bp、1500bp、3000bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了,下面结合实施例并参照附图,对本发明进一步详细说明。应该理解,下述实施例只是示例性的,而并非要限制本发明的范围。
实施例1:使用PKD1基因第2-46号外显子区域真基因特异性引物(E2、T3、K3、R5、K5)进行长片段PCR并进行高通量测序检测PKD1基因突变
在征得受检者知情同意的前提下,针对70例受检者使用长片段PCR结合高通量测序检测PKD1基因突变。
采用OMEGA基因组DNA提取试剂盒(购自美国OMEGA公司)提取受检者外周血的基因组DNA,提取的DNA用分光光度计或其它检测仪器检测DNA浓度和纯度,DNA浓度大于50ng/μl,体积大于30μl,A260/A280在1.6-2.0之间,作为DNA模板。将来自每一个受检者的DNA模板等分加入五个单独的反应管中,在五个反应管的每一个中加入长片段PCR引物E2、T3、K3、R5、K5(序列如表1所示)之一,按表2所述反应体系加入各项试剂,在PTC-200PCR仪(Bio-Rad公司)中以表3所述反应条件进行长片段PCR反应。针对多个受检者样品的、针对不同外显子区域的长片段PCR反应可在同一台PCR仪中以相同的反应条件进行。
表1引物序列
表2反应体系
组分 | 体积(μl) |
DNA模板 | ≥100ng |
上游引物 | 2 |
下游引物 | 2 |
TAKARA LA DNA聚合酶 | 0.5 |
10X BufferⅡ | 5 |
dNTP混合物 | 8 |
灭菌双蒸水 | 加至总体积50 |
表3反应条件
扩增结束后,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶浓度为0.8%,点样5μl PCR产物,并检测扩增是否达到目的长度,长度如表4所示,检测到单一条带后进行切胶回收纯化,图1显示了其中4个样本的PKD1基因2-46号外显子区域扩增产物电泳图,其中2、8、14、20泳道为用E2引物扩增2-7号外显子区域的结果,大小为4041bp;3、9、15、21泳道为用T3引物扩增8-12号外显子区域的结果,大小为4200bp;4、10、16、22泳道为用K3引物扩增12-21号外显子区域的结果,大小为7800bp;5、11、17、23泳道为用R5引物扩增22-34号外显子区域的结果,大小为7503bp;6、13、18、24泳道为用K5引物扩增35-46号外显子区域的结果,大小为5200bp;1泳道M为15Kb Marker,片段长度至下而上依次为500bp、1000bp、1500bp、3000bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp。
表42-46号外显子区域片段长度
目的片段 | 长度(kb) |
2-7号外显子区域 | 4 |
8-12号外显子区域 | 4.2 |
13-21号外显子区域 | 7.8 |
22-34号外显子区域 | 7.5 |
35-46号外显子区域 | 5.2 |
然后根据NEB Next Fast DNA Frafmentation Library Prep Set for IonTorrent(购自美国Life Technology公司)的说明书进行文库构建,根据Ion PGM TemplateOT2200Kit(购自美国Life Technology公司)、Ion PGM Sequencing 200Kit v2(购自美国Life Technology公司)的说明书进行高通量测序,详细步骤如下。
1文库制备
将5段PCR产物用Qubit(购自美国Life Technology公司)定量,取相同的质量混在一起,总质量为0.5μg。
将上述长片段PCR反应获得的5条目的片段采用NEBFast DNAFragmentation&Library Prep Set for Ion Torrent的建库试剂盒(购自美国LifeTechnology公司)进行酶切打断,该试剂盒包含NEB Next DNA Fragmentase ReactionBufffer、Mgcl2、NEBNext DNA Fragmentase Master Mix三种试剂。PCR反应在Bio-Rad公司的PTC-200PCR仪上运行(PCR反应体系:模板DNA:1-15.5μl、NEB Next DNA FragmentaseReaction Bufffer:2μl、NEB Next DNA Fragmentase Master Mix:1.5μl,最后用灭菌双蒸水补至总体积为20μl;PCR反应条件:25℃,酶切20min;72℃,末端修复10min,最后4℃保存)。最终获得主带在300bp的DNA双链片段的混合物。
接下来,对上述片段进行纯化,纯化过程采用Ampure Beads方法,按照AgencourtAMPure试剂盒(购自美国Beckman公司)说明书进行,该试剂盒包含T4DNA Ligase Bufferfor Ion Torrent、Adapters&Barcodes Mixtrue、Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase、T4DNA Ligase。简而言之:将DNA片段进行末端修复,成为带有平末端的片段混合物,并在每一条单链的3'端添加一个"A",然后进行连接反应,通过此过程为DNA片段加上带有"T"的接头;在T4DNA Ligase Buffer for Ion Torrent、Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase下进行PCR反应连接(PCR反应体系:模板DNA:20μl,T4DNA Ligase Buffer for Ion Torrent:4μl,Adapters&Barcodes Mixtrue:10μl,Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase:1μl,T4DNALigase:4μl,最后用双蒸水补至总体积40μl;PCR反应条件:25℃,连接15min;65℃,延伸5min,4℃保存),连接后继续按照Agencourt AMPure说明书进行纯化,去除多余的试剂如缓冲物、酶、ATΡ等,最终得到连有接头的DNA。
使用E-gel size selective 2%get kit回收试剂盒(购自美国Life Technology公司)对纯化的DNA进行E-Gel(E-Gel预制琼脂糖凝胶电泳仪,购自美国Life Technology公司)纯化回收290-330bp大小的目的片段。回收的片段为连接有接头的DNA样品文库。
对E-Gel回收的连接有接头的DNA样品进行扩增富集,PCR反应在Bio-Rad公司的PTC-200PCR仪上运行(PCR反应体系:DNA:1-40μl,primers:10μl,NEBNext High-Fidelity2*pcr Master Mix:50μl;PCR反应条件:98℃,30s;98℃变性10s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共扩增7个循环;最终72℃延伸5min)。
对扩增的DNA片段进行纯化,纯化过程与上述Ampure Beads方法一致,同样按照Agencourt AMPure试剂盒(购自美国Beckman公司)说明书进行,得到单链的带有接头的DNA文库。
纯化的DNA文库可在4℃保存数天或在-20℃保存数周,也可直接用于后续的高通量测序。
2、高通量测序
将构建好的DNA文库和相关试剂(配套的试剂盒:Ion PGM Template OT2200Kit,购自美国Life technology公司,货号:4480974)按照1.8稀释因子(终浓度为1.8ng/ml)进行稀释。
按照Ion PGM Template OT2200Kit的试剂盒说明书,将稀释好的DNA文库按说明书要求配制乳液扩增液,然后在Ion One TouchTM system仪(Ion OneTouch系统包含两个模块:Ion OneTouch仪器和Ion OneTouchTM ES-富集系统,购自美国Life Technology公司)的Ion OneTouch仪器中上样并运行,使单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化,形成油包水的混合物,平行进行整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言,扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后,乳液混合物被打破,扩增的片段仍然结合在磁珠上。它使模板化IonSphere颗粒自动导入,进行克隆扩增。反应运行时间约为5小时20分钟,反应后进行离心,回收模板化的Ion Sphere颗粒。
然后Ion OneTouchTM ES-富集系统分离模板阳性的Ion Sphere颗粒。
最后,将Ion PGM测序仪(购至美国Life Technology公司)进行初始化,将IonOneTouchTM ES-富集系统富集的Ion Sphere样品颗粒按Ion PGM Sequencing 200Kit v2上机试剂盒(购自美国Life Technology公司)说明书进行操作,准备Ion 318芯片(购自美国Life Technology公司)吸取30μL样品进行上机测序,反应运行时间约为2-3小时,完成测序过程,获得测序原始序列(包括多个200bp左右的独段测序结果)。
3、生物信息分析
(1)通过BLAST比对6个假基因序列与PKD1真基因序列,获得6个假基因序列相对于PKD1真基因序列的同源序列片段以及这些同源序列片段上假基因序列与PKD1真基因序列的差异位点,构建假基因参考序列数据库,该数据库中所包含的“假基因参考序列”为6个假基因序列上的PKD1基因同源片段与PKD1真基因序列相应片段的差异位点。
(2)使用TMAP软件(美国Life Technology公司Ion PGMTM System服务软件)将测序得到的原始序列独段比对到参考序列NCBI build 37/hgl9(获自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的PKD1基因全长序列上,获得原始比对结果BAM文件。
(3)使用samtools软件(http://sourceforge.net/projects/samtools/)对步骤(2)中BAM文件进行处理,将其格式转换为VarScan软件可以识别的比对信息文件。
(4)使用VarScan软件(http://massgenomics.org/varscan)对步骤(2)中得到的比对信息文件进行突变位点检测,获得样品相对于PKD1参考基因的原始突变位点信息文件,其中包括突变位置、参考碱基、突变碱基、突变比例、总覆盖深度、参考碱基覆盖深度、突变碱基覆盖深度等信息。原始位点信息既包含PKD1真基因上的突变又包含假基因干扰位点。
其中通过高通量测序获得的2例样本(每例样本来自上述的1位受检者)的原始突变位点信息分别如表5和表6所示。
表5:高通量测序获得的样本1的原始突变位点信息
表6:高通量测序获得的样本2的原始突变位点信息
(5)将步骤(4)中的原始突变位点信息与假基因参考序列数据库进行比较,找出具有相应的假基因参考序列的原始突变位点集合,在该原始突变位点集合中,分别找出其突变位点属于用E2扩增的2-7号外显子区域、用T3扩增的8-12号外显子区域、用K3扩增的13-21号外显子区域和用R5扩增的22-34号外显子区域中的四组突变,并对这四组突变的突变比例进行线性回归分析,确定平均值,该平均值为相应外显子区域的假基因扩增比例(即假基因污染比例),步骤(4)中得到的原始位点其中突变比例高于其相应外显子区域的平均值的离群点对应的突变被判定为PKD1真基因突变,接近平均值的点对应的突变被判定为假基因干扰位点。例如,找出上述样本1中具有相应的假基因参考序列的原始突变位点,构成用于样本1的回归分析的原始突变位点集合,并从该用于样本1的回归分析的原始突变位点集合中找出属于用T3扩增的8-12号外显子区域的突变(样本1的原始突变位点对应的假基因参考序列可参见表7),进行线性回归分析,结果如图2所示,从中可以看出,假基因扩增比例约为11.1%。再例如,找出上述样本2中具有相应的假基因参考序列的原始突变位点,构成用于样本2的回归分析的原始突变位点集合,并从该用于样本2的回归分析的原始突变位点集合中找出属于用T3扩增的8-12号外显子区域的突变(样本2的原始突变位点对应的假基因参考序列可参见表8),进行线性回归分析,结果如图3所示,从中可以看出,假基因扩增比例约为11%。对于上述样本1和样本2的所有外显子区域,都进行同样分析(针对其它外显子区域的线性回归分析图未显示),并找出步骤(4)获得的所有原始突变位点中就突变比例而言相对于这些回归分析结果来说相当于高于线性回归分析平均值的离群点的突变,确定为真基因突变,对上述样本1和样本2的所有原始突变位点的分析结果如表7和表8所示。
(6)将经过上述分析的PKD1基因突变位点与dbSNP138数据库进行比较,确定哪些突变位点为已报道的突变位点,哪些位点为新突变位点。
上述样本1和样本2的基因组DNA突变位点分析结果如表7和表8所示。
表7:样本1的突变位点分析结果
注:NA表示此位点无家基因参考序列;突变位点参考序列为NCBI build 37/hgl9;
表8:样本2的突变位点分析结果
注:NA表示此位点无假基因参考序列;突变位点参考序列为NCBI build 37/hgl9;
任选样本1中发现的一个新突变c.10420G>A进行Sanger法测序验证,明确是否确属PKD1真基因突变位点,以验证本方法的可靠性,结果如图4所示,其中左图为高通量测序结果,下方标识序列为PKD1基因参考序列;右图为Sanger法测序结果,上方标识序列为PKD1基因参考序列。图4的结果表明该突变位点c.10420G>A经Sanger法验证确属PKD1真基因突变位点。
任选样本1中发现的一个已报道突变c.10678C>T进行Sanger法测序验证,明确是否确属突变位点,以验证本方法的可靠性。结果如图5所示,其中左图为高通量测序结果,下方标识序列为PKD1基因参考序列;右图为Sanger法测序结果,上方标识序列为PKD1基因参考序列。图5的结果表明该突变位点c.10678C>T经Sanger法验证确属PKD1基因的突变位点。
任选样本1中发现的一个假基因干扰位点c.8087A>C进行Sanger法测序验证,明确是否确属突变位点,以验证本方法的可靠性,结果如图6所示,其中左图为高通量测序结果,下方标识序列为PKD1基因参考序列和相应的假基因同源序列;右图为Sanger法测序结果,上方标识序列为PKD1基因参考序列。图6的结果表明该c.8087A>C突变位点为假基因干扰位点,经Sanger法验证在PKD1基因的该位点处无突变,表明此位点确属假基因干扰位点。
任选样本2中发现的其中一个新突变c.9377G>A进行Sanger法测序验证,明确是否确属突变位点,以验证本方法的可靠性,结果如图7所示,其中左图为高通量测序结果,下方标识序列为PKD1基因参考序列;右图为Sanger法测序结果,上方标识序列为PKD1基因参考序列。图7的结果表明该突变位点c.9377G>A经Sanger法验证确属PKD1基因的突变位点。
任选样本2中发现的其中一个假基因干扰位点c.7165A>G进行Sanger法测序验证,明确是否确属突变位点,以验证本方法的可靠性,结果图8所示,其中左图为高通量测序结果,下方标识序列为PKD1基因参考序列和相应的假基因同源序列;右图为Sanger法测序结果,上方标识序列为PKD1基因参考序列。图8的结果表明该c.7165A>G突变位点为假基因干扰位点,经Sanger法验证在PKD1基因的该位点处无突变,表明此位点确属假基因干扰位点。
以上结果表明使用本发明的方法分析假基因干扰位点是可行的。
实施例2:PKD1基因特异性T3引物(SEQ ID NO:3和4)和R5引物(SEQ ID NO:7和8)与Adrian Y.Tan等的方法的引物特异性比较
在征得受检者知情同意的前提下,对1例受检者采集外周血,用OMEGA基因组DNA提取试剂盒(购自美国OMEGA公司)提取受检者外周血的基因组DNA,提取的DNA用分光光度计或其它检测仪器检测DNA浓度和纯度,DNA浓度大于50ng/μl,体积大于30μl,A260/A280在1.6-2.0之间,作为模板DNA。
采用Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_2-12F、PKD1_NGS_2-12R、PKD1_NGS_13-21F、PKD1_NGS_13-21R和PKD1_NGS_22-34F、PKD1_NGS_22-34R及其PCR反应体系和PCR反应条件扩增2-34号外显子区域,另采用用于扩增2-34号外显子区域的E2引物(SEQ ID NO:1和2)、T3引物(SEQ ID NO:3和4)、K3引物(SEQ ID NO:5和6)和R5引物(SEQ ID NO:7和8)及上述表2所述的反应体系和上述表3所述的PCR反应条件,分别对上述模板DNA进行长片段PCR扩增,如实施例1中所述进行高通量测序和生物信息分析,对所收集的符合条件的突变根据其突变比例进行线性回归分析,以比较此两种方法的引物在PKD1基因2-34号外显子区域内的假基因扩增比例(即假基因污染比例)。显示用Adrian Y.Tan等的方法的引物扩增2-34号外显子区域的假基因扩增比例的线性回归分析图如图9所示。显示用本发明的E2、T3、K3、R5引物扩增PKD1基因2-34号外显子区域假基因扩增比例的线性回归分析图如图10所示。由图9和图10可见,Adrian Y.Tan等的方法的引物扩增8-12号外显子区域的假基因扩增比例较高(即假基因污染程度较重);采用本发明的引物扩增8-12号外显子区域的假基因扩增比例较低(即假基因污染程度较轻);由于Adrian Y.Tan等的方法扩增2-7号外显子和8-12号外显子为同一对引物,其2-7号外显子区域受假基因污染亦同样严重;而采用AdrianY.Tan等的方法的引物和采用本发明的R5引物扩增22-34号外显子区域的假基因扩增比例均极低,即Adrian Y.Tan等的方法和本发明的方法均能特异性地扩增出PKD1基因22-34号外显子的序列。
采用Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_2-12F、PKD1_NGS_2-12R及其PCR反应体系和PCR反应条件,另采用用于扩增8-12号外显子区域的T3引物(SEQ ID NO:3和4)引物及上述表2所述的反应体系和上述表3所述的PCR反应条件,分别对上述模板DNA进行长片段PCR扩增,如实施例1中所述进行高通量测序和生物信息分析,对所收集的符合条件的突变的突变比例进行线性回归分析,以比较此两对引物在PKD1基因8-12号外显子区域内的假基因扩增比例(即假基因污染比例)。显示用Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_2-12F、PKD1_NGS_2-12R扩增8-12号外显子区域的假基因扩增比例的线性回归分析图如图11所示。显示用T3引物(SEQ ID NO:3和4)扩增PKD1基因8-12号外显子区域假基因扩增比例的线性回归分析的图如图12所示。
同时以将上述长片段PCR扩增产物作为模板对8号外显子进行第二轮巢式PCR扩增,并对产物进行一代Sanger法测序,通过测序结果比较T3引物(SEQ ID NO:3和4)与Adrian Y.Tan等的方法的引物的特异性,结果如图13所示,其中图13的上图为AdrianY.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_2-12F、PKD1_NGS_2-12R扩增测序结果,图13的下图为T3引物(SEQ ID NO:3和4)扩增测序结果。
由图11结果可见,8-12号外显子区域各位点平均扩增比例为30.692%,表明用此对引物扩增8-12号外显子区域后,其假基因污染程度达30.692%。由于假基因扩增比例高达30.692%,真基因扩增比例只占70%,若真基因上发生杂合突变,其突变比例即为35%,由于本高通量测序平台能显著区分突变比例相差20%的突变,因此与假基因污染的突变比例的30.692%则无法区分,则可能带来假阴性的结果。因此,当发生这种比例的假基因扩增时,检测得出的结果可能为错误的,实验应该认定为失败。
由图12结果可见,8-12号外显子区域内各位点平均扩增比例为9.5895%,表明用此对引物扩增8-12号外显子区域后,其假基因污染程度仅为9.5895%,受假基因污染程度轻。在假基因扩增比例为10%的情况下,真基因扩增比例为90%,发生杂合突变的突变比例约为45%,与假基因污染的突变比例10%有显著差异,高通量测序可明确区分。因此,当出现45%左右比例的突变时,可明确为真基因上的突变。因此即使扩增到假基因,也可被发现,并通过生物信息分析进行区分和排除。
由图13的结果可以看出,Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_2-12F、PKD1_NGS_2-12R扩增检测结果有假基因干扰,而本发明的T3引物(SEQ ID NO:3和4)扩增检测结果在相应位点没有假基因干扰。以上结果表明本发明的引物与Adrian Y.Tan等的引物相比,更能特异性地扩增8-12号外显子区域。
另外采用Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_22-34F、PKD1_NGS_22-34R和针对22-34号外显子区域的R5引物(SEQ ID NO:7和8)分别上述模板DNA进行扩增,再分别以扩增后的PCR产物为模板对26号外显子进行第二轮巢式PCR,并将产物进行一代Sanger测序,通过测序结果比较,验证R5引物(SEQ ID NO:7和8)是否能准确且特异性地扩增出目的片段,结果如图14所示,其中图14的上图为Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_22-34F、PKD1_NGS_22-34R扩增测序结果,图14的中图为R5引物(SEQ ID NO:7和8)扩增测序结果,下图为相应的假基因同源序列。由图14的结果可以看出,Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_22-34F、PKD1_NGS_22-34R扩增检测结果和本发明的R5引物(SEQ ID NO:7和8)扩增检测结果在相应位点均没有假基因干扰,同时二者扩增片段的测序结果完全一致,以上结果表明本发明的R5引物与Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_22-34F、PKD1_NGS_22-34R同样都能准确且特异性地扩增22-34号外显子区域。
实施例3:E2、T2、R5引物与Adrian Y.Tan等的方法的引物稳定性比较
在征得受检者知情同意的前提下,对8例受检者采集外周血,用OMEGA基因组DNA提取试剂盒(购自美国OMEGA公司)提取受检者外周血的基因组DNA,提取的DNA用分光光度计或其它检测仪器检测DNA浓度和纯度,DNA浓度大于50ng/μl,体积大于30μl,A260/A280在1.6-2.0之间,作为模板DNA。
采用Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_2-12F、PKD1_NGS_2-12R及其PCR反应体系和PCR反应条件,另采用用于扩增2-7号外显子区域的E2引物(SEQ ID NO:1和2)引物和用于扩增8-12号外显子区域的T3引物(SEQ ID NO:3和4)引物及上述表2所述的反应体系和上述表3所述的PCR反应条件,分别对上述模板DNA进行长片段PCR扩增,结果如图15所示,其中1-8泳道为采用Adrian Y.Tan等的方法扩增的2-12号外显子区域结果(使用PKD1_NGS_2-12F、PKD1_NGS_2-12R引物),扩增产物大小应为8700bp;10-17泳道为用E2引物扩增2-7号外显子区域结果,扩增产物大小为4041bp;18-25泳道为用T3引物扩增8-12号外显子区域结果,扩增产物大小为4200bp;9泳道M为15Kb Marker;片段长度至下而上依次为500bp、1000bp、1500bp、3000bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp。由图15结果可知,采用AdrianY.Tan等的方法中引物和条件未扩增到目的片段,而采用本发明的E2、T3引物和条件可一次成功扩增2-12号外显子区域。
采用Adrian Y.Tan等的方法的引物PKD1_NGS_22-34F、PKD1_NGS_22-34R及其PCR反应体系和PCR反应条件,另采用用于扩增22-34号外显子区域的R5引物(SEQ ID NO:7和8)引物及上述表2所述的反应体系和上述表3所述的PCR反应条件,分别对上述模板DNA进行长片段PCR扩增,结果如图16所示,其中1-8泳道为采用Adrian Y.Tan等的方法扩增22-34号外显子区域结果(使用PKD1_NGS_22-34F、PKD1_NGS_22-34R引物),扩增产物大小应为7800bp;10-17泳道为用R5引物扩增22-34号外显子区域结果,扩增产物大小为7503bp;9泳道M为15Kb Marker,片段长度至下而上依次为500bp、1000bp、1500bp、3000bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp。由图16的结果可知,采用Adrian Y.Tan等的方法中引物和条件未扩增到目的片段,而采用本发明的R5引物和条件可一次成功扩增22-34号外显子区域。
应当理解的是,本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理,而不构成对本发明的限制。因此,在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。此外,本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
Claims (14)
1.用于通过长片段PCR和高通量测序技术检测PKD1基因突变的引物组,包括下述引物:
用于扩增PKD1基因外显子2-7的引物,其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示;
用于扩增PKD1基因外显子8-12的引物,其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示;
用于扩增PKD1基因外显子13-21的引物,其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;
用于扩增PKD1基因外显子22-34的引物,其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;和
用于扩增PKD1基因外显子35-46的引物,其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
2.用于通过长片段PCR和高通量测序技术检测PKD1基因突变的试剂盒,包含权利要求1的引物组。
3.权利要求2的试剂盒,还包含以下一种或多种试剂:
用于从样品提取基因组DNA的试剂;
利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂;
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂; 以及
用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的试剂。
4.权利要求3的试剂盒,其中所述利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂包括DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物。
5.权利要求4的试剂盒,其中所述DNA聚合酶为TAKARA LA DNA聚合酶。
6.权利要求4的试剂盒,其中所述缓冲液为10× BufferⅡ。
7.一种用于通过长片段PCR和高通量测序技术检测PKD1基因突变的检测反应体系,包含权利要求1的引物组。
8.权利要求7的检测反应体系,还包含模板DNA、DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物。
9.权利要求8的检测反应体系,其中DNA聚合酶为TAKARA LA DNA聚合酶。
10.权利要求9的检测反应体系,其中在50μl的所述检测反应体系中包含≥100ng的DNA模板、上下游引物各2μl、TAKARA LA DNA聚合酶0.5μl、10×BufferⅡ 5μl,dNTP混合物8μl。
11.一种用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法,包括以下步骤:
(1)使用权利要求1的引物组或权利要求2-6任一项的试剂盒或权利要求7-10任一项的检测反应体系通过长片段PCR扩增PKD1基因;长片段扩增反应条件是98℃1min,然后进行10个循环,每个循环为98℃10s、68℃10min,然后进行20个循环,每个循环为98℃10s、68℃10min20s,随后72℃10min,然后置于4℃直至使用;
(2)对步骤(1)获得的扩增序列进行高通量测序;
(3)将步骤(2)获得的测序结果与PKD1基因参考序列比对,确定突变位点;
(4)通过生物信息学分析排除假基因位点干扰,确定PKD1真基因突变位点;其中所述“生物信息学分析”包括以下步骤:
a)通过BLAST比对6个假基因序列与PKD1真基因序列,获得6个假基因序列相对于PKD1真基因序列的同源序列片段以及这些同源序列片段上假基因序列与PKD1真基因序列的差异位点,构建假基因参考序列数据库,该数据库中所包含的“假基因参考序列”为6个假基因序列上的PKD1基因同源片段与PKD1真基因序列相应片段的差异位点;
b)将高通量测序结果与PKD1基因参考序列进行比对,获得样品相对于PKD1参考基因的原始突变位点信息,其中包括突变位置、参考碱基、突变碱基、突变比例的信息;
c)将原始突变位点信息与假基因参考序列数据库进行比较,找出具有相应的假基因参考序列的原始突变位点,构成用于回归分析的原始突变位点集合,将该用于回归分析的原始突变位点集合中包含的突变位点按照扩增区域分组,其中每一组突变位点位于用一对引物扩增的区域中且包含所述用于回归分析的原始突变位点集合中位于该扩增的区域中的所有突变位点;对于每一组突变位点,针对该组中所有突变位点的突变比例进行线性回归分析,确定平均值,该平均值为该组所对应的扩增区域内的假基因扩增比例-即假基因污染比例,另外从步骤b)获得的原始突变位点找出位于该组所对应的扩增区域内的所有原始突变位点,从这些原始突变位点中找出突变比例相对于该组所对应的上述线性回归分析结果而言是高于该扩增区域内的平均值的离群点的突变位点,这些突变位点所对应的突变被判定为PKD1真基因突变。
12.一种用于非诊断目的的体外PKD1基因分析方法,包括以下步骤:
(1)使用权利要求1的引物组或权利要求2-6任一项的试剂盒或权利要求7-10任一项的检测反应体系通过长片段PCR扩增PKD1基因;长片段扩增反应条件是98℃1min,然后进行10个循环,每个循环为98℃10s、68℃10min,然后进行20个循环,每个循环为98℃10s、68℃10min20s,随后72℃10min,然后置于4℃直至使用;
(2)对步骤(1)获得的扩增序列进行高通量测序;
(3)将步骤(2)获得的测序结果与PKD1基因参考序列比对,确定突变位点;
(4)通过生物信息学分析排除假基因位点干扰,确定真基因突变位点;其中所述“生物信息学分析”包括以下步骤:
a)通过BLAST比对6个假基因序列与PKD1真基因序列,获得6个假基因序列相对于PKD1真基因序列的同源序列片段以及这些同源序列片段上假基因序列与PKD1真基因序列的差异位点,构建假基因参考序列数据库,该数据库中所包含的“假基因参考序列”为6个假基因序列上的PKD1基因同源片段与PKD1真基因序列相应片段的差异位点;
b)将高通量测序结果与PKD1基因参考序列进行比对,获得样品相对于PKD1参考基因的原始突变位点信息,其中包括突变位置、参考碱基、突变碱基、突变比例的信息;
c)将原始突变位点信息与假基因参考序列数据库进行比较,找出具有相应的假基因参考序列的原始突变位点,构成用于回归分析的原始突变位点集合,将该用于回归分析的原始突变位点集合中包含的突变位点按照扩增区域分组,其中每一组突变位点位于用一对引物扩增的区域中且包含所述用于回归分析的原始突变位点集合中位于该扩增的区域中的所有突变位点;对于每一组突变位点,针对该组中所有突变位点的突变比例进行线性回归分析,确定平均值,该平均值为该组所对应的扩增区域内的假基因扩增比例-即假基因污染比例,另外从步骤b)获得的原始突变位点找出位于该组所对应的扩增区域内的所有原始突变位点,从这些原始突变位点中找出突变比例相对于该组所对应的上述线性回归分析结果而言是高于该扩增区域内的平均值的离群点的突变位点,这些突变位点所对应的突变被判定为PKD1真基因突变。
13.一种用于非诊断目的的检测PKD1基因上的新突变位点的方法,包括以下步骤:
(1)使用权利要求1的引物组或权利要求2-6任一项的试剂盒或权利要求7-10任一项的检测反应体系通过长片段PCR扩增PKD1基因;长片段扩增反应条件是98℃1min,然后进行10个循环,每个循环为98℃10s、68℃10min,然后进行20个循环,每个循环为98℃10s、68℃10min20s,随后72℃10min,然后置于4℃直至使用;
(2)对步骤(1)获得的扩增序列进行高通量测序;
(3)将步骤(2)获得的测序结果与PKD1基因参考序列比对,确定突变位点;
(4)通过生物信息学分析排除假基因位点干扰,确定真基因突变位点;其中所述“生物信息学分析”包括以下步骤:
a)通过BLAST比对6个假基因序列与PKD1真基因序列,获得6个假基因序列相对于PKD1真基因序列的同源序列片段以及这些同源序列片段上假基因序列与PKD1真基因序列的差异位点,构建假基因参考序列数据库,该数据库中所包含的“假基因参考序列”为6个假基因序列上的PKD1基因同源片段与PKD1真基因序列相应片段的差异位点;
b)将高通量测序结果与PKD1基因参考序列进行比对,获得样品相对于PKD1参考基因的原始突变位点信息,其中包括突变位置、参考碱基、突变碱基、突变比例的信息;
c)将原始突变位点信息与假基因参考序列数据库进行比较,找出具有相应的假基因参考序列的原始突变位点,构成用于回归分析的原始突变位点集合,将该用于回归分析的原始突变位点集合中包含的突变位点按照扩增区域分组,其中每一组突变位点位于用一对引物扩增的区域中且包含所述用于回归分析的原始突变位点集合中位于该扩增的区域中的所有突变位点;对于每一组突变位点,针对该组中所有突变位点的突变比例进行线性回归分析,确定平均值,该平均值为该组所对应的扩增区域内的假基因扩增比例-即假基因污染比例,另外从步骤b)获得的原始突变位点找出位于该组所对应的扩增区域内的所有原始突变位点,从这些原始突变位点中找出突变比例相对于该组所对应的上述线性回归分析结果而言是高于该扩增区域内的平均值的离群点的突变位点,这些突变位点所对应的突变被判定为PKD1真基因突变;
(5)将步骤(4)确定的真基因突变位点与已知的PKD1基因突变位点进行比较,确定PKD1基因上的新突变位点。
14.权利要求11-13任一项的方法,其中高通量测序为Ion Torrent测序。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510017500.0A CN104531883B (zh) | 2015-01-14 | 2015-01-14 | Pkd1基因突变的检测试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510017500.0A CN104531883B (zh) | 2015-01-14 | 2015-01-14 | Pkd1基因突变的检测试剂盒及检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104531883A CN104531883A (zh) | 2015-04-22 |
CN104531883B true CN104531883B (zh) | 2018-02-02 |
Family
ID=52847502
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510017500.0A Active CN104531883B (zh) | 2015-01-14 | 2015-01-14 | Pkd1基因突变的检测试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104531883B (zh) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106282171B (zh) * | 2015-05-25 | 2020-05-29 | 中国福利会国际和平妇幼保健院 | Pkd2基因的str位点及其应用 |
CN106282172B (zh) * | 2015-05-25 | 2020-05-29 | 中国福利会国际和平妇幼保健院 | Pkd1基因的str位点及其应用 |
CN104975081B (zh) * | 2015-06-01 | 2019-03-01 | 南京市妇幼保健院 | 检测pkd1基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 |
CN107201402A (zh) * | 2017-06-06 | 2017-09-26 | 俞晓敏 | 一种成人型多囊肾的检测方法 |
WO2020041946A1 (zh) * | 2018-08-27 | 2020-03-05 | 深圳华大生命科学研究院 | 基于高通量测序检测同源序列的方法和装置 |
CN109971845B (zh) * | 2018-12-26 | 2023-12-08 | 阅尔基因技术(苏州)有限公司 | 一种扩增人类pkd1基因1-33号外显子的pcr引物组和扩增体系 |
CN110305943A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-10-08 | 北京新抗元生物技术有限公司 | 一种用于评估基因测序数据噪声的内参体系及其建立方法 |
CN112195238B (zh) * | 2020-11-18 | 2023-01-13 | 上海韦翰斯生物医药科技有限公司 | 一种扩增pkd1基因的引物组及试剂盒 |
CN113388672A (zh) * | 2021-04-27 | 2021-09-14 | 北京嘉宝仁和医疗科技有限公司 | 检测pkd1变异单精子的引物组合物、产品及方法 |
CN113528649B (zh) * | 2021-07-27 | 2022-04-22 | 武汉良培医学检验实验室有限公司 | 一种多囊肾疾病致病基因扩增引物组及其检测试剂盒 |
CN116732168B (zh) * | 2023-08-04 | 2023-11-03 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | 检测常染色体显性多囊肾多种突变的方法和试剂盒 |
CN117143997B (zh) * | 2023-10-31 | 2024-02-23 | 北京中仪康卫医疗器械有限公司 | 一种用于pkd1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法 |
CN117497049B (zh) * | 2024-01-03 | 2024-04-19 | 广州迈景基因医学科技有限公司 | 一种snp突变来源的区分方法、系统及装置 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1729289A (zh) * | 2002-11-07 | 2006-02-01 | 松原洋一 | 基因突变检出法 |
-
2015
- 2015-01-14 CN CN201510017500.0A patent/CN104531883B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1729289A (zh) * | 2002-11-07 | 2006-02-01 | 松原洋一 | 基因突变检出法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
A Novel Long-Range PCR Sequencing Method for Genetic Analysis of the Entire PKD1 Gene;Ying-Cai Tan et al;《The Journal of Molecular Diagnostics》;20120731;第14卷(第4期);摘要,表2,表5 * |
应用Ion Torrent半导体测序技术检测常染色体显性多囊肾患者PKD1基因致病突变;马定远等;《中华检验医学杂志》;20150111;摘要,第二部分方法部分,表1,结果部分,讨论部分 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104531883A (zh) | 2015-04-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104531883B (zh) | Pkd1基因突变的检测试剂盒及检测方法 | |
CN104232777B (zh) | 同时确定胎儿核酸含量和染色体非整倍性的方法及装置 | |
CN106715711B (zh) | 确定探针序列的方法和基因组结构变异的检测方法 | |
WO2022033000A1 (zh) | 一种基于二代测序技术测定基因组不稳定的方法及试剂盒 | |
CN105441432B (zh) | 组合物及其在序列测定和变异检测中的用途 | |
US20180051329A1 (en) | Alignment and variant sequencing analysis pipeline | |
CN106834502A (zh) | 一种基于基因捕获和二代测序技术的脊髓性肌萎缩症相关基因拷贝数检测试剂盒及方法 | |
CN106544407A (zh) | 确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA比例的方法 | |
CN104131008A (zh) | Dna标签、pcr引物及其应用 | |
WO2021232388A1 (zh) | 确定胚胎细胞染色体中预定位点碱基类型的方法及其应用 | |
CN105555970B (zh) | 同时进行单体型分析和染色体非整倍性检测的方法和系统 | |
US20170321270A1 (en) | Noninvasive prenatal diagnostic methods | |
Yin et al. | Challenges in the application of NGS in the clinical laboratory | |
CN107075564A (zh) | 确定肿瘤核酸浓度的方法和装置 | |
CN101928776A (zh) | 一种hla基因分型的pcr-sbt方法及其试剂 | |
CN106995851A (zh) | 扩增pkd1外显子超长片段的pcr引物、检测pkd1基因突变的试剂盒及应用 | |
CN114317728B (zh) | 用于检测sma中多种突变的引物组、试剂盒、方法和系统 | |
CN114283889A (zh) | 一种矫正同源重组修复缺陷评分的方法及装置 | |
CN111534602A (zh) | 一种基于高通量测序分析人类血型基因型的方法及其应用 | |
CN108060227A (zh) | 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 | |
CN107236037A (zh) | 一种突变的msh6蛋白及其编码基因、应用 | |
TWI675918B (zh) | 基於單倍型之通用非侵入性單基因疾病產前檢測 | |
CN112442530B (zh) | 检测cah相关真假基因的方法 | |
US20180119210A1 (en) | Fetal haplotype identification | |
WO2016090585A1 (zh) | 测序数据处理装置和方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230725 Address after: 102400 101-112, A101-A109, F1, 201-214, A201-A209, F2, No. 9, Guangyang Street, Changyang Town, Fangshan District, Beijing Patentee after: BEIJING SHENGGU ZHIHUI MEDICAL INSTITUTE CO.,LTD. Address before: 11th Floor, East Building, Block A, Qingdong Business District, No. 1 Lanxiangou, Haidian District, Beijing, 100089 Patentee before: BEIJING SAN VALLEY TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO.,LTD. |
|
TR01 | Transfer of patent right |