CN113528649B - 一种多囊肾疾病致病基因扩增引物组及其检测试剂盒 - Google Patents
一种多囊肾疾病致病基因扩增引物组及其检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种多囊肾疾病致病基因扩增引物组，所述引物组能够扩增多囊肾疾病致病基因PKD1和PKD2的全部外显子区及外显子与内含子连接处侧翼序列至少50bp，同时，本发明还提供了一种多囊肾疾病致病基因检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述引物组。本发明通过设计长片段扩增子引物，避开假基因及高GC区域，设计的引物能够将PKD1和PKD2的全部外显子进行扩增，并且扩增的准确性和成功率得到提高，通过将PKD1和PKD2扩增引物组应用于检测试剂盒，提高试剂盒检测的准确性，简化试剂盒的操作步骤，节省操作时间和成本，不易出错。
Description
技术领域
本发明属于检验技术领域，具体涉及一种多囊肾疾病致病基因扩增引物及其检测试剂盒。
背景技术
多囊肾疾病(Polycystic Kidney Disease,PKD),根据遗传方式不同，分为常染色体显性和隐性遗传肾病，PKD患者肾脏囊肿往往表现出持续性的不断形成和增大，约50％的常染色体显性遗传多囊肾病(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease,ADPKD)最终发展为终末期肾病，严重威胁病人生活质量和生命健康。ADPKD发病率高，约1/400-1/1000，全球大约有0.12亿病人。因此，加强对PKD病人的早期诊断，明确致病变异位点，有效干预和治疗对PKD疾病有着重要意义。
研究表明，ADPKD主要有PKD1和PKD2两个基因突变致病，其中PKD1突变占病因约85％，PKD2基因变异约占全部病因15％。变异具有高度异质性，未有热点突变，点突变约占97％，剩余大片段插入缺失、重排等占到约3％。PKD1有46个外显子，编码区约14.6kb，其1-33号外现在有6个高度同源的假基因，基因空间复杂，相似性高达98％，部分区域GC含量高达80％，基因空间复杂，以上因素导致 PKD1基因检测难度增加。
现有技术中常用的DNA高效液相层析(DHPLC)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多态性分析(SSCP)等方法，只能检测是否有变异，不能直接针对核酸序列测序得到明确变异。并且长片段PCR后sanger测序，需要对几十kb的长片段进行测序，工作量大，PCR 体系复杂，针对不同长片段需要用到不同添加剂组成的体系、PCR程序，且sanger测序受复杂基因结构及高GC等特殊序列干扰测序难度大、通量低、成本高。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种多囊肾疾病致病基因扩增引物组及其检测试剂盒，使用该引物组扩增能够覆盖多囊肾疾病致病基因PKD1和PKD2的全部外显子，并优化了PCR体系和程序，采用高通量测序方法代替sanger测序，降低测序难度、测序通量高、成本低。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种多囊肾疾病致病基因扩增引物组，所述引物组能够扩增多囊肾疾病致病基因PKD1和PKD2的全部外显子区及外显子与内含子连接处侧翼序列至少50bp。
优选地，所述引物组包含18对引物，引物设计时避开致病基因中的假基因和高GC区域，引物扩增片段长度为1206-5356bp。
优选地，所述引物组包含下所述的引物：
另一方面，本发明提供一种多囊肾病致病基因检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。
优选地，所述检测试剂盒还包括DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、纯化试剂盒、建库试剂盒、测序试剂盒。
优选地，所述引物组分为2组，其中PKD1-1F、PKD1-1R、PKD1-3F、 PKD1-3R、PKD1-5F、PKD1-5R、PKD1-7F、PKD1-7R、PKD1-9F、 PKD1-9R、PKD2-2F、PKD1-2R、PKD1-4F、PKD1-4R、PKD1-6F、PKD1-6R、PKD1-8F、PKD1-8R为引物组1，PKD1-2F、PKD1-2R、 PKD1-4F、PKD1-4R、PKD1-6F、PKD1-6R、PKD1-8F、PKD1-8R、 PKD2-1F、PKD2-1R、PKD2-3F、PKD1-3R、PKD1-5F、PKD1-5R、 PKD1-7F、PKD1-7R、PKD1-9F、PKD1-9R为引物组2。
优选地，所述引物按照如下浓度配置后稀释10倍备用：
优选地，所述PCR扩增试剂盒包含Takara LA Taq酶，所述纯化试剂盒为VAHTS DNAClean Beads，所述建库试剂盒为VAHTSTM Universal Plus DNA Library Prep Kit for
试剂盒。
一种检测多囊肾疾病致病基因是否存在变异的方法，所述检测方法中，PCR的反应体系和反应程序如下所示：
PCR反应体系
| 组分 | 体积(μL) |
| LA Taq(5U/uL) | 0.25 |
| 10×LA PCR Buffer II(with Mg 2+) | 2.5 |
| dNTP(2.5mM each) | 5 |
| 1F(2F) | 2.5 |
| 1R(2R) | 2.5 |
| DMSO | 1.25 |
| 甜菜碱(5M) | 2.5 |
| DNA(50ng) | 1.5 |
| 水 | 7 |
| total | 25 |
PCR反应程序
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过设计长片段扩增子引物，避开假基因及高GC区域，设计多囊肾疾病致病基因PKD1和PKD2基因的全部外显子区及与外显子与内含子连接处侧翼序列至少50bp，能够将PKD1和PKD2 的全部外显子进行扩增，并且扩增的准确性和成功率得到提高。
(2)本发明通过将PKD1和PKD2扩增引物组应用于检测试剂盒，提高试剂盒检测的准确性，简化试剂盒的操作步骤，节省操作时间和成本，不易出错。
(3)本发明通过将引物进行分组，并对不同引物设置不同初始浓度，分组后的引物不存在相互重叠的扩增子，设置不同引物初始浓度能够使得到的扩增子均一性更好，在获得同等数据量的同时，数据有效利用率得到明显提高，节约分析成本。
附图说明
图1为PKD1中9个扩增子测序深度分布图；
图2为PKD2中9各扩增子测序深度分布图；
图3为实施例5中sanger验证结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
实施例1
本实施例描述了多囊肾疾病致病基因PKD1和PKD2基因序列的确认与分析，并针对该基因序列进行引物设计。
1、基因序列与分析
通过NCBI查询PKD1和PKD2的基因序列，其中PKD1基因的序列登记号为NC_000016.10，存在于人类第16号染色体上，PKD2基因的序列登记号为NC_000004.12，存在于人类第4号染色体上。
2、引物设计
以PKD1和PKD2基因序列作为模板，进行引物设计，引物设计时避开假基因及高GC区域，设计18对PCR引物，可以覆盖PKD1 和PKD2基因的全部外显子及外显子与内含子连接处侧翼序列的至少 50bp。得到的18对PCR引物与扩增区域大小如下表所示：
表1引物序列与扩增子长度
实施例2
本实施例描述了如何采集DNA样品和预处理，并使用实施例1中设计的引物组对采集的样本进行PCR扩增。
1、DNA样本采集与预处理
采集人体血液样本2mL，按照血液基因组DNA提取试剂盒(天根， DP348)步骤提取，得到总核酸样本。
2、复合扩增
(1)引物分组和稀释
将实施例1中设计的引物合成后按照以下方式进行分组，并使用1 ×TE buffer将各引物稀释到100μM备用，稀释后各引物最终浓度如下表所示：
表2引物分组和最终浓度
(2)配制扩增体系
按照步骤(1)中要求配制好引物组，并稀释10倍备用，按照以下方式将引物组1和引物组2分别配制扩增体系：
表3 PCR反应体系
| 组分 | 体积(μL) |
| LA Taq(5U/uL) | 0.25 |
| 10×LA PCR Buffer II(with Mg 2+) | 2.5 |
| dNTP(2.5mM each) | 5 |
| 1F(2F) | 2.5 |
| 1R(2R) | 2.5 |
| DMSO | 1.25 |
| 甜菜碱(5M) | 2.5 |
| DNA(50ng) | 1.5 |
| 水 | 7 |
| total | 25 |
扩增体系中LA Taq酶为Takara LA Taq酶，DNA为血液样本抽提得到的总核酸，使用引物组1中的1F和1R引物配制PCR体系1，使用引物组2中的2F和2R引物配制PCR体系2。
(3)PCR扩增
将步骤(2)中配制的PCR体系1和PCR体系2分别进行PCR扩增，扩增程序如下：
表4 PCR反应程序
扩增后，分别得到PCR产物1和PCR产物2。
(4)PCR产物纯化
分别取步骤(3)中得到的PCR产物1和PCR产物2各25μL，制备成50μL混合样品，使用50μL 1.0×VAHTS DNA Clean Beads纯化该混合样品，并使用dsDNA HS Assay Kit定量浓度。
实施例3
本实施例描述了如何对实施例2中得到的PCR扩增产物建立文库，文库建立采用VAHTSTM Universal Plus DNA Library Prep Kit for
试剂盒，具体建立如下：
1、酶切、末端修复和“A”尾添加
将实施例2中得到的纯化后的PCR产物按照下表所述方式配制反应体系：
表5反应体系
| 组分 | 体积(μL) |
| 纯化PCR产物 | X(50ng) |
| ddH2O | 17.5-X |
| FEA Buffer | 2.5 |
| FEA Enzyme Mix | 5 |
| Total | 25 |
按照下列反应程序进行酶切、末端修复和A尾添加：
表6反应程序
| 温度 | 时间 |
| 热盖70℃ | —— |
| 37℃ | 12min |
| 65℃ | 30min |
| 4℃ | Hold |
2、酶切片段连接
将步骤1中得到的经过末端修复后的DNA产物进行连接，按照以下反应体系和反应程序进行：
表7反应体系
表8反应程序
| 温度 | 时间 |
| 热盖 | Off |
| 20℃ | 15min |
| 4℃ | Hold |
3、连接产物纯化
使用VAHTS DNA Clean Beads对连接产物进行纯化，在步骤2中得到的连接产物中加入0.6倍(30μL)磁珠，在室温条件下平衡30min，然后分离去除上清液，使用80％乙醇漂洗2遍后，用12μL水洗脱，即得到纯化后的连接产物。
4、纯化产物PCR
将纯化后的连接产物按照表9的反应体系和表10的反应程序进行 PCR反应：
表9反应体系
表10反应程序
5、PCR产物纯化
使用VAHTS DNA Clean Beads对PCR产物进行纯化，在步骤4 中得到的连接产物中加入0.9倍(22.5μL)磁珠，在室温条件下平衡 30min，然后分离去除上清液，使用80％乙醇漂洗2遍后，用50μL水洗脱，即得到纯化后的PCR产物。使用Qubit荧光定量仪检测纯化后PCR产物的浓度。
实施例4
1、上机测序
按照上机试剂盒说明书操作，兼容Illumina
2000/2500,
MGI Seq 2000/200等测序仪。PE150模式，数据量500M。
2、数据分析
将步骤1中得到的原始下机数据(raw data)进行过滤，滤掉接头污染reads、质量值低reads、含连续N比例大于5％，得到clean data 用于后续分析；使用软件Burrows-Wheeler Alignment(BWA)将所得 clean data比对到人类参考基因组，流程中所用基因组参考版本为 GRCh38，进行碱基质量值校正后，用GATK中的Unified Genotyper 工具进行个体变异检测，检测变异类型包括SNV及small indel，由于原始变异检测结果包含大量假阳性，接着会对变异进行过滤(已知致病位点不进行过滤)，得到最终变异位点结果。
检测时的数据质控结果如表11所示，扩增子深度图如图1、2：
表11数据质控结果
实施例5可靠性验证：
将样本A采用本发明实施例1～4的方法分2管复合扩增，NGS检测变异位点，遗传解读有临床意义的位点Sanger验证其准确性，具体参见下表12：
表12样本A的检测结果
将样本A按常规长片段单独扩增18个扩增子，sanger测序结果与按照实施例1～4方法的检测结果进行比较，具体操作如下：将样本A 按照以上18对引物单独扩增，sanger测序，在该实验中需要单独18 个25μL扩增体系，单独纯化，因sanger测序耗时长需设计引物将其测通，时间在一周左右，按照上述方法，3天得到检测结果，经遗传解读得到以下需验证结果如下表13和图3所示：
表13 sanger验证结果
对比例1
本对比例1与实施例1～4的不同之处在于，引物的初始浓度不同，具体如下：每组引物中各引物的初始浓度设置为1:1，按以上PCR组分以及程序进行长片段复合扩增，检测结果如下表14所示：
表14对比例1和实施例1～4的检测结果比较
由上表14可以看出：2样本数据量基本相同，从扩增子最高深度与最低深度比值，以及0.2×平均深度占比参数，调整后的本发明中的引物比得到的扩增子均一性明显优于常规1:1引物比，可以提高数据有效利用率，降低数据量，节约成本。
以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉良培医学检验实验室有限公司
<120> 一种多囊肾疾病易感基因扩增引物组及其检测试剂盒
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 31
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Claims (6)
1.一种多囊肾疾病致病基因扩增引物组，其特征在于，所述引物组包含下所述的引物：
2.一种多囊肾疾 病致病基因检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1中所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的一种多囊肾疾病致病基因检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、纯化试剂盒、建库试剂盒、测序试剂盒。
4.根据权利要求2所述的一种多囊肾疾病致病基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物组分为2组，其中PKD1-1F、PKD1-1R、PKD1-3F、PKD1-3R 、PKD1-5F、PKD1-5R、PKD1-7F、PKD1-7R、PKD1-9F、PKD1-9R、PKD2-2F、PKD1-2R、PKD1-4F、PKD1-4R、PKD1-6F、PKD1-6R、PKD1-8F、PKD1-8R为引物组1，PKD1-2F、PKD1-2R、PKD1-4F、PKD1-4R 、PKD1-6F、PKD1-6R、PKD1-8F、PKD1-8R、PKD2-1F、PKD2-1R、PKD2-3F、PKD1-3R、PKD1-5F、PKD1-5R、PKD1-7F、PKD1-7R、PKD1-9F、PKD1-9R为引物组2。
5.根据权利要求4所述的一种多囊肾疾病致病基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物按照如下浓度配置后稀释10倍备用：
6.根据权利要求3所述的一种多囊肾疾病致病基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂盒包含Takara LA Taq酶，所述纯化试剂盒为VAHTS DNA Clean Beads，所述建库试剂盒为VAHTSTM Universal Plus DNA Library Prep Kit for Illumina®试剂盒。
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Denomination of invention: An amplification primer set for pathogenic gene of polycystic kidney disease and its detection kit Effective date of registration: 20220623 Granted publication date: 20220422 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: Wuhan liangpei medical laboratory Co.,Ltd. Registration number: Y2022420000178 |
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Denomination of invention: A PCR Primer Set and Detection Kit for Pathogenic Genes of Polycystic Kidney Disease Effective date of registration: 20230628 Granted publication date: 20220422 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: Wuhan liangpei medical laboratory Co.,Ltd. Registration number: Y2023420000265 |